Prctica de motilidad intestinal in vivo e in vitro

Tabla de contenidoI.MOTILIDAD INTESTINAL IN VIVO01.Introduccin1,202.Procedimiento13.Mecanismo de accin34.Resultados45.Discusin y conclusiones4II.MOTILIDAD INTESTINAL IN VITRO41.Introduccin42.Materiales y procedimiento43.Mecanismo de accin64.Resultados75.Discusin y conclusiones8III.BIBLIOGRAFA8

I. II. MOTILIDAD INTESTINAL IN VIVO1. Introduccin1,2Fisiologa de la motilidad gastrointestinalEl msculo liso del tracto gastrointestinal est conformado por fibras que tienen de 200 a 500 um de longitud y de 2 a 10 um de dimetro; estas fibras estn dispuestas como haces paralelos. Estas fibras estn dispuestas en dos capas: la circular interna y la capa longitudinal externa.Estas fibras musculares lisas estn interconectadas entre s mediante hendiduras en las uniones intercelulares, hendiduras que favorecen el pasaje de iones ofreciendo escasa resistencia. Esto favorece que la contraccin sea rpida a lo largo de las fibras longitudinales. Cada haz est delimitado por tejido conectivo laxo; sin embargo, existen uniones en muchos puntos de tal manera que dan a las fibras un aspecto de red o sincitio.La actividad elctrica que permite la contraccin del msculo liso est favorecida por dos tipos de ondas elctricas: las ondas lentas y los potenciales en espigaOndas lentasEste tipo de ondas favorece la contraccin rtmica y lenta del tracto gastrointestinal, estas ondas no son potenciales de accin; sino que son cambios lentos del potencial de membrana en reposo. Su intensidad vara entre 5 15 mV y la frecuencia oscila entre 3 (cuerpo gstrico) y 12 (duodeno) contracciones por minuto.Se plantea que el origen de estas ondas lentas surge de la interaccin entre las clulas musculares y las clulas intersticiales de Cajal que actan como marcapasos. Estas clulas sufren cambios en su potencial de membrana debido a la presencia de canales inicos. Las ondas lentas favorecen la entrada de iones sodio (Na+), ms no entrada de calcio Su funcin no radica tanto en generar por s mismas contraccin muscular, sino que su funcin ms se centra en controlar la aparicin de potenciales intermitentes.Potenciales en espigaSon potenciales de accin que se generan automticamente cuando el potencial de la membrana del msculo liso llega a valores ms positivos como - 40 mV, cuando ms asciende el potencial, mayor ser la frecuencia de aparicin de potenciales en espiga.La generacin de estos potenciales se debe a la entrada a la clula muscular lisa de grandes cantidades de iones calcio (Ca++) junto a cantidades mnimas de iones sodio (Na+); la apertura y cierre de estos canales se da de forma ms lenta que los canales presentes en la membrana de las fibras nerviosas. Cambios de voltaje del potencial de membranaEl potencial de membrana en reposo puede cambiar independientemente de la presencia de ondas lentas y de los potenciales en espiga. Normalmente, el potencial de reposo de las clulas musculares lisas tiene un valor de - 56mV. El potencial puede volverse ms negativo, fenmeno llamado despolarizacin; as como tambin puede ser menos negativo, fenmeno llamado hiperpolarizacin; cuando la clula est despolarizada es ms excitable, mientras que si est hiperpolarizada hay menor excitabilidad por parte de las clulas Entre los factores que despolarizan la membrana de las clulas musculares lisas tenemos la distensin del msculo liso, la estimulacin con acetilcolina liberada por las terminaciones de nervios parasimpticos y la estimulacin por hormonas gastrointestinales. Por otro lado, los factores que hacen que el potencial sea ms negativo (hiperpolarizacin) tenemos la estimulacin simptica y el efecto de la adrenalina y noradrenalina. Contraccin muscularLa contraccin del msculo liso gastrointestinal est regulada por el ion calcio Ca++, los cuales al unirse a la calmodulina activan los filamentos de miosina y generan una potente atraccin entre los filamentos de actina y los de miosina; as inducen la contraccin muscular. Las ondas lentas favorecen la entrada de iones sodio, mientras que los potenciales en espiga favorecen la entrada de iones calcio que generan la mayor cantidad de las contracciones.

2. Procedimiento2.1. Pesar y marcar ratones

2.2. Distribucin aleatoria para formacin de grupos:Aplicaciones por va orogstricaGrupoAplicacin y concentracin/dosis

ControlSSF 0,1 ml/ 10 g

Metilcelulosa0.2 % de metilcelulosa 0,1 ml/ 10 g

LoperamidaLoperamida 10 mg/kg

Aceite de ricinoDosis nica de 0,2 ml

2.3. Despus de 10 minutos, aplicar va orogstrica carbn activado 0,1 ml/ 10 g a todos los ratones.

2.4. Despus de 30 minutos, sacrificar a los animales por dislocacin cervical.2.5. Realizar laparotoma y remover el tracto gastrointestinal completo (desde el estmago hasta el ciego)

2.6. Medir a partir del ploro la distancia recorrida por la suspensin de carbn (se distingue por el color negro del contenido intestinal). Esta medida indicar el trnsito intestinal.

2.7. Anotar el desplazamiento para cada intestino obtenidos en todos los grupos y se calcula la medida de los controles y los tratados.

3. Mecanismo de accin 3, 4, 5, 6LoperamidaLa loperamida es un derivado del haloperidol que se adhiere al receptor opiceo de la pared intestinal, disminuyendo la liberacin de mediadores qumicos como acetilcolina y prostaglandinas, disminuyendo la peristalsis; acta tambin sobre las fibras musculares circulares y longitudinales del intestino; no posee actividad analgsica. Inhibe la calmodulina aumentando la absorcin de agua y electrlitos a nivel de luz intestinal; adems mejora el tono del esfnter anal, reduciendo la urgencia y la incontinencia. La loperamida prolonga el tiempo del trnsito intestinal, incrementa la viscosidad de las heces, reduce el volumen fecal diario y reduce la prdida de fluidos y electrlitos. No se observado tolerancia a los efectos anti diarreicos de la loperamida.Indicaciones: Tratamiento de la diarrea inespecfica no infecciosa: Tratamiento de la diarrea crnica: Tratamiento de la diarrea inducida por la quimoterapia Aceite de ricinoEl aceite de ricino tiene unos efectos laxantes muy fuertes, incluso purgantes. El principio activo responsable es el cido ricinoleico, y su ismero, el isorricinoleico. Son liberados de los triglicridos a travs de la lipasa pancretica. En la luz intestinal estimulan la liberacin de agua e impiden la reabsorcin en el intestino delgado, a la vez que estimulan la produccin de prostaglandina E2. Parece que los efectos son debidos a una desestabilizacin de la bicapa lipdica de los enterocitos, que produce una lisis de los mismos y da lugar a un aumento del peristaltismo.El cido ricinoleico del aceite de ricino desencadena una irritacin de la mucosa intestinal, en el cual produce inicialmente un aumento de lquidos. Adems , este cido evita que los lquidos sean posteriormente reabsorvidos. La acumulacin de lquidos va aumentndo el contenido intestinal. Seguidamente se estimula la liberacin de jugo biliar y pancretico que junto a las propiedades lubricantes del aceite, favorecernn el deslizamiento de las heces por el intestino. con sus propiedades Indicaciones: [Vaciado gastrointestinal] prerradiografa o preoperatorio. [intoxicacion por alimentos].MetilcelulosaLa metilcelulosa al absorber el agua se expande y provee de tamao y de humedad a las heces, lo que a su vez estimula el peristaltismo y motilidad normal del intestino.

Indicaciones: Estreimiento habitual atnico por cambio de dieta, ambiente o reposo prolongado en cama.

4. ResultadosRATONES TRATAMIENTOPESO (grs)VOL (mL)LONGITUDOBSERVACIONES

TotalDe avance

CONTROLBlanco410,4161 cm00%

Cabeza360,3659 cm52 cm88%

METILCELULOSALomo450,4564 cm42 cm65,6%

Base de cola320,3249 cm35 cm71,4%

ACEITE DE RICINOCola420,4260 cm44 cm63,3%

Nariz340,3465 cm25 cm38,5%

LOPERAMIDAOreja400,4065 cm33 cm50,8%

Pata400,4069 cm61 cm88,4%

5. Discusin y conclusiones7, 8, 9En esta prctica de motilidad intestinal in vivo, se pudo apreciar que en los ratones qu se les administro metilcelulosa menor desplazamiento que en los ratones controles, ya que el desplazamiento es proporcional al incremento de la peristalsis intestinal, esto no se correlacionara con su mecanismo de accin ni con los efectos que produce la metilceluosa en el organismo, como menciona la bibliografa.Tambin se pudo apreciar en los resultados de la prctica un menor desplazamiento del carbn activado en los ratones a quienes les fue administrado aceite de ricino a comparacin de los ratones controles, estos resultados tampoco se correlacionan con el mecanismo de accin del aceite de ricino ni con sus efectos, pues el aceite de ricino es usado como purgante.La loperamida es un antiperistltico, cuyo mecanismo de accin a grandes rasgos es bloquear la va colinrgica en el intestino, disminuyendo as la actividad estimulante del plexo mientrico sobre el musculo liso. En esta prctica se puede apreciar en uno de los ratones con loperamida (oreja) una disminucin de la perstalsis a comparacin del nico ratn til control, con una disminucin del 37.2% del desplazamiento del carbn activado. En el otro ratn con loperamida (pata) se observa un desplazamiento del carbn activado aumentado en 0.4%, prcticamente imperceptible. En este caso se puede apreciar que el nico ratn en el cual la loperamida ha actuado eficazmente como antiperistltico es el primer ratn (oreja), en el segundo ratn (pata) la loperamida prcticamente no hizo ningn efecto.Se puede concluir que en esta prctica solo se pudo demostrar el efecto de la loperamida sobre uno de los ratones. El efecto de la metilcelulosa y el aceite de ricino como estimulante de la evacuacin y purgante, respectivamente, no se pudieron demostrar.

III. MOTILIDAD INTESTINAL IN VITRO1. Introduccin 10, 11, 12Introduccin fisiologa de la motilidad gastrointestinalLos mecanismos bsicos para el control de la motilidad del estmago (intestino delgado y grueso) tiene caractersticas comunes. la motilidad gstrica est regulada por el Sistema Nervioso Autnomo o Vegetativo (control extrnseco), el parasimptico con la produccin de acetilcolina, estimula la motilidad gstrica, el simptico con la produccin de catecolaminas inhibe la actividad muscular. En la motilidad gstrica interviene un control intrnseco propio de la pared por parte de los plexos nerviosos (submucosa de Meissner, musculoso de Awerbach) que regulan la motilidad gastrointestinal.Electrofisiologa del estmago:En el cuerpo distal y antro hay dos tipos de actividad elctrica que son:1. La onda lenta que es la despolarizacin parcial de la clula muscular la cual ocurre a intervalos regulares (c/ 20 seg.). Es un fenmeno puramente elctrico y no produce contraccin.2. La onda rpida la cual se acompaa de actividad muscular (dura 2-3 seg. y se acompaa de una onda lenta). Funciona como marcapaso y se origina en un punto de la parte media de la curvatura mayor propagndose circunferencial y longitudinalmente hacia el ploro. Cuando la onda lenta se acompaa de onda rpida aparece una banda de contraccin circunferencial en la parte baja del cuerpo gstrico que se propaga hacia el ploro es la llamada onda peristlticaVaciamiento Gstrico para lquidos:Este vaciamiento es funcin del gradiente de presin entre el estmago y el duodeno. Las ondas lentas y sostenidas dan la presin basal del estmago, las ondas rpidas tiene poco efecto sobre la presin. La deglucin y distensin producen una rpida relajacin de las paredes proximales del estmago por inhibicin de las contracciones sostenidas. Esto constituye la relajacin receptiva que permite la funcin de reservorio del estmago manteniendo una presin intra-gstrica baja. Esta relajacin est mediada por mecanismos neurales y hormonales mediante neuronas vagales inhibitorias tipo NCNA y dopaminrgicas con transmisores como dopamina, encefalinas e incluso la CCK.El vaciamiento para lquidos lo controla el estmago proximal, el cambio en las contracciones lentas y sostenidas en dicha zona lleva a cambio en el vaciamiento de lquidos. El vaciamiento aumenta en relacin al aumento de la presin intragstrica.Vaciamiento Gstrico para slidos:Los slidos pasan al duodeno solo en forma licuada, las partculas son retenidas hasta tener un tamao menor 2 mm. Esto ocurre en el estmago distal en donde se dan las fluctuaciones de la actividad elctrica que determinan la frecuencia y la velocidad de las contracciones. La frecuencia normal es de 3-4 ciclos por minuto, sin embargo un cambio de potencial ms rpido aparece con la accin deneurotransmisores.

Las contracciones del estmago distal son las ondas peristlticas que avanzan distalmente y aumentan de amplitud y velocidad a medida que se propaga. Despus de las comidas hay conjuntos rtmicos de estas ondas que conforman el patrn post-prandial que tiene funcin propulsiva pero tambin de trituracin y mezcla de las partculas slidas. A medida que la onda peristlsica se acerca al antro, este y el ploro se cierran. De esta forma gradualmente son reducidos los slidos hasta conformar el quimogstrico. Tambin esta zona est controlada por mecanismos hormonales y neurales siendo la gastrina la hormona ms importante puesto que aumenta la frecuencia del marcapaso y facilita la generacin de potenciales de accin. Los mecanismos neurales de control son vagales y simpticos.Vaciamiento Gstrico para slidos no digeribles:Los slidos que no se pueden reducir a partculas menores de 2 mm son eliminados del estmago por un mecanismo consistente en una actividad electromecnica que tiene lugar en el peridico interprandial comenzando en el estmago proximal y progresando hasta el intestino. Este ciclo ocurre aproximadamente cada dos horas complejo motor migratorio (CMM). Se compone de cuatro fases: Fase I: Es un perodo de inactividad motora con espordicos potenciales de accin con duracin de 45-60 min. Fase II: Contracciones peristlticas intermitentes que aumentan de frecuencia y amplitud por unos 30 a 45 minutos ms. Fase III: De 5 a 15 minutos hay salvas de contracciones peristlticas que ocurren con cada potencial de marcapaso (unas 3 contracciones por minuto.) En el perodo interdigestivo, contrariamente a lo que ocurre en el periodo prandial, el ploro permanece abierto, de forma que los slidos no digeridos son barridos del estmago por el CMM. Fase IV: Es un corto perodo de mezcla entre la intensa actividad electromecnica de la fase II, III y I

2. Materiales y procedimientoMaterial biolgico: Rata de peso 350-400 gramos.Material farmacolgico y qumico: Acetilcolina, sol. 2 x 10-4M, 2x10-5M, 2x10-6M. Neostigmina, sol. 10-5M Atropina, sol. 10-6M. Adrenalina, sol. 2x10-3M Solucin de Krebs-HenseleitProcedimiento:1) Sacrificar a las ratas.2) Identificar y extraer la porcin terminal del leon. 3) Colocar el rgano en una placa petri conteniendo Solucin de Krebs-Henseleit a temperatura ambiente, procedindose a la eliminacin del tejido suprfluo y limpieza intraluminal.4) Una vez limpio, se procede a cortar el segmento a montar en el bao de rganos.5) Colocar 2 puntos opuestos de sujecin (hilo) donde uno de los cuales se fija a la parte inferior dentro del bao de rganos y el otro se acopla a la varilla que contacta con el quimgrafo.6) La sujecin se realiza con la ayuda de una aguja; por el extremo que se unir a la varilla que contactar con el quimgrafo se introduce el hilo pinchando tan solo una vez en el rgano de manera que el medio nutritivo pueda penetrar a la luz del leon (pico de flauta), mientras que en el otro extremo se pincha 2 veces en el tejido, dejndose un asa de hilo antes de atarlo para no estrangular el rgano.7) El bao de rganos debe contener solucin de Krebs-Henseleit con aireacin contnua.8) La preparacin se deja estabilizar durante 30 minutos.9) Una vez conseguida una lnea basal estable, se puede aadir al bao 0.2 ml. de los frmacos a ensayar en el siguiente orden:i. Acetilcolina 2x10-6M (1) ii. Acetilcolina 2x10-5M (2) iii. Acetilcolina 2x10-4M (3)Renovar la solucin y una vez que vuelve a su estado basal, dejar estabilizar por 15 minutos iv. Neostigmina 10-5Mv. Acetilcolina 2x10-6M (1)Renovar la solucin y una vez que vuelve a su estado basal, dejar estabilizar por 15 minutos vi. Atropina 10-5Mvii. Acetilcolina 2x10-4M (3)Renovar la solucin y una vez que vuelve a su estado basal, dejar estabilizar por 15 minutos viii. Acetilcolina (1) y en el pico de contraccin agregar adrenalina 2x10-3M.

3. Mecanismo de accin6Acetilcolina:Su sntesis, almacenamiento y liberacin ocurre a nivel de uniones neuromusculares, terminaciones preganglionares y varicosisdades posganglionares. En su sntesis ocurre la unin de acetil CoA fabricada a nivel de las terminales axnicas donde hay un gran nmero de mitocondrias y la colina trada desde el extracelular por transporte activo (independiente de Na+ y dependiente de Na+ y Cl-); enzima que cataliza esto es la colina acetiltransferasa. Luego se almacena en vesculas a travs del transportador de ACh vesicular (VAChT) mediante un gradiente electroqumico de protones. La liberacin junto con otros mediadores ocurre por despolarizacin y entrada de Ca++ para la exocitosis por fusin de la vescula con la membrana. La accin de este neurotransmisor va a producirse en contacto con receptores muscarnicos, de 5 tipos (M1 al 5)y nicotnicos, 2 tipos (Nn y Nm).En el experimento se trabaj con leon , parte del intestino el cual posee principalmente receptores M3 y M2, a nivel de M2 y M3 se produce principalmente en el msculo liso la contraccin, y con accin sobre M3 se produce la secrecin, cabe mencionar que la secrecin se da mayormente en glndulas salivales.NeostigminaEs un inhibidor de la AchE, su mecanismo reside en su residuo ester carbamoilo y en su forma catinica a pH fisiolgico, la serina del centro activo la reconoce como sustrato y genera la carbamoilacion de la enzima, la cual es ms estable y cuya vida media es de 15 a 30 minutos para su posterior hidrlisis. Su accin en el tubo digestivo: aumenta las contracciones, motilidad e incrementa la produccin de cido, debido a la combinacin de fibras colinrgicas del plexo de Auerbach.AtropinaEs un inhibidor competitivo de la ACh, tiene el mismo sitio de unin que la ACh. Sin embargo este grupo de frmacos son poco eficaces en comparacin con los que inhiben a los esteres de colina ya que la concentracin en el espacio sinptico de ACh es muy alta. Su accin en el estmago y el intestino como antiespasmdico es debido a la inhibicin parcial de la respuesta vagal, ya que hay sinapsis de fibras colinrgicas con otras no colinrgicas y no se inhibe la secrecin de gastrina.AdrenalinaEs un estimulante adrenrgico por igual de los receptores alfa y beta. La actividad alfa incluye reaccin alrgica, descongestin nasal, actividad presora y vasocontriccin local. La actividad beta incluye broncodilatacin, cardiaca y uterina. En el musculo liso del endotelio vascular hay receptores alfa y beta 2, en concentraciones fisiolgicas hay accion predominantemente beta 2 (vasodilatacin), pero si se aumentan concentraciones se produce aumento de actividad alfa (vasoconstriccin). El estmago se relaja y contrae los esfnteres, pero esto depende del estado basal del estmago. Sin embargo, las acciones en el tubo intestinal son menos relevantes que las que se producen en los vasos.4. ResultadosFRMACOGRAFICA DE LA MOTILIDAD INTESTINAL

BASALCAMBIO

ACETILCOLINA (1)

ACETILCOLINA (2)

ACETILCOLINA (3)

NEOSTIGMINA- ACETILCOLINA (1)

ATROPINA- ACETILCOLINA (3)

ACETILCOLINA (1) ADRENALINA

5. Discusin y conclusionesEn esta prctica nosotros aadimos al bao de rganos ACh. La ACh interaccion con receptores muscarnicos, concretamente M3. Tras su estimulacin se desencadenaron una serie de procesos que condujeron a un incremento de [Ca2+] intracelular, provocando la contraccin del musculo liso ya que el receptor M3 est asociado a una proteina G cuya activacin estimula la actividad de la fosfolipasa C.El ileon presenta una contraccin bifsica, con un componente fsico (un pico de contraccin) seguido de otro tnico (una meseta mantenida). El pico de contraccin se asocia con la liberacin de Ca2+ de los depsitos intracelulares y la contraccin tnica con la entrada de Ca2+ a travs de canales.En el caso de aumento de dosis de Ach, entre ms sea la concentracin de acetilcolina, como se apreci en el experimento, es mayor el rea bajo la curva que expresa el quimografo. Como se ver, este aparato tiene la funcin de transmitir los cambios de presin o los movimientos fisiolgicos del rgano, como las contracciones musculares de la porcin de leon de la rata. Es as que podemos decir que si se aumenta la dosis de Ach aumenta la intensidad de las contracciones en el intestino gracias a la activacin del receptor M3.En el caso de la neostigmina y acetilcolina, ocurre que como estamos trabajando con una porcin de leon de rata, sin ningn otro tipo de medicamentos ni alteraciones a sus receptores por bloqueadores o estimuladores, y as, en el resultado al aplicar la neostigmina, esta aument la respuesta constrictora de la acetilcolina y se produjo un efecto de potenciacin en esta. Estos resultados pueden atribuirse a las diferentes sensibilidades de las muestras utilizadas. Debido a que la neostigmina compite con la acetilcolina por el sitio de unin en la acetilcolinesterasa, y as ayudando a que esta acetilcolina no se hidrolice.

En la prctica este efecto potenciador se vio evidenciado satisfactoriamente en el quimigrafo, aunque cabe la posibilidad y como teora que hubiese sido mayor el efecto si la concetracin de neostigmina.

En el caso de la atropina y acetilcolina, como sabemos la acetilcolina estimula la actividad secretora y de motilidad del intestino, pero por el contrario la atropina disminuye el tono y el peristaltismo intestinal. La atropina tiene ms afinidad a los receptores muscarnicos que la acetilcolina, por ello la atropina compite con la acetilcolina por ocupar los receptores y es la atropina quien los vas a ocupar.

Esto se vio evidenciado en la prctica ya que al adicionar primero la atropina, ocup los receptores M3 y posteriormente al aadir la acetilcolina, ya no tena la misma cantidad de receptores a los cuales unirse, por ello no se pudo estimular la motilidad del leon. Pero como es un antagonismo reversible, si hubiramos aumentado la concentracin de acetilcolina se hubiera podido lograr la estimulacin de la motilidad intestinal.En el caso de la acetilcolina y adrenalina cuando se introdujo acetilcolina podamos notar el aumento en la tensin muscular en el rgano, pero cuando posteriormente se agreg adrenalina, al haber receptores B (B2) adrenrgicos se provoca la relajacin de las clulas musculares del intestino, y en los receptores alfa (a1 y a2) que se encuentran en el musculo liso de las arterias causa vasoconstriccin, que tambin apoya en la disminucin de la motilidad intestinal. Se espera entonces que a partir del aumento del tono por Ach la adrenalina produzca un efecto antagnico de los efectos colinrgicos por activacin de receptores adrenrgicos.

IV. BIBLIOGRAFA

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