Metatranscriptomic Analysis of the Response of

River Biofilms to Pharmaceutical

Products, Using Anonymous DNA Microarrays

Applied and Environmental Microbiology – Agosto 2010

ESCOLA SUPERIOR DE BIOTECNOLOGIA - UNIVERSIDADE CATÓLICA PORTUGUESA

MESTRADO EM MICROBIOLOGIA APLICADA

MICROBIOLOGIA MOLECULAR

Porto, 04 de Janeiro de 2011.

Ana Figueiredo

João Pereira

Leonardo Dantas

Introdução

A contaminação de efluentes de esgotos tratados, leva muitas vezes

productos de cuidado pessoal e fármacos cada vez mais utilizados a serem

disseminados no meio ambiente.

Razões do interesse nestes productos:

Muitas drogas interagem com alvos biológicos partilhados entre

humanos, outros animais e mesmo plantas e microrganismos;

Muitas actuam a concentrações relativamente baixas;

Fármacos necessitam de tempo para atingir o efeito desejado e

logo, são produzidos especificamente para resistir à degradação

dentro do corpo;

A taxa de adição ao meio excede a sua transformação ou degradação;

A sua exposição crónica tem vindo a ser associada ao desenvolvimento

de bactérias resistentes a antibióticos.

Os biofilmes tanto pelo seu efeito basal nas redes de comida aquática e a

sua importância em processos fundamentais como na biodegradação e

em ciclos bioquímicos, são candidatos ideais para a monitorização de

efeitos ecológicos de poluição por fármacos em ambientes aquáticos.

Anonymous DNA microarrays

Frequentemente utilizados para estudos transcriptómicos de

organismos cujo genoma ainda não foi sequenciado.

Anonymous DNA microarray poderá ser uma alternativa

interessante para análises metatranscriptómicas comparativas

pois não requer conhecimento prévio da genómica ambiental e

permite um grande número de amostras sem que seja

necessário o sequênciamento metatranscriptomico a cada

amostra a analisar.

Introdução

Objectivos do presente estudo:

Demonstrar a utilidade de anonymous microarrays em

estudos do metatranscriptoma em larga escala.

Identificar respostas transcripcionais de biofilmes fluviais

para doses ambientalmente relavantes de diferentes

tipos de productos farmacêuticos.

Introdução

Amostragem

Eritromicina (EL) 1µgL-1,

Clindamicina, Trimetroprim, Sulfametazina (SN)

0.5µgL-1,

Norfloxacina, Sulfametoxazol (SL) 0.5µgL-1,

Gemfibrozil (GM) 1µgL-1,

Nothing was added to the control reactors (CO).

•

•

1) Wascana Creek (WC)

Para a observação da resposta do biofilme

a cada um dos fármacos.

Misturas de Biofilmes de WC sujeitos a seis

tratamentos diferentes foram usados para a

construção do microarray (33 amostras).

2) South Saskatchewan River (SSR)

Biofilmes de SSR: Teste ao microarray.

Sonication

Total Genomic DNA

Genomic Fragments

(400-600bp)

Taq DNA polymerase

+

dATP

End repair (End-It kit)

UA Ligation

into

pDrive vector

Transformação de células

XL1-Blue

VersArray Colony Picker

(Bio-Rad)

Extracção de DNA

dos 9 600 clones

Amplificação

(primers para vector)

Verificação em gel

Quantificação de DNA por UV

6,351 “bons” (66.2%)

917 “fracos” (9.6%)

Construção da plataforma de microarray anónimo

VersArray Chip Writer Pro

Printer

(Bio-Rad)

48 sub-arrays impressos

em lâminas de vidro

revestidas de Aminosilano

O mRNA foi enriquecido, amplificado

para cDNA, e marcado com Cy3.

Usam-se primers aleatórios e uma forma mutada do

fragmento Klenow da DNA polimerase I, para a

incorporação de nucleotidos fluorescentes, Cy5.

Hibridização e análise do Microarray

250-500mg de Biofilme (amostra composta)Ácidos nucleicos

RNAse

50µL de DNA 50µL de RNA

DNAsemRNA

cDNA

Sequenciação e qRT-PCR

Após a análise estatística as sondas que obtiveram maiores valores para com o

primeiro e segundo eixo foram recuperadas dos clones usados para a construção do

microarrray e sequenciadas.

Para algumas das sondas identificadas como mais reactivas aos

tratamentos, construiram-se primers que foram usados em reacções de qRT-PCR, para a

verificação das tendências observadas no microarray.

Resultados

Padrões normalizados de hibridação foram usados com 2 propósitos:

(i) Providenciar a impressão do metatranscriptoma de cada amostra

(ii) Identificar as sondas mais fortemente ligadas com os tratamentos

experimentais.

fingerprint de alta definição da comunidade microbiana e para

identificar genes que fossem expressos mais diferenciadamente entre

tratamentos.

Resultados

Análise do microarray para Wascana Creek (WC)

As associações das

sondas, relativas aos

tratamentos, foram determinadas

positivamente ou negativamente

(por vezes ambas) baseando-se na

comparação da intensidade média

para um dado tratamento, com os

restantes.

Os 96 valores positivos e

negativos de maior valor para

cada eixo foram seleccionados

para sequenciação.

Fig 1a.

Resultados

Análise do microarray para South Saskatchewan River (SSR)

Fig 1b.

Este rio foi escolhido por diferir do WC

em um parâmetro ambiental importante

(por ex: disponibilidade de nutrientes ou

trofismo).

As posições relativas dos tratamentos

não foram exactamente as mesmas que

para WC, mas observou-se alguma

similaridade

Sondas mais reactivas aos tratamentos dos biofilmes de WC

•Sulfamethoxazole (SL)

sondas > parede celular e membrana externa (COG M)ou envolvidas na

transducção de sinal (COG T) - resposta positiva.

Sondas > genes que codificam as DNA e RNA polimerases - resposta negativa.

•Gemfibrozil (GM)

3 sondas > Chitinophaga pinensis – resposta negativa ao GM, que pode

indicar que este microrganismo pode ser inibido pelo gemfibrozil.

3 sondas > transporte e metabolismo lipídico (COG I) e uma relacionada com

regulação da síntese flagelar – resposta positiva.

Resultados

Resultados

•Eritromicina (ER)

1 sonda >guanosina tetrafosfato (ppGpp) sintetase – resposta

positiva.

Resposta mais positiva para a sonda ligada à proteína chaperona

DnaK (proteína de choque térmico 70).

Sondas potencialmente relacionadas com genes de resposta a

stress - respostas positivas ou negativa.

Sondas > producção e conversão de energia (COG C), transporte

de hidratos de carbono e metabolismo (COG G), e Haliangium

ochraeum – resposta negativa.

Sulfametazina (SN)

5 genes relacionados com producção e conversão de energia (COG

C) – resposta positiva.

2 sondas relacionadas a Hyphomonas neptunium – resposta negativa.

Vários genes relacionados com replicação, recombinação, e

reparação (COG L), tiveram respostas positivas ou negativas.

Resultados

Sondas mais reactivas aos tratamentos dos biofilmes de SSR

11 das 192 sondas que obtiveram os maiores valores em cada lado dos dois primeiros eixos (relativamente a SSR), estiveram também entre as 384 sondas de maior valor para os biofilmes de WC.

Entre estas 11 sondas, 3 tiveram equivalências significantes na base de dados

Resultados

Sulfametoxazol

Parede celular e

membrana

externa

Transdução de

sinal

Sondas de melhor resposta nos biofilmes WC

Gemfibrosil

Transporte e

metabolismo de

lipidos

Produção e

conversão de

energia

Eritromicina

Produção e

conversão de

energia

Sulfametazina

Resultados

Sondas de melhor resposta

11 das 192 sondas com os maiores valores em cada lado dos dois primeiros eixos dos biofilmesSSR também estavam entre as 384 sondas que tiveram os maiores valores para os biofilmes WC.

Resultados

qRT-PCR

concordante

com MicroarrayqRT-PCR

discordante do

Microarray

qRT-PCR

Resultados

Discussão

Hormese

ERITROMICINA

ppGpp sintetase Chaperona DnaK

Discussão

SULFONAMIDAS

Diminuição da expressão de genes relacionados à replicação e

transcrição (DNA e RNA polimerases)

SULFAMETOXAZOL

Aumento da expressão de genes relacionados à parede celular e

membrana externa

Formação de

biofilme

SULFAMETAZINA

Aumento da expressão de genes relacionados à produção e conversão

de energia.

Discussão

GEMFIBROSIL

Aumento da expressão de diversos genes relacionados ao metabolismo

lipídico, indicando que o GM possa afectar este processo em baixas

concentrações.

Regulador de síntese do flagelo Regulador de síntese do flagelo

DIMINUIÇÃO DOS NÍVEIS DE 16S rRNA

Todos os produtos farmacêuticos;

Diminuição da biomassa microbiana ou diminuição da atividade geral no biofilme.

Discussão

Das centenas de sondas analisadas que demonstraram uma resposta

mais forte aos tratamentos, 11 mostraram sobreposição entre os dois

rios.

Indicação que as pequenas moléculas testadas causam alterações

reproductiveis nas comunidades de biofilmes para ambos os rios.

Sondas serão de, ou genes similares de organismosdiferentes, ou de genes diferentes provindos deorganismos idênticos.

As diferenças entre respostas, das restantessondas, poderá ter sido causado não só pelo númerorelativamente pequeno de sondas, mas também pelodiferente estado nutricional dos biofilmes.

A exposição de comunidades bacterianas complexas a fármacos induz

respostas a nível da transcrição proteica que confirmam os estudos

anteriores, em particular no que diz respeito à eritromicina.

Conclusões

Quanto ao Gemfibrozil e às Sulfonamidas as respostas observadas, estão

de acordo com o conhecimento geral, pois não existem muitos estudos de

transcriptómica com estes fármacos.

O microarray foi usado com sucesso em biofilmes formados sob condições

nutriocionais diferentes daquelas a que lhe deram origem.

A partir deste poderá ser construido um microarray mais reduzido

contendo apenas as sondas mais relevantes.

Poderá ser uma forte contribuição para o desenvolvimento de um sistema

capaz de monitorizar os efeitos de diferentes fármacos nos ecossistemas

fluviais.

Os antibióticos sulfametoxazol e sulfametazina possuem estrutura e

mecanismo de acção quase idênticos; por que geraram expressão génica tão

diferente?

Se os produtos farmacêuticos não estavam em altas concentrações, o que

levou a grande diminuição da biomassa microbiana?

Questões para debater…

A utilização de apenas um tipo de amostra diferente da utilizada para

construção do microarray será suficiente para sua validação?

Quais as principais limitações, inerentes ao próprio método, e que não são

mencionadas?

Qual a principal contribuição deste estudo para análises de transcriptomas

ambientais?

REFERÊNCIAS

Yergeau E, Lawrence JR, Waiser MJ, Korber DR, Greer CW.

Metatranscriptomic Analysis of the Response of River Biofilms to

Pharmaceutical Products, Using Anonymous DNA Microarrays. Applied and

Enviromental Microbiology 2010; 76(16):5432–39.

Pariset L, Chillemi G, Bongiorni S, Spica VR, Valentini A. Microarrays and

high-throughput transcriptomic analysis in species with incomplete

availability of genomic sequences. New Biotechnology 2009; 25(5):272-79.

Linares JF, Gustafsson I, Baquero F, Martinez JL. Antibiotics as intermicrobial

signaling agents instead of weapons. Proceedings of the National Academy

of Sciences 2006; 103(51): 19484-89.

Davies J, Spiegelman GB, Yim G. The world of subinhibitory antibiotic

concentrations. Current Opinion in Microbiology 2006; 9:445–53.

Fajardo A, Martínez JL. Antibiotics as signals that trigger specific bacterial

responses. Current Opinion in Microbiology 2008; 11:161–67.

Lawrence JR, Swerhone GDW, Neu TR. A simple rotating annular reactor for

replicated biofilm studies. J. Microbiol. Methods 2000; 42:215– 24.

Sonenshein AL. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis.

Nature Reviews Microbiology 2007; 5:917-27 .