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UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FARMACOLÓGICA Y TOXICOLÓGICA LABORATORIOS DE BIOELECTROQUÍMICA Y FARMACOQUÍMICA

“Estudio de estabilidad hidrolítica de N-(p-clorobenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol y N-(p-flúorbenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol”

PATROCINANTE: Dr. ALEJANDRO ÁLVAREZ LUEJE

Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica

DIRECTORES: Dr. ALEJANDRO ÁLVAREZ LUEJE

Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica

Dr. HERNÁN PESSOA MAHANA Departamento de Química Orgánica y Fisicoquímica

Memoria para optar al titulo de Químico Farmacéutico

MARÍA JOSÉ ORELLANA BUSTOS

‐ 2009 ‐

Dedicatoria

~ 1 ~

A mi familia humana

y también a mi familia felina

María José Orellana Bustos

~ 2 ~

Agradecimientos

A mis padres por su apoyo y paciencia en este largo camino recorrido, por tolerar mi mal genio, por despertarme para estudiar y por sobretodo por hacer de mí la mujer que soy. A mis hermanas Jany y Paty, por ayudarme siempre, sobretodo en los momentos difíciles. Al Profesor Alejandro Álvarez Lueje por darme la oportunidad de realizar esta memoria bajo su supervisión y permitirme conocer lo “lindo” que es hacer ciencia. A mi codirector de memoria Henan Pessoa Mahana. A Manuel Bravo, por su colaboración el la realización de esta memoria que fue siempre oportuna y útil en este nuevo mundo que es la quimiometría. A mi gran amiga Elena Salazar Beltrán, por siempre tener la visión perfecta de la situación y servirme de luz en los momentos cuando todo se ve oscuro. A mi gran amiga Karina Navarrete Méndez, simplemente por estar, por ayudarme con la síntesis, entre otras muchas cosas. A mis grandes amigas de la U (Natalia Notari, Daniela Núñez, Catherine Osorio, Natalia González, Claudia Fernández, Ximena Gómez, y a las que se me quedaron en el tintero también) porque formaron parte importante de esta larga estadía en la universidad y le dieron el toque alegre y hermoso a mis años de universidad. A mi gran amigo Eduardo Miño Guerrero, por se como es, siempre alegre, y a pesar de la distancia y las diferencias siempre estar. A mis sobrinos regalones todos (Cote, Smiky, Alan), por ser siempre fuente de alegría. A mis amigas de siempre, las del colegio (Pepa, Carola, Dany y Aileen), que están ahí aunque pase el tiempo y las distancias se hagan más grandes. A los que ya no están… Y por ultimo agradecer a Fondecyt por financiar esta memoria. POR FIN!!!!!

Índice

~ 3 ~

ÍNDICE

RESUMEN…………………………………………………………………………………iv

SUMMARY………………………………………………………………………………….vi

1. INTRODUCCIÓN………………………………………...……………………………….1

2. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………..9

2.1 MATERIALES ................................................................................................... 9

2.1.1 Compuestos estudiados ............................................................................ 9

2.1.2 Reactivos y disolventes ............................................................................. 9

2.1.3 Disoluciones tampón ................................................................................. 9

2.1.4 Material de vidrio ..................................................................................... 10

2.1.5 Otros materiales ...................................................................................... 10

2.1.6 Equipos ................................................................................................... 10

2.2 MÉTODOS ...................................................................................................... 11

2.2.1 Síntesis ................................................................................................... 11

2.2.2 Preparación de disoluciones ................................................................... 12

2.2.3 Polarografía de pulso diferencial (PPD) .................................................. 13

2.2.4 Desarrollo de la metodología polarográfica-quimiométrica ..................... 14

2.2.5 Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) ..................................... 17

2.2.6 Estudios de estabilidad ........................................................................... 20

2.2.7 Análisis estadístico. ................................................................................. 24

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………………25

3.1 Caracterización electroquímica ...................................................................... 26

3.2 Desarrollo del método polarográfico asistido por quimiometría ...................... 30

3.3 Cromatografía líquida de alta eficiencia ......................................................... 33

3.4 Estudios de estabilidad ................................................................................... 38

4. CONCLUSIONES……………………………………………………………………..56

REFERENCIAS…………………………………………………………………………..57


~ iv ~

RESUMEN

En esta Memoria se presenta el desarrollo y aplicación de una metodología

electroanalítica usando polarografía de pulso diferencial con aplicación de

calibración multivariada PLS, con el objetivo de cuantificar dos nuevos compuestos

con actividad sobre Tripanosoma cruzi: N-(p-clorobenzoil)-2-(o-nitrofenil)-

benzimidazol (PCNB) y N-(p-flúorbenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol (PFNB), en

presencia de su producto de degradación 2-(o-nitrofenil)-1H-benzimidazol (NB). Las

señales polarográficas de los compuestos principales (PCNB y PFNB) se solapan

parcialmente con la señal de su producto de degradación (NB), siendo excelentes

candidatos para la aplicación de la calibración multivariada. Las condiciones ideales

de estudio para ambos compuestos fueron de acetonitrilo: tampón Britton-Robinson

(30:70) a pH 6.8 para PCNB y a pH 7.0 para PFNB.

Los tres compuestos estudiados (PCNB, PFNB y NB) presentan una señal

principal bien definida, generada por la reducción del grupo nitro presente en su

estructura. Esta señal es pH dependiente en un amplio rango de pH (1-9),

desplazándose a potenciales más catódicos a medida que el pH aumenta. La

evolución de los potenciales de pico exhibe una dependencia lineal con respecto al

pH del medio, observándose un quiebre en la señal a pH 8 para PCNB, a pH 4 para

PFNB y pH 9 para NB.

El modelo de calibración multivariada utilizado se construyó en base a un set

de 14 mezclas binarias de PCNB y NB en un rango de concentración de 1×10-3 M a

1×10-6 M. Luego este modelo fue validado utilizando la validación cruzada,

evaluando el error relativo de predicción (REP=5.4%), obteniéndose un error

estándar de predicción de 6.5×10-6 M (r2=0.97038) para un numero de componentes

A=4. Para PFNB se utilizó el mismo modelo, debido a que la extensión de la

degradación es similar a la del PCNB, determinando su grado de solapamiento a

una concentración de 5×10-4 M para ambos compuestos por separado (PFNB y NB).

Luego se procedió a utilizar 9 mezclas binarias realizadas mediante la aplicación

de diseño experimental de composición variada, en intervalos de concentración de

1.57×10-4 M a 8.68×10-6 M para PFNB y de 1.4×10-4 M a 6.54×10-6 M para NB. Una

Resumen

~ v ~

vez determinadas las mezclas se obtuvieron las cifras de merito correspondientes

para la calibración multivariada, obteniéndose valores dentro de los rangos

analíticos aceptables.

Esta metodología desarrollada fue aplicada a estudios de degradación

acelerada para ambos compuestos (PCNB y PFNB), obteniéndose los valores de

las kobs para cada condición analizada. Se obtuvieron además los valores de las

constantes cinéticas que describen el perfil de pH de cada uno de los compuestos.

Además se determinó el comportamiento de estos compuestos a distintas

temperaturas, calculándose el valor de Ea para cada uno y, en el caso de PFNB, se

analizó la influencia de la composición de la disolución en la velocidad de

degradación.

Con el fin de establecer si los métodos son estadísticamente similares, se

compararon los datos de concentraciones iniciales obtenidos en cada experiencia,

mediante la aplicación de la prueba estadística de t para muestras emparejadas,

con los datos obtenidos por medio de HPLC, no evidenciando diferencias

estadísticas significativas entre ellos. Para comparar la aplicación de los métodos

establecidos en los estudios de estabilidad, se realizó prueba de regresión de la

curva en cada una de las experiencias, comparando los datos de kobs obtenidos por

ambos métodos.

Esta Memoria fue financiada por Proyecto Fondecyt 1061144


~ vi ~

SUMMARY Hydrolysis stability study of N-(p-chlorobenzoyl)-2-(o-nitrophenyl)-benzimidazole and

N-(p-fluorbenzoyl)-2-(o-nitrophenyl)-benzimidazole

This Memory presents development and implementation of an electroanalítical

methodology using differential pulse polarography with application of multivariate

calibration PLS, to quantify two new compounds with activity on Trypanosoma cruzi:

N-(p-chlorobenzoyl)-2-(o-nitrophenyl)-benzimidazole (PCNB) and N-(p-fluorbenzoyl)-

2-(o-nitrophenyl)-benzimidazole (PFNB) in presence of its degradation product 2-(o-

nitrophenyl)-1H-benzimidazole (NB). Polarographic signals from the main compound

(PCNB and PFNB) are partially overlapping with signal of its degradation product

(NB), being excellent candidates for implementation of multivariate calibration. Ideal

conditions for studying both compounds were acetonitrile: Britton-Robinson buffer

(30:70) at pH 6.8 to PCNB and pH 7.0 for PFNB.

Three compounds studied (PCNB, PFNB and NB) showed a well-defined

main signal generated by the nitro group reduction present in its structure. This

signal is pH dependent on a wide range of pH (1-9), moving into more catholically

potentials when pH increases. Evolution of the potential peak exhibits a linear

dependence with regard to the pH of medium, with a break in signal at pH 8 for

PCNB, at pH 4 for PFNB and pH 9 for NB.

Multivariate calibration model used was built based on a set of 14 binary

mixtures of PCNB and NB in a concentration range from 1×10-3 M to 1×10-6 M. This

model was validated using cross-validation, assessing relative error of prediction

(REP = 5.4%), for a standard error of prediction of 6.5×10-6 M (r2 = 0.97038) for a

number of components A = 4. To PFNB was used the same model, because extent

of degradation is similar to that of PCNB, determining their degree of overlapping at

concentration of 5×10-4 M for both separated compounds (PFNB and NB). Then we

proceeded to use 9 binary mixtures made through application of experimental design

of varied composition at intervals of concentration from 1.57×10-4 M to 8.68x10-6 M

for PFNB and 1.4×10-4 M to 6.54×10-6 M for NB. Once mixtures were obtained, merit

Summary

~ vii ~

figures corresponding to multivariate calibration were calculated being obtained

values within acceptable analytical ranges.

This methodology was applied to studies of accelerated degradation for both

compounds (PCNB and PFNB), obtained values of kobs for each condition tested. We

obtained further values of kinetic constants that describe pH profile of each of

compounds. In addition it was determined behavior of these compounds at different

temperatures, calculated value of Ea for each one and, in case of PFNB, it was

analyzed the influence of the composition of the solution in the rate of degradation.

To determine if methods are statistically similar, we compared data obtained

in initial concentrations of each experience, by applying statistical t test for paired

samples, with data obtained by HPLC, showing no statistical difference significant

between them. To compare application of methods set out in stability studies, testing

was conducted regression curve in each experience, comparing kobs data obtained

by both methods.

This report was funded by Project Fondecyt 1061144

Introducción

~ 1 ~

1. INTRODUCCIÓN

Al desarrollar un nuevo compuesto con posible actividad farmacológica, es

necesario entre otras caracterizaciones fisicoquímicas, evaluar su estabilidad. Los

estudios de estabilidad tienen como fin establecer el comportamiento de una

sustancia, bajo ciertas condiciones extremas (pH, temperatura, etc.) y en

consecuencia, analizar su grado de inestabilidad en las condiciones estudiadas.

La forma más estudiada de inestabilidad es la pérdida de cantidades de la

especie activa bajo análisis, a través de reacciones químicas que resultan en una

disminución de su potencia. Esta disminución en la potencia es una causa

reconocida como pobre calidad del producto obtenido y por ende es de suma

importancia establecer los parámetros a los cuales la sustancia o fármaco sufre su

degradación, las reacciones químicas que están involucradas y los productos que se

generan en el proceso de degradación1.

En este sentido, un fármaco puede degradarse en una sustancia tóxica, lo

que implica la importancia de no sólo determinar cuanto fármaco se pierde en el

proceso de degradación, sino que también qué productos son los que se generan.

Por otra parte, la degradación del fármaco puede producir un producto

estéticamente inaceptable que haga presumir que ha sido adulterada (cambio de

color, de olor en el tiempo) o que se ha descompuesto y ya no es útil. Y por último,

el fármaco estudiado debe mostrar estabilidad a pH fisiológicos, para establecer

cual seria su comportamiento en el caso de que la droga se administrada a un

organismo vivo.

La técnica analítica más utilizada durante años para establecer el

comportamiento del fármaco estudiado y su producto de degradación frente a las

condiciones analizadas, ha sido la cromatografía líquida acoplada a un detector

selectivo. Esta técnica analítica permite cuantificar y separar los compuestos de

interés farmacéutico de forma directa, sin utilizar ningún procedimiento analítico

para lograrlo.

Aún cuando algunos fármacos son electroactivos, las técnicas

electroquímicas han sido escasamente utilizadas para estos fines, debido a la


~ 2 ~

similitud estructural existente entre el principio activo y sus productos de

degradación, lo cual permite que los procesos electroquímicos tengan lugar a

potenciales muy cercanos, produciendo un solapamiento de las respuestas en

corriente obtenidas, sin que sea posible su cuantificación por una medición directa

utilizando una curva de calibrado unidimensional.

En el último tiempo la aplicación de herramientas quimiométricas, tales como

la calibración multivariada, han sido utilizadas para la resolución de mezclas donde

las señales instrumentales de sus componentes se encuentran fuertemente

solapadas. Los algoritmos más comunes son PCR (principal component regression),

PLS (partial least-squares), entre otros; no obstante lo anterior, aún cuando la

aplicación de estas herramientas a señales espectroscópicas ha sido extensa, el

uso de datos electroquímico ha sido escasamente reportado.

Dos nuevos compuestos sintéticos con actividad sobre Trypanosoma cruzi2:

N-(p-clorobenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol (PCNB) y N-(p-flúorbenzoil)-2-(o-

nitrofenil)-benzimidazol (PFNB), han sido estudiados en esta Memoria, cuyas

estructuras químicas se presentan en la figura 1.

Figura 1. Estructuras químicas de PCNB y PFNB.

Estos compuestos incluyen en su estructura un núcleo benzimidazólico y un

sustituyente nitroaromático, ambos de reconocida y variada actividad biológica. El

núcleo benzimidazólico se encuentra presente en distintos fármacos para el

tratamiento de patologías muy diversas, por ejemplo en el tratamiento de algunas

parasitosis3, como antibacterianos4, antifúngicos5 antivirales6 y antineoplásicos7,

entre otros. Por otra parte, los compuestos nitroaromáticos han sido ampliamente

R = -Cl (PCNB), -F (PFNB)

Introducción

~ 3 ~

usados como productos farmacéuticos, pesticidas y explosivos8-11. Estas

características los hacen interesantes como candidatos de estudios de estabilidad,

con el fin de establecer parámetros concretos para posibles estudios biológicos.

Tanto PCNB como PFNB, al ser analizados en conjunto con su producto de

degradación (NB) por medio de PPD (polarografía de pulso diferencial), presentan

señales solapadas entre si, lo que brinda una buena oportunidad para aplicar la

quimiometría a estudios de estabilidad de ambos compuestos.12

Durante los años 70 se dio un impulso al estudio y aplicación de métodos

matemáticos y estadísticos, en el tratamiento de resultados obtenidos en química

analítica en particular datos multivariados y diseño de experimentos.13 Así se dio

inicio a la quimiometría, que a partir de los años ochenta se convirtió en una

disciplina organizada, enfocándose a resolver problemas analíticos simples, tales

como la resolución de señales solapadas mediante calibración multivariada y

análisis de factores14. A partir de estos años, la quimiometría trascendió sus

fronteras hacia otras disciplinas, expandiéndose en sus usos, llegando a ser

utilizados en la obtención de los datos químicos e instrumentales hasta incluso la

resolución simultanea de los datos instrumentales14, siendo utilizada en la industria

farmacéutica para resolver bases de datos complejas, a partir de los años 90.14

Quimiometría se define como “la disciplina que usa métodos matemáticos y

estadísticos para la selección óptima del procedimiento analítico y del tratamiento de

los datos obtenidos por química analítica”15. En la figura 1 se ilustra la forma como la

quimiometría se relaciona con otras disciplinas.16

Si observamos la figura 2, a la izquierda se encuentran todas las ciencias

que están basadas en la matemática y no en la experimentación de laboratorio,

siendo la estadística la que cumple el rol más importante en la quimiometría. A la

derecha de la figura, encontramos a las ciencias que utilizan la quimiometría, siendo

probablemente la química analítica el área que más significativamente se beneficia

de ella.16


~ 4 ~

Figura 2. Relación entre la quimiometría y otras disciplinas16

La idea central de todas estas metodologías es compensar la carencia de

selectividad total de las señales analizadas, usando algoritmos matemáticos

eficientes para extraer la porción de la señal solapada, la cual puede ser empleada

para predecir la concentración de un componente particular de la muestra.17 Para

lograr este objetivo, la quimiometría dispone de variadas metodologías, entre las

cuales se debe elegir la que más se adecue a los datos que obtenemos

experimentalmente y lo que queremos obtener de ellos. Dentro de estas

metodologías encontramos12:

Metodología bivariada: Consta de dos etapas: calibración y predicción. Es

útil para determinar concentración de analito determinado, usando dos sensores

diferentes o a dos longitudes de onda distintas. El efecto de la colinealidad espectral

disminuye la sensibilidad, la selectividad y la precisión. En presencia de

interferentes no modelados en la calibración, el análisis de muestras incógnitas es

inexacto.12

Metodología multivariada: por medio de esta metodología se analizan

varios analitos mediante múltiples sensores. Para esta metodología se dispone de

variados modelos:

Introducción

~ 5 ~

Modelo de análisis por cuadrados mínimos clásicos (CLS, classical least-

squares): se trata de un modelo matemáticamente sencillo, que puede seguirse

convenientemente con el auxilio del cálculo matricial estándar. Es útil para tipos de

muestras que no presenten interferencias serias de componentes desconocidos, o

no se encuentran colinealidades espectrales significativas entre los analitos;

proveyendo una manera rápida, simple y confiable de estimar las concentraciones

en muestras de multicomponentes en forma simultanea. Desafortunadamente, el

modelo es sensible a la presencia de colinealidad espectral, de manera que analitos

con espectros severamente solapados no pueden estudiarse mediante esta técnica.

Además es necesario conocer los componentes químicos presentes en las mezclas

incógnitas, de lo contrario, la presencia de interferentes no modelados producirá un

serio error en la determinación, siendo informados por esta técnica.12

Modelo de regresión por cuadrados mínimos inversos (ILS, inverse

least-squares): permite estudiar mezclas de componentes en las que uno o más

analitos son de interés, pero de los restantes componentes pueden desconocerse

concentraciones, espectros e identidades químicas. Lamentablemente, es sensible

a colinealidades espectrales y por ende debe usarse un número reducido de

sensores, con la consecuente pérdida de información y de sensibilidad.12

Modelos de regresión por componentes principales (PCR, principal

component regression): al igual que el anterior (ILS), permite estudiar mezclas de

componentes en las que uno o más analitos son de interés, desconociéndose los

demás componentes de la muestra. Posee una calibración directa, que permite

ignorar las concentraciones de compuestos químicos desconocidos durante el

calibrado y el uso de “espectros” abstractos llamados scores, que eliminan los

problemas asociados con la colinealidad espectral. Lamentablemente se mantiene

el problema de las interferencias no modeladas tanto para este modelo, como para

los anteriormente mencionados, produciéndose un análisis no exacto de la muestra,

problema que tiene un estilo en el mundo multivariado.12


~ 6 ~

Modelo de regresión por cuadrados mínimos parciales (PLS, partial

least-square): pretende mejorar la técnica antes descrita (PCR) introduciendo los

valores de las concentraciones de calibración en el cálculo de los factores. Existen

dos tipos de modelos PLS: uno denominado PLS-1, que concentra su atención en

un único analito a la vez, y otro llamado PLS-2, que permite calibrar y predecir las

concentraciones de varios analitos simultáneamente. Este último factor, que puede

parecer una ventaja, ya que en PLS-1 debe repetirse para cada analito de interés,

es una gran desventaja, ya que PLS-1 permite optimizar las condiciones de trabajo

para cada analito independientemente. A pesar de todas estas ventajas por sobre

los anteriores modelos, persiste el problema de la medición inexacta, si en la

muestra problema se presenta un interferente que no esté calibrado en el método.12

Los datos de calibración multivariada detallados anteriormente, se basan en

el procesamiento de datos del tipo vectorial (espectros u otro similar, por ejemplo

voltamperogramas) y se consideran calibraciones de primer orden. Los datos que se

calibran según orden superiores (segundo, tercero, etc.), permiten cuantificar

analitos calibrados en presencia de interferencias no modeladas, propiedad que

está ausente en los datos de primer orden. Esta propiedad presenta inmensas

posibilidades en el análisis de mezclas complejas, en particular de origen

biológico.12

En el ámbito de la tecnología farmacéutica, la quimiometría ha encontrado

variadas aplicaciones, encontrándose dentro de estas las de identificación y

cuantificación de los materiales de partida, así como del producto farmacéutico

terminado, siendo extensiva a la cuantificación de este último en diferentes matrices,

tanto in vitro como in vivo.15

Dentro de las técnicas más utilizadas en la aplicación de la quimiometría se

encuentran la espectrofluorometría, espectrofotometría UV y espectrofotometría

infrarrojo, notándose que el uso de polarografía es muy poco común, debido a las

pocas mezclas de sustancias que dan señales solapadas en esta técnica.

Introducción

~ 7 ~

La polarografía es un tipo de voltamperometría, que consiste en la medición de la intensidad de corriente que se desarrolla en una celda electroquímica en condiciones de polarización total de concentración18, siendo el electrodo de

trabajo utilizado, una gota de mercurio. Este electrodo le confiere ciertas ventajas

por sobre los otros tipos de voltamperometría como son18:

• Su inusual elevado sobrepotencial asociado con la reducción de iones

hidrogeno; lo que trae como consecuencia que iones metálicos, tales como el

zinc y el cadmio, se puedan depositar de disoluciones ácidas, a pesar que sus

potenciales termodinámicos sugieran que la deposición de estos metales es

imposible sin formación de hidrógeno.18

• Es renovable, debido a que se forma una nueva superficie metálica en cada

medición, lo que permite que el comportamiento del electrodo sea

independiente de su historia pasada, situación que no sucede con los

electrodos sólidos, que se caracterizan por su comportamiento irregular, debido

a impurezas adsorbidas o depositadas.18

• Las intensidades promedio reproducibles se obtienen inmediatamente a

cualquier potencial dado, independientemente de si el potencial se alcanza

desde posiciones más altas o más bajas.18

Así como el electrodo de gota de mercurio le brinda ventajas, también tiene

desventajas con respecto a los otros electrodos, como son:

• La facilidad con que el mercurio es oxidado, lo cual limita su uso como ánodo.

• La intensidad residual no farádica o de carga, que limita la sensibilidad del

método clásico a concentraciones aproximadamente de 10-5 M, provocando que

a concentraciones menores, la intensidad residual pueda ser mayor que la

intensidad de difusión, lo que impide determinaciones exactas de esta última.18

Esta última desventaja se mejora de manera importante utilizando la

polarografía de pulso diferencial, la cual se basa en hacer dos medidas de

intensidad, una que se efectúa 16.7 ms antes del pulso y otra 16.7 ms después del


~ 8 ~

pulso. La diferencia de intensidad por pulso se registra en función del potencial que

aumenta linealmente. De esta manera se obtiene una curva diferencial en forma de

pico, donde la altura es directamente proporcional a la concentración. Esta

diferencia de intensidad permite aumentar significativamente la sensibilidad del

método polarográfico, elevándola al intervalo de 10-7 a 10-8 M.18

En base a los antecedentes anteriormente expuestos, el objetivo general de

esta Memoria es el desarrollo de metodologías quimométricas aplicadas a técnicas

electroquímicas, con vistas a ser utilizadas en el estudio de la estabilidad de N-(p-

clorobenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol y N-(p-flúorbenzoil)-2-(o-nitrofenil)-

benzimidazol.

Para cumplir adecuadamente con el objetivo planteado, se estiman como

necesarios los siguientes objetivos específicos:

1. Implementar metodologías eletroanalíticas y cromatográficas, a objeto de contar

con herramientas analíticas selectivas para la identificación y cuantificación de

los compuestos en estudio.

2. Aplicar los métodos quimiométricos para sacar partido de los datos obtenidos

mediante la técnica electroanalíca utilizada.

3. Caracterizar la estabilidad de los compuestos en estudio, haciendo uso de las

herramientas analíticas previamente desarrolladas.

Materiales y Métodos

~ 9 ~

2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 MATERIALES

2.1.1 Compuestos estudiados a) Fórmula global: C20H12N3O3Cl

Nomenclatura: N-(p-clorobenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol (PCNB)

Peso molecular: 377.78 g/mol

Intervalo de fusión: 126 – 129 ºC

b) Fórmula global: C20H12N3O3F

Nomenclatura: N-(p-flúorbenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol (PFNB)

Peso molecular: 361.33 g/mol

Intervalo de fusión: 141 – 146 ºC

2.1.2 Reactivos y disolventes Acetonitrilo (99.0%) p.a., Merck

Ácido acético glacial (CH3COOH) (100.0 %) p.a. Merck.

Ácido bórico (H3BO

3) p.a., Merck

Ácido clorhídrico (HCl) (36.5%) p.a Equilab

Ácido ortofosfórico (H3PO

4) (85.0%) p.a., Merck

Agua calidad HPLC (Milli-Q)

Etanol absoluto (etanol) (99.8%) p.a., Merck

Helio extrapuro AGA

Hidróxido de sodio (NaOH) (pellets) p.a. Merck

Mercurio metálico extrapuro

Nitrato de potasio, p.a., Fluka

Nitrógeno extrapuro AGA

2.1.3 Disoluciones tampón Tampón Britton-Robinson 0.1 M


~ 10 ~

2.1.4 Material de vidrio Material de vidrio clase A, tanto transparente como ámbar.

2.1.5 Otros materiales Pipetas automáticas, Eppendorf Research de volumen variable 0.5-1.000 μL

Jeringa de inyección Hamilton de 25 μL y 500 μL

Viales ámbar de 2 mL, Hewlett Packard.

Sellos de viales, Hewlett Packard.

Engargoladora, Hewlett Packard.

Desengargoladora, Hewlett Packard.

Gotarios plásticos

Papel Parafilm

2.1.6 Equipos a) Sistema voltamperométrico Metrohm, procesador 693 VA

Electrodo de trabajo: goteo de mercurio (EGM); Metrohm

Electrodo de referencia: Calomelano saturado, Metrohm

Electrodo auxiliar: platino, Metrohm

Celda polarográfica de 25 mL, Metrohm

Computador 486 DTK computer, modelo Multi Sync 4D, con programa de

adquisición y tratamiento de datos Stand VA 693.

Estación de trabajo Bioanalytical System (BAS), CV-50W.

Computador Pentium, con programa de adquisición y tratamiento de datos CV-50W

b) Sistema cromatográfico

Bomba WatersTM

600 Controller Millipore Model Code 6CE

Detector con arreglo de fotodiodos WatersTM

996

Columna cromatográfica Kromasil 100-5C-18 (4.6 mm×150 mm)

Precolumna C18 μBondapak (30 mm×4.6 mm)

Inyector Rheodyne de 20 μL.


~ 11 ~

Horno calefactor, WatersTM

600

Computador Pentium II con programa de adquisición y tratamiento de datos

MILLENIUM versión 3.05

c) Equipos de uso general Balanza analítica de precisión, Precisa 40SM-200A (sensibilidad 0.01 mg)

Agitador magnético, Heidolph MR 3002

Medidor de pH, WTW pMX 537

Sistema purificador de agua, Milli-Q Ultra-Pure Water System

Baño de Ultrasonido, Branson 2210

Estufa WTC Bindert

Agitador Heidolph DSG 304

2.1.7 Programas Computacionales Origin® OriginPro versión 8.0724. OriginLab Corporation.

Microsoft® Office Excel 2003. Microsoft Corporation.

MATLAB® R2007a, versión 7.4.0287. The MathWorks, Inc.

2.2 MÉTODOS

2.2.1 Síntesis a) La síntesis del núcleo base 2-(o-nitrofenil)-1H-benzimidazol se realizó por

condensción entre o-nitrobenzaldehído y 1,2-fenilendiamina en etanol en cantidades

equimolares, obteniéndose una nitrobenzimidazolidina la cual es oxidada in situ19,

de acuerdo con el siguiente esquema sintético:


~ 12 ~

N

NH

N+O

-

O

+

O

Cl

R

N

N

O

N+O

-

O

R

THF

25 °CN

+ HCL

R = -Cl, -F

b) Por otra parte, las síntesis de N-(p-clorobenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol y N-

(p-flúorbenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol, se llevaron a cabo por reacción entre el

2-(o-nitrofenil)-1H-benzimidazol previamente sintetizado y el respectivo cloruro de

benzoilo comercial (cloruro de p-clorobenzoilo y cloruro de p-flúorbezoilo) en

tetrahidrofurano20, en cantidades equimolares, de acuerdo con el siguiente esquema

sintético:

2.2.2 Preparación de disoluciones a) Tampón Britton-Robinson Se disolvieron 6.20 g de H

3BO

3 en 300 mL de agua Milli-Q aproximadamente,

usando ultrasonido, en un matraz aforado de 1000 mL. Se agregó 6.8 mL de ácido

ortofosfórico, 5.8 mL de ácido acético y se completó volumen con agua Milli-Q. Esta

preparación da como resultado una disolución tampón Britton-Robinson 0.1M, que

permite trabajar en un amplio rango de pH (entre 2.0 y 12.0).

O

N+

O-

O+

NH2

NH2

Δ

EtOH

NH

NH

N+O

-

O

O2 N

NH

N+O

-

O


~ 13 ~

b) Preparación de disolución estándar de los compuestos estudiados Se pesaron exactamente 0.0378 g de PCNB, que fueron disueltos en acetonitrilo y

llevado a ultrasonido para facilitar su disolución. Luego se completó el aforo en un

matraz de 10 mL. De esta manera se obtiene una disolución estándar de 1×10-2 M.

En el caso del PFNB se pesaron 0.03613 g y se procedió de la misma manera,

obteniendo una disolución madre de concentración 1×10-2 M.

2.2.3 Polarografía de pulso diferencial (PPD) Para trabajar en PPD, cada solución de calibración se obtuvo a partir de las

disoluciones estándar preparadas de ambos compuestos. Para PCNB y PFNB, la

disolución estándar se realizó como indica el punto 2.2.2.b, y para NB se pesaron

exactamente 0.0239 g, los cuales fueron disueltos en acetonitrilo y llevados a

ultrasonido para facilitar su disolución. Luego se completó el aforo en un matraz de

10 mL, con lo que se consiguió una disolución estándar de 1×10-2 M.

a) Condiciones de trabajo Cada disolución fue vertida en la celda polarográfica y burbujeada con nitrógeno

cerca de 6 minutos antes de comenzar la medición. La temperatura de trabajo fue la ambiental y el pH de trabajo fue de 6.8 para PCNB

y pH 7.0 para PFNB. La composición de la disolución fue de acetonitrilo: tampón

Britton-Robinson (50:50), para ambos compuestos estudiados.

Los electrodos utilizados fueron los siguientes:

Electrodo de trabajo : goteo de mercurio (EGM), Metrohm.

Electrodo de referencia : electrodo de Calomelano saturado, Metrohm

Electrodo auxiliar : electrodo de platino, Metrohm


~ 14 ~

Las condiciones de trabajo fueron las siguientes:

Sensibilidad : 2,5-10 μA

Rango de potencial : 0 a -1800 mV

Tiempo de goteo : 0,60 s

Altura de pulso : 50 mV

Retardo de pulso : 40 ms

Incremento de potencial : 6 mV

2.2.4 Desarrollo de la metodología polarográfica-quimiométrica a) Set de muestras de calibración. Usando las disoluciones preparadas en el punto 2.2.2.b, se preparó un set de

mezclas de PCNB-NB y PFNB-NB. El intervalo de concentración de cada analito

presente en las mezclas fue definida en función de los niveles esperados en las

muestras de interés. Los niveles seleccionados para PFNB y NB son presentados

en la tabla 1. Las concentraciones de cada una de estas mezclas fueron

determinadas de distinta manera para cada compuesto: para PCNB se eligieron

mezclas al azar (tabla 2) y para PFNB se utilizó un diseño composición central (tabla

3). Para ambos casos, los niveles de concentración considerados fueron más de

cuatro, de modo de asegurar una calibración adecuada.

Tabla 1. Concentraciones de analitos PFNB y de su producto de degradación NB, utilizados para hacer las mezclas del modelo quimiométrico.

PFNB (M) NB (M)

-1 5.40×10-5 2.70×10-5

1 2.60×10-4 1.20×10-4

0 1.57×10-4 7.35×10-5

α 3.05×10-4 1.40×10-4

-α 8.68×10-6 6.54×10-6


~ 15 ~

Tabla 2. Mezclas realizadas para PCNB y NB

PCNB (M) NB (M) PCNB (M) NB (M)

1 1×10-3 1×10-6 8 1×10-6 1×10-3

2 5×10-4 5×10-6 9 2×10-4 8×10-5

3 1×10-4 1×10-5 10 8×10-4 8×10-5

4 5×10-5 5×10-5 11 8×10-5 2×10-4

5 1×10-4 1×10-4 12 8×10-5 8×10-4

6 1×10-5 1×10-4 13 6×10-4 1×10-6

7 5×10-6 5×10-4 14 3×10-4 1×10-6

Tabla 3. Composición de cada mezcla de analitos (PFNB) y su producto de degradación (NB)

Mezcla N° PFNB (M) NB (M) PFNB (M) NB (M)

1 -1 -1 5.40×10-5 2.70×10-5

2 1 -1 2.60×10-4 2.70×10-5

3 -1 1 5.40×10-5 1.20×10-4

4 1 1 2.60×10-4 1.20×10-4

5 0 0 1.57×10-4 7.35×10-5

6 α 0 3.05×10-4 7.35×10-5

7 -α 0 8.68×10-6 7.35×10-5

8 0 α 1.57×10-4 1.40×10-4

9 0 -α 1.57×10-4 6.54×10-6

En base a estas mezclas se procedió a realizar con cada una de ellas,

determinaciones en triplicados.

Con esta información se establecieron sistemas de matrices usados en la

calibración multivariada PLS, de forma tal de relacionar las señales

correspondientes de cada uno de los analitos estudiados (PCNB y PFNB), junto con

su producto de degradación (NB) y determinar la concentración del analito de

interés, sin que la señal de su producto de degradación interfiriera en esto.


~ 16 ~

b) Validación de modelo quimiométrico12. Para determinar el número apropiado de factores (A), que explican la varianza del

modelo, se realizó una validación cruzada. La anterior consiste en:

‐ Construir el modelo con todas las muestras de calibración excepto una,

‐ Predecir la concentración de la muestra dejada de lado,

‐ Calcular el error cometido que es la diferencia entre el valor nominal (Cnom) y

el predicho (Cpred).

Este cálculo se realiza utilizando un número creciente de factores, desde uno hasta

un cierto máximo que debe ser menor al numero de mezclas de calibrado. Luego se

repite el procedimiento hasta que todas las muestras hayan sido dejadas de lado

una vez. Para cada número de factores se calcula la suma de los cuadrados de los

errores de predicción, llamada PRESS (por predicted error sum of squares), de

acuerdo a la siguiente expresión:

Luego se procede a estudiar como varía PRESS, obtenido en función del número de

factores, mediante un procedimiento estadístico. Una vez calibrado el modelo, se

estiman las cifras de mérito correspondientes.

La sensibilidad (SEN) fue calculada de acuerdo a la siguiente ecuación:

|| ||

Donde || || representa la norma de un vector y b es el vector de coeficientes de

regresión obtenido por el algoritmo de PLS.

La selectividad (SEL) fue evaluada de acuerdo a:

|| ñ |||| ñ ||


~ 17 ~

Donde la señal neta del analito, es calculada por la proyección de un espectro de

una muestra problema, ortogonal al espacio descrito por todos los otros

componentes de la matriz, exceptuando al analito de interés.

Los límites de detección y cuantificación se calcularon de acuerdo a:

. 12 ;

Donde s0 es error estándar de concentración para muestras de baja concentración,

y está dado por:

Donde h es la leva de la muestra (un parámetro que ubica la muestra problema en

el espacio de calibración), sc es el error estándar de la concentración de calibración,

sr es el ruido instrumental y SEN la sensibilidad.

c) Comparación estadística del modelo utilizado. Para comparar los métodos, se usaron como referencia las determinaciones

realizadas por HPLC, las que fueron comparadas mediante prueba t para muestras

emparejadas21.

2.2.5 Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) a) Disolución de trabajo Se utilizó la misma disolución preparada en el punto 2.2.2.b.

b) Condiciones de trabajo Las condiciones bajo las cuales se trabajó en el HPLC para los compuestos fueron

las siguientes:

Fase móvil isocrática : acetonitrilo: agua (65:35) para PCNB y acetonitrilo:

agua (60:40) para PFNB

Flujo : 1.0 mL /min


~ 18 ~

Volumen de Inyección : 20 µL

Temperatura : 25 ºC para PCNB y 30ºC para PFNB

c) Ensayo de aptitud de sistema (system suitability test)22 Para PFNB se preparó una disolución de 100 µL PFNB 1×10-2 M, 4900 µL

acetonitrilo y se llevó a volumen de 10 mL con agua. Se acidificó la disolución con 3

gotas de HCl y se procedió a calentar la disolución por 50 minutos. Luego de

neutralizada la disolución, se agregaron 40 µL de PFNB disolución madre y 0.0080

g de KNO3, logrando así una disolución que permite observar las señales tanto del

analito como la de sus productos de degradación.

Se inyectaron 20 µL de la disolución variando la composición de la fase móvil

(acetonitrilo: agua), comenzando con la combinación menos polar (80:20) hasta

llegar a la más polar (20:80). Para cada condición cromatográfica se obtuvieron los

valores de resolución (R), capacidad (k’) y selectividad (α), los cuales fueron

analizados para determinar las condiciones experimentales óptimas de trabajo a

30ºC. Las ecuaciones utilizadas se indican a continuación 22.

R = (tr-t0)12(w2-w1)

Ecuación 1 Ecuación 2 Ecuación 3

Donde,

tr= tiempo de retención.

t0 = tiempo muerto.

w = ancho de pico tomado desde la base.

d) Curva de calibración A partir de la disolución madre de PFNB se prepararon un set de 6 disoluciones en

un intervalo de concentración de 5×10-4 M hasta 5×10-6 M, las que fueron llevadas a

10 mL de volumen con acetonitrilo. Todas las mediciones fueron realizadas por

duplicado.


~ 19 ~

e) Estudio de repetibilidad Se procedió a realizar 7 mediciones de 3 disoluciones de distinta concentración: dos

en los extremos de la curva de calibración (1×10-4 M y 6×10-6 M) y uno en medio

(5×10-5 M). Se tomó como parámetro estadístico el coeficiente de variación a cada

una de las concentraciones antes señaladas.

f) Estudio de reproducibilidad Se repitió el estudio de repetibilidad señalado en el punto 2.2.5.e, variando el día de

realización de las mediciones y el operador.

g) Límite de detección y límite de cuantificación Para la determinación del límite de detección y del límite de cuantificación se

procedió de la siguiente manera:

A partir de la curva de calibración determinada en el punto 2.2.5.d se obtuvo el valor

de la pendiente de la recta (m).

Se midieron 3 disoluciones en el extremo de la curva (4×10-6 M, 5×10-6 M y 6×10-6

M) todas por duplicado, obteniéndose los valores promedio de las áreas bajo la

curva (ABC) y la desviación estándar (σ).

Se representó gráficamente ABC promedio versus concentración y se obtuvo la

ecuación de la recta, para extrapolar el valor a concentración cero, con lo cual se

obtiene el valor de la respuesta del blanco (Ybl).

De la misma forma se graficó σ versus concentración, obteniéndose la ecuación de

la recta respectiva y al extrapolar el valor de concentración cero, se obtuvo el valor

de la desviación estándar del blanco (σbl).

Con los datos obtenidos anteriormente, se calculó el límite de detección (LD) y el

límite de cuantificación (LC), usando las siguientes ecuaciones22:

(Ecuación 4)22 ; (Ecuación 5)22


~ 20 ~

Donde: m = pendiente

Ybl = respuesta del blanco

σbl = desviación estándar del blanco.

2.2.6 Estudios de estabilidad a) Estudio de influencia del pH en la cinética de degradación Se estudió la influencia del pH durante la degradación del PCNB y de PFNB a pHs

1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 y 9.0, a una temperatura de 50ºC. Para cada uno

de los pH estudiados, se preparó 25 mL de una disolución madre de PCNB o PFNB

5×10-4 M, con una composición de acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 30:70.

Cada disolución madre fue dividida en 10 viales ámbar de 2 mL y sometida a la

temperatura requerida, tomando un vial a un intervalo de tiempo determinado y

deteniendo la reacción en hielo. Posteriormente, de cada vial seleccionado, se tomó

una alícuota de 50 μL para medir directamente en el cromatógrafo, en tanto que una

alícuota de 1.5 mL fue llevada a un matraz de 5 mL, se agregó 2.05 mL de

acetonitrilo y se completó a volumen con disolución tampón al pH óptimo para ser

medido por PPD (pH 6.8 para PCNB y pH 7.0 para PFNB) a temperatura ambiente.

Cada disolución obtenida de esta forma tuvo una concentración de 1.25×10-4 M, y

una composición de acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 50:50.

b) Estudio de la influencia de la temperatura en la cinética de degradación Se estudió el efecto de la temperatura en la cinética de degradación de PCNB y

PFNB a 3 temperaturas: 30ºC, 40ºC y 50ºC. El pH 2 fue elegido como el adecuado

para realizar estos estudios, debido a su velocidad de degradación. Las disoluciones

estudiadas se realizaron de la misma manera descrita en el punto 2.2.6.a.

c) Estudio de la influencia de la composición de la disolución en la cinética de degradación Se realizaron estudios para PFNB variando la composición de la disolución, a la

misma temperatura y a igual pH. Las composiciones estudiadas fueron 30:70, 40:60

y 50:50 de acetonitrilo: tampón Britton-Robinson a 50ºC a pH 2. Las disoluciones se


~ 21 ~

prepararon de la misma forma indicada en el punto 2.2.6.a, variando para cada una

la cantidad de acetonitrilo y tampón Britton-Robinson agregada.

d) Estudio de Influencia del pH en la cinética de degradación por HPLC Se procedió de la misma manera que en el punto 2.2.6.a, utilizando las mismas

disoluciones y la alícuota de 20 µL fue tomada antes de proceder con la disolución

efectuada para PPD. Por lo tanto la concentración de la disolución inyectada en el

HPLC fue 5×10-4 M, para cada pH en estudio.

e) Estudio de la influencia de la temperatura en la cinética de degradación por HPLC Se procedió de la misma manera que en punto 2.2.6.a, utilizando las mismas

disoluciones y procediendo de igual forma que en el punto 2.2.6.b.

f) Estudio de la influencia de la composición de la disolución en la cinética de degradación. Se procedió de la misma forma que en punto 2.2.6.a, utilizando las mismas

disoluciones indicadas 2.2.6.c

g) Cálculo de la constante de velocidad de la reacción Se determinó el valor de la constante de velocidad (kobs) para cada valor de pH, para

cada temperatura y para cada composición de la disolución; graficando cada

experiencia como el logaritmo natural de la concentración vs tiempo, en que kobs

corresponde a la pendiente de la regresión lineal para cada gráfico. Las

concentraciones obtenidas están en moles/litro (M) y el tiempo en minutos (min.)

Ecuación 623

Las unidades para kobs obtenidas son minutos-1 (min-1).


~ 22 ~

h) Cálculo de la vida media (t1/2) Se calculó la vida media para cada pH de la disolución degradada, utilizando la

siguiente ecuación:

/ Ecuación 723

El uso de esta ecuación es valida, debido a que la degradación de PCNB y PFNB

tiene una cinética de pseudo primer orden23.

i) Cálculo de la vida de estantería (t90) Se calculó la t90 para cada pH de la disolución degradada, utilizando la siguiente

ecuación:

. Ecuación 823

El uso de esta ecuación es valida, debido a que la degradación de PCNB y PFNB

tiene una cinética de pseudo primer orden 23.

j) Determinación del perfil de pH Para la determinación del perfil de pH se utilizaron los valores de kobs obtenidos en

los estudios de la influencia del pH (2.2.6.a y 2.2.6.d). Estos datos fueron graficados

como logaritmos en base 10 de kobs (log kobs) vs pH, donde se determinó la ecuación

de la cinética de degradación de los compuestos estudiados, además de la

especificación de los intervalos de pH donde la degradación se veía influenciada por

catálisis ácida, catálisis básica y catálisis general, obteniéndose las

correspondientes constantes para cada catálisis.

Para determinar la ecuación de la cinética de los compuestos estudiados, se

estableció la ecuación hipotética de cinética, para luego utilizar los datos obtenidos

experimentalmente y corroborar que esta ecuación fuera correcta con los datos

obtenidos 23.


~ 23 ~

Para determinar el valor de k1, correspondiente al tramo ácido del perfil de

degradación se utilizó la ecuación:

Ecuación 923

Para determinar el valor de k3, correspondiente al tramo básico del perfil de

degradación se utilizo la ecuación 10.

Ecuación 1023

k) Determinación de la energía de activación (Ea) y ecuación de Arrhenius Para la determinación de la Ea, se utilizaron los datos obtenidos en los estudios de

la influencia de la temperatura en la cinética de degradación (2.2.6.b y 2.2.6.e).

Estos datos se graficaron como log k vs 1/T, donde la temperatura se usó en ºK. La

Ea fue obtenida según la ecuación:

.

Ecuación 1123,

Donde la pendiente del gráfico log k vs 1/T será igual a –Ea/ 2.303RT.

l) Determinación del valor de Q10

Para determinar el valor de Q10 se utilizaron los datos obtenidos en el estudio de la

influencia de la temperatura (2.2.6.c y 2.2.6.f.)

Ecuación 1223

Donde: Ea= energía de activación

R= constante de los gases ideales (1.987×10-3 Kcal/ºK mol)

T= temperatura en ºK

k= pendiente de la recta para cinética de orden uno


~ 24 ~

2.2.7 Análisis estadístico. Para saber si los datos obtenidos por el uso de PPD con aplicación quimiométrica y

los datos obtenidos por HPLC son comparables, se debe aplicar una prueba de

significación. Esta prueba consiste en determinar si las diferencias entre los

resultados obtenidos por ambos métodos, son significativas o se pueden justificar

sólo por variables aleatorias.21

Para comparar los métodos, se realizará una prueba de t para muestras

emparejadas usando los valores de concentraciones iniciales obtendios para cada

una de las experiencias realizadas

La prueba de t para muestras emparejadas, determina la diferencia que existe entre

pares de datos que serán comparados entre sí. Luego de debe obtener la media y la

desviación estándar de las diferencias. Una vez obtenidos estos valores, se procede

a determinar el valor para t, con la siguiente ecuación:

√ / Ecuación 1321

Donde:

= media

n= numero de muestras

sd= desviación estándar

Donde t tiene (n-1) grados de libertad y su valor crítico se obtiene a través de tablas

estadísticas. Si el valor del t obtenido mediante la ecuación 11 es menor al valor de t

critico, se acepta que los métodos no tienen diferencias significativas entre si.

Para determinar si los métodos utilizados son aplicables de igual forma a los

estudios de estabilidad, se realizará una prueba de regresión de la curva, con el fin

de determinar si existen diferencias significativas en los valores de kobs obtenidos al

realizar dichas experiencias. La prueba de la regresión de la curva consiste en

graficar los valores obtenidos por medios del método de referencia (en nuestro caso

HPLC) con los valores del método nuevo (PPD con aplicación de calibración

multivariada), determinando lo valores del intercepto, pendiente y r2. Para que los


~ 25 ~

datos no posean diferencias estadísticas significativas, los valores ideales de los

parámetros requeridos son de 0 para el intercepto y de 1 para la pendiente y r2.

Además, se establecen valores de desviación tanto para el intercepto y la pendiente.

Las ecuaciones utilizadas para estas desviaciones son las siguientes:

∑∑ Ecuación 1421

∑ Ecuación 1521

∑ Ecuación 1621


~ 26 ~

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1 Caracterización electroquímica

Se caracterizaron electroquímicamente, tanto los compuestos estudiados

(PCNB y PFNB) como su producto de degradación (NB), utilizando polarografía de

pulso diferencial (PPD) bajo distintas condiciones de pH, en disolución tampón

Britton-Robinson 0.1 M.

Al observar los polarogramas para los tres compuestos (figura 3), se

aprecian señales bien definidas a los distintos pH estudiados, que se desplazan a

potenciales más negativos, a medida que el pH aumenta. Además se aprecian dos

señales distintas: una señal principal (señal 1) a potenciales bajos, que se debe a la

reducción del grupo nitro que poseen los compuestos y una segunda señal, de

menor intensidad (señal 2), que se debe probablemente a la reducción del enlace

azometino.24

Respecto a la evolución de los potenciales de pico (EP) en función del pH del

medio, se puede apreciar que los tres compuestos exhiben una dependencia lineal

del potencial de pico con el pH del medio, para su señal principal (figura 4). Para

PCNB se observa un quiebre en el potencial de pico de esta señal a pH 8, en tanto

que para PFNB este punto de quiebre se produce a pH 4. Por otra parte, NB

presenta dos quiebres en cada señal, el primero a pH 5 (señales 1 y 2), y el

segundo a pH 9 para la señal 1, y pH 8.5 para la señal 2. Además, puede

observarse en la figura 4, que a pH superiores a los indicados, el potencial de pico

de NB se mantienen prácticamente independiente del pH. En la tabla 4 se presenta

un resumen de las pendientes obtenidas en cada tramo lineal.

Resultados y Discusión

~ 27 ~

0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1.0 -1.2 -1.40.0

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

-1.0

-1.2

-1.4

I / µ

A

E / V

pH 3.0 pH 4.1 pH 6.1 pH 8.1 pH 11.0

CpH

Señal 1

Señal 2

Figura 3. Polarogramas a distintos pH de PCNB (A), PFNB (B) en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) y de NB (C) en etanol: tampón Britton-Robinson 0.1 M

(30:70)25-27

0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1.0 -1.20.0

-0.5

-1.0

-1.5

-2.0

-2.5

I/µA

E/V

2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

pHASeñal 1

Señal 2

0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1.0 -1.20.0

-0.5

-1.0

-1.5

-2.0

i / μ

A

E / V

pH3 pH5 pH7 pH9

BpHSeñal 1

Señal 2


~ 28 ~

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10200

300

400

500

600

700-E

p / m

v

pH

A

2 4 6 8 10 12

-200

-400

-600

-800

-1000

-1200

-1400

-1600 Señal 1 Señal 2

E P /

mV

pH

C

3 4 5 6 7 8 9

-0.3

-0.4

-0.5

-0.6

-0.7

-0.8

E p /

V

pH

B

Figura 4. Dependencia del potencial de pico (EP) con respecto al pH. PCNB (A), PFNB (B) en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) y de NB (C) en etanol: tampón Britton-

Robinson 0.1 M 25-27

Estos puntos de quiebre se deberían a cambios en la protonación-

desprotonación de la especie electroactiva que accede a las superficie del

electrodo, y que se deberían al nitrógeno de carácter débilmente básico presente en

cada molécula (N-1), siendo consecuente la gráfica 4C con la presencia de dos

grupos ionizables en el NB (N-1 y N-3). En efecto, PCBN y PFBN presentan valores

de pKa de 4.69 y 4.86, respectivamente, en tanto que NB exhibe valores de pKa1 =

5.69 (N=C) y pKa2 = 11.38 (N-H)25-27.


~ 29 ~

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

-0.4

-0.6

-0.8

-1.0

-1.2

-1.4

Ip/μ

A

pH

C

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

Ip /

μA

pH

B

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

2.6

I p / μ

A

pH

A

Tabla 4. Valor de las pendientes de los gráficos EP – pH para NB, PCNB y PFNB.

aTramo 1: pH 2-8, tramo 2: pH 8-10 bTramo 1: pH 3-4, tramo 2: pH 4-10 cTramo 1: pH 3-5, tramo 2: pH 5-9, tramo 3: pH 9-12 dTramo 1: pH 3-5, tramo 2: pH 5-9, tramo 3: pH 9-12

La evolución de las corrientes de pico (IP) respecto del pH para los tres

compuestos estudiados, se puede apreciar en la figura 5. PCNB presenta un

incremento lineal de IP entre pH 2 y 6, disminuyendo en forma lineal entre pH 6 y 8,

volviendo a aumentar de la misma forma entre pH 8 y 11 (figura 5-A). Por otra parte,

PFNB presenta un aumento lineal de IP entre pH 3 y 6.5, seguido de una

estabilización de la corriente para luego decaer (figura 5-B).

En el caso de NB, se aprecia un incremento no lineal de IP hasta pH 5, a

partir del cual se produce un descenso de IP hasta pH 9, para luego volver a

aumentar a partir del pH 10 (figura 5-C). Estas variaciones en los valores de IP con

respecto al pH se podrían explicar por el efecto de la protonación y desprotonación

de los nitrógenos presentes en la molécula, de forma análoga a lo observado con el

comportamiento de los potenciales de pico de cada sustancia. Figura 5. Relación IP vs pH de PCNB (A), PFNB (B) en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson

0.1 M (30:70) y NB (C) en etanol: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70)25-27

Valor de pendientes (mV/pH)

Tramo 1 r2 Tramo 2 r2 Tramo 3 r2

PCNBa 59.4 0.9996 30.8 0.9963 - -

PFNBb 77.0 1 53.6 0.9980 - -

NB (1era señal)c 28.3 0.9833 53.4 0.9991 15.4 0.9505

NB (2da señal)d 70.4 0.9839 151.9 0.9923 34.32 0.6329


~ 30 ~

0.0 -0.5 -1.0 -1.50.0

-0.4

-0.8

-1.2

-1.6

-2.0

I/μA

E/V

Mezcla 1 Mezcla 2 Mezcla 3 Mezcla 4 Mezcla 5 Mezcla 6 Mezcla 7 Mezcla 8 Mezcla 9 Mezcla 10 Mezcla 11 Mezcla 12 Mezcla 13 Mezcla 14

A

0.0 -0.5 -1.0 -1.50.0

-0.5

-1.0

-1.5

-2.0

I/μA

E/V

Mezcla 1 Mezcla 2 Mezcla 3 Mezcla 4 Mezcla 5 Mezcla 6 Mezcla 7 Mezcla 8 Mezcla 9

B

3.2 Desarrollo del método polarográfico asistido por quimiometría a) Calibración del modelo multivariado. Con el fin de establecer tanto el comportamiento de los compuestos

estudiados frente a su producto de degradación, como la relación entre la

concentración y la intensidad de corriente (IP), se realizaron mezclas de cada uno de

los analitos (PCNB y PFNB) junto con su producto de degradación (NB), como que

se indica en el punto 2.2.4. Las gráficas obtenidas para cada una de las mezclas

consideradas se presentan en la figura 6.

Figura 6. Polarogramas de mezclas para PCNB (A) y PFNB (B) junto con su producto de degradación (NB).

Como se observa en la figura 6, los analitos de interés y su producto de

degradación presentan una solapación parcial en la región de potenciales de -0.5 V,

sin observarse cambios en la morfología de ninguna de las señales obtenidas.

b) Validación del modelo quimiométrico Para determinar el numero de factores (A) se procedió a realizar una

validación cruzada. Para esto se utilizaron las mezclas de compuestos establecidas

en el punto 2.2.4.a y además soluciones de cada analito por separado (PCNB y NB),

cuyas concentraciones se muestran en la tabla 5.


~ 31 ~

Tabla 5. Concentraciones de PCNB y NB utilizadas en la validación cruzada.

Muestra nº PCNB (M) NB (M)

1 1×10-3 1×10-3

2 7×10-4 7×10-4

3 5×10-4 5×10-4

4 4×10-4 1×10-4

5 3×10-4 7×10-5

6 2×10-4 5×10-5

7 1×10-4 1×10-5

8 5×10-5 -

9 3×10-5 -

Con los datos obtenidos, se determinó el error predictivo de la suma de los

cuadrados (PRESS) de cada número de factores (A) y se procedió a hacer un

estudio estadístico de la variación de PRESS frente al número de factores (figuras 7

y 8).

Para validar el modelo quimiométrico multivariado, se evaluó el error relativo

de predicción (%REP) y la correlación entre los valores de concentraciones

Figura 7. Gráfico del error predictivo de la suma de cuadrados (PRESS) vs. número

de factores (A) para PCNB.

Figura 8. Gráfico de SEC (Standar error of calibration) vs. número de factores (A) para PCNB.

SEC

SEC vs. A


~ 32 ~

predichos y reales, obteniendo un %REP = 5.4 %, con un error estándar de

predicción = 6.5×10-6 (r2=0.97038), para una número de componentes (A) de 4.

La correlación entre los valores de concentraciones predichos y los valores

ideales se observa en la figura 9.

Como se observa en la figura 9, las pendientes obtenidas tiene un valor

cercano a 1 (0.933395), lo que indica una buena correlación entre los datos

analizados.

Como última prueba de validación, se realizó la prueba de exactitud de la

elipse, cuyo resultado se muestra en la figura 10. Como se observa en la figura 10,

el modelo de calibración multivariada aplicado, pasa la prueba de exactitud, ya que

el punto ideal determinado para este modelo, se encuentra dentro de la elipse.

Para PFNB, debido a que la extensión de la degradación de éste es similar a

la PCNB, se determinó el grado de solapamiento de las señales en concentraciones

de 5×10-4 M de cada compuesto (PFNB y NB por separado) y luego se realizaron

las mezclas indicadas en la tabla 3 (punto 2.2.4.a) y graficadas en la figura 6-B.

Slope : 0.93395 SD : 0.10274 Intercep : 1.8619x10-6 SD : 7.7227x10-6

Figura 9. Gráfico de la correlación entre valores de [C] reales y predichos para PCNB.

Figura 10. Gráfico de prueba de exactitud de la elipse para PCNB.


~ 33 ~

c) Cifras de mérito Se determinaron las cifras de mérito correspondientes para cada uno de los

compuestos estudiados. Los valores obtenidos se muestran en la tabla 6.

Tabla 6. Valores de cifras de mérito para PCNB y PFNB

3.3 Cromatografía líquida de alta eficiencia

a) Ensayo de aptitud del sistema

Para la selección la fase móvil óptima, se debe elegir aquélla donde se

cumplan las siguientes condiciones:

• El valor de α (selectividad) debe estar entre 1 y 2. Valores de α menores que 1

generan malas separaciones y valores mayores que 2 dan malas separaciones,

debido a que los tiempos de retención son muy extensos.

• Los valores de R (resolución) deben ser lo más cercanos a 1.5, ya que en este

valor se obtienen picos bien definidos, logrando la separación de los componentes

en forma completa.22 Usando las ecuaciones 1, 2 y 3, se obtuvieron los valores para R, k’ y

α respectivamente, en cada composición de fase móvil estudiada, los cuales se

presentan en la tabla 7 y se representan gráficamente en la figura 11.

Sensibilidad (A x M-1)

Sensibilidad Analítica (M-1)

1/ Sensibilidad Analítica (M)

Selectividad LOD/M Error Medio

PCNB 1.3×10-3 4.8×105 2.083×10-6 1.1×10-1 6.2×10-6 4.5×10-9

PFNB 2.0×10-2 7.5×105 1.33×10-6 7.7×10-1 3.9×10-6 2.0×10-8


~ 34 ~

80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20

2

4

6

8

10

0

2

4

6

8

10

12

k'α

% acetonitrilo

k' α

Rtr

R tr

A

80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 200

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

k'α

% acetonitrilo

k' α

Rtr

B R tr

Tabla 7. Valores de R, k’ y α obtenidos a distintas composiciones de fase móvil (acetonitrilo: agua) para PFNB y NB a 30°C.

Figura 11. Gráficas del ensayo de aptitud del sistema de PFNB (A) y NB (B) por HPLC

PFNB NB

Fase Móvil

tr (min) k’ α R

tr (min) k’ α R

80/20 2.64 0.7280 2.5308 1.4933 1.97 0.2877 5.2892 1.9418

75/25 3.29 1.1916 3.0253 2.2481 2.10 0.3939 1.6536 0.6686

70/30 3.95 1.6530 3.7093 4.5932 2.15 0.4456 2.0060 1.2109

65/35 4.97 2.2805 3.9576 4.9181 2.39 0.5762 1.8937 1.2059

60/40 6.08 3.1040 4.2447 6.0240 2.56 0.7313 1.9478 1.5057

55/45 8.80 4.8908 5.0533 7.0284 2.94 0.9678 2.1188 1.9904

50/50 12.18 7.1356 7.1166 10.5935 3.00 1.0027 2.1722 1.8000

45/55 10.11 5.7969 5.2369 10.5934 3.13 1.1069 2.1859 1.7010

40/60 8.70 4.7038 5.2625 8.8314 2.89 0.8938 1.6062 1.3886

35/65 7.21 3.7874 4.2986 8.3314 2.83 0.4684 1.5945 1.6800

30/70 6.52 3.3236 4.4670 7.7800 2.63 0.7440 1.5320 1.2706

25/75 8.29 4.6031 5.0655 8.2997 2.82 0.9087 1.5224 1.4640

20/80 8.17 4.1585 3.8230 7.3884 3.31 1.0878 4.1922 3.9360


~ 35 ~

Según lo que se observa tanto en la figura 11 como en la tabla 7, la

composición de fase móvil elegida para hacer los estudios de estabilidad del PFNB

fue de acetonitrilo: agua (60:40). Si bien los valores de k’ = 3.1040, α = 4.2447 y r =

6.0240 obtenidos para PFNB no son los más cercanos a lo óptimo, se deben tener

en cuenta los tiempos de retención. Si observamos la tabla 7, para los valores de α

y R óptimos que se obtuvieron con la composición de la fase móvil acetonitrilo: agua

(80:20), el tiempo de retención es de 2.64 minutos, lo que es muy cercano al tiempo

de retención del producto de degradación (NB) a esa misma composición. Por este

motivo, se tomó como criterio principal el que las señales de NB y PFNB se

obtuvieran en el cromatograma a tiempos de retención tales que las señales puedan

apreciarse totalmente separadas y a un tiempo de retención razonable, lo que se

alcanza con la composición seleccionada, en los que se obtienen tiempos de

retención es de 6.08 min. para PFNB y de 2.56 min. para NB

Después de alcanzar su mayor tiempo de retención (12.18 min.), PFNB

presenta un comportamiento poco usual al cambiar la composición de la fase móvil,

pues los tiempos de retención de hacen cada vez más pequeños al ir aumentando la

polaridad de la fase móvil.

b) Curva de calibración Luego de obtener los parámetros adecuados, se realizó una curva de

calibración, relacionando el área bajo de la curva (ABC) con la concentración del

analito. En la figura 12 se muestra la curva de calibración realizada, la cual quedó

definida por la siguiente ecuación:

ABC = 7095.3 + 1.87783×1010 [C] (r=0.99998, n= 6)


~ 36 ~

0.0 3.0x10-5 6.0x10-5 9.0x10-5 1.2x10-4 1.5x10-40.0

5.0x105

1.0x106

1.5x106

2.0x106

AB

C

C/ M

Figura 12. Curva de calibración por HPLC de PFNB, en fase móvil acetonitrilo: agua (60:40)

c) Limites de detección y limites de cuantificación Los límites de detección y de cuantificación fueron determinados usando los

datos experimentales obtenidos, según se indica en el punto 2.2.5. y aplicando las

ecuaciones 4 y 5. Los valores obtenidos para LD y LC fueron 5.51×10-7 y 7.33×10-7

M, respectivamente.

d) Estudio de repetibilidad Se realizó el estudio de repetibilidad con en fin de establecer la confianza de

los datos obtenidos bajo el método analítico de HPLC, encontrándose valores

menores al 3% para las tres concentraciones ensayadas (tabla 8)

Tabla 8. Valores de CV para el estudio de repetibilidad de PFNB en HPLC. Concentración (M) CV (%)

1×10-4 2.80

5×10-5 0.91

6×10-6 1.75


~ 37 ~

e) Estudio de reproducibilidad Se realizó este estudio, con el fin de establecer el nivel de confianza que

aportan los datos obtenidos por medio del HPLC pare el PFNB. Los valores de CV

obtenidos para cada concentración estudiada se informan en la tabla 9.

Tabla 9. Valores de CV para el estudio de reproducibilidad de PFNB por HPLC

Concentración (M) CV (%)

1×10-4 3.09

5×10-5 0.57

6×10-6 1.85

f) Comparación de los métodos utilizados

Para determinar si los métodos son comparables estadísticamente entre si,

se realizó una prueba t para muestras emparejadas a las determinaciones de

concentraciones iniciales obtenidas por PPD con aplicación de quimiometría y por

HPLC, aplicando la ecuación 13.

Para este efecto, se tomaron todos los valores de concentraciones obtenidos

en las distintas experiencias del estudio de degradación y cinético, de ambos

compuestos.

En el caso de PCNB, se obtuvo un valor para t = 4.05×10-3, que es menor

que el valor critico de t = 2.31 (P=0.05) para un n = 9 concentraciones iniciales.

En el caso de PFNB, el valor de t obtenido fue de 8.00×10-2 que, comparado

con su valor critico t = 2.18 para n = 14 concentraciones iniciales determinadas, es

mucho menor.

Con los datos anteriores, se puede observar que los valores de las

concentraciones iniciales obtenidas por ambos métodos utilizados, (PPD con

aplicación de calibración multivariada y HPLC) son estadísticamente comparables y

no presentan diferencias significativas, siendo posible afirmar que ambos métodos

son estadísticamente similares y comparables entre si.


~ 38 ~

0.0 -0.3 -0.6 -0.9 -1.2 -1.50.0

-0.5

-1.0

-1.5

-2.0

-2.5

NB

I / µ

A

E / V

PCNBA

0.0 -0.3 -0.6 -0.9 -1.2 -1.50.0

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

-1.0

-1.2

-1.4

-1.6

NB

P F N B

I/uA

E/V

B

3.4 Estudios de estabilidad

En la figura 13 se presentan los polarogramas obtenidos al realizar el

seguimiento de la degradación de PCNB y PFNB.

Figura 13. Degradación de PCNB (A) y PFNB (B) a pH 7 en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) a 50°C.

Como se puede observar, las señales de los compuestos y de su producto

de degradación se solapan parcialmente en una región del potencial de barrido,

haciendo imposible la determinación de la concentración en forma directa, a partir

de los resultados obtenidos mediante polarografía de pulso diferencial. Este

aparente impedimento en el uso de esta técnica electroquímica, abre la posibilidad

de la aplicación de la quimiometría para tratar los datos obtenidos y así determinar

las constantes cinéticas de importancia en tal estudio.


~ 39 ~

0 200 400 600 800 1000 12000.0

2.0x10-5

4.0x10-5

6.0x10-5

8.0x10-5

1.0x10-4

1.2x10-4

1.4x10-4

1.6x10-4

C/M

t/min

B

0 20 40 60 80 100 120 140 1600.0

1.0x10-4

2.0x10-4

3.0x10-4

4.0x10-4

5.0x10-4

C /

M

t/min

A

a) Estudio de la influencia del pH sobre la cinética de reacción Se determinó el orden de reacción de la degradación de los compuestos

estudiados, resultando ser de pseudo-primer orden para ambos compuestos en todo

el intervalo de pH estudiado, como se aprecia en la figura 14 para el caso de pH 3.

Figura 14. Curva de concentración (M) vs tiempo (minutos) para PCNB (A) y PFNB (B), a pH

3 en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1M (30:70) a 50°C.

0 200 400 600 800 1000 1200-12

-11

-10

-9

-8

ln [C

]

t/min

0 50 100 150 200 250 300 350

-10.2

-10.0

-9.8

-9.6

-9.4

-9.2

-9.0ln

[C]

t/min


~ 40 ~

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

-12.0

-11.2

-10.4

-9.6

-8.8

-8.0 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 8

ln [C

]

t/min0 50 100 150 200 250

-12.0

-11.2

-10.4

-9.6

-8.8

-8.0 pH 1 pH 2 pH 7

ln [C

]

t/min

0 50 100 150 200 250

-10.0

-9.5

-9.0

-8.5

pH4 pH 7 pH 8

ln [C

]

t/min0 100 200 300 400 500 600 700

-13.0

-12.5

-12.0

-11.5

-11.0

-10.5

-10.0

-9.5

-9.0

-8.5 pH 2 pH 3 pH 5 pH 6

ln [C

]

t/min

Figura 15. Gráficos de logaritmo natural de la concentración (ln [C]) versus tiempo (t/min) de PCNB (A) y PFNB (B) en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) a 50°C.

A partir de la pendiente de los gráficos anteriores (figura 15), se obtuvo el

valor de la kobs para cada pH de cada compuesto. Los valores obtenidos se

presentan el las tablas 10 y 11 y se comparan con los valores obtenidos por HPLC,

para las mismas cinéticas de degradación.

B

A


~ 41 ~

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.070.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

k obs P

PD

kobs HPLC

Tabla 10. Valores obtenidos para la kobs mediante PPD y HPLC para PCNB en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) 50 °C.

Si observamos los datos presentados en la tabla 10, podemos ver que los

valores se encuentran dentro de mismo orden, poseen buenos coeficientes de

regresión, pero difieren en su valor. El valor para el pH 5 no se determinó aplicando

el método de HPLC, debido a problemas con el compuesto de estudio ajeno a la

reacción.

Para establecer la similitud de los valores de kobs obtenidos por ambos

métodos, se utilizará el método de regresión de la recta. Los valores obtenidos se

informan en la figura 16.

Figura 16. Correlación de kobs a distintos pH (50°C) por PPD vs HPLC para PFNB.

(Tabla 10)

PPD HPLC

pH kobs (min-1) r2 Error (min-1) kobs (min-1) r2 Error (min-1) 2 0.02261 0.9995 4.3×10-4 0.01706 0.9908 1.8×10-4

3 0.00390 0.9909 5.2×10-5 0.00309 0.9938 1.0×10-4

4 0.00244 0.9859 9.7×10-5 0.00227 0.9827 1.1×10-4

5 0.00111 0.9036 1.5×10-4 ---- ---- ----

6 0.00227 0.9872 8.6×10-5 0.00320 0.9929 9.3×10-5

7 0.00484 0.9855 1.2×10-4 0.00713 0.9981 1.3×10-4

8 0.02270 0.9625 1.2×10-3 0.06695 0.9899 4.8×10-3

Intercepto = 0.00465 ± 0.01045 Pendiente = 0.30962 ± 0.36756 r2 = 0.61113


~ 42 ~

Los datos obtenidos para los parámetros de la regresión de la recta del

PCNB difieren notoriamente de los parámetros ideales (intercepto = 0; pendiente y r2

=1), por lo tanto podemos decir que los resultados obtenidos sí presentan

diferencias estadísticas significativas y por ende no son comparables. Esta situación

se debería a que el modelo multivariado para PCNB no fue establecido usando el

diseño experimental.

Como se observa en la tabla 10, los valores de las kobs van disminuyendo

desde pH 2 hasta llegar a pH 5, desde donde vuelven a aumentar su valor hasta el

pH 8, lo que nos sugiere que existe un punto de quiebre definido en el

comportamiento de este compuesto en relación a su degradación a distintos pH y

este se encontraría en el pH 5.

Los valores de pH 1 y pH 9 no fueron incluidos en este estudio, debido a que

la velocidad de degradación no permitió establecer si ésta estaba influenciada de

mayor forma por la temperatura, que por el pH de la muestra.

Tabla 11. Valores obtenidos para la kobs mediante PPD y HPLC para PFNB en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) 50 °C.

PPD HPLC

pH kobs (min-1) r2 Error (min-1) kobs (min-1) r2 Error (min-1) 1 0.05903 0.9532 6.5×10-3 0.05911 0.9966 1.7×10-3

2 0.01898 0.9336 2.5×10-3 0.00802 0.9943 2.0×10-4

3 0.00223 0.9903 9.9×10-5 0.00267 0.9979 5.5×10-5

4 0.00133 0.9989 1.7×10-5 9.2×10-4 0.9901 2.5×10-5

5 8.5×10-4 0.9933 2.9×10-5 9.1×10-4 0.9968 1.9×10-5

6 6.9×10-4 0.9702 4.1×10-5 0.00116 0.9955 3.9×10-5

7 0.00389 0.9675 4.1×10-4 0.00317 0.9897 1.1×10-4

8 0.0415 0.9874 2.1×10-3 0.05779 0.9950 2.1×10-3

Como se observa en la tabla 11, las kobs obtenidas por ambos métodos

analíticos son similares, ya que se obtiene valores muy parecidos entre cada una de

las determinaciones.


~ 43 ~

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.060.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06k ob

s PPD

kobs HPLC

Al igual que en el caso de PCNB, se aplicó la regresión de la recta para

establecer la diferencia estadística entre los datos obtenidos. Los resultados para

esta regresión se muestran en la figura 17.

Figura 17. Correlación de kobs a distintos pH (50°C) por PPD vs HPLC para PFNB.

(Tabla 11)

Según los datos informados en la figura 17, PFNB posee valores más

cercanos a los ideales para la prueba de la regresión de la recta, pudiéndose

establecer que no hay diferencias estadísticas significativas en los valores obtenidos

mediante el uso de ambos métodos.

Al observar los valores de la kobs podemos decir que para PFNB la velocidad

de reacción va decayendo en el rango de pH 1 a 6, para luego subir a partir de pH 7.

También se puede observar que las velocidades más bajas para esta reacción se

presentan en los pH 4, 5 y 6.

El pH 9 no fue incluido en la tabla 11, debido a que la velocidad de reacción

era demasiado rápida, por lo que no se pudo estimar si la velocidad estaba

influenciada por la temperatura a la cual se realizó la experiencia, o si la rapidez de

la reacción se debía a que el PFNB es inestable a pH demasiado alcalinos.

Otra observación que es importante de hacer, es la diferencia que presentan

los valores obtenidos para kobs por ambas técnicas aplicadas en el compuesto

Intercepto = 0.00332 ± 0.00286 Pendiente = 0.81297 ± 0.09709 r2 = 0.9167


~ 44 ~

PCNB (tabla 10), situación que no se aprecia en el caso de PFNB. Esto se debería a

que el set de calibración no fue determinado bajo la aplicación del diseño

experimental como lo fue para PFNB (tabla 11), implicando que la curva no fue

realizada dentro de los intervalos de concentración reales que se esperaban obtener

de las muestras a determinar en los experimentos. Hay que considerar que el PCNB

fue la primera sustancia estudiada, por tanto, la realización de la mezclas con el

diseño experimental, fue una opción que se tomó como herramienta para mejorar la

correlación entre ambos métodos. Con los datos obtenidos en la comparación de ambos métodos, utilizando

los datos obtenidos por HPLC como referencia, se puede afirmar que el método

quimiométrico aplicado resuelve de buena manera la solapación de las señales y

que es aplicable a esta técnica analítica. Ahora bien, no hay que olvidar que los

datos obtenidos para PFNB son mejores que los datos obtenidos para PCNB;

podemos decir de igual manera, que la aplicación quimiométrica es buena, sólo que

para PCNB se deberían ajustar las concentraciones de las mezclas usadas para

establecer el modelo, y de esta formar se lograría obtener resultados aún mejores.

A partir de los valores obtenidos para la kobs (tablas 10 y 11), se

determinaron parámetros cinéticos de importancia, como son vida media (t1/2)

(Ecuación 7) y vida de estantería (t90) (Ecuación 8). Los resultados se resumen en la

tabla 12, para cada uno de los pH ensayados.

Tabla 12. Valores de t1/2 y t90 para PCNB y PFNB

PCNB PFNB

pH t1/2 (min) t 90 (min) t1/2 (min) t 90 (min)

1 ---- ---- 11.74 1.78

2 29.87 4.53 36.51 5.53

3 181.41 27.49 310.76 47.09

4 279.44 42.34 672.81 101.94

5 624.46 94.59 815.29 123.53

6 310.76 47.09 1008.87 152.86

7 143.18 21.69 180.94 27.51

8 17.17 2.60 16.70 2.53


~ 45 ~

0 2 4 6 8

-3.0

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

log

k

pH

PPD HPLC

A

0 2 4 6 8-3.5

-3.0

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

log

k

pH

PPD HPLC

B

Los valores presentados en la tabla 12 son consecuentes con lo descrito

anteriormente, respecto al comportamiento de los valores de kobs en el intervalo de

pH.

Comparando los valores de t1/2 y t90 a los mismos pH para cada uno de los

compuestos estudiados, podemos afirmar que PCNB es menos estable que PFNB

bajo las condiciones estudiadas, siendo el pH 8 el único pH donde los valores se

invierten. Esto se debería a que PFNB es más inestable a pH básicos que PCNB.

Usando los valores obtenidos en las tablas 10 y 11 se determinó el perfil de

velocidad-pH característico para cada reacción de degradación, el cual se

representa en la figura 18.

Figura 18. Perfil de pH para PCNB (A) y PFNB (B) en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson

0.1 M (30:70) a 50°C

Al observar la figura 18-A, PCNB presenta regiones de catálisis ácida y

básica bien definidas, evidenciando un cambio del comportamiento de la

degradación entre los pH 3 y 5. Esta zona no es independiente del pH, ya que los

valores obtenidos para log k van cambiando conforme cambia el pH de la solución

estudiada, adoptando un perfil de sigmoidea, superpuesta con un clásico grafico en

forma de V. Esta zona sugiere que la disociación del compuesto provocaría ese

cambio en el comportamiento cinético de la degradación, adoptando la ecuación

cinética la siguiente forma23:


~ 46 ~

Con los datos obtenidos podemos determinar, si en algún tramo de las rectas

obtenidas, las catálisis tanto ácida como básica tienen carácter específico. Para

saber si son específicas o no, se deben obtener los valores de las pendientes. Si se

obtienen valores de estas pendientes iguales o cercanos a 1, se determina que esa

catálisis es específica, dependiendo del rango de pH que se tome para determinar la

pendiente. Con los datos obtenidos podemos determinar, si en algún tramo de las

rectas determinadas, las catálisis tanto ácida como básica tienen carácter

específico. Para saber si son específicas o no, se deben obtener los valores de las

pendientes. Si se obtienen valores de estas pendientes iguales o cercanos a 1, se

determina que esa catálisis es específica, dependiendo del rango de pH que se

tome para determinar la pendiente.

Como se observa en la figura 18-B, para PFNB la curva del perfil de pH

presenta, al igual que PCNB, una zona del rango de pH (pH 3-6) donde cambia su

comportamiento de degradación evidentemente, siendo esta zona influenciada por

el pH del medio de manera mas sutil, provocando una disminución drástica de la

pendiente. En este caso también es posible determinar si las catálisis tanto ácida

como básica son específicas o no. Los valores de pendientes en tramos de pH son

informados en la tabla 13, para ambos compuestos.

Tabla 13. Valores de pendientes en zonas de catálisis para PCNB y PFNB en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1M (30:70) a 50°C.

PCNB PFNB

Intervalo de pH Valor de pendiente Intervalo de pH Valor de pendiente

2-3 0.76324 2-3 0.92999

7-8 0.67118 6-8 1.03485

De los valores obtenidos en la tabla 13, podemos afirmar que PCNB no

poseen regiones de catálisis especificas28,29, siendo informados los rangos donde

las pendientes de la recta dan mas cercanos a 1. En el caso de PFNB sufre de


~ 47 ~

0 2 4 6 8

-3.0

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

log

k

pH

A

k1= 0.1097 min-1

n = 0.41306

k3=6.93x10-6 min-1

m = 0.42609

0 2 4 6 8-3.5

-3.0

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

log

k

pH

k1= 0.223 min-1

n = 0.58717

Bk3=2.79x10-9 min-1

m = 0.89054

catálisis ácida específica y de catálisis básica específica30-32, en el rango de pH que

se indica en la tabla 13.

Debido al cambio evidente de comportamiento que sufren ambos

compuestos estudiados, no se hace posible establecer una ecuación general de

cinética que describa el proceso de degradación de forma única y total. Por este

motivo se procedió a establecer la ecuación cinética que describa la degradación en

el rango de pH bajos y otra ecuación que describa este proceso a elevados valores

de pH, utilizando las ecuaciones 9 y 10.

Para PCNB y PFNB, se estableció, mediante regresión lineal del perfil de pH

(figura 18), los valores de la pendiente y del intercepto, que corresponden a los

valores de n y log k1 en el tramo ácido (pH 2- 3), y m y log k3 en los tramos de pH

básico (pH 6- 8)

Figura 19. Curvas compradas de kobs experimental (■) y kobs teórica (●) obtenidas a través de las ecuaciones cinéticas para PCNB (A) y PFNB (B).

Para PCNB, la ecuación teórica que describe el comportamiento cinético a pH ácido,

es la siguiente:

. .

Y para el intervalo de pH básico es la siguiente

. .


~ 48 ~

En el caso de PFNB las ecuaciones teóricas obtenidas son las siguientes:

Para pH ácidos

. .

Y para pH básicos

. .

Una vez obtenido los valores hipotéticos para las constantes cinéticas (k1 y

k3) para cada intervalo de pH, se calcularon los valores para cada una de las kobs de

los valores de pH estudiados, usando las ecuaciones anteriormente definidas. Estos

valores de kobs resultantes de la interpolación, se compararon mediante la regresión

de la curva, con los datos obtenidos en forma experimental, para observar si la

ecuación hipotética corresponde a la ecuación experimental de la cinética de

degradación de los compuestos estudiados, en el rango de pH establecido. Los

datos analizados se muestran en la tabla 14.

Tabla 14. Valores de kobs experimental y kobs interpolada para PCNB y PFNB (PPD).

PCNB PFNB

pH kobs experimental kobs interpolada kobs experimental kobs interpolada

1 ---- ----- 0.05903 0.05769456

2 0.02261 0.01637143 0.01898 0.01492674

3 0.0039 0.00632451 0.00223 0.00386185

6 0.00227 0.00249725 6.87×10-4 0.00061496

7 0.00484 0.00666118 0.00389 0.00477952

8 0.0227 0.01776811 0.0415 0.03714704

Los gráficos de la prueba de regresión de la curva se muestran en la figura

20 y los valores obtenidos para cada parámetro se informan en la tabla 14.


~ 49 ~

0.000 0.005 0.010 0.0150.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

k obs

Exp

erim

enta

l

kobs Interpolada

A

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.060.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

k obs

Exp

erim

enta

l

kobs Interpolada

B

Figura 20. Correlación entre kobs experimentales e interpoladas a distintos pH para

PCNB (A) y PFNB (B). Técnica: PPD

Tabla 15. Valores de parámetros obtenidos mediante la regresión de la curva.

PCNB PFNB

Intercepto -0.00386 ± 3.4×10-7 1.19×10-4 ± 0.00179

Pendiente 1.52383 ± 0.16 1.05524 ± 0.0624

r2 0.9687 0.9919

Con estos resultados estadísticos, se establece que los valores obtenidos

mediante la aplicación de las ecuaciones teóricas presentan diferencias

significativas, respecto de los valores obtenidos de forma experimental, en el caso

de PCNB. Esto se debería a que los datos experimentales sobre los cuales se

establecieron los parámetros para definir las ecuaciones, no son comparables entre

sí. Como se explicó anteriormente, esto se debería a que el modelo para PCNB se

realizó sin hacer el diseño experimental correspondiente. En el caso de PFNB, los

datos no poseen diferencias estadísticas significativas, con lo que podemos afirmar

que la ecuación teórica, efectivamente describe el comportamiento de las kobs en el

rango de pH establecido.


~ 50 ~

0 50 100 150 200 250 300

-12

-11

-10

-9

-8 30 °C 40 °C 50 °C

ln [C

]

t/min

B

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-11.5

-11.0

-10.5

-10.0

-9.5

-9.0

-8.5

-8.0

30 °C 40 °C 50 °C

ln [C

]

t/min

A

b) Estudio de la influencia de la temperatura sobre la cinética de degradación Los datos obtenidos en el estudio de degradación a distintas temperaturas se

muestran en la figura 17.

Figura 21. Influencia de la temperatura en la cinética de reacción para PCNB (A) y PFNB (B) en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) a pH 2.

Como se puede observar en los gráficos de la figura 21, a medida que

aumenta la temperatura, la pendiente se acerca a 1; por lo tanto el valor de la kobs es

mayor, mostrando que a medida que aumenta la temperatura, aumenta la cinética

de la degradación de estos compuestos. Los valores de las kobs obtenidas en este

estudio se informan en la tabla 16.

Tabla 16. Valores obtenidos para las kobs a distintas temperaturas para PCNB y PFNB

en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) a pH 2

PCNB PPD HPLC

T (°C)

kobs

(min-1) r2 Error (min-1)

kobs


30 0.00649 0.9730 5.4×10-4 0.00496 0.9929 1.5×10-4

40 0.01002 0.9986 1.3×10-7 0.01053 0.9962 2.3×10-4

50 0.01181 0.9942 3.4×10-4 0.0164 0.9946 4.0×10-4


~ 51 ~

0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 0.016 0.0180.006

0.007

0.008

0.009

0.010

0.011

0.012

k obs

PPD

kobs HPLC

A

0.000 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.0080.000

0.004

0.008

0.012

0.016

0.020

k obs

PPD

kobs HPLC

B

PFNB PPD HPLC

T (°C)

kobs


kobs


30 0.00269 0.9786 1.4×10-4 0.00264 0.9969 5.6×10-5

40 0.00607 0.9946 2.0×10-4 0.00588 0.9993 1.1×10-4

50 0.01898 0.9336 2.5×10-3 0.00802 0.9943 2.0×10-4

Al igual que a los datos obtenidos en las experiencias anteriores, se aplicó la

regresión de la curva. Los resultados gráficos de la prueba se muestran en la figura

22 y los valores de los parámetros requeridos se informan en la tabla 17.

Figura 22. Correlación de kobs a distintas temperaturas por PPD vs HPLC para PCNB (A) y PFNB (B). (Tabla 16).

Tabla 17. Valores de parámetros obtenidos mediante la regresión de la curva.

PCNB PFNB

Intercepto 0.00451 ± 7.21×10-8 -0.00656 ± 1.19×10-7

Pendiente 0.4636 ± 0.0948 2.8672 ± 1.360

r2 0.9598 0.81607


~ 52 ~

Como se observa en la tabla 17 los valores obtenidos por ambos métodos

difieren bastante de los valores ideales informados para esta prueba (intercepto =0;

pendiente y r2 = 1). Esto indica, que los valores obtenidos para las kobs, por medio de

ambos métodos analíticos presentan diferencias significativas y por lo tanto no son

equivalentes en esta experiencia.

Si analizamos con detención los datos informados en la tabla 17 y

representados en la figura 22, en el caso de PFNB se observa una mayor influencia

de la temperatura en la kobs (50°C), tal como se informó previamente (figura 21, tabla

16). Esta influencia haría que la reacción de hidrólisis de PFNB a 50°C y pH 2 fuera

más rápida e inestable, incrementando el error en la determinación de los valores de

kobs, debido a la manipulación previa que debe hacerse de la solución para medirla

por PPD.

Este efecto puede apreciarse más claramente al comparar los métodos

tomando sólo los valores de las kobs determinadas a temperaturas menores (30°C y

40°C), en las cuales se observa una buena correlación entre las kobs obtenidas por

PPD y por HPLC, presentando valores para el intercepto y la pendiente cercanos a

cero y a la unidad , respectivamente (intercepto = -6.407×10-5 ± 6.49×10-15;

pendiente = 1.043 ± 3.32×10-7).

En el caso de PCNB, ya se había estimado con anterioridad que los métodos

presentan diferencias significativas entre ellos, debido a que el ajuste del modelo

multivariado no se realizó aplicando en diseño experimental, además que los datos

obtenidos en la regresión de la curva poseen un buen valor de r2.

Para calcular el valor de la energía de activación (Ea) se realizó el graficó log

kobs vs. 1/T, donde la temperatura esta en grados Kelvin (ºK).


~ 53 ~

0.00310 0.00315 0.00320 0.00325 0.00330 0.00335

-2.6

-2.4

-2.2

-2.0

-1.8

-1.6

-1.4

log

k

1/T (ºK)

B

0.00310 0.00315 0.00320 0.00325 0.00330

-2.2

-2.0

-1.8

-1.6lo

g k

1/T (K)

A

Figura 23. Gráficos de log kobs vs. 1/T (K) para PCNB (A) y PFNB (B).

A partir de los gráficos, podemos obtener a través de los valores de las

pendientes, el valor de Ea para cada uno de los compuestos estudiados, siendo

estos valores de 5.5 y 18.8 Kcal/mol, para PCNB y PFNB, respectivamente. Los

valores obtenidos son concordantes con los valores generales de Energías de

activación para hidrólisis de ésteres, lo cual pone de manifiesto la labilidad de estos

compuestos5, siendo PCNB más inestable con la temperatura que PFNB.

A partir de los valores de Ea, podemos calcular el valor de Q10 para un rango

de temperatura, utilizando la ecuación 12. Los valores para cada Q10 en cada rango

de temperatura se muestran en la tabla 18.

Tabla 18. Valores de Q10 para cada compuesto estudiado.

Rango Temperatura (°C) Q10 PCNB Q10 PFNB

30 - 40 1.95 2.71

40 - 60 1.87 2.55

Como se aprecia en la tabla 18, los valores para Q10 son similares para cada

uno de los rangos de temperatura, concluyendo que cada 10°C, la constante de

velocidad kobs aumenta aproximadamente 2 veces para PCNB y 2.5 veces para

PFNB.


~ 54 ~

0 50 100 150 200 250 300-14

-13

-12

-11

-10

-9

-8 30/70 40/60 50/50

ln [C

]

t/min

B

c) Estudios de la influencia de la composición de la disolución en la cinética de degradación

Los resultados obtenidos durante este estudio están representados en la

figura 24. Esta figura muestra que a mayor cantidad de acetonitrilo en la disolución,

y por ende menor composición de tampón, las rectas se alejan del valor 1, siendo

las cinéticas de degradación más lentas.

Figura 24. Influencia de la composición de la disolución en la cinética de degradación de PFNB, en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M a pH 2

Tabla 19. Valores obtenidos para la influencia de la composición en la cinética de degradación de PFNB, en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M a pH 2.

PPD HPLC

Composición kobs r2 Error kobs r2 Error

30/70 0.01898 0.9336 2.5×10-3 0.00802 0.9943 2.0×10-4

40/60 0.00557 0.9936 1.5×10-4 0.00532 0.9943 1.3×10-4

50/50 0.00324 0.9918 9.8×10-5 0.0027 0.9809 1.9×10-4

Como se aprecia en la tabla 19, los valores para la kobs van disminuyendo a

medida que la composición de la disolución se hace más polar, estableciéndose que

la reacción de degradación se ve afectada por la cantidad de agua presente en la

disolución. Este dato obtenido en forma experimental, sumado a la estructura


~ 55 ~

0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008

0.004

0.008

0.012

0.016

0.020

k obs

PPD

kobs HPLC

química de los compuestos, ratifica que la reacción de degradación del enlace

amida es mediada por hidrólisis.

Para comparar los métodos utilizados se utilizó nuevamente la prueba de la

regresión de la curva, cuyos resultados se informan en la figura 25.

Figura 25. Correlación de kobs a distintas composiciones por PPD vs HPLC para PFNB. (Tabla 19)

Como se puede observar en la figura 25, lo datos obtenidos por medio de

ambos métodos presentan diferencias estadísticas significativas, lo cual los hace no

comparables.

Si observamos los datos obtenidos a la composición de 30% acetonitrilo

(Tabla 19), la velocidad de hidrólisis es mayor debido a la cantidad de agua

presente en la disolución e influencian en mayor medida los resultados

experimentales, considerando la manipulación posterior que debe hacerse de la

solución para medir en PPD.

Si consideramos sólo los valores a menores porcentajes de agua en el medio

de la reacción (40% y 50%), se observa una correlación entre los valores de las kobs

obtenidos por ambos métodos bastante mejor, con un intercepto que tiene a cero

(8.39×10-4 ± 1.13×10-13) y una pendiente que tiende a la unidad (0.8893 ± 9,55×10-6).

Intercepto = -0.00661 ± 9.61 x 10-8 Pendiente = 2.9688 ± 1.177 r2 = 0.8642


~ 56 ~

CONCLUSIONES

• PCNB y PFNB exhiben señales polarográficas pH dependientes, que se desplazan a potenciales más catódicos, a medida que el pH se incrementa.

• PCNB y PFNB sufren degradación de pseudo primer orden, pH dependiente e

influenciado tanto por la temperatura como por la composición de la disolución. • Al someter a ambos compuestos a hidrólisis, se genera una nueva señal

polarográfica, debida al producto de degradación 2-(o-nitrofenil)-1H-benzimidazol (NB), la cual se solapa con la señal del compuesto inicial (PCNB o PFNB).

• Las señales solapadas son resueltas utilizando calibración multivariada PLS,

permitiendo determinar las concentraciones de los analitos de interés (PCNB y PFNB), en presencia de su producto de degradación (NB) exitosamente.

• Las metodologías utilizadas (HPLC y PPD con aplicación de calibración

multivariada) fueron comparadas entre sí utilizando la prueba t para muestras pareadas, no observándose diferencias estadísticamente significativas.

• Los perfiles de pH para cada compuesto presentan puntos de inflexión en las

zonas de pH cercanas a sus valores de pKa. • Para PCNB se observan regiones de catálisis ácida general (pH 2-3) y catálisis

básica general (pH 7-8). Para PFNB se observa catálisis ácida específica y catálisis básica específica en los rangos de pH 2-3 y pH 6-8, respectivamente.

• Los valores de kobs para PFNB obtenidos por ambas metodologías exhiben buena

correlación y sin diferencias estadísticamente significativas. Para PCNB, las diferencias observadas entre ambos métodos se deberían a que no se empleó un diseño experimental al establecer el modelo de calibración multivariada aplicado.

• La degradación de ambos compuestos se ve influenciada por la temperatura,

incrementándose la velocidad de la reacción al aumentar el valor de ésta. • Para PFNB, su velocidad de degradación se ve influenciada por la composición

de la solución, aumentando ésta al aumentar la polaridad de la solución.

Referencias

~ 57 ~

REFERENCIAS

1. S. Yoshioka, V.J. Stella. Stability of drugs and dosage forms. 2002, Kluwer Academic Publishers. New York.

2. S. Brain-Isasi, C. Quezada, H. Pessoa, A. Morello, M.J. Kogan, and A. Álvarez-Lueje. Determination and characterization of new benzimidazoles with activity against Trypanosoma cruzi by UV spectroscopy and HPLC. Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 7622.

3. E. Lacey, The role of the cytoskeletal protein, tubulin, in the mode of action and mechanism of drug resistance to benzimidazoles. Int. J. Parasitol. 1988, 18, 885.

4. C. Kus, H. Goker, G. Ayhan, R. Ertyan, N. Altanlar, A. Akin, Farmaco. 1996, 51, 413.

5. C.J. Going, V.W. Mayer, Induction of chromosomes loss in Sacchromyces cerevisiae strain D61.M by selected benzimidazole compounds. Mut. Res. 1995, 343, 185.

6. L. Hall, L. Kier, Molecular connectivity and substructure analysis. J. Pharm. Sci. 1978, 67, 1743.

7. J.S. Kim, B. Gatto, C. Yu, A. Liu, L.F. Liu, E.J. Lavoie, Substituted 2, 5'-Bi-1H-benzimidazoles: Topoisomerase I Inhibition and Cytotoxicity. J. Med. Chem. 1996, 39, 992.

8. H. Nivinskas, R. L. Koder, Ž. Anusevičius, J. Šarlauskas, A. Miller, N. Čėnas, Quantitative Structure–Activity Relationships in Two-Electron Reduction of Nitroaromatic Compounds by Enterobacter cloacae NAD(P)H:Nitroreductase. Arch. Biochem. Biophys. 2001, 385, 170.

9. E. Grunberg, E.H. Titsworth, Chemotherapeutic Properties of Heterocyclic Compounds: Monocyclic Compounds with Five-Membered Rings. Annu. Rev. Microbiol. 1973, 27, 317.

10. G. L. Kedderis, G. Miwa, The metabolic activation of nitroheterocyclic therapeutic agents. Drug. Metab. Rev. 1988, 19, 31.


~ 58 ~

11. J. C. Spain, Biodegradation of nitroaromatic compounds. Annu. Rev. Microbiol. 1995, 49, 523.

12. A.C. Olivieri, Curso quimiometría: calibraciones univariada y multivariada de primer orden, 2004, Universidad del Rosario, Argentina.

13. B. R. Kowalski, Chemometrics. Anal. Chem. 1980, 52, 112R

14. Richard G. Brereton, Applied Chemometrics for Scientists, 2007, John Wiley & Sons Ltd. England, 1-3

15. Y. Roggo, P. Chalus, L. Maurer, C. Lema-Martinez, A. Edmond, N. Jent, A review of near infrared spectroscopy and chemometrics in pharmaceutical technologies J. Pharm. Biomed. Anal. 2007, 44, 683.

16. Richard G. Brereton, Chemometrics: Data Analysis for the Laboratory and Chemical Plan, 2003, John Wiley & Sons, Ltd, England,

17. G. Escandar, P. Damiani, H. Goicoechea, A. Olivieri, A review of multivariate calibration methods applied to biomedical analysis. Microchem. J. 2006, 82, 29.

18. Skoog-Leary. Análisis Instrumental. 1993, Mc Graw Hill. España.

19. l.A. Valderrama, H. Pessoa-Mahana, G. Sarrás, R.Tapia, Access to Quinazolines from 2-Nitrobenzaldehyde and Arylamines. Heterocycles. 1999, 51, 2193.

20. H. Pessoa-Mahana, C.D. Pessoa-Mahana, R. Salazar, J.A. Valderrama, E. Saez, R. Araya-Maturana, Solvent-free synthesis of 6-arylbenzimidazo [1,2-c] quinazolines under microwave irradiation Synthesis. 2004, 3, 436.

21. J.C. Miller, J.N. Miller. Estadística para química analítica. Segunda edición, 1993. Addison- Wesley Iberoamerican, S.A., Wilgminton, Delaware, E.U.A.

22. O.A. Quattrocchi, S.A. de Andrizzi, R.F. Laba. Introducción a HPLC aplicación y práctica 1992, 321-328. Artes Gráficas Farro S.A. Argentina.

23. K. A. Connors, Chemical stability of pharmaceuticals: a handbook for pharmacists. 1986, Wiley New York.

24. E. Hammam, A. Tawfik, M.M. Ghoneim, Adsorptive stripping voltammetric quantification of the antipsychotic drug clozapine in bulk form, pharmaceutical

Referencias

~ 59 ~

formulation and human serum at a mercury electrode J. Pharm. Biomed. Anal. 2004, 36, 149.

25. S. Brain, Desarrollo de metodologías analíticas para la cuantificación y caracterización de N-benzoil-(p-metoxi)-2-(o-nitrofenil)-nitrobenzimidazol y N-benzoil-(p-cloro)-2-(o-nitrofenil)-nitrobenzimidazol. Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico, Universidad de Chile, 2007.

26. C. Cerda, Síntesis de derivados N-benzoil-2-(2-nitrofenil)-1-H-benzimidazoles. Desarrollo de metodologías analíticas y caracterización fisicoquímica de N-(p-flúor)-benzoil-2-(2-nitrofenil)-nitrobenzimidazol y N-( p-nitro)-benzoil -2-(2-nitrofenil)-nitrobenzimidazol. Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico, Universidad de Chile, 2008.

27. C. Quezada, Desarrollo de metodologías analíticas para la cuantificación y caracterización de 2-(o-nitrofenil)-nitrobenzimidazol y n-benzoil-2-(o-nitrofenil)-nitrobenzimidazol. Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico, Universidad de Chile, 2007.

28. S. Kim, K. Lee, Y. Shin, C. Lee, Physicochemical properties of 2’- benzoyloxycinnamaldehyde. I. J. Pharm. 2004, 287, 21.

29. I. Muszalska, Kinetics of hydrolysis of 4-methoxy-2-[2-hydroxy-3(4-phenyl-1- piperazinyl)] propyl-2,3-dihydro-6-methyl-1,3-dioxo-1H-pyrrolo[3,4-c]pyridine in aqueous solutions Il Fármaco, 2004, 59, 437.

30. Th. Cachet, G. Van den Mooter, R. Houchecorne, C. Vinckier, J. Hoogmartens, Decomposition kinetics of erythromicin A in acidic aqueous solutions. I. J. Pharm, 1989, 55, 59.

31. X. Teng, D. Cutler, N. Davies, Degradation kinetics of mometasone furoate in aqueous systems I. J. Pharm., 2003, 259, 129.

32. W. Lin, Y. Chen, R. Chen, Degradation kinetics of benzonatate in aqueous solutions I. J. Pharm., 1999, 176, 179.

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