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Metatranscriptomic Analysis of the Response of
River Biofilms to Pharmaceutical
Products, Using Anonymous DNA Microarrays
Applied and Environmental Microbiology – Agosto 2010
ESCOLA SUPERIOR DE BIOTECNOLOGIA - UNIVERSIDADE CATÓLICA PORTUGUESA
MESTRADO EM MICROBIOLOGIA APLICADA
MICROBIOLOGIA MOLECULAR
Porto, 04 de Janeiro de 2011.
Ana Figueiredo
João Pereira
Leonardo Dantas
Introdução
A contaminação de efluentes de esgotos tratados, leva muitas vezes
productos de cuidado pessoal e fármacos cada vez mais utilizados a serem
disseminados no meio ambiente.
Razões do interesse nestes productos:
Muitas drogas interagem com alvos biológicos partilhados entre
humanos, outros animais e mesmo plantas e microrganismos;
Muitas actuam a concentrações relativamente baixas;
Fármacos necessitam de tempo para atingir o efeito desejado e
logo, são produzidos especificamente para resistir à degradação
dentro do corpo;
A taxa de adição ao meio excede a sua transformação ou degradação;
A sua exposição crónica tem vindo a ser associada ao desenvolvimento
de bactérias resistentes a antibióticos.
Os biofilmes tanto pelo seu efeito basal nas redes de comida aquática e a
sua importância em processos fundamentais como na biodegradação e
em ciclos bioquímicos, são candidatos ideais para a monitorização de
efeitos ecológicos de poluição por fármacos em ambientes aquáticos.
Anonymous DNA microarrays
Frequentemente utilizados para estudos transcriptómicos de
organismos cujo genoma ainda não foi sequenciado.
Anonymous DNA microarray poderá ser uma alternativa
interessante para análises metatranscriptómicas comparativas
pois não requer conhecimento prévio da genómica ambiental e
permite um grande número de amostras sem que seja
necessário o sequênciamento metatranscriptomico a cada
amostra a analisar.
Introdução
Objectivos do presente estudo:
Demonstrar a utilidade de anonymous microarrays em
estudos do metatranscriptoma em larga escala.
Identificar respostas transcripcionais de biofilmes fluviais
para doses ambientalmente relavantes de diferentes
tipos de productos farmacêuticos.
Introdução
Amostragem
Eritromicina (EL) 1µgL-1,
Clindamicina, Trimetroprim, Sulfametazina (SN)
0.5µgL-1,
Norfloxacina, Sulfametoxazol (SL) 0.5µgL-1,
Gemfibrozil (GM) 1µgL-1,
Nothing was added to the control reactors (CO).
•
•
1) Wascana Creek (WC)
Para a observação da resposta do biofilme
a cada um dos fármacos.
Misturas de Biofilmes de WC sujeitos a seis
tratamentos diferentes foram usados para a
construção do microarray (33 amostras).
2) South Saskatchewan River (SSR)
Biofilmes de SSR: Teste ao microarray.
Sonication
Total Genomic DNA
Genomic Fragments
(400-600bp)
Taq DNA polymerase
+
dATP
End repair (End-It kit)
UA Ligation
into
pDrive vector
Transformação de células
XL1-Blue
VersArray Colony Picker
(Bio-Rad)
Extracção de DNA
dos 9 600 clones
Amplificação
(primers para vector)
Verificação em gel
Quantificação de DNA por UV
6,351 “bons” (66.2%)
917 “fracos” (9.6%)
Construção da plataforma de microarray anónimo
VersArray Chip Writer Pro
Printer
(Bio-Rad)
48 sub-arrays impressos
em lâminas de vidro
revestidas de Aminosilano
O mRNA foi enriquecido, amplificado
para cDNA, e marcado com Cy3.
Usam-se primers aleatórios e uma forma mutada do
fragmento Klenow da DNA polimerase I, para a
incorporação de nucleotidos fluorescentes, Cy5.
Hibridização e análise do Microarray
250-500mg de Biofilme (amostra composta)Ácidos nucleicos
RNAse
50µL de DNA 50µL de RNA
DNAsemRNA
cDNA
Sequenciação e qRT-PCR
Após a análise estatística as sondas que obtiveram maiores valores para com o
primeiro e segundo eixo foram recuperadas dos clones usados para a construção do
microarrray e sequenciadas.
Para algumas das sondas identificadas como mais reactivas aos
tratamentos, construiram-se primers que foram usados em reacções de qRT-PCR, para a
verificação das tendências observadas no microarray.
Resultados
Padrões normalizados de hibridação foram usados com 2 propósitos:
(i) Providenciar a impressão do metatranscriptoma de cada amostra
(ii) Identificar as sondas mais fortemente ligadas com os tratamentos
experimentais.
fingerprint de alta definição da comunidade microbiana e para
identificar genes que fossem expressos mais diferenciadamente entre
tratamentos.
Resultados
Análise do microarray para Wascana Creek (WC)
As associações das
sondas, relativas aos
tratamentos, foram determinadas
positivamente ou negativamente
(por vezes ambas) baseando-se na
comparação da intensidade média
para um dado tratamento, com os
restantes.
Os 96 valores positivos e
negativos de maior valor para
cada eixo foram seleccionados
para sequenciação.
Fig 1a.
Resultados
Análise do microarray para South Saskatchewan River (SSR)
Fig 1b.
Este rio foi escolhido por diferir do WC
em um parâmetro ambiental importante
(por ex: disponibilidade de nutrientes ou
trofismo).
As posições relativas dos tratamentos
não foram exactamente as mesmas que
para WC, mas observou-se alguma
similaridade
Sondas mais reactivas aos tratamentos dos biofilmes de WC
•Sulfamethoxazole (SL)
sondas > parede celular e membrana externa (COG M)ou envolvidas na
transducção de sinal (COG T) - resposta positiva.
Sondas > genes que codificam as DNA e RNA polimerases - resposta negativa.
•Gemfibrozil (GM)
3 sondas > Chitinophaga pinensis – resposta negativa ao GM, que pode
indicar que este microrganismo pode ser inibido pelo gemfibrozil.
3 sondas > transporte e metabolismo lipídico (COG I) e uma relacionada com
regulação da síntese flagelar – resposta positiva.
Resultados
Resultados
•Eritromicina (ER)
1 sonda >guanosina tetrafosfato (ppGpp) sintetase – resposta
positiva.
Resposta mais positiva para a sonda ligada à proteína chaperona
DnaK (proteína de choque térmico 70).
Sondas potencialmente relacionadas com genes de resposta a
stress - respostas positivas ou negativa.
Sondas > producção e conversão de energia (COG C), transporte
de hidratos de carbono e metabolismo (COG G), e Haliangium
ochraeum – resposta negativa.
Sulfametazina (SN)
5 genes relacionados com producção e conversão de energia (COG
C) – resposta positiva.
2 sondas relacionadas a Hyphomonas neptunium – resposta negativa.
Vários genes relacionados com replicação, recombinação, e
reparação (COG L), tiveram respostas positivas ou negativas.
Resultados
Sondas mais reactivas aos tratamentos dos biofilmes de SSR
11 das 192 sondas que obtiveram os maiores valores em cada lado dos dois primeiros eixos (relativamente a SSR), estiveram também entre as 384 sondas de maior valor para os biofilmes de WC.
Entre estas 11 sondas, 3 tiveram equivalências significantes na base de dados
Resultados
Sulfametoxazol
Parede celular e
membrana
externa
Transdução de
sinal
Sondas de melhor resposta nos biofilmes WC
Gemfibrosil
Transporte e
metabolismo de
lipidos
Produção e
conversão de
energia
Eritromicina
Produção e
conversão de
energia
Sulfametazina
Resultados
Sondas de melhor resposta
11 das 192 sondas com os maiores valores em cada lado dos dois primeiros eixos dos biofilmesSSR também estavam entre as 384 sondas que tiveram os maiores valores para os biofilmes WC.
Resultados
qRT-PCR
concordante
com MicroarrayqRT-PCR
discordante do
Microarray
qRT-PCR
Resultados
Discussão
Hormese
ERITROMICINA
ppGpp sintetase Chaperona DnaK
Discussão
SULFONAMIDAS
Diminuição da expressão de genes relacionados à replicação e
transcrição (DNA e RNA polimerases)
SULFAMETOXAZOL
Aumento da expressão de genes relacionados à parede celular e
membrana externa
Formação de
biofilme
SULFAMETAZINA
Aumento da expressão de genes relacionados à produção e conversão
de energia.
Discussão
GEMFIBROSIL
Aumento da expressão de diversos genes relacionados ao metabolismo
lipídico, indicando que o GM possa afectar este processo em baixas
concentrações.
Regulador de síntese do flagelo Regulador de síntese do flagelo
DIMINUIÇÃO DOS NÍVEIS DE 16S rRNA
Todos os produtos farmacêuticos;
Diminuição da biomassa microbiana ou diminuição da atividade geral no biofilme.
Discussão
Das centenas de sondas analisadas que demonstraram uma resposta
mais forte aos tratamentos, 11 mostraram sobreposição entre os dois
rios.
Indicação que as pequenas moléculas testadas causam alterações
reproductiveis nas comunidades de biofilmes para ambos os rios.
Sondas serão de, ou genes similares de organismosdiferentes, ou de genes diferentes provindos deorganismos idênticos.
As diferenças entre respostas, das restantessondas, poderá ter sido causado não só pelo númerorelativamente pequeno de sondas, mas também pelodiferente estado nutricional dos biofilmes.
A exposição de comunidades bacterianas complexas a fármacos induz
respostas a nível da transcrição proteica que confirmam os estudos
anteriores, em particular no que diz respeito à eritromicina.
Conclusões
Quanto ao Gemfibrozil e às Sulfonamidas as respostas observadas, estão
de acordo com o conhecimento geral, pois não existem muitos estudos de
transcriptómica com estes fármacos.
O microarray foi usado com sucesso em biofilmes formados sob condições
nutriocionais diferentes daquelas a que lhe deram origem.
A partir deste poderá ser construido um microarray mais reduzido
contendo apenas as sondas mais relevantes.
Poderá ser uma forte contribuição para o desenvolvimento de um sistema
capaz de monitorizar os efeitos de diferentes fármacos nos ecossistemas
fluviais.
Os antibióticos sulfametoxazol e sulfametazina possuem estrutura e
mecanismo de acção quase idênticos; por que geraram expressão génica tão
diferente?
Se os produtos farmacêuticos não estavam em altas concentrações, o que
levou a grande diminuição da biomassa microbiana?
Questões para debater…
A utilização de apenas um tipo de amostra diferente da utilizada para
construção do microarray será suficiente para sua validação?
Quais as principais limitações, inerentes ao próprio método, e que não são
mencionadas?
Qual a principal contribuição deste estudo para análises de transcriptomas
ambientais?
REFERÊNCIAS
Yergeau E, Lawrence JR, Waiser MJ, Korber DR, Greer CW.
Metatranscriptomic Analysis of the Response of River Biofilms to
Pharmaceutical Products, Using Anonymous DNA Microarrays. Applied and
Enviromental Microbiology 2010; 76(16):5432–39.
Pariset L, Chillemi G, Bongiorni S, Spica VR, Valentini A. Microarrays and
high-throughput transcriptomic analysis in species with incomplete
availability of genomic sequences. New Biotechnology 2009; 25(5):272-79.
Linares JF, Gustafsson I, Baquero F, Martinez JL. Antibiotics as intermicrobial
signaling agents instead of weapons. Proceedings of the National Academy
of Sciences 2006; 103(51): 19484-89.
Davies J, Spiegelman GB, Yim G. The world of subinhibitory antibiotic
concentrations. Current Opinion in Microbiology 2006; 9:445–53.
Fajardo A, Martínez JL. Antibiotics as signals that trigger specific bacterial
responses. Current Opinion in Microbiology 2008; 11:161–67.
Lawrence JR, Swerhone GDW, Neu TR. A simple rotating annular reactor for
replicated biofilm studies. J. Microbiol. Methods 2000; 42:215– 24.
Sonenshein AL. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis.
Nature Reviews Microbiology 2007; 5:917-27 .
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