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1.Einleitung

Der menschliche Embryo stellt das Fortpflanzungsprodukt zweier histoinkompatibler

Individuen dar. Daher handelt es sich bei jeder Schwangerschaft um einen einzigartigen

Lebensabschnitt, in dem das Immunsystem der Mutter den zur Hälfte mit väterlichen

Fremdantigenen beladenen Embryo akzeptiert. Da hierbei das mütterliche Immunsystem in

direktem Kontakt mit den für sie fremden, paternalen Zellen steht, wurde die

Schwangerschaft lange Zeit mit einer „Allotransplantation“ verglichen [1].

Das maternale Immunsystem muss während der Schwangerschaft vielfältige Aufgaben

übernehmen: zum einen den Schutz der Mutter vor Infektionen. Zusätzlich ist auch das Kind

vor eindringenden Erregern zu schützen. Zum andern darf der Fetus vom maternalen

Immunsystem nicht als „fremd“ erkannt werden, damit eine Abstoßungsreaktion verhindert

und der Erhalt der Schwangerschaft gewährleistet werden kann. Diese Fähigkeit ist als

essentielle Voraussetzung für das Überleben des Fetus und somit für eine erfolgreiche

Schwangerschaft anzusehen. Deshalb findet sich während der Schwangerschaft eine

einzigartige, veränderte maternale Immunitätslage, woran insbesondere das adaptive

Immunsystem beteiligt ist [2].

Es stellt sich nun die Frage nach den regulatorischen Mechanismen, welche im Rahmen des

Schwangerschaftsgeschehens eingreifen und diese Veränderung der Immunitätslage der

Mutter bewirken.

Im frühen Stadium der Schwangerschaft kommt es zu multiplen morphologischen,

biochemischen und immunologischen Veränderungen im uterinen Milieu der Mutter, welche

die Implantation der Blastozyste in das Endometrium ermöglichen [3]. Dies erfordert eine

subtile Kommunikation und Interaktion zwischen Mutter und Embryo. Betrachtet man

zunächst den Hormonhaushalt der Mutter, so ist zu beobachten dass sich das Endokrinium

umstellt um die Gegebenheiten für den Embryo zu optimieren. Wichtig sind hierbei vor allem

die Hormone Humanes Choriongonadotropin, Östrogen und Progesteron, die im Folgenden

näher beschrieben werden:

1.1 Humanes Choriongonadotropin:

Das Humane Choriongonadotropin (beta-HCG) stellt ein in der Plazenta gebildetes

Gonadotropin dar, ein Hormon das denen des Hypophysenvorderlappen ähnelt. Beta-HCG ist

ein Glykoprotein mit einem Molekülgewicht von 38 kDa, bei dem eine ausgeprägte

Mikroheterogenität vorliegt. Es bindet an den selben Rezeptor wie das Luteinisierende

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Hormon (LH), weist allerdings eine erheblich höhere Affinität zu diesem Rezeptor auf und

wird wegen seiner LH-ähnlichen Wirkung auch als luteotropes Hormon bezeichnet. Es

zeichnet sich durch eine lange Halbwertszeit aus, die bei 96 Stunden liegt [4].

Beta-HCG wird von der menschlichen Blastozyste bereits während der Implantationsphase in

geringen Mengen gebildet [6, 57]. Nach Abschluss der Implantation wird das vom

Synzytiotrophoblasten gebildete beta-HCG in den maternalen Kreislauf abgegeben und kann

im Blut der Mutter ca. 6 Tage post ovulationem nachgewiesen werden. Maximale

Konzentrationen von beta-HCG liegen nach ungefähr 10 Schwangerschaftswochen vor, mit

Werten über 100000 IU/L. Danach fallen sie wieder ab auf einen Plateauwert von 10000-

20000 IU/L, der in der 16. SSW erreicht wird und bis zum Geburtstermin auf diesem

konstanten Niveau bestehen bleibt [5].

Die Hauptaufgabe des beta-HCG besteht darin den Fortbestand der Schwangerschaft zu

gewährleisten, was durch die Stimulation des Corpus luteum geschieht. Durch die Bindung an

den LH-Rezeptor induziert beta-HCG im Corpus luteum die Bildung der

Schwangerschaftshormone Progesteron und Estradiol. Dies wiederum bewirkt die Zunahme

der endometrialen Sekretion und des uterinen Wachstums um die Überlebensbedingungen für

den Embryo zu sichern.

Auch für den Fetus spielt Humanes Choriongonadotropin eine wichtige Rolle, da es die

fetalen Gonaden stimuliert. Beim männlichen Feten werden die Leydig-Zellen zur

Testosteronproduktion anregt, die Ovarien der weiblichen Feten werden zur Follikelreifung

bis hin zum Tertiärfollikel stimuliert [6].

1.2 Östrogen:

Östrogene sind Steroidhormone, die aus 18 Kohlenstoffatomen aufgebaut sind und sich durch

ihre Hydroxylgruppen unterscheiden. Beim Menschen unterscheidet man Östron, Östriol,

sowie die biologisch aktivste Substanz, das Östradiol. Sie entstehen aus Cholesterol, das via

17-alpha-Progesteron zu Progesteron, dann zu Androgen und schließlich zu Östrogen

umgewandelt wird. Der Abbau der Östrogene erfolgt in der Leber, die Ausscheidung über die

Nieren [7]. Bei der Frau werden die Östrogene vor allem in den Theka-interna-Zellen und den

Granulosazellen der Follikel, und im Stratum granulosum der Nebennierenrinde gebildet.

Während der Schwangerschaft wird Östrogen unter dem Einfluss von beta-HCG im 1.

Trimenon vom Corpus luteum, später von der Plazenta produziert. In der Menopause ist es

vor allem das Fettgewebe, das den Hauptproduktionsort für Östrogen darstellt.

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Während der Follikelphase steigt die Östrogenkonzentration bis auf 350 pg/ml an.

Postovulatorisch kommt es zum kurzfristigen Absinken der Konzentration, um etwa eine

Woche post ovulationem in der Lutealphase auf Werte bis zu 200 pg/ml anzusteigen. Gegen

Zykusende kommt es wieder zum Abzusinken der Östrogenkonzentration. Im Verlauf der

Schwangerschaft kommt es zu einem konstanten Ansteigen der Östrogenkonzentration, wobei

die Werte zum Zeitpunkt der Geburt mit bis zu 25 ng/ml etwa 1000 mal höher liegen als zum

Beginn der Schwangerschaft [5].

Östrogene haben vielfältige Wirkungen auf den weiblichen Körper, die über

Östrogenrezeptoren auf den Zielzellen vermittelt werden: Östrogene verleihen der Stimme

einen weichen Klang, Fördern das Wachstum und die Proliferation der Brustdrüse, dienen der

Entwicklung des subkutanen Fettgewebes und seiner Verteilung. Am Uterus bewirken sie den

zyklusabhängigen Aufbau der neuen Schleimhaut und fördern das Dickenwachstum des

Myometriums. An der Zervix öffnet sich präovulatorisch der Muttermund, die Menge und

Spinnbarkeit des Zervixsekretes nimmt zu und die Viskosität des Zervixschleims nimmt ab. In

der Vagina lassen die Östrogene das Epithel proliferieren und der Karyopyknoseindex steigt

an. In den Knochen werden die Osteoblasten aktiviert. Die sexualunspezifischen Wirkungen

lassen sich als allgemein protein-anabole zusammenfassen. Die Wasserretention unter

Östrogeneinfluss führt zu einer Ablagerung in Haut und Schleimhäuten, und durch die

Stimulation der Prolaktinsekretion kommt es zu einer gesteigerten Synthese der

Hormontransportproteine in der Leber [4].

1.3 Progesteron:

Progesteron ist der wichtigste Vertreter der Gestagene, welches Steroidhormone mit 21 C-

Atomen sind. Die Bildung von Progesteron erfolgt im Gelbkörper in den Granulosa- und

Theka-Luteinzellen, in der Plazenta und in geringer Menge auch in der Nebennierenrinde [4].

Die Progesteronkonzentration ist zyklusabhängig: in der Follikelphase findet sich ein

niedriger Progesteronspiegel mit einem Normwert <1ng/ml, der mit Beginn des

präovulatorischen LH- Anstiegs zunimmt. In der anschliessenden Lutealphase kommt es zu

einem konstant hohen Niveau der Progesteronkozentration >12 ng/ml. Mit Rückbildung des

Corpus-luteum fällt auch der Progesteronspiegel wieder ab, und der Zyklus beginnt von

neuem. Progesteron wird zu Pregnandiol abgebaut und als solches über die Nieren

ausgeschieden. Die Aufgaben von Progesteron sind die sekretorische Transformation des

Endometriums und die Glykogeneinlagerung in die Deziduazellen. An der Zervix führt es zu

einem postovulatorischen Verschluss des Muttermundes, zur verminderten Sekretion und

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Spinnbarkeit des Zervixschleims. Die Alveoli der Brustdrüse werden angeregt zur

Proliferations- und Sekretionsbereitschaft. Auf das Myometrium wirkt Progesteron

tonusmindernd. Die Körpertemperatur wird durch Progesteron um 0,5 °C erhöht.

Zusammenfassend dienen die Wirkungen des Progesterons der Vorbereitung, sowie dem

Schutz und Erhalt der Schwangerschaft, wobei die Wirkungen rezeptorvermittelt sind. In der

Schwangerschaft liegen die Normwerte von Progesteron im 1. Trimenon bei 10-50 ng/ml, im

2.Trimenon bei 20-130 ng/ml und bei 130-260 ng/ml im 3. Schwangerschafts-Trimenon [7].

1.4 Dexamethason:

Zusätzlich wurde in der vorliegenden Arbeit auch der Einfluss von Dexamethason untersucht,

welches als Glucocorticoid einen Vertreter der Steroidhormone darstellt.

Neben den physiologischen Wirkungen, die sich vor allem auf den Kohlenhydrat-, Fett- und

Proteinstoffwechsel beziehen, sollen hier ganz besonders die Wirkungen betrachtet werden,

die sich erst in höheren Dosen finden. Die katabole Wirkung auf das Blut- und Lymphsystem,

bei der es zu einer Lymphopenie im peripheren Blut kommt, welche auf eine

Umkompartimentierung der Lymphozyten zurückzuführen ist und vor allem die T-Zellen

betrifft. Die Zahl der Eosinophilen und Basophilen wird ebenfalls vermindert, jedoch nimmt

die Leukozytengesamtzahl durch Anstieg der Neutrophilen zu. Ausserdem kommt es unter

dem Einfluss von Dexamethason zu einer Thrombo- und Erythrozytose.

Die antiphlogistischen, immunsuppressiven und antiallergischen Wirkungen sind unspezifisch

und symptomatisch, d.h. sie sind nicht gegen eine bestimmte Noxe gerichtet, sondern es

werden die allgemeinen Reaktionen des Organismus gegen ein schädigendes Agens

unterdrückt [4]. Immunsuppressiv wirksam ist Dexamethason durch den Einfluss auf die

dendritischen Zellen. Es steigert die Produktion der antiinflammatorischen Cytokine und

unterdrückt die Produktion der cytotoxischen Cytokine, wie z.B. Interleukin-12, die eine Th-1

Immunantwort hervorrufen würden [8]. Zusätzlich inhibieren Glucocorticoide auch die

Reifung der dendritischen Zellen [9].

Glucocorticoide reduzieren die gesteigerte Gefäßpermeabilität und vermindern den Austritt

von Makrophagen und Leukozyten in das Gewebe, wodurch eine Ansammlung von

Entzündungszellen verhindert wird. Sie hemmen verschiedene Phospholipasen und die

Cyclooxygenase COX 2 und reduzieren so das entzündliche Geschehen.

Das Immunsystem beeinflussen die Glucocorticode durch eine Verminderung der T-

Lymphozytenzahlen. Sie hemmen die Phagozytosefähigkeit der Makrophagen und hindern

diese daran proinflammatorische Cytokine wie z.B. IL-1 oder TNF-alpha zu produzieren.

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Die Synthese der Glucocorticoide verläuft wie folgt: ausgehend vom Cholesterin entstehen

über Pregnenolon und Progesteron die Glucocorticoide. Sie werden in einem zirkadianen

Rhythmus ins Blut abgegeben mit einer maximalen Ausschüttung in den Morgenstunden.

Glucocorticoide diffundieren in die Zielzellen um dort an spezifische, zytoplasmatische

Rezeptoren zu binden. Dexamethason stellt im Bezug zu Cortisol das Glucocorticoid mit der

stärksten antiphlogistischen Wirkung dar und besitzt keinerlei mineralocorticoide Wirkung

[4].

Auch der Embryo ist in der Lage Hormone zu bilden um mit der Mutter in Kontakt zu treten

[10]. Die hormonale Interaktion zwischen Mutter und Kind ist von mütterlicher Seite aus

durch die Trophoblastenzellen der Plazenta gewährleistet, da diese in der Lage sind Hormone

zu produzieren, wie z.B. das beta-HCG in den ersten 12-14 Wochen der Schwangerschaft. Als

wichtige Vertreter dieser Hormone ist neben beta-HCG das GnRH zu nennen. Aber auch

Prostaglandin E2 und Plättchen- aktivierender Faktor sind neben vielen anderen Substanzen

wie Cytokinen, Interferon-gamma oder dem „early pregnancy-factor“ wichtige, von

kindlicher Seite ausgehende Kommunikationsmittel [3].

Diese Art der Signalübertragung zwischen Mutter und Kind ist ebenso faszinierend wie

effizient und Gegenstand aktueller Forschungen. In der vorliegenden Arbeit sind vor allem die

Hormone Progesteron, Östrogen, humanes Choriogonadotropin, sowie Dexamethason näher

betrachtet worden, da das Hauptaugenmerk im Verlauf der Schwangerschaft auf diesen

Hormonen liegt. Bei einer normal verlaufenden Schwangerschaft treten jedoch nicht nur

Hormonveränderungen auf, sondern auch das vorherrschende Cytokinprofil der Mutter ist

verschoben. So dominieren die Th2 Cytokine bei einer erfolgreichen Schwangerschaft,

während ein Th1 Cytokinprofil mit einer normalverlaufenden Schwangerschaft nicht zu

vereinbaren ist [11].

Unter Cytokinen versteht man humorale Stoffe, die der unspezifischen Immunität zugerechnet

werden und die als Botenstoffe besonders der Kommunikation zwischen dem spezifischen

und unspezifischen Immunsystem dienen [12]. Es ist eine heterogene Stoffgruppe mit

gemeinsamen Strukturprinzipien: so handelt es sich meist um kleine Proteine bzw.

Monomere, die glykolysiert sind und zu denen man Interferone, Interleukine und

Wachstumsfaktoren rechnet. Die Cytokine wirken nach dem pleiotropen Wirkprinzip, das

bedeutet dass je nach Zielzelle ein und dasselbe Cytokin unterschiedliche Wirkung

hervorrufen kann. Ausserdem können die Wirkungen in ein und der selben Zelle

unterschiedlich sein. Die Redundanz der Cytokine wird als das Phänomen bezeichnet,

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welches zu gleichen Wirkungen in Zielzellen durch unterschiedliche Cytokine führt. Auf

diese Art und Weise entsteht ein sehr komplexes Signalübermittlungssystem zwischen den

einzelnen Zellen des Immunsystems, dessen Klassifizierung zu Verwirrung geführt hat [13].

Die Einteilung erfolgt heute in Th1- und Th2 Cytokine, wobei das Th1-Profil während

immunologischer Aktivität beispielsweise bei Infekten vorrangig ist um eine cytotoxische

Immunantwort einzuleiten und den Körper auf diese Weise vor Erregern zu schützen.

Zur Gruppe der Th1 Cytokine gehören Interleukin (IL)-6, IL-18, IL-12, IFN-gamma und

TNF-alpha, während typische Vertreter der Th2-Klasse die Interleukine IL-4, IL-5 und IL-10

sind. Als Vertreter der Chemokine bezeichnet man IL-8 und MDC [14]. Im Folgenden soll

auf die einzelnen Cytokine näher eingegangen werden:

1.5 Interleukin-6:

Interleukin-6 (IL-6), ein Vertreter der proinflammatorischen Th1-Cytokine, wurde

ursprünglich definiert als B-Zell-stimulierender Faktor 2. Die Aufgabe der

proinflmmatorischen, also der entzündungsauslösenden Cytokine, ist es, durch Aktivierung

der körpereigenen Abwehr den Körper vor Erregern zu schützen. IL-6 wird hauptsächlich von

Monozyten, B-Zellen, T-Zellen, Endothelzellen, Fibroblasten und Keratinozyten produziert,

aber auch Tumorzellen, wie z.B. das Blasen- oder auch das Zervixkarzinom sind in der Lage,

IL-6 zu bilden. IL-6 ist ein essentieller Faktor für die finale B-Zell-Reifung zu antikörper-

produzierenden Plasmazellen und ist somit grundlegend für die gezielte körpereigene Abwehr

innerhalb des erworbenen Immunsystems. Es wirkt außerdem als Kofaktor bei der

Aktivierung von T-Zellen mit, und fördert zusammen mit IL-2 die Differenzierug der T-

Zellen in cytotoxische T-Zellen [15]. Diese spielen wiederum eine wichtige Rolle in der

Körperabwehr. Weiterhin ist IL-6 ein wichtiger Regulator der Akute-Phase-Reaktion, einem

Instrument der unspezifischen Abwehr, und stimuliert in diesem Zusammenhang die Synthese

und Freisetzung der Akute-Phase-Proteine wie z.B.: CRP, Fibrinogen oder Haptoglobin [15].

Auch auf die Hämatopoese hat das IL-6 vielfältige Wirkungen und kann somit auf die

Produktion der für das Immunsystem wichtigen Effektorzellen direkt einwirken. Es stimuliert

die hämatopoetischen Vorläuferzellen, steigert die Thrombozytopoese und fördert die

Ausreifung der Megakaryopoese. Im Tiermodel beschleunigt IL-6 die Erholung des

Knochenmarks nach cytotoxischer Behandlung und nach Knochenmarktransplantation [13].

Man kann somit das IL-6 als Stimulans für Zellwachstum und Zellreifung ansehen, was

jedoch nicht nur Vorteile mit sich bringt, denn auch bei pathologischen Prozessen ist das IL-6

von großer Wichtigkeit. Es kann als Wachstumsfaktor für verschiedene Tumorerkrankungen

gelten. In diesem Zusammenhang ist IL-6 mit Tumoren, wie dem maligen Myelom oder dem

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Endometriumkarzinom assoziiert, deren unkontrolliertes Wachstum unter dem Einfluss dieses

Cytokins steht [16].

Besonders hervorzuheben ist auch die antiinflmmatorische Potenz des IL-6, wodurch die

Komplexität der Interaktionen des humanen Immunsystems verdeutlicht werden kann. Durch

die Fähigkeit des IL-6 die Spiegel der inflammatorischen Cytokine TNF-a und IL-1 zu senken

wird per se eine antiinflammatorische Reaktion hervorgerufen und somit eine weitere

Kontrolle der Immunantwort möglich [15].

1.6 Interleukin -18:

Interleukin-18 (IL-18) ist ein Monomer, welches aus 157 Aminosäuren aufgebaut ist. Es wird

von zahlreichen Zellen, z.B. aktivierten Makrophagen, Kupferzellen, oder auch

von dendritischen Zellen produziert und reguliert die Immunantworten sowohl im

angeborenen, als auch im erworbenen Immunsystem. Erkannt wird das IL-18 vom IL-18

Rezeptor, durch den es seine Wirkungen in den Zellen vermitteln kann. Dieser Rezeptor ist

weit verbreitet und befindet sich auf der Oberfläche der verschiedenen Zellen der beiden

Untereinheiten des humanen Immunsystems. Aus diesem Grund kann das IL-18 als

Bindeglied zwischen den beiden Schenkeln des Immunsystems angesehen werden [4]. IL-18

moduliert die Aktivität von Th1- und Th2-Zellen, B-Zellen, Natürlichen-Killer-Zellen sowie

dendritischen Zellen und ist in der Lage, in Abhängigkeit vom umgebenden Cytokinprofil,

sowohl Typ1-, als auch Typ2-Immunantworten hervorzurufen. Dies ist zum einen wichtig in

der Abwehr von Infekten, bei denen durch Beeinflussung der Zellen in ihrer

Cytokinproduktion das Interleukin-18 cytotoxische Immunantworten hervorrufen kann [17].

Zum anderen ist es während der Schwangerschaft wichtig durch das Cytokinprofil eine

protektive Immunantwort zu erhalten, was durch die Präsenz von IL-18 in der

Amnionflüssigkeit gewährleistet zu sein scheint. Mit zunehmendem Alter der physiologischen

Schwangerschaft steigt IL-18 in seiner Konzentration an, jedoch können zu hohe IL-18

Spiegel im Schwangerschaftsverlauf zu Aborten führen [18].

Unter dem Einfluss des IL-18 kommt es zu einer Expressionssteigerung von TNF-alpha, IL-1

beta und IFN-gamma bei den T-Zellen und NK-Zellen, wodurch die cytotoxische

Immunantwort gefördert und die tolerogene Immunantwort unterdrückt wird. Weiterhin teilt

IL-18 die biologische Aktivität mit IL-12, um eine Th1-Antwort hervorzurufen [19]. Von

ganz besonderer Bedeutung ist der Einfluss des IL-18 auf die dendritischen Zellen. Diese

werden unter dem Einfluss von IL-18 befähigt T-Zellen zu aktivieren und haben somit eine

herausragende Rolle im immunologischen Geschehen [31].

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1.7 Interleukin-12:

Dieses ist ein cytotoxisches Interleukin (IL-12), welches eine Th1-Immunantwort hervorruft.

Es handelt sich um ein Heterodimer aus einer IL-12p70 und einer IL-12p40 Untereinheit und

wird auch als NK-Zell stimulierender Faktor bezeichnet. Produziert wird IL-12 vor allem von

B-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen. Seine Funktionen sind die Aktivierung von

natürlichen Killerzellen und es induziert die Differenzierung der T-Zellen zu Th1-Zellen.

Diese produzieren dann Interferon-gamma (IFN-gamma), wodurch eine cytotoxische

Immunantwort zustande kommt. IFN-gamma selbst wirkt wiederum als verstärkendes Agens

auf die Ausschüttung von IL-12 [20]. IL-12 entsteht bei Infektionen in der frühen Phase der

Immunreaktion und kann durch IL-10, sowie durch Fibroblasten in seiner Funktion blockiert

werden [21]. Induziert wird die Bildung von IL-12p70 durch die Interaktion von DC 40+

Zellen mit dem CD 40- Ligand auf den T-Zellen nach deren Aktivierung. Jedoch sind es vor

allem die unreifen dendritischen Zellen die von IL-12p70 aktiviert werden, auf reife DC hat

dieses Interleukin keinen Einfluss [22]. Mittels IL-12 ist es den DC möglich naive CD 40+ B-

Zellen und auch Gedächtnis-B-Zellen zu aktivieren und in Antikörper-produzierende

Plasmazellen umzuwandeln.

Im Rahmen einer Infektion produzieren unreife dendritische Zellen das IL-12 um auf diese

Weise chemotaktische Anreize für die Immunzellen zu liefern, um z.B. Makrophagen, T-

Zellen, oder NK-Zellen zum Ort des immunologischen Geschehens zu locken. Reife DC

hingegen benutzen IL-12 um die Differenzierung der T-Zellen in die Wege zu leiten [23]. So

könnte der Th2-Weg, der nicht cytotoxische Weg der Immunantwort als „Fehler“ des

Immunsystems betrachtet werden, der gewählt wird wenn kein IL-12 ausgeschüttet wird.

IL-12 könnte inhibitorische Effekte auf die Ausbildung von Th2-Zellen haben, aber es

aktiviert die Th1-Zellen und regt diese zur Bildung von IFN-gamma an. Auf die IL-4

Produktion hat das Interleukin-12 keine Effekte [24]. Interleukin-12 bildet ein wichtiges

Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort da es im Rahmen

einer Entzündung folgende Reaktionen hervorruft: in der frühen Phase wird es von NK-Zellen

und T-Zellen produziert und dann induziert es deren IFN-gamma Produktion. Außerdem ist

das IL-12 für den Wechsel zu Th1 verantwortlich und führt zur optimalen IFN-gamma

Produktion und Verteilung durch die Th1-Zellen als Antwort auf das angreifende Antigen.

1.8 Tumornekrosefaktor-alpha:

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Tumornekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha) zählt zu den klassischen Vertretern der Th1-Gruppe

der Cytokine und führt somit ebenfalls zu einer cytotoxischen Immunantwort. Es handelt sich

um ein nicht-glykolysiertes Molekül mit Disulfidbrücken und ist aus 157 Aminosäuren

aufgebaut. Die Bildung dieses Interleukins erfolgt vor allem in Neutrophilen, aktivierten

Lymphozyten, Makrophagen, NK-Zellen und dendritischen Zellen auf inflammatorische

Stimuli hin. Die Rezeptoren für TNF-alpha werden auf der Oberfläche einer Vielzahl von

Zellen exprimiert, wobei 2 Arten von TNF-alpha Rezeptoren existieren. Der 55 kDa Rezeptor

ist hierbei verantwortlich für die lytische Aktivität, der 75 kDa Rezeptor für die proliferativen

und regulatorischen Signale in Interaktion mit den T-Zellen [25].

Die biologischen Funktionen des Tumornekrosefaktors sind vielfältig: er stimuliert die

cytotoxische Aktivität von Neutrophilen und fördert deren Adhärenz and das Endothel. TNF-

alpha wirkt als endogenes Pyrogen, da es durch die Freisetzung von Prostaglandin E2 und

Interleukin-1 im Körper Fieber auslösen kann. Durch das Zusammenspiel mit IL-1, dessen

Ausschüttung in den Makrophagen und Monozyten durch TNF-alpha gefördert werden,

kommt es außerdem zu einem Aktivierungssignal für Makrophagen, die dadurch in ihrer

Aktivität noch gesteigert werden [26]. TNF-alpha ist ein wichtiges Interleukin für die

regelrechte Entwicklung des lymphatischen Gewebes. Es ist an der Regulation der B-Zellen

beteiligt, da es die B-Zellen zur Proliferation anregt und deren Differenzierung fördert.

Im hämatopoetischen System wirkt es inhibitorisch auf Progenitorzellen, stimuliert aber

gleichzeitig die Freisetzung von Wachstumsfaktoren. Es stimuliert die T-Zellen und induziert

die Expression von MHC-Molekülen und von Interleukinrezeptoren [27].

TNF-alpha steigert die Migration der DC und erhöht somit die Anzahl der Zellen in den

Lymphknoten. Es führt zur vermehrten Bildung von Chemotaktischen Interleukinen wie IL-8

und führt zu einer bis zu 100- fachen Steigerung der Antigenprästentation durch die DCs.

TNF-alpha stellt selbst einen wichtigen Reifungsfaktor für die dendritischen Zellen dar und ist

somit essentiell für den Lebenszyklus dieser Zellen und das Ausführen der Immunantwort des

Menschen [28].

1.9 Interleukin-10:

Das Interleukin-10 (IL-10), oder auch der Cytokinsythese Inhibitor Faktor, ist ein Homodimer

aus 160 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 18 kDa und zählt zu der Klasse der

Th2-Cytokine. Es wird von Makrophagen, DC und Th2-Zellen produziert und bewirkt durch

die Blockade von IL-12 im Makrophagen, dass diese Zellen die Th1-Zellen nicht aktiveren

können und es somit nicht zu einer cytotoxischen Immunantwort kommt. IL-10 gilt als

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wirksamster Inhibitor der Makrophagenfunktion und Gegenspieler des cytotoxischen IL-12

[29]. Es hemmt weiterhin die Synthese der cytotoxischen Interleukine gamma-Interferon und

TNF-alpha, die von den Th1-Zellen produziert werden. Auf Proteinebene hemmt Interleukin-

10 die Monokine IL-4, IL-6 und IL-8 und greift auf diese Weise regulatorisch in das

immunologische Geschehen ein, im Sinne einer toleranten Immunantwort. Hinzu kommt eine

Proliferationshemmung der T-Zellen, was der Cytotoxizität entgegensteht.

Auf die Th2-Zellen übt das IL-10 keinen Einfluss aus [30]. Autoregulativ ist IL-10 wirksam

indem es im Sinne einer negativen Rückkopplung die eigene Produktion reduziert, wodurch

eine Limitierung der toleranten Immunantwort gegeben ist und das Immunsystem wieder auf

neue Antigene reagieren kann. IL-10 hat keinen Einfluss auf die MHC-II –Expression der

dendritischen Zellen, oder deren Fähigkeit naive T-Zellen zu stimulieren. Es verhindert aber

die verstärkte Produktion von kostimulatorischen Molekülen in den DC. Und es inhibiert die

Induktion von proinflammatorischen Cytokinen [31].

IL-10 blockiert die Cytokinsynthese und wirkt somit als Suppressor der Effektorfunktionen

von Makrophagen, T-Zellen und NK-Zellen. Auf diese Weise reguliert es die Differenzierung

von B-Zellen, Mastzellen und Thymozyten. Für die B-Zellen wirkt IL-10 als Kostimulans für

deren Proliferation und es führt als Differenzierungsfaktor dazu, dass die B-Zellen Antikörper

produzieren. Während der Schwangerschaft ist IL-10 wichtig für deren Erhalt, da es die Th1-

Zellen davon abhält cytotoxische Cytokine zu produzieren, welche zu einem Abort führen

würden [32]. IL-10 ist ein multifunktionales Cytokin mit unterschiedlichen Wirkungen auf die

meisten hämatopetischen Zelltypen. Die Hauptfunktion zeigt sich in einer Unterdrückung der

inflammatorischen Reaktion durch herabregulieren der cytotoxischen Immunantwort.

1.10 Interleukin-8:

Interleukin-8 (IL-8) gehört zur Klasse der Chemokine, worunter man Cytokine versteht, die in

den ersten Phasen entzündlicher Reaktionen im Körper freigesetzt werden, um eine gerichtete

Chemotaxis zu induzieren. D.h. sie sind dafür zuständig die für die Entzündung wichtigen

Zellen an den Ort des Geschehens zu locken. IL-8 ist ein von Monozyten abstammendes

Peptid, das chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten wirkt und diese Zellen aktiviert. Die

Hauptproduzenten des IL-8 sind die dendritischen Zellen, daneben wird es aber auch von

Monozyten, Makrophagen, Fibroblasten und anderen Zellen produziert. Seine Synthese wird

durch TNF-alpha und IL-1 induziert [33].

IL-8 ist ein nicht-glykolysiertes Protein, das aus 72 Aminosäuren besteht und eine Molmasse

von 8 kDa hat. Es besitzt außerdem 4 Cysteinreste, die für seine biologische Aktivität wichtig

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sind und zur Einteilung in die CXC-Chemokine geführt haben. Die Funktionen von IL-8 sind

neben der Aktivierung von Granulozyten, die Bildung von Sauerstoffradikalen, Verstärkung

der Chemotaxis und Expression von Adhäsions-molekülen. Dies sind Reaktionen die vor

allem zu Beginn der entzündlichen Reaktion in Körper wichtig sind um eine gezielte Abwehr

zu ermöglichen [31].

1.11 Macrophage-derived chemokine:

Macrophage-derived chemokine (MDC) zählt zur Subklasse der CC Chemokine und wird von

Makrophagen und vor allem von dendritischen Zellen produziert. Sein genetischer Pool ist

bereits vollständig codiert und liegt auf Chromosom 16. Es wirkt dosisabhängig als potentes

Chemotaxin für DC und aktivierte NK-Zellen mit einem Wirkungsmaximum bei 1 ng/l [34].

Vor allem unreife dendritische Zellen werden von MDC schnell an den Ort der Entzündung

gelockt und sind dann sehr effizient in der Antigenaufnahme. Auf den Reifungsvorgang der

DC hat das MDC jedoch keinen Einfluss. Im Thymus hat MDC die Aufgabe die dendritischen

Zellen entweder anzulocken oder zurückzuhalten, um die T-Zell-Stimulation zu verstärken.

Chemotaktisch wirkt MCD ebenfalls auf T2-Zellen, die CD4+, bzw. CD8+ sind. MDC ruft

eine Typ II Immunantwort hervor, wobei entzündliche Reize zu einem erhöhten MDC-

Spiegel führen [35].

Während der Schwangerschaft ist ein Shift von Th1 in Richtung Th2 zu beobachten. Dieser

soll den Embryo vor Angriffen des mütterlichen Immunsystems schützen, da die Th1

Cytokine die Plazenta direkt, bzw. indirekt mittels Aktivieren von cytotoxischen Zellen,

schädigen können [36]. Im Zusammenhang mit der Cytokinproduktion und

Cytokinsignalverarbeitung von herausragender Bedeutung erscheinen die dendritischen Zellen

(DC), welche eine zentrale Rolle im menschlichen Immunsystem einnehmen. Da diese Zellen

in der Lage sind Cytokine zu produzieren und auf Cytokinsignale hin zu reagieren, können sie

direkt auf das immunologische Geschehen einwirken und die Immunantwort modulieren.

Diese Eigenschaft der DC, die Fähigkeit Cytokine zu produzieren, war der zentrale Punkt der

vorliegenden Arbeit, in der die Cytokinproduktion von unreifen dendritischen Zellen nach

Einwirken von schwangerschaftsassoziierten Hormonen gemessen wurde.

1.12 dendritische Zellen

Erstmals entdeckt 1973 von Steinman und Cohn in der Milz von Mäusen, wurden diese Zellen

nach ihrem charakteristischen Aussehen mit den vielen Ausläufern, den sogenannten

12

Dendriten, benannt [37]. Wenig später wurde erkannt dass diese Zellen dem gleichen

Zellsystem angehörten wie die schon vor Hundert Jahren von Langerhans entdeckten

Langerhans-Zellen in der Epidermis, welche dort eine wichtige Funktion im Sinne der lokalen

Erregerabwehr haben. Bald wurden die dendritischen Zellen auch in anderen Organen, sowohl

in lymphatischen, als auch in nicht-lymphatischen, nachgewiesen, und die Expression einer

Vielzahl von HLA-Antigenen legte nahe dass es sich bei den DC um spezialisierte,

antigenpräsentierende Zellen handelt, die eine zentrale Stellung im menschlichen

Immunsystem innehaben.

Diese hochspezialisierten Abkömmlinge von Leukozyten kommen in fast allen Geweben des

Körpers, und so auch im Uterus vor. Sie bilden ein Netz von Zellen aus, das Fremdmaterial

erkennen kann und für dessen Beseitigung sorgen soll. Auf diese Weise erfüllen die

dendritischen Zellen eine Art „Wächterfunktion“, da sie den Körper vor eindringenden

Erregern schützen und über die Integrität der körpereigenen Zellen wachen [38, 39, 40]. Sie

können Fremdmaterial, in der Regel Proteine, mit Hilfe der Phagozytose aufnehmen und

intrazellulär prozessieren, d.h. verarbeiten. Die so zerkleinerten Moleküle werden an HLA-

Moleküle gebunden und an die Zelloberfläche transportiert damit T-Lymphozyten das fremde

Material erkennen können. Während dieser Vorgänge liegen die DC noch in unreifer Form

vor. Wichtig ist weiterhin die Fähigkeit mit dem internalisierten Antigen zum Lymphknoten

zu wandern, zum Ort des immunologischen Geschehens mit Sitz der T-Lymphozyten. Auf

diesem Weg durchlaufen die DCs einen Reifungsprozess. Dieser wird durch Signale der

Antigene und Signale der aktivierten T-Zellen mittels CD 40-Ligand getriggert [41].

Im Lymphknoten findet nun die Aktivierung der naiven T-Zellen statt. Die dendritischen

Zellen zünden die Immunantwort und wirken als natürliches Adjuvans bei der T-Zell

Aktivierung. Sie gelten als stärkste natürliche T-Zell Stimulatoren, die in ihrer Wirksamkeit

alle anderen Antigen-Präsentierenden-Zellen um ein Vielfaches an Effizienz und Potenz

übertreffen [42]. Aufgrund dieser Erkenntnisse setzt man hohe Erwartungen in die

dendritischen Zellen, um diese im Sinn von Immunmodulatoren einsetzen zu können.

Denkbar wären beispielsweise der Einsatz bei der Therapie von Autoimmunerkrankungen, bei

Tumoren oder in der Transplantaionsmedizin.

Um die Kontrolle bei einer Immunantwort nicht zu verlieren und das Immunsystem nach

Beseitigung der Antigene wieder herunterzufahren, haben die dendritischen Zellen eine

Apoptosefunktion, d. h. sie können sich selbst ausschalten und so die Immunantwort des

Körpers beenden [43].

13

Funktionsprinzip von APC:

Antigenaufnahmeund VerarbeitungWanderung

undReifung

Im Lymhknoten:Aussuchen derpassenden T-Zellen

Aktivierung derpassenden T-Zellen

T-Zellen wandern insGewebe, bekämpfendie fremden Antigene

Unreife Wächterzellen

Abbildung1: Schematischer Lebenszyklus von dendritischen Zellen.

Unreife Wächterzellen nehmen fremde Antigene (orange Punkte) auf und werden aktiviert.

Während sie die Antigene verarbeiten, wandern sie über die Lymphgefäße in die

Lymphknoten. Hier „screenen“ sie die ruhenden T-Zellen, bis sie diejenigen finden, welche

das fremde Antigen erkennen (rote Zellen). Diese T-Zellen werden darauf hin zur Teilung

angeregt und aktiviert (große rote Zellen). Die im Lymphknoten aktivierten T-Zellen wandern

dann über das Blutgefäßsystem in das Gewebe mit den fremden Antigenen (z.B. infiziertes

Gewebe) ein, um die eingedrungenen Fremdstoffe und Organismen zu bekämpfen.

Seit es gelungen ist die dendritischen Zellen aus Monozyten der peripheren Blutes zu isolieren

und anzuzüchten, wurde noch mehr über die Wirkungsweise dieser einzigartigen

Zellpopulation erforscht. So konnte man viel über die Cytokinproduktion erfahren, die je nach

ihrer Art, zu einer Aktivierung der cytotoxischen T-Zellen führt oder eben keine solche

Antwort hervorruft. Von besonderer Wichtigkeit ist das umgebende Cytokinprofil wie bereits

erwähnt während der Schwangerschaft, da eine vorherrschende Th1- Immunität mit einer

erhöhten Abortrate assoziiert ist [44, 11].

Die Schwangerschaft hier als Model für Onkologie und Autoimmunität heranzuziehen

erscheint logisch: führen doch die Th2-Cytokine, die zum Großteil von den dendritischen

Zellen produziert werden, zum Erhalt der teils „fremden Zellmasse“ Embryo, d.h. es findet

trotz der paternalen Signale auf der Zelloberfläche keine cytotoxische Reaktion statt, sondern

14

das Immunsystem ist tolerant gegen den „Fremdling“. Bleibt die Frage offen was die

maternalen Immunzellen dazu veranlasst, diesem bestimmten, weil bei jeder

normalverlaufenden Schwangerschaft gleichen, Muster zu folgen.

Da jedoch nicht nur das Immunsystem, sondern auch der Hormonhaushalt der Mutter

während der Schwangerschaft charakteristische Veränderungen erfährt, drängte sich im

Rahmen der Grundlagenforschung die Frage auf inwieweit die maternale Hormonlage mit

dem Immunsystem interagiert und welcher Zusammenhang zwischen der Hormon- und der

Immunlage der Mutter während einer Schwangerschaft besteht. Es stellte sich die Frage ob

durch die hormonellen Veränderungen im Schwangerschaftsverlauf auch die Veränderungen

im Immunsystem der Mutter beeinflusst werden.

Und so war es das Ziel dieser Studie zu untersuchen, inwieweit die im Körper überall

verbreiteten unreifen dendritischen Zellen unter dem Einfluss von Hormonen während der

Schwangerschaft stehen. Ob der Schlüssel zur einziartigen Immunitätslage während der

Schwangerschaft in dem Zusammenspiel von DC und Schwangerschaftshormonen liegt. Und

die Frage zu beantworten ob die hormonelle Lage der Mutter Einwirkungen auf die

Cytokinproduktion der dendritischen Zellen hat, um eventuell mit Hilfe von

schwangerschaftsassoziierten Hormonen das Immunsystem modulieren zu können.

15

2. Material und Methoden

2.1 Material

Alle Prozentangaben zu Lösungen verstehen sich für Feststoffe als Gewichtsprozent, für

Flüssigkeiten als Volumenprozent.

2.1.1 Geräte

Zellkulturausstattung:

Sterilwerkbank SterilGARD® Class II TypA/B3

Brutschrank Incubator NAPCO 5420-1

Lichtmikroskop Leica DM IRB

Zählkammer Brand Neubauer-Zählkammer Tiefe 0,1mm Fläche 0,0025mm

Zentrifugen :

Hettich EBA 12

Hettich Universal 16R

Waagen:

Kern 510-33

Scaltec SAC 51

Ohaus LS 5000

Sonstige Geräte:

Biophotometer, Eppendorf

ELISA Reader MRX ,Dynex Technologies

Heizblock Techne Dri-Block® DB2A

Magnetrührer Variomag® Electronicrührer, Monotherm

PH-Meter Greisinger Electronic GPRT 1400A

Vortex MS1 Minishaker IKA®

Software:

CellQuest, Becton Dickinson

16

Excel, Microsoft

WinMDI, Joseph Trotter, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA

Winword, Microsoft

Statistica StatSoft

GraphpadPrism Prism

2.1.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterial

geordnet nach Herstellern

Verbrauchsmaterial:

American National Can™ Parafilm “M”

Brand Reaktionsgefäße, Zentrifugenröhrchen 15ml und 50ml,

Braun Original Perfusorspritze OPS 50ml

Costar Zellkulturplatten: Cell culture Cluster 24 well

Eppendorf Combitips, Pipettenspitzen, Plastikküvetten

Greiner Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße, Zentrifugenröhrchen,

Kryoröhrchen, Petrischalen Cellstar®

Hartmann Pehazell® Zellstoff

Nunc ELISA-Platten Nunc-Immuno™ Platte 96-well

TPP Petrischalen für Zellkultur 100*20mm

96-well- Zellkulturplatten für MLR

17

Chemikalien und Medienzusätze:

Biochrom PBS Dulbecco, Alsever Lösung, Zellkulturmedium RPMI1640,

Gentamycinsulfat, Penicillin/Streptomycin

Boehringer Neuraminidase

CAI Biochem Prostaglandin E2

Centeon Beriglobin

DAKO Ziegenserum (normal)

Endogen Merrettichperoxidase konjugiertes Streptavidin

Merck Zitronensäure ( Monohydrat)

Pharmingen Substrat Reagentien A und B (für ELISA)

ELISA-Sets: OptEIA™Set Human IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-

13, TNF-alpha

PAN Fetales Kälberserum (FCS)

Sandoz GM-CSF (Leukomax400®)

Serono beta-HCG Pregenesin

Sigma Histopaque–1077, EDTA, Tween20, 2-Mercaptoethanol,

Dexamethason (9a-Fluoro-16a-methylprednisolon), Ethanol,

Trypanblau-Lösung 0,4%, Rinder Serumalbumin, DMSO, 17β-

Estradiol (4-Pregnene-3,20-dione), KHCO3, NH4CL,

Dexamethason

Strathmann Zellkulturzusätze IL-4, IL-6, IL-1β, TNF-alpha

Antikörper:

BD Pharmingen Fluorescein isothiocyanat (FITC)-konjugierter anti-IgG1

Antikörper

FITC-konjugierter anti-human monoklonaler Anti-CD40

Antikörper

FITC-konjugierter anti-human monoklonaler Anti-HLA-DR

Antikörper

Coulter Immunotech Phycoerythrin (PE)-konjugierter antihumaner monoklonaler

Anti-CD83 Antikörper

Cymbus Biotechnology PE-konjugierter anti-IgG1 Antikörper

18

PE- konjugierter anti-human monoklonaler anti-HLA-DR

Antikörper

R&D Systems Beschichtungs- und Dedektions- Antikörper für MDC und IL-18

ELISA

2.1.3 Puffer und Lösungen

Soweit nicht anders angegeben wurde destilliertes Wasser als Lösungsmittel verwendet.

Medienzusätze (Stocklösungen):

Pen/Strep 10000 E/ml Penicillin + 10000µl/ml Streptomycin

Gentamycin 10mg/ml Gentamycinsulfat

GM-CSF 100 U/µl gelöst in RPMI 1640 mit Gentamycin (1:200) mit

0,1% B SA

IL-4 500 U/µl gelöst in PBS mit 0,1% BSA

IL-1β 1000 U/µl in RPMI 1640 mit Gentamycin (1:200) mit 10% FCS

IL-6 1000 U/µl in RPMI 1640 mit Gentamycin (1:200) mit 10% FCS

TNF-alpha 1000 U/µl in RPMI 1640 mit Gentamycin (1:200) mit 10% FCS

PGE2 PBS

Lösungen zur Zellisolierung:

PBS Aus Pulverkonzentrat angesetzt (9,55g gelöst in 1l Wasser)

Alsever Lösung unverdünnt eingesetzt

PBS mit Pen / Strep PBS mit Penicillin/Streptomycin (1:200)

PBS / Citrat 1 Volumenteil 0,106M Na-Citrat-Lösung mit 9 Teilen PBS

PBS / EDTA PBS mit 2mM EDTA

PBS mit Neuraminidase 0,01 U/ml

Lysepuffer für Schafserys 8M NH4Cl

Hormone (Stocklösungen):

Östrogen 5mg/ml gelöst in Ethanol (MW 272,4 g/mol)

Progesteron 5mg/ml gelöst in Ethanol (MW 314,5 g/mol)

19

beta-HCG 5000IE/ml gelöst in physiologischer NaCl-Lösung

Dexamethason 50mM gelöst in DMSO

ELISA:

Beschichtungs- Puffer für IL-6, IL-18 PBS, pH 7,4

Beschichtungs-Puffer für MDC PBS, pH 7,4

Beschichtungs-Puffer für IL-8 8,4g NaHCO3 + 3,56g Na2CO3 auf 1l H2O, pH

9,5

Beschichtungs-Puffer für IL-12p70 11,8g Na2HPO4 + NaH2PO4 auf 1l H2O, pH 9,0

Verdünnungsmittel für OptEIAsets PBS mit 10% FCS

Verdünnungsmittel für MDC PBS mit 1% BSA

Verdünnungsmittel für IL-18 20mM TBS (20mM Tris-Base, 150mM NaCl) mit

0,1% BSA und 0,05% Tween 20, pH 7,3

Verdünnungsmittel für IL-6 PBS mit 4% BSA, pH 7,2 – 7,4

Wasch-Puffer für IL-6 50mM Tris, 0,2% Tween-20, pH 7,9 – 8,1

Wasch-Puffer für IL-18, MDC PBS mit 0,05% Tween-20, pH 7,4

Wasch-Puffer für OptEIAsets PBS mit 0,05% Tween-20, pH 7,4

Substrat-Lösung Tetramethylbenzidine und Hydrogen Peroxid

gemischt im Verhältnis 1:1

Stop-Lösung 2M H2SO4

2.1.4 Zellen, Zellkulturmedien und Medienzusätze

Zellen:

dendritische Zellen isoliert aus Buffycoats von Blutspendern des

Blutspendedienstes des BRK, Institut Wiesentheid und

der Abteilung für Transfusionsmedizin des

Universitätsklinikums Würzburg.

Die Buffycoats wurden ca. 24h nach der Spende

verarbeitet.

T- Zellen isoliert aus Buffycoats (s.o.), in FCS/DMSO

eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert.

20

Schafserythrozyten isoliert aus Schafblut von Schafen aus den Tierställen des

Universitätsklinikums Würzburg. Das Schafblut wurde

ca. 2h nach Blutabnahme weiterverarbeitet.

Medien:

Differenzierungsmedium RPMI-1640 mit 10% FCS und Gentamycin (1:50µl/ml)

mit GM-CSF (1000 U/ml) und IL-4 (800 U/ml)

21

2.2 Methoden

2.2.1 Reinigung der Schaferythrozyten

Schaferythrozyten mit speziellen Oberflächeneigenschaften erlauben eine Rosettierung von T-

Zellen, die damit eine Isolation von T- Zellen aus einer Zell-Suspension ermöglicht.

Ausgegangen wird von einer Mischung aus 30ml frisch gewonnenem Schafblut, das zur

Gerinnungshemmung direkt bei der Blutabnahme mit 20ml Alseverlösung versetzt wird. Das

Schafblut wird in PBS gewaschen, bei 1100xg 10 min ohne Bremse zentrifugiert und durch

sorgfältiges Abnehmen des Überstandes vom Buffycoat, d.h. allen leukozytären Bestandteilen

des Blutes befreit. Anschließend erfolgt die Inkubation der Schafserythrozyten mit 0,005 U

Neuraminidase pro ml eingesetzten Schafblutes für 30 min bei 37°C. Nach drei weiteren

Waschschritten mit PBS mit Penicillin und Streptomycin wird das Pellet in 0,4 ml

RPMI1640/Genta/10% FCS pro ml eingesetztem Schafblut aufgenommen und bei 4°C im

Kühlschrank gelagert. Die gereinigten Schafserythrozyten können bis circa eine Woche nach

der Isolation verwendet werden. Eine Ausgangsmenge von 50ml Schafblut mit Alseverlösung

reicht für die Isolation von vier humanen Buffycoats.

2.2.2. Isolation dendritischer Zellen und Hormonansätze

Die Isolation dendritischer Zellen erfolgte weitgehend nach dem Standard- Protokoll von

Romani et al., 1996 [58].

2.2.2.1 Isolation von peripheral blood mononuclear cells (PBMC)

Die Isolation der PBMC erfolgte ausgehend von Buffycoats der Blutspendedienste, die

jeweils dem leukozytären Anteil von 500ml Vollblut entsprachen. Die Buffycoats wurden

steril geöffnet und nach Verdünnen mit PBS/Citrat auf Histopaque-Gradienten aufgetragen.

Pro Buffycoat wurden drei 50ml Röhrchen mit je 15ml vorgelegtem Histopaque mit dem

Leukozytengemisch beladen. Nach 30min Zentrifugation bei 400xg ohne Bremse bildeten

sich drei Phasen. In der obersten Phase befand sich das Plasma, welches abgenommen wurde

und nach Abzentrifugieren der Thrombozyten bei 3000g zur weiteren Verwendung kühl

gelagert werden konnte. In der mittleren weißlichen Phase befanden sich die PBMCs die

sorgfältig abgenommen und anschließend in PBS/Citrat gewaschen und 10 min bei 300xg

zentrifugiert wurden. Um die T-Zellen aus dem PBMC- Zell-Gemisch zu entfernen wurde das

PBMC- Pellet in 5ml der vorbehandelten Schafserythrozyten aufgenommen und bei 4°C eine

Stunde lang inkubiert. Die T-Zellen, die mit den Schafserythrozyten Rosetten-ähnliche

22

Vernetzungen bildeten, konnten nun über eine weitere Zentrifugation über einen Histopaque-

Gradienten abgetrennt werden: Die oberste Phase wurde verworfen, die mittlere weißliche

Phase die nunmehr Monozyten, Granulozyten und B-Zellen enthielt wurde vorsichtig

abgenommen und nach einem Waschschritt mit PBS/EDTA weiterverarbeitet. Die unterste

Phase enthielt das Erythrozyten- Pellet mit den T-Zellen, die zur T-Zell-Isolation verwendet

werden konnten. Um etwaige Schafblutspuren aus der Monozytenfraktion zu entfernen

wurden die Zellen kurz in 8M NH4Cl gespült, was zur Lyse der Erythrozyten führte, und

anschließend in PBS/EDTA gewaschen und gezählt.

Nach Bestimmung der Zellzahl wurde der Adhärenzschritt zur Entfernung nicht plastik-

adhärenter Zellen vorbereitet. Je 30 Millionen Zellen wurden in 10ml RPMI/Genta mit 2%

autologem Plasma in einer Petrischale 60min bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach Ablauf

der Inkubationszeit wurden die nicht-adhärenten Zellen abgenommen und die

Zellkulturschalen zweimal kräftig mit PBS/EDTA gewaschen. Die verbleibende adhärente

Zellfraktion wurde nun 7 Tage lang in 8ml Differenzierungsmedium pro Schale bei 37°C und

5% CO2 kultiviert. Medienwechsel erfolgten am Tag 3 und 5 der Kultur wobei jeweils nur die

Hälfte des Mediums durch frisches Medium mit IL-4 und GM-CSF ersetzt wurde.

2.2.2.2 Zugabe der Hormone

Für den Beginn der Stimulationsversuche wurden die DC gezählt und zu je 5x105 Zellen pro

well in 24well Platten umgesetzt. In jedem well wurden 500µl altes Medium mit 500µl

frischem Medium aufgefüllt. Von der jeweiligen Hormonverdünnung wurden je 20 µl

zugegeben, so dass die gewünschte Endkonzentration im jeweiligen Ansatz vorlag. Die

Hormonstimulationsansätze wurden weiter bis zum 10. Tag kultiviert, dann wurden die Zellen

abzentrifugiert (10min bei 250xg), die Überstände aliquotiert, in flüssigem Stickstoff

schockgefroren und bis zur Untersuchung im ELISA bei -80°C gelagert.

Progesteron und 17β-Östradiol wurden jeweils in den Konzentrationen 0,1ng/ml, 10ng/ml und

1000ng/ml getestet. Darüber hinaus wurden Versuche mit Kombinationen aus 0,1ng/ml,

10ng/ml und 1000ng/ml Progesteron mit 10ng/ml 17β-Östradiol durchgeführt.

Beta-HCG wurde in Konzentrationen von 10mU/ml, 50mU/ml und 250mU/ml getestet.

Zusätzlich wurden Kombinationen aus 0,1ng/ml, 10ng/ml und 1000ng/ml Progesteron mit

50mU/ml untersucht.

Dexamethason wurde in Verdünnungen von 10-10mol/l, 10-8mol/l und 10-6mol/l getestet, die

Kontrolle mit DMSO durchgeführt.

23

Da Progesteron und 17β-Östradiol in Ethanol gelöst wurden, musste der Einfluss des

Alkohols auf die Zellen untersucht werden. Hierfür wurden alle Experimente zusätzlich zu

den Hormonansätzen auch mit Lösemittelkontrollen durchgeführt, deren

Ethanolkonzentration den in den Hormonansätzen vorliegenden Ethanolanteilen entsprach.

2.2.3 Isolation der T-Zellen

Für die MLR mussten die T-Zellen isoliert werden. Die benötigten Zellen wurden aus den mit

den Schaferythrozyten rosettierten T-Zellen gewonnen, die bei der Monozytenisolierung

zurückblieben. Die Schafserythrozyten wurden hierfür mit NH4Cl-haltigem Lysepuffer

zerstört und die Zellen sofort in PBS gewaschen um die T-Zellen nicht zu schädigen. Nach

einem zweiten Waschschritt wurden die Zellen gezählt und in Aliquots zu je 20 mio. Zellen in

FCS/DMSO eingefroren.

2.2.4 Cytokin-ELISAs

Als erster Schritt der Untersuchung der Hormonwirkungen auf DCs wurde die

Cytokinproduktion der hormonstimulierten Zellen untersucht.

Die Cytokinmessungen erfolgten in Zellkulturüberständen, die am Tag 10 der Kultur

entnommen, aliquotiert und bei –80°C eingefroren wurden. Insgesamt wurden Überstände

von 20 gesunden Blutspendern gemessen, von denen 10 männlich und 10 weiblich waren.

Gemessen wurden die Cytokinspiegel von Interleukin-12(p70), da dies die funktionelle Form

des Cytokins darstellt, Interleukin-18, Interleukin-10, Tumornekrosefaktor-alpha, und

Interleukin-6, sowie die Chemokine Interleukin-8 und macrophage derived chemokine

(MDC). Verwendet wurden OptEIA ELISA-Sets von Pharmingen, die Antikörper für MDC

und IL-18 ELISA wurden von R&D Systems bezogen. Die ELISAs wurden nach den

Herstellerangaben etabliert und optimiert.

Vorgegangen wurde nach einem einheitlichen Schema:

Das Beschichten der Platten erfolgte am Abend vor dem Versuchstag: Für eine 96well- Platte

wurden 10 ml Beschichtungspuffer mit der entsprechenden Antikörpermenge gemischt und je

100µl der Lösung pro well aufgetragen. Die Beschichtungs-Antikörper der OptEIA Sets

wurden in einer Verdünnung von 1:250 zugesetzt, die Platten mit Folie zugeklebt und über

Nacht bei 4°C inkubiert. Für den IL-18 und MDC ELISA wurden die Antikörper in der

Konzentration 2µg/ml aufgetragen und die zugeklebten Platten bei Raumtemperatur stehen

24

gelassen. Nach Beendigung der Inkubation wurde die Beschichtungslösung entfernt und die

Platten dreimal mit Waschpuffer gewaschen und auf Zellstoff trockengeklopft. Anschließend

erfolgte das 60 minütige Blocken der Platte mit 200µl Blocking-Puffer pro well. Nach drei

Waschschritten wurden je 100µl der Standards und Proben aufgetragen.

Die Ermittlung der optimalen Standardreihe erfolgte in den Optimierungsversuchen und lag

im Bereich zwischen 2000pg/ml und 0pg/ml. Entsprechend mussten die Proben je nach

erwartetem Gehalt des jeweiligen Cytokins verdünnt werden. Nach 2h Inkubation und drei

anschließenden Waschschritten wurde der Detektions-Antikörper zugegeben: Im Fall der

OptEIA- Sets wurden 100µl Antikörper plus Streptavidin- horseradish peroxidase (HRP)-

Konjugat, beide jeweils in einer 1:250 Verdünnung, zugegeben und für eine Stunde inkubiert.

Bei den IL-18 und MDC- ELISAs erfolgte die Zugabe von Antikörper und HRP- Konjugat

getrennt: Zunächst wurde der Detektions- Antikörper aufgetragen, für die MDC- ELISAs in

einer Konzentration von 200 ng/ml, für die IL-18- Bestimmung in 250 ng/ml wobei hier die

Antikörperlösung 1 Stunde zuvor mit 2% hitze-inaktiviertem Ziegenserum versetzt werden

musste. Nach 2h Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Platte dreimal gewaschen und

anschließend 20 Minuten lang mit 100µl Streptavidin konjugierter Meerrettich- peroxidase

pro well versetzt. Die optimalen Verdünnungen für die Streptavidinlösung wurden in

Vorversuchen ermittelt und lagen bei 1: 12000 für den MDC und 1:8000 für den IL-18-

ELISA.

Um das Messergebnis sichtbar zu machen, wurde nun nach drei (bzw. sieben bei den OptEIA-

Sets) weiteren Waschschritten je 100µl Substrat zugegeben. Da das Substrat lichtempfindlich

ist, musste die nun erfolgende enzymatische Reaktion im Dunkeln stattfinden. Nach der

Unterbrechung der Reaktion, die nach 20 Minuten mit je 50µl Stoplösung durchgeführt

wurde, konnte bei 450nm die optische Dichte und damit die Cytokinmenge photometrisch

bestimmt werden.

Die erhaltenen Daten wurden für valide erachtet, wenn die photometrisch gemessenen Werte

mindestens 2 Standardabweichungen über dem Nullwert der Standardkurve lagen.

2.2.5 statistische Auswertung

Die gemesenen Daten wurden mit dem Shapiro- Wilkins-Test auf eine Normalverteilung

überprüft. Da die Messergebnisse keiner Normalverteilung entsprachen, musste die weitere

statistische Auswertung der Daten mit einem nicht- parametrischen Test für gepaarte Proben

erfolgen. Hierfür wurde der „two-tailed Wilkoxon matched pair log rank Test“ gewählt.

25

Werte mit p< 0.05 wurden als statistisch signifikant betrachtet und mit * gekennzeichnet,

Werte mit p< 0.01 wurden mit ** als hochsignifikant gekennzeichnet. Alle statistischen

Auswertungen wurden mit dem Statistikprogramm Statistica Version 5.1 durchgeführt.

26

3. Auswertung und Ergebnis

Die jeweiligen Cytokinkonzentrationen in den Überständen der Zellkulturen von unreifen

dendritischen Zellen (uDC), die von den uDC nach Zugabe der unterschiedlichen

Hormonkonzentrationen gebildet wurden, wurden mittels ELISA Technik bestimmt. Es

wurden hier folgende, von den DC typischerweise produzierte Cytokine analysiert: IL-6, IL-

10, IL-12p70, IL-18, die Chemokine IL-8 und MDC, sowie der Tumornekrosefaktor TNF-

alpha.

Aus der Gruppe der Th2-Cytokine wurde exemplarisch folgendes Mitglied analysiert:

3.1 Interleukin-10:

Dieses Interleukin der anitinflammatorischen Subklasse Th-2, wirkt auf das Immunsystem

indem es die Fähigkeit der DC hemmt, die cytotoxische CD4+-T-Zell-Antwort auszulösen.

Min-Max25%-75%Median

IL-10 unreife DC

Ver

ände

rung

des

Zyt

okin

spie

gels

(in%

)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

E2

0,1

E2

10

E2

1000

P 0

,1

P 1

0

P 1

000

BH

CG

10

BH

CG

50

BH

CG

250

P+E

0,1

P+E

10

P+E

100

0

P+H

0,1

P+H

10

P+H

100

0

DE

XA

10-1

0

DE

XA

10-8

DE

XA

10-6

**

*

*

*

Abbildung 2: Box- und Whisker Plots der ELISA-Ergebnisse der IL-10 Messung

Der Messbereich liegt bei IL-10 im Intervall von 16,24 bis 125,4 pg/ml und ist somit gut zu

verwerten, da es mit der Sensitivität des IL-10-ELISAs übereinstimmt. Diese liegt im Bereich

von 7,8 pg/ml bis 1000 pg/ml.

27

Unter dem Einfluss von Dexamethason kommt es sowohl in der höchsten, als auch in der

mittleren Konzentration zu einem signifikanten Anstieg des IL-10 Spiegels. Ebenso erzielen

die Hormone Östrogen und Progesteron verschiedene Wirkungen: so ist bei Östrogen eine

spiegelsenkende Tendenz zu erkennen, die sich in der höchsten Konzentration als statistisch

signifikant erweist. Progesteron steigert den IL-10 Spiegel der unreifen DC, vor allem in der

mittleren Konzentration. Die Kombination der beiden Hormone hat keinen statistisch

signifikanten Einfluss auf den IL-10 Spiegel. Bei beta-HCG scheint jedoch eine senkende

Tendenz erkennbar zu sein, die mit zunehmender Hormonkonzentration ansteigt. Der

Kombination aus beta-HCG und Progesteron gegenüber bleibt der von den unreifen DC

produzierte IL-10 Spiegel in allen drei Konzentrationen konstant.

Aus der Gruppe der Chemokine wurden folgende Vertreter analysiert:

3.2 Interleukin-8:

Das Interleukin-8 zählt zur Klasse der Chemokine und ist durch die gerichtete Chemotaxis

besonders wichtig für eine gerichtete cytotoxische Immunantwort.

Seine Konzentration wurde im Bereich von 11,6 pg/ml bis 301,1 pg/ml gemessen. Dieses

Ergebnis liegt vollständig im Rahmen des angewendeten ELISAs, der einen Messbereich von

3,1 pg/ml bis 200 pg/ml besitzt. Somit sind die ermittelten Daten gut verwertbar.

28

Min-Max25%-75%Median

IL-8 unreife DCÄ

nder

ung

des

Zyto

kins

pieg

els

(in%

)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

E2

0,1

E2

10

E2

1000

P 0

,1

P 1

0

P 1

000

P+E

2 0,

1

P+E

2 10

P+E

2 10

00

P+H

0,1

P+H

10

P+H

100

0

HC

G 1

0

HC

G 5

0

HC

G 2

50

DE

X 1

0-10

DE

X 1

0-8

DE

X 1

0-6

** **

Abbildung 3: Box- und Whisker Plots der ELISA-Ergebnisse der IL-8 Messung

Dexamethason senkt in der mittleren und höchsten Konzentration in hochsignifikanter Art

und Weise, den Cytokinspiegel von IL-8. Alle anderen Hormonzugaben lassen leider keine

eindeutig signifikanten Einflüsse auf die IL-8 Produktion der unreifen dendritischen Zellen

erkennen.

Jedoch sind einige Tendenzen durchaus ersichtlich, auch wenn diese nicht eindeutig mit

statistischer Signifikanz belegbar sind: Spiegelsteigerung bei der Kombination von

Progesteron und Östrogen; die grösste Senkung des IL-8 Spiegel findet bei jedem Hormon in

der jeweils mittleren Konzentration statt. Ebenso wäre eine Senkung des Il-8 Spiegels bei

beta- HCG in allen Konzentrationen denkbar.

3.3 Macrophage-derived chemokine:

MDC gehört zu der Klasse der Chemokine und wird durch die schwangerschaftsassoziierten

Hormone wie folgt in seiner Ausschüttung beeinflusst:

29

Min-Max25%-75%Median

MDC unreife DCV

erän

deru

ng d

es Z

ytok

insp

iege

ls (i

n %

)

20

60

100

140

180

220

E2

0,1

E2

10

E2

1000

P 0

,1

P 1

0

P 1

000

P+E

2 0,

1

P+E

2 10

P+E

2 10

00

P+H

0,1

P+H

10

P+H

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0

HC

G 1

0

HC

G 5

0

HC

G 2

50

DE

X 1

0-10

DE

X 1

0-8

DE

X 1

0-6

*

Abbildung 4: Box- und Whisker Plots der ELISA-Ergebnisse der MDC Messung

Die gemessenen Werte des Chemokins MDC liegen alle zwischen 68,8 pg/ml und 447,7

pg/ml. Sie sind daher gut zu verwerten, da sie alle im Sensitivitätsbereich des MDC-ELISAs

liegen, der zwischen 15,6 pg/ml und 1000 pg/ml angegeben ist.

Der Cytokinspiegel von MDC zeigt unter dem Hormoneinfluss auf die unreifen dendritischen

Zellen eine auffällige Konstanz; d.h. die hier verwendeten Hormone üben nur wenig Einfluss

auf die MDC-Produktion der DC aus. Lediglich die Kombination von Progesteron und

Östrogen zeigt in der geringsten Konzentration einen signifikanten Einfluss im Sinne einer

leichten Steigerung, aber auch die mittlere und die höchste Konzentration haben die Tendenz

die DC in ihrer MDC-Produktion anzuregen. Gegenteilig verhält es sich bei den Steroiden:

Dexamethason zeigt in jeder Konzentration eine tendenzielle Senkung des MDC-Spiegels.

Die restlichen Hormone verhalten sich weder senkend, noch steigernd auf die Konzentration

von MDC.

30

Aus der Gruppe der cytotoxischen Th1-Cytokine wurden folgende Vertreter analysiert:

3.4 Interleukin-18:

Interleuin-18 zählt zu den cytotoxischen Interleukinen der Klasse Th1 und ruft als

sogenannter Interferon-gamma induzierender Faktor, die inflammatorische Immunantwort

hervor.

Min-Max25%-75%Median

IL-18 unreife DC

Ver

ände

rung

en d

es Z

ytok

insp

iege

ls (i

n%)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

E2

0,1

E2

10

E2

1000

P 0

,1

P 1

0

P 1

000

P+E

2 0,

1

P+E

2 10

P+E

2 10

00

P+H

0,1

P+H

10

P+H

100

0

HC

G 1

0

HC

G 5

0

HC

G 2

50

DE

X 1

0-10

DE

X 1

0-8

DE

X 1

0-6

**

*

Abbildung 4: Box- und Whisker Plots der ELISA-Ergebnisse der IL-18 Messung

Die Konzentrationen des Cytokins IL-18 lagen zwischen 15,94 pg/ml und 816,08 pg/ml. Sie

entsprechen somit dem Sensitivitätsbereich des IL-18 ELISAs, der zwischen 31,2 pg/ml und

4000 pg/ml liegt, und sind vollständig auswertbar.

Unter dem Einfluss der Hormonkonzentrationen ändert sich der von den dendritischen Zellen

sezernierte Cytokinspiegel von IL-18 wie folgt:

Progesteron steigert in der mittleren Konzentration den IL-18 Spiegel, senkt diesen jedoch in

Kombination mit Östrogen. Ebenfalls im Sinn einer Herabregulierung wirkt Dexamethason,

welches in der mittleren Konzentration den IL-18 Spiegel senkt. Bei beta-HCG zeigen sich

zwar keine statistisch signifikanten Ergebnisse, jedoch könnte man von einer Tendenz im

Sinne einer Steigerung der IL-18 Produktion von DC sprechen, da der Spiegel in allen drei

Konzentrationen ansteigt. Östrogen, sowie die Kombination aus Progesteron und beta-HCG,

31

zeigen ein ausgeglichenes Bild, so dass davon auszugehen ist, dass diese beiden Hormone ohne

Einfluss auf die IL-18-Produktion von dendritischen Zellen bleiben.

3.5 Interleukin-6:

Folgender Einfluss der schwangerschaftsassoziierten Hormone konnte auf die IL-6

Produktion von dendritischen Zellen herausgefunden werden:

Min-Max25%-75%Median

IL-6 unreife DC

Ver

ände

rung

en d

es Z

ytok

insp

iege

ls (i

n%)

0

20

40

60

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120

140

160

180

200

220

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0,1

E2

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P 0

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P 1

0

P 1

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P+E

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P+E

2 10

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0,1

P+H

10

P+H

100

0

HC

G 1

0

HC

G 5

0

HC

G 2

50

DE

X 1

0-10

DE

X 1

0-8

DE

X 1

0-6

*

*

*

*

Abbildung 5: Box- und Whisker Plots der ELISA-Ergebnisse der IL-6 Messung

Mit ermittelten Messwerten von 15,7 pg/ml bis 153,5 pg/ml liegt der IL-6 Spiegel im

Sensitivitätsbereich des IL-6 ELISAs. Dieser liegt zwischen 15 pg/ml und 1000 pg/ml. Die

Messergebnisse sind somit auswertbar. Progesteron steigert in der geringsten Konzentration

den IL-6-Spiegel von unreifen dendritischen Zellen. Die gleiche Tendenz lässt sich ebenfalls

für Östrogen feststellen, auch wenn der statistische Beweis nicht gegeben ist. Senkend auf die

IL-6 Produktion wirken sich in den höchsten Konzentrationen Dexamethason und beta-HCG

aus. Östrogen, die Kombination Östrogen mit Progesteron und beta-HCG folgen dem gleichen

Schema was die Beeinflussung des Cytokinspiegels im Zusammenhang mit der

Hormonkonzentration angeht: die niedrigsten Konzentrationen steigern die IL-6 Produktion

der unreifen DC am meisten.

32

3.6 Tumornekrosefaktor-alpha:

Ein klassisches cytotoxisches Th1-Cytokin, mit folgenden Auswirkungen der Hormone auf

die Produktion durch unreife dendritischen Zellen:

Min-Max25%-75%Median

TNFa unreife DC

Ver

ände

rung

en d

es Z

ytok

insp

iege

ls (i

n %

)

20

60

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0,1

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10

E2

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P 1

0

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CG

10

BH

CG

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CG

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0,1

P+E

10

P+E

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0

P+H

0,1

P+H

10

P+H

100

0

DE

XA

10-1

0

DE

XA

10-8

DE

XA

10-6

*

* *

Abbildung 6: Box- und Whisker Plots der ELISA-Ergebnisse der TNF-alpha Messung

Auch sämtliche Messwerte des Cytokins TNF-alpha liegen mit 87,3 pg/ml bis 413,7 pg/ml im

Sensitivitätsbereich des TNF-alpha-ELISAs, welcher Werte zwischen 7,8 pg/ml und 500

pg/ml erfasst. Sie sind somit aussagekräftig und komplett zu verwerten.

In der mittleren Konzentration steigert sich unter dem Einfluss von Progesteron der

Cytokinspiegel. Der gleiche Effekt ist tendenziell auch bei Östrogen zu beobachten. Beta-

HCG senkt die TNF-alpha Konzentration sowohl in der mittleren als auch in der höchsten

Konzentration. Dexamethason hat ebenfalls einen senkenden Effekt auf die TNF-alpha

Produktion von dendritischen Zellen, jedoch ist dies leider nicht statistisch belegt. Die

Hormonkombinationen Progesteron und Östrogen, sowie Progesteron und beta-HCG, üben

auf die TNF-alpha Produktion keine eindeutig statistisch belegbaren Einflüsse aus.

3.7 Interleukin-12p70:

33

Interleukin-12p70 zählt zu den proinflammatorischen Th1-Interleukinen. Seine Produktion

durch unreife dendritische Zellen, die unter dem Einfluss von schwangerschaftsassoziierten

Hormonen stehen, lässt sich leider nicht graphisch darstellen, da die ermittelten Messwerte

zwischen 2,8 pg/ml und 8,4 pg/ ml lagen. Diese Werte liegen ausserhalb des

Sensitivitätsbereiches für den IL-12-ELISA, der von 7,8 pg/ml bis 1000 pg /ml festgelegt ist.

Aufgrund dessen können die ermittelten Messergebnisse leider nicht ausgewertet werden .

3.8 Gesamtauswertung:

Insgesamt gesehen bleiben die von den dendritischen Zellen produzierten Cytokinspiegel

unter dem Einfluss von unterschiedlichen schwangerschaftsassoziierten Hormonen in

verschiedenen Konzentrationen und in unterschiedlichen Kombinationen, bemerkenswert

stabil.

Es lassen sich auch nur wenig statistisch signifikanten Ergebnisse darstellen, so dass davon

ausgegangen werden muss, dass es nicht die während der Schwangerschaft vorherrschende

Hormonlage ist, die Einfluss auf die dendritischen Zellen nimmt. Das heißt es werden die DC

nicht durch die Hormone angeregt um das Immunsystem des Menschen in der Art und Weise

zu beeinflussen, dass die Toleranz des „allogenen Transplantats“ Embryo gewährleistet ist.

34

4. Diskussion

Die Schwangerschaft stellt im Leben des Menschen einen immunologischen Balanceakt dar.

Das mütterliche Immunsystem muss tolerant sein gegenüber väterlichen Fremdantigenen auf

der Zelloberfläche des Embryos, und trotzdem muss es kompetent in der Erregerabwehr

bleiben.

Da die Plazenta während der Schwangerschaft keine unüberwindbare Barriere für kindliche

Zellen in den mütterlichen Organismus darstellt, kommt es zum Übertritt von Zellen in den

Kreislauf der Mutter. Das Ausbleiben von Angriffen gegen diese Zellen macht die

Veränderung im Immunsystem während der Zeit der Schwangerschaft deutlich und noch

immer sind diese Veränderungen, denen das menschliche Immunsystem während einer

Schwangerschaft unterliegt, wenig verstanden. Doch wie hängen die Schwangerschaft und

das Immunsystem zusammen, und wer ermöglicht diese einzigartige immunologische

Ausnahmesituation?

Die dendritischen Zellen gelten als zentrale Zellen im menschlichen Immunsystem. Sie

vermitteln zwischen dem angeborenen und adaptiven System und haben somit entscheidenden

Anteil an der Immunantwort, sei sie cytotoxisch oder toleranzauslösend. In der vorliegenden

Arbeit wurde nach dem Zusammenhang zwischen Immunsystem und Schwangerschaft

gesucht, um einen Erklärungsansatz zu finden, warum der Embryo vom maternalen

Immunsystem in der normal verlaufenden Schwangerschaft akzeptiert wird.

Bei jeder Schwangerschaft ändert sich der Hormonhaushalt der Mutter um einerseits den

Körper auf die Einnistung der befruchteten Eizelle vorzubereiten und optimale Bedingungen

für die Entwicklung des Kindes zu schaffen, und um andererseits auf diese Weise eine

Möglichkeit der Kommunikation zwischen Mutter und Kind zu ermöglichen. Es scheint daher

logisch, das Augenmerk darauf zu richten, welche Wirkung die maternale Hormonlage

während einer Schwangerschaft auf das Immunsystem ausübt.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von schwangerschaftsassoziierten Hormonen

auf die Cytokinproduktion unreifer dendritischer Zellen untersucht, weil das Cytokinprofil,

welches während der Schwangerschaft vorherrscht, entscheidend sein kann für den Erhalt,

bzw. den Verlust des Embryos [11].

Die unreifen dendritischen Zellen wurden hierbei aus menschlichen Blutspendeüberresten

angezüchtet und nach Anzucht und Kultur mit verschiedenen schwangerschaftsassoziierten

Hormonen in unterschiedlichen Konzentrationen versetzt. Um die immunologischen

Vorgänge im Rahmen einer Schwangerschaft zu untersuchen, wurden die in der

35

Schwangerschaft wichtigen Hormone Östrogen, Progesteron, beta- HCG und das

Corticosteroid Dexamethason eingesetzt. Dann wurden mittels ELISA-Technik die von den

unreifen dendritischen Zellen produzierten Cytokinspiegel gemessen, welche unter dem

Einfluss der Hormone entstanden sind. Dies erlaubt eine Aussage darüber, ob die unreifen

dendritischen Zellen, durch die maternale Hormonlage während der Schwangerschaft

beeinflusst werden ein bestimmtes Cytokinprofil hervorzubringen und dadurch

schwangerschaftsprotektiv, bzw. abortiv wirksam sein können.

4.1 Östrogene:

Östrogene wurden in drei unterschiedlichen Konzentrationen zu den unreifen dendritischen

Zellen gegeben: 0,1 ng/ml als physiologische Konzentration wie es im Zyklus der

Nichtschwangeren im Körper im Serum vorliegt; 10 ng/ml als Konzentration, die die

Schwangerschaft simulieren sollte und während der Schwangerschaft so vor allem im zweiten

Trimenon im Serum vorkommt; und mit 1000 ng/ml als supraphysiologische Konzentration,

wie sie im Körper normalerweise nicht vorkommt und Situationen maximaler

Östrogenausschüttung nachahmen sollte, wie es beispielsweise bei hormonproduzierenden

Tumoren oder bei einer Hormonbehandlung der Fall sein kann.

Die Cytokinproduktion von unreifen dendritischen Zellen wird durch Östrogen kaum

beeinflusst. Vor allem sind wenige statistisch signifikante Effekte zu verifizieren. Einzig auf

das Th2-Interleukin IL-10 zeigt Östrogen in der supraphysiologischen Konzentration von

1000 mg/ml eine signifikante Senkung. Da in den beiden anderen Konzentrationen jedoch

kein Effekt zu sehen ist, ist davon auszugehen, dass Östrogen die IL-10 Produktion in

physiologischen Situationen nicht beeinflusst. Es führt also nicht zu einem

schwangerschaftsprotektiven Cytokinprofil.

Betrachtet man nun die Th1-Cytokine TNF-alpha, IL-6, und Il-18, stellt man fest, dass auch

die Th1-Cytokin-Produktion der unreifen dendritischen Zellen nicht unter dem Einfluss von

Östrogen steht, da hier keine Effekte im Sinne einer Senkung oder Steigerung nachgewiesen

werden konnten. Ebenso verhält es sich mit dem Einfluss von Östrogen auf die Chemokine

MDC und Interleukin-8. Auch diese bleiben unbeeinflusst von Östrogen.

So kann man zusammenfassend sagen, dass das schwangerschaftsassoziierte Hormon

Östrogen keinen Einfluss, weder einen steigernden, noch einen hemmenden, auf die

Cytokinproduktion von humanen dendritischen Zellen hat. Es lässt sich somit keiner eindeutig

schwangerschaftsprotektiven Funktion zuordnen, was den Erhalt des Embryos aufgrund

immunologischer Akzeptanz von paternalen Fremdantigenen angeht.

36

Früheren Studien zufolgen befinden sich auf den unreifen dendritischen Zellen viele

Rezeptoren für Östrogene, durch welche unterschiedliche Effekte in den DC erzielt werden

können [45]. So inhibiert Östrogen die Antigenpräsentation der unreifen dendritischen Zellen.

Außerdem senkt Östrogen die Fähigkeit der DC naive T-Zellen zu induzieren. Auf die

Cytokine hat Östrogen folgende Wirkungen: es zeigten sich keine Effekte auf das Th2-

Cytokin IL-10, was auch dem Ergebnis der vorliegenden Arbeit entspricht. Man kann

demzufolge davon ausgehen dass die bei einer normalen Schwangerschaft erhöht gefundenen

Th2-Cytokinspiegel nicht als Folge des erhöhten Östrogenspiegels der Mutter auf dendritische

Zellen anzusehen sind.

Die Spiegel der Th1-Cytokine TNF-alpha und IL-12 fanden Liu et al. unter dem Einfluss von

Östrogenen gesenkt. Dies steht im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit, da sich hier durch

Östrogeneinfluss kein statistisch signifikanter Effekt auf die Th1-Cytokine nachweisen lies.

Die Studienlage ist jedoch kontrovers. So konnte in anderen Studien belegt werden dass

Östrogene die Antigenpräsentation der dendritischen Zellen, und deren Migrationsfähigkeit

supprimieren und es unter dem Einfluss von Östrogen zu einer Th2-Immunantwort kommt,

Östrogene also antiinflammatorische Wirksamkeit besitzen [46]. Dies steht wiederum im

Gegensatz zu anderen Studien, in denen unter dem Einfluss von Östrogen eine eindeutig

cytotoxische Th1-Immunantwort bewiesen wurde [47].

37

4.2 Progesteron:

Progesteron wurde ebenfalls in drei unterschiedlichen Konzentrationen zu den unreifen

dendritischen Zellen gegeben: 0,1 ng/ml, die physiologische Konzentration, die sich im

Zyklusgeschehen in der follikulären Phase widerspiegelt; 10 ng/ml, was einer

Schwangerschaft entsprechen sollte, und 1000 ng/ml, welches die supraphysiologische

Konzentration darstellt, wie sie eventuell bei hormonproduzierenden Tumoren auftreten

könnte.

Von allen schwangerschaftsassoziierten Hormonen zeigte Progesteron die deutlichsten

Effekte auf die Cytokinprduktion unreifer DC, so dass dieses Hormon eine Schlüsselstellung

einzunehmen scheint. Folgende Einflüsse auf die Cytokinproduktion der unreifen

dendritischen Zellen konnten für Progesteron gezeigt werden:

In der mittleren Konzentration, d.h. mit dem physiologischen Progesteronspiegel der

Schwangerschaft, beeinflusst Progesteron alle gemessenen Cytokinspiegel der DC in

statistisch signifikanter Art und Weise. Es führt zu einer Steigerung sowohl der Konzentration

der Th1-, als auch der Th2-Cytokine. Das bedeutet dass Progesteron die unreifen

dendritischen Zellen zu einer gesteigerten Cytokinproduktion anregen kann. Allein die

Chemokine bleiben in ihrer Produktion unbeeinflusst. Es ist erwiesen dass Progesteron mit

Glucocorticoidrezeptoren kreuzreagiert und deshalb ähnliche antiinflammatorische

Wirkungen hervorruft [48]. Daher ist es kontrovers zu betrachten das Progesteron die

Produktion der inflammatorischen Cytokine in gleicher Weise steigert wie die Produktion der

anti-inflammatorischen Th2- Cytokine. Dass Progesteron eine Th2-Immunantwort fördert und

somit auch auf immunologischem Weg schwangerschaftsprotektiv wirksam ist, ist durch

Studien belegt [49]. Gleichzeitig wurde in diesen Studien auch herausgefunden dass

Progesteron durch direkte Interaktion mit den T-Zellen die cytotoxische Th1-Immunantwort

unterdrückt.

Die jeweils niedrigsten und die höchsten Progesteronkonzentrationen hatten keinen

signifikanten Einfluss auf die Cytokinproduktion. Dies könnte dadurch erklärt werden, dass

eine Einflussnahme von Progesteron auf die dendritischen Zellen am deutlichsten während

der Schwangerschaft stattfindet, jedoch in den anderen Phasen, während des normalen Zyklus

oder im supraphysiologischen Bereich, die dendritischen Zellen nicht vom Progesteron

beeinflusst werden.

38

4.3 Beta-Humanes-Chorion-Gonadotropin:

Auch beta-HCG wurde in drei verschiedenen Konzentrationen gemessen: die niedrigste

Konzentration mit 10 IE/ml, zu Beginn einer Schwangerschaft im Serum zu finden, die

mittlere Konzentration mit 50 IE/ml, die etwa der 7. Schwangerschaftswoche entspricht und

die höchste Konzentration mit 250 IE/ml, welche sich während der maximalen beta-HCG-

Ausschüttung um die 10. Schwangerschaftswoche im Serum findet.

Folgende Einflüsse von dem beta-HCG auf die Cytokinproduktion von unreifen dendritischen

Zellen wurde ermittelt: Auf die Chemokinspiegel von MDC und IL-8 hat beta- HCG keinen

Einfluss, das heisst dass deren Produktion durch dendritische Zellen nicht unter Einfluss

dieses Hormons steht. In aktuellen Studien konnte jedoch gezeigt werden dass beta-HCG

durch Aktivierung von Monozyten, also den Vorläuferzellen der unreifen DC, zu einem

Ansteigen des Chemokins IL-8 führt, dies scheint sich aber im Fall der unreifen dendritischen

Zellen in unserem Experiment nicht zu bestätigen [50].

In den mittleren und hohen Dosen senkt beta-HCG in signifikanter Art und Weise den

Cytokinspiegel der Th1-Cytokine IL-6 und TNF-alpha. Das Cytokin IL-18 bleibt jedoch

unbeeinflusst. Dies bedeutet, dass die Produktion bestimmter cytotoxischer Cytokine unter

dem Einfluss von beta-HCG gemindert wird, was sich protektiv auf das

Schwangerschaftsgeschehen auswirken kann. Dies steht im Gegensatz zu früheren Studien,

denen zufolge beta-HCG die cytotoxischen Cytokine wie IL-6 und TNF- alpha in ihrer

Produktion steigert [51].

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die als potentiell schwangerschaftsprotektiv

anzusehenden Th2-Cytokine durch beta-HCG zwar nicht statistisch signifikant beeinflusst

werden, jedoch ist eine Tendenz zur Spiegelsenkung bei ansteigender Konzentration des

Hormons zu beobachten. Dies ließe sich insofern interpretieren, als dass beta-HCG die

gesamte Cytokinproduktion der dendritischen Zellen herabreguliert.

4.4 Dexamethason:

Als Coticosteroid mit der grössten Potenz, wurde Dexamethason ebenfalls in drei

verschiedenen Konzentrationen zu den unreifen dendritischen Zellen gegeben:

10-10 mol/l als niedrigste Konzentration mit der höchsten Verdünnung, 10–8 mol/l als mittlere

Konzentration und 10–6 mol/l als höchste Konzentration mit der geringsten Verdünnung.

39

Corticosteroide beeinflussen das Immunsystem auf verschiedenen Ebenen, so wird die

Cytokinproduktion von unterschiedlichen Zellen, z.B. den T-Zellen, Makrophagen,

Monozyteten oder dendritischen Zellen verändert.

Studienergebnissen zufolge supprimiert Dexamethason die Produktion der Th2-Cytokine [52].

Dies ist ein Effekt, der in der vorliegenden Arbeit ganz gegensätzlich gefunden wurde. Genau

wie bei Ramirez F. et al, 1996, fand sich in der vorliegenden Arbeit, dass Corticosteroide zu

einer Th2-Immunantwort führen [53]. Es zeigte sich dass Dexamethason in der mittleren und

der höchsten Konzentration den IL-10 Spiegel steigert. Das heisst unter dem Einfluss von

Steroiden kommt es zur Ausschüttung schwangerschaftsprotektiver Cytokine durch die

dendritischen Zellen. Im Gegensatz dazu werden die potentiell schwangerschaftsschädigenden

Th1-Cytokine in ihrer Produktion durch unreife dendritische Zellen, unter dem Einfluss von

Dexamethason gehemmt.

Statistisch signifikante Effekte zeigen sich besonders deutlich bei IL-18 in der mittleren

Konzentration, sowie bei IL-6 in der mittleren und höchsten Konzentration. Bei TNF-alpha

war ebenfalls eine Tendenz zur Spiegelsenkung zu erkennen, so dass man davon ausgehen

kann dass Dexamethsaon die Produktion der cytotoxischen Cytokine während der

Schwangerschaft hemmt. Gleiches konnte schon durch verschiedenen Studien belegt werden,

so fanden zum Beispiel Viera et al., 1998, das Glucocorticoide die Produktion cytotoxischer

Cytokine durch humane dendritische Zellen hemmen, und Piemonti und Kollegen wussten

schon 1999, dass die dendritischen Zellen in ihrer Differenzierung und Reifung durch

Glucocorticoide beeinflusst werden [8, 54].

Das Ergebnis der vorliegenden Arbeit entspricht auch den Studien von de Jong et al., 1999,

die herausfanden dass unreife dendritische Zellen zu einer Hemmung der Th1-

Cytokinprodukion führen und im Gegensatz dazu die Th-2 Cytokine vermehrt von den

unreifen DC sezerniert werden [55]. Auch die Reifung der DC wird von Corticosteroiden

blockiert. Ohne Einfluss bleiben die Steroide laut de Jong, auf die Antigenaufnahme und die

Expression kostimulatorischer Moleküle wie CD 40-Ligand oder MHC-II-Produktion. Dies

steht im Gegensatz zu Pan J. et al., 2001, welcher Beweise erbrachte, dass Dexamethason die

Expression kostimulatorischer Moleküle inhibiert, und auf diese Weise die Aktivierung von

T-Zellen durch dendritische Zellen verhindert wird [56].

Werden die unreifen dendritischen Zellen mit Dexamethason inkubiert, kommt es zu einer

Herabregulation der kostimulatorischen Merkmale wie den MHC II-Rezeptoren und dem B7-

Ligand. Ausserdem sind die unreifen DC nach einer Dexamethasoninkubation refraktär in

ihrer Reifung. Insgesamt konnten wir zeigen dass die unreifen dendritischen Zellen unter dem

40

Einfluss von Glucocorticoiden in der Produktion der cytotoxischen Th1-Cytokine unterdrückt

werden. Die schwangerschaftsprotektiven, antiinflammatorischen Th2-Cytokine werden in

ihrer Produktion gesteigert.

4.5 Progesteron und Östrogen:

Da Hormone in vivo nie einzeln auftreten, sondern immer in Kombination auf den Körper

einwirken, wurden verschiedene Kombinationen von Hormonen ausgetestet und deren

Einfluss auf die Cytokinproduktion der unreifen dendritischen Zellen untersucht, um die in

vitro Bedingungen den Bedingungen im Körper anzupassen. Ziel war es hierbei

herauszufinden, ob es zu einer eventuellen Summation der Einzeleffekte der getesteten

Hormone kommen kann und ob sich diese Effekte durch Kombination sinnvoll nutzen lassen.

So wurden zuerst die beiden weiblichen Sexualhormone kombiniert, die den Zyklus der Frau

im Wesentlichen mitbestimmen und die während einer Schwangerschaft dominieren. Wieder

wurden drei unterschiedliche Konzentrationen ausgetestet:

Die geringste Konzentration mit Progesteron 1000 mg/ml und Östrogen 0,1mg/ml, was

annähernd der Follikelphase des weiblichen Zyklus entspricht, die mittlere Konzentration mit

Progesteron 1000 mg/ml und Östrogen 10 mg/ml, die sich während der lutealen Zyklusphase

findet, und die höchste, die supraphysiologische Konzentration mit Progesteron 1000 mg/ml

und Östrogen 1000 mg/ml.

Die Kombination der beiden Hormone lies in der mittleren Konzentration eine Tendenz zur

Steigerung des IL-10-Spiegels erkennen, das heisst das Zusammenspiel von Progesteron und

Östrogen ruft ein schwangerschaftsprotektives Cytokinmuster durch dendritische Zellen

hervor. Ebenfalls positiv auf den Verlauf der Schwangerschaft würde sich auswirken dass IL-

18, ein Th1-Cytokin, in der mittleren Konzentration gesenkt wird. Auf die anderen

gemessenen Th1-Cytokine zeigten sich keine eindeutigen Effekte. Und auch die niedrigste

oder die höchste Konzentration der Hormonkombination brachte keine statistisch

signifikanten Ergebnisse. Bei den Chemokinen war auffällig dass es unter dem Einfluss von

Progesteron und Östrogen zu einer signifikanten Spiegelsteigerung von MDC in der

niedrigsten Konzentration kommt. Da MDC zu einer Th2-Immunantwort führt, könnte man

dies als positiv für die Schwangerschaft werten.

Insgesamt ist festzustellen, dass sich direkte summatorische Effekte der Einzelfunktionen der

beiden Hormone Progesteron und Östrogen nicht nachweisen lassen.

41

4.6 Progesteron und beta-HCG:

Auch diese Hormonkombination wurde in drei unterschiedlichen Konzentrationen zu den

unreifen dendritischen Zellen gegeben, um deren Verhalten während unterschiedlicher

hormoneller Stimulation zu untersuchen. Wie in den Versuchsansätzen vorher wurde versucht

mit den beiden unteren Konzentrationen physiologische Situationen im Körper zu imitieren,

mit der höchsten Konzentration jedoch eine Situation zu erreichen, wie sie im Körper

normalerweise nicht vorkommt, um Aussagen über die DC-Funktion unter maximaler

Hormonstimulation zu treffen. Die niedrigste Konzentration lag bei Progesteron 1000 mg/ml

und beta-HCG 10 IE/ml; die mittlere bei Progesteron 1000 mg/ml und beta-HCG 50 IE/ml,

und die höchste, supraphysiologische Konzentration lag bei Progesteron 1000 mg/ml und

beta-HCG 250 IE/ml.

Die Kombination dieser beiden Hormone lässt leider nur wenige Aussagen über die

Cytokinproduktion der unreifen dendritischen Zellen zu. Es stehen in keiner Konzentration

statistisch signifikante Ergebnisse zur Verfügung. Die Effekte der aus den Einzelmessungen

gewonnenen Erkenntnisse konnten auch hier nicht summiert werden. Man muss in diesem

Fall annehmen dass die Cytokinproduktion der unreifen DC nicht durch die

Hormonkombination von Progesteron mit beta-HCG beeinflusst wird und man keine

Aussagen bezüglich der Wirkung auf die Schwangerschaft treffen kann.

Es lassen sich insgesamt nur wenige statistisch signifikante Einflüsse speziell der

schwangerschaftsassoziierten Hormone auf die Cytokinproduktion der unreifen dendritischen

Zellen feststellen. Man kann somit festhalten dass es nicht die mütterlichen Hormone sind, die

im Verlauf der Schwangerschaft dazu führen, dass ein bestimmtes, förderliches Cytokinprofil,

nämlich das der Th2-Cytokine, vorliegt. Sondern dass es von bisher noch unbekannten

Mechanismen abhängt, dass diese Klasse der Cytokine von den DC produziert werden und die

Schwangerschaft ungestört verlaufen kann.

Alles in allem handelte es sich natürlich um einen Versuch mit hohem experimentellen

Aufwand mit einer Probandenzahl von n=20. Obwohl dies in einer Versuchsanordnung auch

für die statistische Aussagekraft eine ausreichende Testanzahl darstellt, wären natürlich

Versuche mit mehr Patientenproben wünschenswert. So könnte man konkretere Aussagen

über die in dieser Arbeit sichtbaren Tendenzen treffen. Auch könnte man verschiedenen

42

unvermeidbaren Ereignissen besser begegnen, wie zum Beispiel der hohen biologischen

Variabilität aufgrund der Verwendung biologischen Materials.

Die in der Arbeit verwendeten Zellen stammten von gesunden Blutspendern, wobei 10

männliche und 10 weibliche Proben weiterverarbeitet wurden. Hierbei blieben auch viele

Aspekte unklar, die im Zusammenhang mit der Hormonlage hätten wichtig sein können.

Beispielsweise wurden keine Angaben über das Alter der Blutspender gemacht, ob sich

Frauen in der Menopause unter den Spendern befanden. Auch könnte z.B. die Einnahme

oraler Kontrazeptiva, oder die Zyklusphase der gebärfähigen Frau, über die man keine

Aussage treffen kann, die Zellen beeinflussen.

Letztlich bleibt es weiterhin unklar was die genauen Ursachen für die Spiegelerhöhung der

Th2-Cytokine während einer normalverlaufenden Schwangerschaft sind. Man kann jedoch

davon ausgehen dass es nicht alleine die schwangerschaftsoziierten Hormone der Mutter sind,

die zu dem Th2-gewichteten Cytokinprofil führen, bzw. dass die dendritischen Zellen ihr

Verhaltensmuster im Hinblick auf die hormonelle Beeinflussung nur in begrenztem Ausmaß

ändern.

43

5. Zusammenfassung

Die Schwangerschaft ist aus immunologischer Sicht ein Phänomen: trotz der fremden,

väterlichen Antigene, die der Embryo auf seinen Zellen exponiert, wird er von Immunsystem

der Mutter akzeptiert, und im Normalfall nicht abgestossen. Die Frage nach der Ursache

dieses Phänomens beschäftigt die Wissenschaft seit Jahren.

Die Schwangerschaft geht jedoch nicht nur mit einer Veränderung des Immunsystems einher,

sondern es müssen sich viele Systeme im Organismus der Mutter umstellen, damit das Leben

und Überleben des Kindes gesichert werden kann. Ein wichtiges Beispiel stellt der

Hormonhaushalt der Mutter dar, der sich bei jeder normalverlaufenden und somit

erfolgreichen Schwangerschaft stets in gleicher Weise ändert. So stellt sich die Frage ob das

mütterliche Immunsystem und die veränderte Hormonlage zusammenhängen, und wenn ja,

auf welche Art und Weise?

Hierzu ist es wichtig das Immunsystem näher zu betrachten. Schnell wird man auf die

aussergewöhnlichen dendritischen Zellen kommen, die ubiquitär im menschlichen Körper

verbreitet sind. Diese Zellen, zurecht als herausragende Immunzellen des Menschen

bezeichnet, dirigieren durch die von ihnen produzierten Cytokine die Immunantwort. Sie sind

fähig durch Interaktion mit den T-Lymphozyten die Reaktion des Körpers in eine

cytotoxische, bzw. tolerogene Richtung zu lenken.

Man hat herausgefunden, dass bei einer Schwangerschaft das umgebende Cytokinprofil von

immenser Bedeutung für deren Verlauf ist. So kann es bei vorliegen von Th1-Cytokinen zu

einem Abortgeschehen kommen, bei überwiegen der Th2-Cytokine im mütterlichen Milieu,

ist von einer normalverlaufenden Schwangerschaft auszugehen. Ausgehend von diesen

Kenntnissen wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, wie die maternale Hormonlage die

Cytokinproduktion der unreifen dendritischen Zellen beeinflusst. Hierzu wurden aus den

Buffycoats von 20 menschlichen Blutspenden gemäß dem Standartprotokoll von Romani et

al., die PBMC, die peripheren Monocyten im Blut isoliert. In der Zellkultur konnten aus

diesen Zellen dendritischen Zellen angezüchtet werden.

Die DC wurden dann mit den schwangerschaftsassoziierten Hormonen Östrogen, Progesteron,

beta-HCG und Dexamethason versetzt, wobei man durch die Gabe unterschiedlicher

Konzentrationen, Situationen im Schwangerschaftsverlauf simulieren wollte. Dann wurden

die dendritischen Zellen zwei weitere Tage zusammen mit den Hormonen kultiviert. Mittels

ELISA-Technik wurde abschließend die Cytokinproduktion der dendritischen Zellen im

Kulturüberstand bestimmt, um eine Aussage über das Cytokinprofil dieser wichtigen

44

menschlichen Immunzellen unter dem Einfluss der schwangerschaftsasoziierten Hormone

treffen zu können. Die Daten wurden mit einem nicht-parametrischen Test für gepaarte

Proben statistisch ausgewertet.

Als Ergebnis dieser Arbeit liegt vor, dass es keinen eindeutig statistisch belegbaren

Zusammenhang zwischen der Cytokinproduktion der dendritischen Zellen und den

schwangerschaftsassoziierten Hormonen gibt; d. h. man kann den maternalen Hormonen

keine direkte immunologisch-protektive Funktion hinsichtlich einer Beeinflussung

dendritischer Zellen zuordnen.

Das heißt aber auch dass das Geheimnis der Toleranz des Embryos weiterhin bestehen bleibt

und auch in Zukunft die Forschung beschäftigen wird.

45

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