“protecciÓn contra el alcoholismo por el...
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UNIVERSIDAD DE CHILE Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
“PROTECCIÓN CONTRA EL ALCOHOLISMO POR EL POLIMORFISMO ARG47HIS DE LA DESHIDROGENASA ALCOHÓLICA:
DESARROLLO DE UN MODELO ANIMAL”
Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de:
DOCTOR EN FARMACOLOGÍA
MARIO RIVERA MEZA
Director de Tesis: Dr. Yedy Israel Jacard
SANTIAGO-CHILE 2009
UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
INFORME DE APROBACIÓN
TESIS DE DOCTORADO Se informa a la Comisión de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacéuticas que la Tesis de Doctorado presentada por el candidato
Mario Rivera Meza
Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para
optar al Grado de Doctor en Farmacología, en el examen de defensa de Tesis
rendido el día ______ de ________________ de 2009. _____________________________________________________________________
Director de Tesis: Dr. Yedy Israel Jacard _______________________
Comisión Informante de Tesis: Dr. Hernán Speisky Cosoy (Presidente) _______________________
Dr. Juan Pablo García-Huidobro Toro _______________________
Dra. Isabel Llona Rodríguez _______________________
Dr. Antonio Morello Caste _______________________
Dr. Juan Segura Aguilar _______________________
A mi hermano Danny.
Siempre estarás con nosotros...
AGRADECIMIENTOS
Esta Tesis ha llegado a su término. Al mirar atrás me doy cuenta que el largo camino
recorrido ha valido la pena, ya que el desarrollo de este doctorado ha significado un
enorme crecimiento tanto en lo personal como en mi formación científica. Ahora, sólo
quiero agradecer a todas las personas que han formado parte de mi vida durante este
período y que, de una u otra forma, han permitido la llegada de este momento.
En primer lugar y con mucho cariño al profesor Dr. Yedy Israel. Gracias por aceptarme
como estudiante en su laboratorio y por ser mi director de tesis. Reconozco en usted a
una gran persona y a un excelente profesor, su visión de la ciencia y sus consejos me
ayudaron a superar cada desafío. Por la preocupación, generosidad y paciencia que
siempre demostró conmigo, muchas gracias.
A la Dra. Amalia Sapag, por darme la oportunidad de realizar una Unidad de
Investigación en el laboratorio y acompañarme en mis primeros pasos en la Biología
Molecular. Muchas gracias por tu generosidad, cada vez que necesité tu ayuda y
consejo, estuviste presente.
A las profesoras María Elena Quintanilla, Lutske Tampier, y al Sr. Juan Santibánez, por
su ayuda con los experimentos realizados en animales.
A los miembros de la Comisión de Doctorado: Dra. Isabel Llona, Dr. Juan Pablo
García-Huidobro, Dr. Antonio Morello, Dr. Juan Segura y Dr. Hernán Speisky. Su ayuda
y consejos fueron muy importantes en el desarrollo de esta tesis.
A mis colegas del laboratorio actuales Gonzalo, Robel, Benjamín, María de los
Ángeles, Thergiory y Mónica, y algunos que recuerdo especialmente como Ginez,
Javier, Fernando, Paula y Gabriel. Muchas gracias por los momentos compartidos.
A mi esposa Cayoya y a mis hijos Manuela, Martina y Maximiliano, por el amor que me
entregan día a día. Son el sentido de mi vida, los amo mucho.
A mis padres Mario y Gladys y a mi hermano Cristian. Son parte fundamental de mi
vida, los llevo en el corazón.
FINANCIAMIENTO
Esta tesis se desarrolló en el Laboratorio de Farmacoterapia Génica del Departamento
de Química Farmacológica y Toxicológica de la Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacéuticas de la Universidad de Chile. Fue financiada por los proyectos NIAAA
R01-015421 e Iniciativa Científica Milenio P99-031F de responsabilidad del Dr. Yedy
Israel J.
Mario Rivera recibió la beca CONICYT para estudiantes de doctorado (2005-2007) y la
beca CONICYT de Término de Tesis (primer semestre 2008).
PUBLICACIONES Y CONGRESOS Los resultados de la presente tesis han dado origen a las siguientes publicaciones y
presentaciones a congresos:
• Publicaciones
Rivera-Meza M, Quintanilla ME, Tampier L, Mura C, Sapag A, Israel Y.
“Mechanism of protection against alcoholism by an alcohol dehydrogenase
polymorphism: Development of an animal model”.
Manuscrito aceptado en FASEB J (6 de Agosto de 2009).
• Congresos Internacionales
Israel Y, Rivera-Meza M, Quintanilla ME, Tampier L, Sapag A.
“The acetaldehyde burst and hormesis: A dual mechanism of protection against
alcoholism and alcohol induced neoplasias generated by alcohol dehydrogenase
ADH1B*2”.
4th International Symposium on ALPD and Cirrhosis.
Hurghada, Egipto, 8-9 de Octubre de 2009. Simposio.
Israel Y, Rivera M, Sapag A, Quintanilla ME, Tampier L.
“The acetaldehyde burst: It takes two to tango”.
32th Annual Meeting of the Research Society on Alcoholism (RSA).
San Diego, EE.UU., 19-23 de Junio de 2009. Simposio.
Alcoholism: Clinical and Experimental Research 33 (6) Suppl: 283A (#065), 2009.
Rivera M, Quintanilla ME, Tampier L, Sapag A, Israel Y.
“Reducción del consumo de alcohol en ratas bebedoras mediante terapia génica”.
XVIII Congreso de la Asociación Latinoamericana de Farmacología.
Coquimbo, Chile, 12-16 de Octubre de 2008. Póster.
Revista de Farmacología de Chile 1(1) 142 Nº5 (2008)
• Congresos Nacionales
Rivera-Meza M, Quintanilla ME, Tampier L, Sapag A, Israel Y.
Premio Prof. Dr. Jorge Mardones Restat 2008. “Protección contra el alcoholismo por un
polimorfismo de la deshidrogenasa alcohólica: Desarrollo de un modelo animal”.
XXXI Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile.
Concepción, Chile, 22-25 de Octubre de 2009. Conferencia Plenaria.
Rivera M, Sapag A, Israel Y.
“Generación de una mutación puntual protectora del alcoholismo en el gen de la
deshidrogenasa alcohólica de rata: Hacia una terapia génica experimental”.
XXIX Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile.
Iquique, Chile, 6-9 de Septiembre de 2007. Presentación Oral.
i
ÍNDICE GENERAL Pág.
ÍNDICE GENERAL……………………..……………………………………………… i
ÍNDICE DE FIGURAS………………….……………………………………………… vi
ÍNDICE DE TABLAS……………………..………………………………………….… viii
ABREVIATURAS……………………………………………………………………… ix
RESUMEN……………………………………………………………………………… x
SUMMARY……………………………………………………………………………... xii
1. INTRODUCCIÓN………………..……………………………………............... 1
1.1. El alcoholismo……………………….…………………………………………... 1
1.2. Genética del alcoholismo………………………….………………………….... 1
1.3. Farmacología del alcohol (etanol)…………………………………………….. 2
1.4. Farmacología del acetaldehído………….…………………………………….. 4
1.5. La terapia farmacológica actual del alcoholismo………………….…………. 6
1.5.1. Disulfiram………………………………………………………………….. 7
1.5.2. Naltrexona………………………………………………………………… 7
1.5.3. Acamprosato………………………………………………………………. 8
1.6. Variaciones genéticas de la ADH y alcoholismo………………..………….... 9
1.6.1. Deshidrogenasa alcohólica (ADH)……………………………………… 9
1.6.2. Polimorfismo de la ADH1B y protección contra el alcoholismo……… 10
1.7. Investigación propuesta………..………………………………………………. 12
2. HIPÓTESIS GENERAL………………………..………………………………. 14
3. OBJETIVO GENERAL…………..…………………………………………….. 14
4. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS…………………….…………... 14
4.1. Hipótesis 1: Estudios in vitro………..…………………………………………. 14
4.2. Objetivos específicos: Estudios in vitro……………..………………………... 14
4.3. Hipótesis 2: Estudios in vivo…………………………………………………… 15
4.4. Objetivos específicos: Estudios in vivo……………………………………….. 15
ii
Pag.
5. MATERIALES………………………………..………………………………….. 16
5.1. Material biológico………………………………………………………………... 16
5.1.1. Animales…………………………………………………………………… 16
5.1.2. Líneas celulares………………………………………………………….. 16
5.1.3. Cepas de Escherichia coli……………………………………………….. 16
5.2. Reactivos….……………………………………………………………………… 16
5.2.1. Enzimas………………………………………………………………........ 16
5.2.2. Anticuerpos………………………………………………………………... 17
5.2.3. Reactivos de cultivo celular……………………………………………… 17
5.2.4. Reactivos generales……………………………………………………… 17
5.3. Plasmidios…..……………………………………………………………………. 18
5.4. Oligonucleótidos…………………………………………………………………. 19
6. MÉTODOS……………………………………………………………………….. 20
6.1. Secuenciación de DNA……………………………………………………........ 20
6.2. Generación y clonación del cDNA mutado de ADH de rata (rAdh-47His)… 20
6.2.1. Obtención del cDNA rAdh-47His por mutagénesis puntual dirigida… 20
6.2.2. Obtención de plasmidios………………………………………………… 22
6.2.3. Clonación del cDNA de rADH-47His…………………………………… 22
6.3. Expresión de los cDNAs de rADH-47His y rADH-47Arg en células
humanas HEK-293………………………….………………………………....... 24
6.3.1. Cultivo de células HEK-293……………………………………………… 24
6.3.2. Lipofección de células HEK-293………………………………………… 24
6.3.3. Análisis de la expresión de los cDNAs de ADH por RT-PCR……….. 25
6.3.4. Obtención de los lisados celulares. …………………………………….. 26
6.3.5. Determinación de la concentración de proteínas……………………... 26
6.3.6. Determinación de la actividad de la deshidrogenasa alcohólica…… . 26
6.3.7. Determinación de los niveles de ADH mediante análisis de Western 27
6.4. Medición de las constantes cinéticas de rADH-47Arg y rADH-47His……… 28
6.4.1. Medición de la Km para NAD+…………………………………………… 28
6.4.2. Medición de la Ki para NADH…………………………………………… 29
iii
Pag.
6.5. Producción de los vectores adenovirales…………………..………………… 29
6.5.1. Obtención de los plasmidios transportadores…………………………. 31
6.5.2. Obtención de los plasmidios recombinantes adenovirales…………... 32
6.5.3. Obtención de los vectores adenovirales……………………………….. 32
6.5.4 Amplificación de los vectores adenovirales……………………………. 33
6.5.5. Purificación de los vectores adenovirales……………………………… 34
6.5.6. Titulación de los vectores adenovirales por absorbancia a 260 nm… 35
6.5.7. Titulación de los vectores adenovirales mediante el método de la
Dosis Infectiva 50 (TCID50)……………………………………………… 35
6.6. Expresión in vitro de los cDNAS de rADH-47His y rADH-47Arg en células
de hepatoma de rata……………………………………………………………. 36
6.6.1. Cultivo de células H4-II-E-C3 de hepatoma de rata………………….. 36
6.6.2. Curva dosis-respuesta: dosis de vector adenoviral versus actividad
de la ADH en células H4-II-E-C3……………………………………….. 36
6.6.3. Acumulación de acetaldehído en cultivo de células H4-II-E-C3…….. 37
6.7. Sobreexpresión in vivo de los cDNAs de rADH-47His y rADH-47Arg en
ratas UChB……………………………….……………………………………… 38
6.7.1. Administración de los vectores adenovirales a ratas UChB…………. 38
6.7.2. Registro del consumo voluntario de alcohol en ratas UChB………… 40
6.7.3. Medición de la velocidad de eliminación de alcohol en ratas UChB.. 40
6.7.4. Medición de los niveles arteriales de acetaldehído en ratas UChB… 42
6.7.5. Preparación de las muestras de tejido para la medición de la
actividad enzimática……………………………………………………… 42
6.7.6. Determinación de la expresión de los cDNAs de rADH-47His y
rADH-47Arg en el hígado de ratas UChB……………………………… 43
6.7.7. Determinación de la Km aparente para NAD+ en homogeneizado de
hígado de rata…………………………………………………………….. 45
6.7.8. Determinación de la toxicidad hepática de la administración de los
vectores adenovirales……………………………………………………. 46
6.7.9. Determinación de la actividad de la ALDH2 en hígado de rata……… 47
6.8. Análisis estadístico……..………………………………………………………... 47
iv
Pag.
7. RESULTADOS………………………………………………………………….. 48
7.1. Secuenciación del cDNA nativo de la ADH de rata ……………….………… 48 7.2. Obtención del cDNA de la ADH mutada de rata (rAdh-47His)……………... 48 7.3. Expresión de los cDNAs rAdh-47His y rAdh-47Arg en células HEK-293…. 50
7.4. Propiedades cinéticas de las enzimas rADH-47His y rADH-47Arg………… 52
7.5. Producción de los vectores adenovirales de primera generación…….……. 54
7.5.1. Generación de los plasmidios transportadores de los cDNAs
rAdh-47His y rAdh-47Arg…………………………………….................. 54
7.5.2. Generación de los plasmidios adenovirales recombinantes………… 55
7.5.3. Obtención de los vectores adenovirales……………………………….. 57
7.6. Transducción de células de hepatoma de rata con vectores adenovirales.. 58
7.7. Acumulación de acetaldehído en células H4-II-E-C3 transducidas con los
vectores adenovirales…………………………………………….…………….. 60
7.8. Estudios in vivo. Actividad de la ADH en diversos órganos de ratas
transducidas con los vectores adenovirales………………………………….. 61
7.9. Detección del mRNA de rADH-47His y rADH-47Arg en el hígado de ratas
transducidas con los vectores adenovirales………………………………….. 62
7.10. Km aparente para NAD+ en el hígado de ratas transducidas con los
vectores adenovirales…………………………………………………………... 64
7.11. Actividad de la ALDH2 en el hígado de ratas transducidas con los
vectores adenovirales…………………………………………………………… 65
7.12. Consumo voluntario de alcohol por las ratas transducidas con los
vectores adenovirales …………………………………………………………. 66
7.13. Niveles sanguíneos de acetaldehído generados por la administración de
etanol en ratas transducidas con los vectores adenovirales………….…….. 67
7.14. Velocidad de eliminación de etanol en las ratas transducidas con los
vectores adenovirales…………………………………………..……………….. 70
7.15. Correlación entre la actividad hepática de la ADH, el nivel arterial de
acetaldehído y el consumo de alcohol en ratas transducidas con los
vectores adenovirales………………………………………………………….. 72
7.16. Toxicidad hepática de la administración de los vectores adenovirales…… 74
v
Pag.
8. DISCUSIÓN……………………………………………………………………… 77
8.1. Generación de una ADH de rata análoga a la enzima humana ADH1B*2:
transfección de células carentes de ADH…………………………………..… 78
8.2. Células de hepatoma de rata como modelo para estudiar los efectos del
aumento de la actividad de la ADH…………………………….……………… 79
8.3. Ratas bebedoras UChB como modelo animal para estudiar el mecanismo
de protección contra el alcoholismo de la enzima humana ADH1B*2…….. 81
8.4. Transducción in vivo de ratas UChB con los vectores adenovirales
codificantes de rADH-47His o rADH-47Arg……………………………..……. 82
8.4.1. Actividad de la ADH mutada rADH-47His en el hígado de rata……… 85
8.5. El aumento transitorio de los niveles sanguíneos de acetaldehído………… 86
8.6. Reducción del consumo voluntario de alcohol en las ratas transducidas
con los cDNAs de rADH-47His y rADH-47Arg……………………………….. 89
8.7. Actividad hepática de la ADH y la velocidad de eliminación de etanol
en ratas…………………………………………………………………………… 91
8.8. Correlación entre la actividad hepática de la ADH, el nivel arterial de
acetaldehído y el consumo de alcohol en ratas UChB……………………... 92
8.9. Posible mecanismo de protección contra el alcoholismo del alelo
ADH1B*2 en humanos………………………………………………………….. 94
8.10. Proyecciones de los resultados obtenidos en esta tesis……………………. 95
8.11. Esquema propuesto de los principales hallazgos de esta tesis………….… 98
9. CONCLUSIONES……………………………………………………………….. 99
10. REFERENCIAS…………………………….……………………………………. 100
11. ANEXO……………………………………………………………………………. 114
vi
ÍNDICE DE FIGURAS Pág.
Figura 1.1 Metabolismo del etanol en el hígado……………………………….. 3
Figura 6.1 Mutagénesis sitio dirigida del cDNA de la ADH de rata
rAdh-47Arg para obtener el cDNA mutado rAdh-47His…………... 21
Figura 6.2 Sistema AdEasy para la obtención de vectores adenovirales…… 30
Figura 6.3 Obtención de los plasmidios transportadores de los genes
de interés……………………………………………………………….. 31
Figura 6.4 Administración de los vectores adenovirales a ratas UChB y
cronograma de los estudios realizados……………………………… 39
Figura 6.5 Determinación de la velocidad de eliminación de etanol a partir
de los valores de alcoholemia………………………………………... 41
Figura 6.6 Esquema experimental para la detección e identificación del
mRNA de rADH-47His y rADH-47 Arg en hígado de rata………… 44
Figura 7.1 Obtención por PCR del cDNA mutado de ADH de rata rAdh-47His 49
Figura 7.2 Clonación y secuenciación del cDNA rAdh-47His………………….. 49
Figura 7.3 Expresión de los cDNAs rAdh-47His y rAdh-47Arg en
células HEK-293………………………………………………………… 50
Figura 7.4 Niveles de ADH en células HEK-293 transfectadas con los
plasmidios pAAV-rADH47His, pAAV-rADH-47Arg y pAAV-MCS…. 51
Figura 7.5 Actividad de la ADH en células HEK-293 transfectadas con los
plasmidios pAAV-rADH47His, pAAV-rADH-47Arg y pAAV-MCS…. 52
Figura 7.6 Determinación de la Km para NAD+ de las enzimas rADH-47His y
rADH-47Arg…………………………………………………………….. 53
Figura 7.7 Determinación de la Ki para NADH de las enzimas rADH-47His y
rADH-47Arg…………………………………………………………….. 54
Figura 7.8 Análisis de restricción de los plasmidios transportadores………… 55
Figura 7.9 Confirmación de la obtención de los plasmidios adenovirales
recombinantes mediante digestión con Pac I……………………… 56
Figura 7.10 Purificación de los vectores adenovirales mediante
ultracentrifugación en gradientes de CsCl…………………………… 57
vii
Pág. Figura 7.11 Actividad de la ADH en células H4-II-E-C3 transducidas con los
vectores AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg o AdV-control……… 59
Figura 7.12 Niveles de la ADH en células H4-II-E-C3 transducidas con los
vectores AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg o AdV-control……… 59
Figura 7.13 Niveles de acetaldehído acumulado en el medio de cultivo de
células H4-II-E-C3 transducidas con los vectores adenovirales….. 60
Figura 7.14 Actividad de la ADH en tejidos de ratas UChB tratadas con los
vectores AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg o AdV-control……… 62
Figura 7.15 Expresión de los cDNAs rAdh-47His y rAdh-47Arg en hígado de
rata……………………………………………………………………..... 63
Figura 7.16 Efecto de la administración de los vectores AdV-rADH-47His y
AdV-rADH-47Arg en la Km aparente para NAD+ en hígado de rata. 64
Figura 7.17 Efecto de la administración de los vectores AdV-rADH-47His y
AdV-rADH-47Arg en la actividad de la ALDH2 en hígado de rata… 65
Figura 7.18 Consumo voluntario de alcohol de ratas UChB tratadas con los
vectores adenovirales………………………………………………….. 66
Figura 7.19 Consumo diario de agua de ratas UChB tratadas con los vectores
adenovirales …………………………………………………………….. 67
Figura 7.20 Concentraciones arteriales de acetaldehído después de
administrar alcohol a ratas tratadas con los vectores adenovirales.. 68
Figura 7.21 Correlación entre la concentración arterial de acetaldehído a los
2,5 minutos y el consumo voluntario de alcohol en ratas
transducidas con los vectores adenovirales……………………….… 69
Figura 7.22 Correlación entre el ABC de los niveles arteriales de acetaldehído
a los 15 minutos y el consumo voluntario de alcohol en ratas
transducidas con los vectores adenovirales…………………………. 70
Figura 7.23 Velocidad de eliminación de etanol en ratas transducidas con los
vectores AdV-rADH-47His y rADH-47Arg…………………………….. 71
Figura 7.24 Correlación entre la actividad hepática de la ADH y el consumo
voluntario de alcohol en ratas UChB………………………………….. 72
viii
Pág. Figura 7.25 Correlación entre la actividad hepática de la ADH y los niveles
arteriales de acetaldehído en ratas UChB……………………………. 73
Figura 7.26 Correlación entre los niveles de acetaldehído arterial y el consumo
voluntario de alcohol en ratas UChB …………………………………. 74
Figura 7.27 Actividad de la alanina aminotransferasa (ALT) en ratas UChB
tratadas con los vectores adenovirales o con vehículo salino……… 75
Figura 7.28 Histología del hígado de ratas UChB tres semanas después del
tratamiento con los vectores adenovirales o vehículo salino……. 76
Figura 8.1 Microfotografía electrónica de barrido de un sinusoide de hígado
de rata………………………………………………………………….. 84
ÍNDICE DE TABLAS Pág.
Tabla 5.1 Oligonucleótidos utilizados en las reacciones de PCR y RT-PCR 19
Tabla 11.1 Secuenciación de los cDNAs silvestre (rAdh-47Arg) y mutado
(rAdh-47His) de la ADH de rata…………………………………….. 114
ix
ABREVIATURAS
ADH : Deshidrogenasa alcohólica
ALDH2 : Deshidrogenasa aldehídica mitocondrial
ALT : Alanina aminotransferasa
BSA : Albúmina de suero bovino
cDNA : Ácido desoxirribonucleico complementario
CMV : Citomegalovirus
DMEM : Dulbecco’s modified Eagle medium
DNA : Ácido desoxirribonucleico
dNTP : Deoxirribonucleótidos
eGFP : Proteína fluorescente verde mejorada
GABA : Ácido gamma-aminobutírico
H4-II-E-C3 : Células de hepatoma de rata
HEK-293 : Células embrionarias de riñón humano
HPLC : Cromatografía líquida de alta precisión
Ki : Constante de disociación del inhibidor
Km : Constante de Michaelis-Menten
Km : Kanamicina
LB : Medio de cultivo bacteriano Luria-Bertani
mRNA : Ácido ribonucleico mensajero
NAD+ : Nicotinamida adenina dinucleótido (cofactor oxidado)
NADH : Nicotinamida adenina dinucleótido (cofactor reducido)
NMDA : N-metil-D-aspartato
PCR : Reacción en cadena de la polimerasa
PFU : Unidades formadoras de placa
RNA : Ácido ribonucleico
RT : Transcripción inversa
SEQ : Suero de Equino
SFB : Suero fetal de bovino
UChB : Rata Universidad de Chile Bebedora
x
RESUMEN
El alcoholismo es una de las adicciones de mayor prevalencia en el mundo. Sin
embargo, se ha visto que la presencia de ciertos polimorfismos en los genes de las
enzimas que metabolizan el etanol, son capaces de proteger a sus portadores de
desarrollar esta enfermedad. En humanos el etanol es metabolizado principalmente en
el hígado por la deshidrogenasa alcohólica (ADH) generando acetaldehído, metabolito
que es oxidado a acetato por la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2). En
algunos individuos de la población asiática, una mutación puntual en el gen de la
ALDH2 (ALDH2*2) elimina la actividad de esta enzima, lo que produce una gran
acumulación de acetaldehído en la sangre luego del consumo de bebidas alcohólicas.
Este aumento de los niveles sanguíneos de acetaldehído genera marcados efectos
disfóricos que provocan un rechazo al consumo de alcohol. Por otra parte, los
individuos que poseen una variante rápida de la ADH (ADH1B*2; 47His) presentan
también una marcada protección contra el alcoholismo respecto a portadores de la
enzima normal (ADH1B*1; 47Arg). A pesar de que la enzima rápida ADH1B*2 tiene
una Vmax 100 veces mayor que la enzima normal ADH1B*1, los individuos portadores
del alelo ADH1B*2 no presentan una mayor velocidad de eliminación del etanol y
tampoco niveles aumentados de acetaldehído (medidos en sangre venosa) que
expliquen su protección al alcoholismo.
En esta tesis se desarrolló un modelo animal en ratas bebedoras de alcohol que, al
expresar una ADH de elevada actividad por entrega génica, podría ayudar a entender
los mecanismos involucrados en la protección al alcoholismo observada en portadores
de la enzima rápida ADH1B*2. Para ello, el cDNA de la ADH silvestre de rata (rADH-
47Arg) se mutó para codificar una enzima de rata (rADH-47His), análoga a la enzima
humana ADH1B*2. Con este material genético se construyeron vectores plasmidiales y
adenovirales que permitieron expresar el gen de la enzima ADH de rata mutada
(rADH-47His) y ADH silvestre (rADH-47Arg) en células de riñón humano, en hepatoma
de rata y en el hígado de ratas bebedoras de alcohol de la línea UChB.
xi
La transfección de células de riñón humano (que no expresan actividad ADH
endógena) con el cDNA de rADH-47His resultó en la expresión de una ADH con una
Km 10 veces mayor (p<0,001) para NAD+ y una Ki 2 veces mayor (p<0,001) para NADH
que la observada al transfectar el cDNA de rADH-47Arg. Estos cambios en la afinidad
por tales co-factores son análogos a los que produce la mutación natural (Arg47His) en
la enzima humana ADH1B*2.
La transducción in vitro de células de hepatoma de rata en cultivo con los vectores
AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg mostró que ambos vectores se expresan en
células hepáticas y que la Vmax de la enzima mutada rADH-47His es 8 veces mayor
que la de la enzima silvestre rADH-47Arg. En estudios in vivo, se administraron los
vectores adenovirales codificantes de rADH-47His y rADH-47Arg a ratas bebedoras de
la línea UChB. Las ratas transducidas por vía intravenosa (5 x 1012 pv/kg) con los
vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg presentaron respectivamente un
aumento de 90% (p<0,01) y 30% (p<0,01) en la actividad hepática de la ADH. Al recibir
una dosis estándar de etanol (1 g/kg, i.p.), las ratas transducidas con los vectores AdV-
rADH-47His y AdV-rADH-47Arg mostraron un aumento transitorio en los niveles
arteriales de acetaldehído, con valores máximos a los 2,5 minutos de recibir etanol,
niveles que fueron respectivamente 5 veces (p<0,001) y 3,5 veces (p<0,001) más altos
que los detectados en los animales controles. Las ratas transducidas con los vectores
adenovirales AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg presentaron además una marcada
reducción de 50% (p<0,001) y 30% (p<0,01) en el consumo voluntario de alcohol.
Los resultados obtenidos en esta tesis indican que, en ratas, la expresión de una
deshidrogenasa alcohólica de elevada actividad (rADH-47His), análoga a la enzima
humana rápida ADH1B*2, resulta en un aumento transitorio del acetaldehído en sangre
arterial al recibir etanol y en una disminución en el consumo voluntario de alcohol.
Estos resultados podrían explicar el mecanismo de protección del alcoholismo en
humanos asociado a la enzima ADH1B*2 y dar origen a nuevas estrategias
terapéuticas para esta enfermedad.
xii
SUMMARY “PROTECTION AGAINST ALCOHOLISM BY THE ARG47HIS ALCOHOL DEHYDROGENASE POLYMORPHISM: DEVELOPMENT OF AN ANIMAL MODEL” Alcoholism is one of the most prevalent types of drug dependence in the world.
However, there is evidence that individuals bearing certain polymorphisms in genes
coding for enzymes involved in the metabolism of ethanol are protected against this
condition. In humans, ethanol is metabolized mainly by hepatic alcohol dehydrogenase
(ADH) to acetaldehyde, which is oxidized to acetate by mitochondrial aldehyde
dehydrogenase (ALDH2). In some East Asians, a point mutation in the ALDH2 gene
(ALDH2*2) abolishes the activity of this enzyme and upon ethanol consumption results
in marked elevations of blood acetaldehyde. This increase in blood acetaldehyde levels
lead to marked dysphoric effects that deter individuals to continue drinking. Another
important polymorphism is that carried by individuals bearing a fast variant of ADH
(ADH1B*2; Arg47His) which show also a marked protection against alcoholism. In spite
of the 100-fold higher Vmax of ADH1B*2 (47His) vs. ADH1B*1(47Arg), individuals who
carry the ADH1B*2 allele show neither an increased rate of ethanol elimination nor
higher blood acetaldehyde levels upon ethanol intake. Thus, the mechanism that leads
to this marked protection against alcoholism is unknown.
The aim of this work was to investigate the possible mechanism by which the ADH1B*2
allele protects against alcoholism. This was studied in rats bred for their high ethanol
intake, which underwent transduction with a rat analogue of human ADH1B*2. For this
purpose, the rat wild type cDNA coding for ADH (rAdh-47Arg) was mutated to encode
His47 (rAdh-47His). This genetic material was incorporated into suitable plasmids and
adenoviral vectors, which were used to express the mutated (rADH-47His) and wild
type rat ADH (rADH-47Arg) genes into (i) human embryonic kidney cells, (ii) rat
hepatoma cells and (iii) liver of UChB alcohol-preferring rats.
xiii
The transduction of human embryonic kidney cells, which lack ADH activity, with rADH-
47His cDNA leads to the expression of an ADH that shows a 10-fold (p<0,001) higher
Km for NAD+ and a 2-fold (p<0,001) higher Ki for NADH than those observed when
expressing the wild type rADH-47Arg. These changes in the affinity for nicotinamide
adenine dinucleotides were found to be analogous to those produced in the human
enzyme ADH1B*2 by the Arg47His aminoacidic change.
The in vitro transduction of rat hepatoma cells with the AdV-rADH-47His or AdV-rADH-
47Arg adenoviral vectors confirmed the ability of both vectors to generate active ADHs.
The Vmax of rADH-47His was 8-fold higher than that of rADH-47Arg. Liver ADH activity
in UChB alcohol-preferring rats transduced in vivo with the AdV-rADH-47His or AdV-
rADH-47Arg adenoviral vectors was increased 90% (p<0,01) and 30% (p<0,01)
respectively. Upon the administration of ethanol (1 g/kg, i.p.) to rats that received either
AdV-rADH-47His or AdV-rADH-47Arg, showed a marked surge (burst) in arterial
acetaldehyde level, reaching maximal levels 2,5 minutes after ethanol injection. These
levels were, respectively, 5- and 3.5-fold higher (P<0.001) than those of control
animals. Rats that received the AdV-rADH-47His or AdV-rADH-47Arg vectors showed,
respectively, a reduction of 50% (p<0,001) and 30% (p<0,01) in their voluntary ethanol
intake.
The present study in animals transduced with the rat equivalent of human ADH1B*2
shows that high levels of arterial acetaldehyde occur only during the first few minutes of
ethanol metabolism, which could be responsible for the reduction in voluntary ethanol
intake seen in these animals. These observations may constitute the basis of the
protection against alcoholism seen in humans who carry the ADH1B*2 allele, and
would provide elements for new therapeutic strategies against alcoholism.
1
1. INTRODUCCIÓN.
1.1. El ALCOHOLISMO. El alcoholismo o dependencia alcohólica es una enfermedad crónica caracterizada por
la ingesta compulsiva y excesiva de bebidas alcohólicas que conduce a: i) la pérdida
de control sobre el consumo, ii) la necesidad de consumir mayores cantidades de
alcohol para conseguir el mismo efecto y frecuentemente iii) la aparición de síntomas
físicos de abstinencia al dejar de consumir alcohol.
El alcoholismo constituye en Chile uno de los problemas más importantes en la salud
pública. Según datos del Consejo Nacional para el Control de Estupefacientes
(CONACE), cerca de 5 millones de chilenos entre los 12 y 64 años de edad son
consumidores de alcohol, y de ellos un 12% presentan dependencia alcohólica. En
Chile el alcoholismo es responsable de 7% de las muertes como causa principal y de
25% de las muertes como causa asociada. Se encuentra además una alcoholemia
positiva en 48,6% de los homicidios, 38,6% de los suicidios y 50% de los accidentes de
tránsito (CONACE, 2003).
1.2. GENÉTICA DEL ALCOHOLISMO. Aunque factores socioculturales, como el costo de las bebidas alcohólicas y la
permisividad social, son factores importantes en el nivel de consumo de alcohol,
existen numerosos estudios que demuestran que los factores genéticos son
determinantes en el desarrollo del alcoholismo. Estudios genéticos de poblaciones y de
familias, han demostrado que los factores genéticos dan cuenta del 40-60% de la
susceptibilidad a desarrollar esta enfermedad (Heath y cols., 1991; Prescott y cols.,
1999).
La utilización de animales en el estudio del alcoholismo ha permitido el desarrollo de
modelos que representan de una forma parcial el complejo cuadro psicobiológico que
constituye el alcoholismo en humanos. Estos modelos animales han permitido estudiar
la relación entre los factores genéticos y aspectos que caracterizan la dependencia
2
alcohólica, tales como patrones de consumo, tolerancia, sensibilidad y síndrome de
abstinencia. En este contexto, se ha encontrado que variedades congénitas (“inbred”)
de una misma especie de animales pueden presentar un comportamiento distinto
frente al consumo de alcohol, como por ejemplo los ratones C57BL/6 que prefieren
beber una solución de etanol al 10% frente al consumo de agua y ratones DBA/2 que
no prefieren el consumo de alcohol y son prácticamente abstemios (Crabbe, 2002). Los
resultados obtenidos en estos modelos sugieren la existencia de factores genéticos
que son permisivos del consumo de alcohol.
Otro modelo animal para el estudio del alcoholismo es el desarrollado a partir de
cruzamientos selectivos entre ratas de una cepa no homogénea (Wistar, Sprague
Dawley, Lewis) que presentan un cierto fenotipo de consumo de alcohol. Al cruzarlos
entre sí por muchas generaciones se logra aumentar la frecuencia de los genes
responsables del fenotipo. De esta forma, se han obtenido líneas de animales
seleccionados como las ratas UChA (no bebedoras) que se caracterizan por un bajo
consumo de alcohol (< 1 g de alcohol/kg/día) y UChB (bebedoras) que presentan un
alto consumo (> 5 g de alcohol/kg/día), las que fueron desarrolladas en la Universidad
de Chile a partir de ratas Wistar (Mardones y Segovia-Riquelme, 1983; Quintanilla y
cols., 2006). El bajo consumo de alcohol que muestran las ratas UChA ha sido
asociado a mutaciones en una de las enzimas involucradas en el metabolismo del
acetaldehído, un metabolito del etanol (Sapag y cols., 2003) y a una deficiente
capacidad oxidativa mitocondrial (Quintanilla y cols., 2005).
Otros modelos de este tipo lo representan las ratas ANA (no bebedoras)/AA
(bebedoras) seleccionadas y desarrolladas en Finlandia (Hilakivi y cols., 1984) y la
línea de ratas bebedoras P (alcohol-preferring) y no bebedoras NP (alcohol-
nonpreferring) desarrolladas en Estados Unidos (Li y cols., 1995).
1.3. FARMACOLOGÍA DEL ALCOHOL (ETANOL). El alcohol ingerido por vía oral es absorbido a la circulación sistémica a través de la
mucosa gastrointestinal, principalmente en el intestino delgado que presenta una gran
3
superficie de absorción (Umulis y cols., 2005). La máxima concentración sanguínea de
alcohol se alcanza aproximadamente a los 60 minutos después de su consumo,
distribuyéndose rápida y uniformemente en todos los fluidos del organismo (Wallgren y
Barry, 1970). Cerca de 90% del alcohol ingerido es completamente oxidado a nivel
hepático a una velocidad constante de metabolización de aproximadamente 100
mg/kg/h (Wallgren y Barry, 1970), mientras que solo un 10% del alcohol es excretado
sin metabolizar a través de la orina y en el aire expirado (Lands, 1998).
La metabolización hepática del alcohol es realizada por tres vías enzimáticas (Figura
1.1); principalmente por la deshidrogenasa alcohólica (ADH) y en una menor
proporción el citocromo P450 2E1 y la catalasa (Matsumoto y Fukui, 2002). Todas
estas vías enzimáticas producen la oxidación de etanol a acetaldehído, siendo la ADH
hepática la de mayor actividad y la principal responsable de su formación. El
acetaldehído formado es rápidamente oxidado a acetato por la deshidrogenasa
aldehídica mitocondrial ALDH2 (Farres y cols., 1989; Klyosov y cols., 1996). Ambas
enzimas ADH y ALDH2 necesitan como cofactor NAD+ y generan NADH como
producto de la reacción.
Figura 1.1. Metabolismo del etanol en el hígado. El etanol es metabolizado en el hígado mediante tres vías enzimáticas. La principal ocurre en el citosol y
es mediada por la deshidrogenasa alcohólica (ADH). Las otras dos vías son proporcionalmente menores y
ocurren en el retículo endoplasmático (sistema microsomal CYP2E1) y en los peroxisomas (catalasa). El
acetaldehído generado es oxidado a acetato en la mitocondria por acción de la deshidrogenasa aldehídica
mitocondrial (ALDH2).
Catalasa
CYP 2E1
Etanol Acetaldehído
H2O2 H2O
O2 + NADPH NADP+ + H2O
NAD+ NADH
ADH
NAD+ NADH
ALDH Acetato
4
Los mecanismos que determinan las propiedades adictivas del alcohol aún no están
claramente definidos y a la fecha no se ha identificado un receptor específico para esta
molécula. A diferencia de otras drogas de abuso como la morfina, nicotina o cocaína
que ejercen sus efectos a concentraciones sanguíneas micromolares (10-6 M), los
efectos farmacológicos del alcohol se observan a concentraciones milimolares (10-3 M),
efecto que se explicaría por la simplicidad de la molécula de etanol que no permitiría su
unión con alta afinidad a algún tipo de receptor.
En dosis moderadas el alcohol posee propiedades ansiolíticas y sedativas similares a
las observadas por la acción de las benzodiazepinas, fármacos que actúan acentuando
los efectos inhibitorios del acido γ-aminobutírico (GABA) sobre los receptores
ionotrópicos GABA-A (Möhler y cols., 2002). La unión alostérica del alcohol al receptor
de GABA-A potencia los efectos inhibitorios del GABA al permitir un mayor flujo de
iones cloruro a través del complejo canal-receptor (Huidobro-Toro y cols., 1987; Mihic y
cols., 1997). Este mecanismo de acción también es compartido por otros alcoholes
alifáticos y anestésicos volátiles como enfluorano e isofluorano (Mihic y cols., 1997;
Krasowski y cols., 1998).
Otro tipo de receptores sobre los que actúa el alcohol son los receptores ionotrópicos
de glutamato del tipo NMDA. El alcohol antagoniza la acción excitatoria del glutamato
en este tipo de receptores, lo que se traduce en anestesia, alteración de los procesos
cognitivos y de consolidación de la memoria (Wirkner y cols., 1999; Robbins y cols.,
2006). Estudios in vitro e in vivo han demostrado que la exposición crónica a alcohol
aumenta el número de receptores NMDA y la sensibilidad neuronal a los efectos
excitatorios del glutamato (Chandler y cols., 1993; Snell y cols., 1996). Este efecto
podría explicar la hiperexcitabilidad observada en los alcohólicos crónicos frente a la
suspensión del consumo de alcohol (Hoffman y Tabakoff, 1996).
1.4. FARMACOLOGÍA DEL ACETALDEHÍDO. En general, la mayoría de los fármacos y sustancias de abuso son eliminados del
organismo bajo la forma de metabolitos que carecen de actividad farmacológica. Sin
5
embargo en el caso del alcohol, su primer metabolito el acetaldehído, es altamente
reactivo y genera una variada gama de efectos farmacológicos y conductuales
(Eriksson, 2001).
En humanos y ratas el acetaldehído es metabolizado a acetato principalmente en el
hígado por la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2), enzima que exhibe una
Km para acetaldehído menor a 1µM (Klyosov y cols., 1996). Dada la alta capacidad del
hígado para metabolizar acetaldehído a acetato, la cantidad de acetaldehído que se
libera a la circulación periférica es muy pequeña o casi nula. La ALDH2 se expresa
también en otros órganos como el cerebro, músculo cardíaco y músculo esquelético
(Stewart y cols., 1996).
Sin embargo, bajo ciertas condiciones genéticas, la producción de acetaldehído por la
acción de la ADH sobre el alcohol, puede superar la capacidad de la ALDH2 hepática
de metabolizarlo, lo que resulta en un aumento de la concentración de acetaldehído en
el torrente sanguíneo. Esta acumulación de acetaldehído produce una serie de efectos
fisiológicos que incluyen vasodilatación periférica, enrojecimiento facial, aumento de la
frecuencia cardiaca y respiratoria, hipotensión, broncoconstricción, náuseas y dolor de
cabeza (Mizoi y cols., 1983).
Estos efectos disfóricos generados por el acetaldehído han sido observados en
poblaciones asiáticas que presentan una mutación en el gen de la ALDH2, lo que
resulta en una enzima prácticamente inactiva denominada ALDH2*2 (Yoshida y cols.,
1984). Individuos que portan el alelo ALDH2*2 y que consumen etanol generan niveles
sanguíneos de acetaldehído 5 a 20 veces más elevados que los individuos que portan
la enzima normal ALDH2*1 (Mizoi y cols., 1994; Peng y cols., 2007), y presentan los
efectos disfóricos asociados a estos niveles elevados de acetaldehído (Mizoi y cols.,
1983). Esta reacción disfórica al consumo de alcohol es responsable de que en estas
poblaciones los individuos heterocigotos para la ALDH2*2 muestren una protección al
alcoholismo de un 66 a 95% (Thomasson y cols., 1991; Higuchi, 1994) y que los
individuos homocigotos para la mutación sean prácticamente abstemios (Tu y cols.,
1995).
6
En experimentos realizados en ratas bebedoras de alcohol, se bloqueó la síntesis de la
enzima ALDH2 mediante la administración de moléculas de antisentido dirigidas contra
el mRNA de la enzima. Al administrar una dosis moderada de alcohol (1 g/kg) a los
animales tratados, estos presentaron una acumulación de más de 4 veces en los
niveles sanguíneos de acetaldehído. La inhibición génica de la ALDH2 en estos
animales redujo además en 50% su consumo voluntario de alcohol (Garver y cols.,
2001; Ocaranza y cols., 2008).
Los mecanismos mediante los cuales el acetaldehído ejerce sus acciones
farmacológicas no están claramente definidos y los estudios realizados hasta la fecha
indican que es un mecanismo complejo que involucra varios blancos moleculares. Una
de las moléculas que más se ha asociado a la acción del acetaldehído es la histamina.
Se ha visto que a nivel periférico tanto el alcohol como el acetaldehído aumentan los
niveles de histamina al estimular su liberación desde los mastocitos y disminuir su
metabolización por inhibición de la enzima diamino oxidasa (Zimatkin y Anichtchik,
1999). Individuos asiáticos portadores de la ALDH2 inactiva (ALDH2*2) tratados
previamente con el antagonista del receptor de histamina H1, difenhidramina,
presentaron menos efectos disfóricos al consumir alcohol que individuos no tratados
con el fármaco (Miller y cols., 1987).
También existe evidencia de que los efectos del acetaldehído pueden estar mediados
por la acción de las prostaglandinas, ya que la administración previa de fármacos
antiinflamatorios no esteroidales como la indometacina y el acido acetilsalicílico, que
actúan reduciendo la generación de prostaglandinas por inhibición de la enzima
ciclooxigenasa, son capaces de bloquear parcialmente el enrojecimiento facial y la
broncoconstricción asociada al consumo de alcohol en individuos portadores de la
enzima ALDH2*2 (Truitt y cols., 1987; Fujimura y cols., 1997).
1.5. LA TERAPIA FARMACOLÓGICA ACTUAL DEL ALCOHOLISMO. La terapia farmacológica actual del alcoholismo esta basada principalmente en el uso
de tres fármacos aprobados por la Administración de Drogas y Alimentos de Estados
7
Unidos (FDA) y disponibles en Chile: disulfiram (Antabus®), naltrexona (Nalerona®) y
acamprosato (Campral®).
1.5.1. Disulfiram. El disulfiram es el fármaco más utilizado para el tratamiento del alcoholismo. Su
mecanismo de acción es la inhibición de la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial
(ALDH2), por unión irreversible a los grupos sulfhidrilo de la enzima (Lam y cols.,
1997). Esta inhibición de la ALDH2 produce una gran acumulación de acetaldehído en
la sangre después del consumo de etanol, lo que genera una serie de efectos
fisiológicos tales como sudoración, dolor de cabeza, náuseas, vómitos, hipotensión y
enrojecimiento facial (“flushing”). La reacción adversa al consumo de etanol
experimentada por los pacientes tratados con disulfiram (“efecto antabus”), constituye
un elemento disuasivo del consumo de alcohol (Brewer y cols., 2000). Sin embargo, la
frecuencia diaria de administración y el elevado número de efectos secundarios
idiosincráticos observados a dosis terapéuticas que incluyen hepatitis, depresión y
psicosis (Rabkin y cols., 1998; O’Shea y cols., 2000), lleva a un bajo cumplimiento de
los esquemas de dosificación, lo que incide negativamente en la efectividad de la
terapia (Poulsen y cols., 1992; Fuller, 2004). En estudios clínicos controlados y con
administración supervisada del medicamento, disulfiram demostró ser eficaz en la
reducción del consumo de etanol (Chick y cols., 1992).
1.5.2. Naltrexona. La naltrexona es otra molécula usada en el tratamiento del alcoholismo, su mecanismo
de acción se basa en el bloqueo inespecífico de los receptores µ-opioide (Zalewska-
Kaszubska y cols., 2006), lo que inhibe de forma indirecta la liberación de dopamina en
el sistema córtico-mesolímbico al consumir alcohol, efecto que se postula disminuiría la
acción reforzadora del alcohol (Roberts y cols., 2000). Los efectos secundarios
asociados al uso crónico de naltrexona son numerosos e incluyen náuseas, tensión
nerviosa y fatiga, los cuales reducen de forma importante el cumplimiento de la terapia
(Croop y cols., 1997). El desarrollo de formulaciones inyectables de depósito de acción
extendida, ha permitido mejorar la adherencia a los tratamientos. Sin embargo,
8
estudios clínicos no han confirmado la eficacia de naltrexona en el tratamiento de
pacientes alcohólicos (Krystal y cols., 2001, Kranzler y cols., 2000).
1.5.3. Acamprosato. Este fármaco se ha utilizado para mantener la abstinencia del consumo de alcohol y
aliviar los síntomas de privación. Hasta el momento no se conoce claramente su
mecanismo de acción, pero pareciera actuar a nivel de receptores NMDA, bloqueando
el efecto excitatorio del glutamato y disminuyendo el tono excitatorio inducido por el
consumo crónico de alcohol (De Witte y cols., 2005). Existe evidencia de que el
acamprosato actuaría también sobre los canales de calcio dependientes de voltaje,
disminuyendo los niveles intracelulares de Ca2+, lo que se traduciría en una menor
excitabilidad neuronal (Putzke y cols., 1996). Datos clínicos avalan su efectividad, pero
en períodos de tiempo que no superan un año (Paille y cols., 1995; Garbutt y cols.,
1999).
Otros fármacos que también han presentado propiedades adecuadas para su uso en el
tratamiento del alcoholismo son la memantina y topiramato. La memantina actúa de
una forma similar al acamprosato, ya que también antagoniza los receptores de
glutamato del tipo NMDA, sin embargo estudios en humanos han mostrado que posee
una baja eficacia en reducir el consumo de alcohol en pacientes alcohólicos (Bisaga y
cols., 2004). El topiramato, molécula que antagonista los receptores para glutamato del
tipo kainato, ha mostrado ser eficaz en reducir el consumo de alcohol en animales
(Nguyen y cols., 2007), pero no ha mostrado la misma eficacia al ser administrado a
pacientes alcohólicos (Johnson y cols., 2003).
Considerando el limitado número de fármacos disponibles para el tratamiento del
alcoholismo, la alta incidencia de efectos secundarios asociados a su uso y la limitada
eficacia de estas terapias, se hace necesario el desarrollo de nuevas estrategias de
tratamiento.
9
1.6. VARIACIONES GENÉTICAS DE LA ADH Y ALCOHOLISMO. 1.6.1. Deshidrogenasa alcohólica (ADH).
La deshidrogenasa alcohólica (ADH), es una extensa familia de enzimas que de
acuerdo a su identidad aminoacídica, características cinéticas y de sustrato se
clasifican en siete clases (Duester y cols., 1999). Estas enzimas se ubican en el
citoplasma y consisten en homo- y heterodímeros con subunidades de una masa
molecular de 40 kDa (Duester y cols., 1999; Galter y cols., 2003). El cofactor utilizado
por la ADH para la oxidación del etanol es NAD+ y los productos de la reacción son el
NADH, y el acetaldehído, siendo la ADH fuertemente inhibida por el NADH y por
concentraciones elevadas de etanol (Crabb y cols., 1983). El equilibrio de la reacción
está favorecido hacia la reacción inversa, es decir hacia la reducción del acetaldehído
por NADH, por lo que la oxidación del etanol por ADH ocurre sólo si el NADH es
liberado del complejo que forma con la enzima y que este producto se elimine
rápidamente del citosol (Cronholm y cols., 1985; Stone y cols., 1993). Por lo tanto, la
actividad ADH se ve favorecida por disminución de la concentración de NADH
citosólico, la que es mediada principalmente por su reoxidación mitocondrial a NAD+.
El metabolismo del etanol en humanos está mediado principalmente por las ADH
pertenecientes a la Clase I, que se expresan mayoritariamente en el hígado (Boleda y
cols., 1989). Las ADH de la Clase I están codificadas en tres genes distintos (ADH1A,
ADH1B y ADH1C), siendo el gen ADH1A expresado sólo durante el desarrollo fetal. El
gen de la ADH1B posee tres variantes polimórficas (ADH1B*1, ADH1B*2 y ADH1B*3),
encontrándose el alelo ADH1B*1 predominantemente en caucásicos; el alelo ADH1B*2
en la población oriental (Matsuo y cols., 1989) y el alelo ADH1B*3 en africanos (Chen y
cols., 1999). El alelo ADH1B*1 codifica para una enzima con baja actividad catalítica
(kcat = 9,2 min-1), mientras que los alelos ADH1B*2 y ADH1B*3 codifican para enzimas
de elevada actividad catalítica de 400 min-1 y 300 min-1 respectivamente. La enzima
ADH1B*1 presenta la mayor afinidad por etanol con una Km de 0,05 mM; la ADH1B*2
presenta una afinidad intermedia (Km= 1mM), mientras que la enzima ADH1B*3
presenta la menor afinidad por etanol con una Km de 24 mM (Burnell y cols., 1989;
Borras y cols., 2000). La intoxicación legal en Chile es 22 mM de etanol en sangre de
10
modo que ambas ADH1B*1 y ADH1B*2 están saturadas a concentraciones
significativamente bajo este límite.
Los alelos ADH1B*1 y ADH1B*2 se diferencian en un solo nucleótido, lo que se traduce
en que la enzima ADH1B*2 presenta una histidina en la posición 47 en vez de una
arginina como ocurre en la enzima ADH1B*1 (Matsuo y cols., 1989). El cambio
aminoacídico Arg47His resulta en una menor afinidad de la enzima por el cofactor, lo
que se refleja en un aumento de los valores de Km para NAD+ y de Ki para NADH
(Hurley y cols., 1990). Estudios cristalográficos y de modelación in silico realizados con
la enzima ADH1B*1, han mostrado que el cambio Arg47His provoca modificaciones en
la estructura terciaria del sitio activo de la enzima que resultan en una disminución de
la afinidad por el NADH generado en el sitio activo, lo cual incrementa la actividad
catalítica de la enzima (Hurley y cols., 1990; Hurley y cols., 1991, Niederhut y cols.,
2001).
En ratas el etanol es metabolizado mayoritariamente por la ADH de la Clase I, enzima
que se expresa principalmente en tejido hepático, presentando una alta afinidad por
etanol (Km = 1,4 mM) (Crabb y cols., 1983; Julià y cols., 1987). Las ADH de rata no
presentan polimorfismos dentro de cada clase; sin embargo, se encuentra que la
actividad de la ADH en el hígado es mayor en la rata hembra respecto de la rata
macho (Rachamin y cols., 1980; Quintanilla y cols., 2007). Estudios in vivo indican que
la castración de ratas macho eleva la actividad de la ADH en el hígado a los valores
observados en hembras (Rachamin y cols., 1980; Mezey y cols., 1993; Simon y cols.,
2002).
1.6.2. Polimorfismo de la ADH1B y protección contra el alcoholismo. Estudios realizados en diversos tipos de poblaciones humanas han mostrado que la
presencia del alelo ADH1B*2 ejerce un efecto protector frente al alcoholismo,
encontrándose que en algunas poblaciones asiáticas este alelo ejerce hasta un 50% de
protección (Neumark y cols., 1998; Chen y cols., 1999; Borràs y cols., 2000; Chambers
y cols., 2002; Wall y cols., 2005). En poblaciones europeas se encontró que el alelo
11
ADH1B*2 reduce el riesgo de consumo excesivo de alcohol (Borràs y cols., 2000) y
que individuos portadores del alelo ADH1B*2 presentaban una mayor incidencia de
efectos desagradables al consumir etanol en comparación a los portadores del alelo
ADH1B*1 (Carr y cols., 2002).
En pacientes alcohólicos de origen polinesio el porcentaje de homocigotos ADH1B*2
es de un 6%, mientras que en individuos no bebedores los homocigotos ADH1B*2
representan un 26% del total, lo que implica una marcada inhibición contra el
alcoholismo (Chambers y cols., 2002). En un meta-análisis de 48 estudios publicado
recientemente por Zintzaras y cols. (2006), se demostró que la variante ADH1B*1 (de
actividad baja) se asocia a un mayor riesgo de desarrollar alcoholismo, versus la
variante ADH1B*2 (de actividad alta) que es protectora.
La mayor actividad de la ADH hepática en los individuos que contienen el alelo para la
isozima de alta actividad ADH1B*2, podría resultar en una mayor velocidad de
eliminación de etanol y de formación de acetaldehído que en aquellos individuos que
codifican para la enzima normal ADH1B*1. Esto podría explicar las reacciones iniciales
de intoxicación que se producen tras la ingesta de alcohol entre aquellos individuos
que presentan el alelo ADH1B*2, ya que se acumularía una mayor cantidad de
acetaldehído. Sin embargo durante el metabolismo del etanol, muy pocos portadores
de la enzima rápida ADH1B*2 presentan una velocidad de eliminación de etanol mayor
que los individuos con genotipo normal, indicando que la protección contra el
alcoholismo en los portadores del alelo ADH1B*2 no estaría relacionada con
diferencias en los niveles de sanguíneos de etanol (Neumark y cols., 2004;
Duranceaux y cols., 2006). Estudios realizados en portadores de la enzima rápida
ADH1B*2 tampoco han encontrado niveles aumentados de acetaldehído posteriores al
consumo de etanol (Mizoi y cols., 1994; Peng y cols., 2007). Por lo tanto, el mecanismo
por el cual los portadores del alelo ADH1B*2 están protegidos del alcoholismo aún no
está dilucidado.
12
Sin embargo, en un estudio reciente realizado en ratas bebedoras de la línea UChB, en
los que se aumentó al doble la actividad de la ADH mediante una manipulación
endocrina (castración en machos), se encontró que al administrar una dosis estándar
de alcohol (1 g/kg) y registrar los niveles de acetaldehído en sangre arterial, los
animales castrados presentaron a los pocos minutos (5-10) un aumento transitorio de
2,5 veces en su acetaldehidemia respecto de los animales controles. No se estudió, sin
embargo, si ello ese debía a una activación de la ADH o a un aumento en los niveles
de la proteína ADH. Los animales con una mayor actividad de ADH redujeron además
su consumo voluntario de alcohol en 60% respecto de los controles (operación sham)
(Quintanilla y col., 2007). Los resultados obtenidos en este estudio, sugieren que el
aumento transitorio de los niveles de acetaldehído al consumir alcohol, sería el factor
responsable de la disminución del consumo voluntario de alcohol.
1.7. INVESTIGACIÓN PROPUESTA.
Basados en los antecedentes presentados se podría hipotetizar que al consumir
alcohol, los individuos portadores de la enzima rápida ADH1B*2, generarían durante
los primeros minutos después del consumo de alcohol una gran cantidad de
acetaldehído que excedería la capacidad del hígado de metabolizarlo, dando lugar a
una liberación de acetaldehído al torrente sanguíneo. Los síntomas disfóricos y
aversivos generados por el acetaldehído sanguíneo actuarían como un elemento
disuasivo del consumo de alcohol, que explicarían la protección al alcoholismo que
presentan los portadores del alelo ADH1B*2.
Para probar el mecanismo antes propuesto, en este trabajo se planteó el desarrollo de
un modelo animal en ratas UChB que mediante la sobreexpresión órgano-específica
del gen de la ADH presenten niveles elevados de ADH en el hígado y una elevada
actividad de esta enzima. Para acercarse aún más a la condición humana de los
portadores del alelo ADH1B*2, en este estudio se planteó adicionalmente la
construcción y administración en el hígado de ratas UChB del gen de una enzima ADH
de rata con la mutación Arg47His que caracteriza a la enzima humana rápida
13
ADH1B*2. El estudio del comportamiento de este modelo animal frente a la
administración de alcohol, podría ayudar a dilucidar los mecanismos involucrados en la
protección contra el alcoholismo que presentan los individuos portadores de la enzima
rápida ADH1B*2.
14
2. HIPÓTESIS GENERAL. La sobreexpresión del gen que codifica una deshidrogenasa alcohólica (ADH) de rata
de elevada actividad se traduce en (i) un aumento de los niveles de la enzima y su
actividad hepática, (ii) una elevación transitoria de los niveles sanguíneos de
acetaldehído al administrar etanol y (iii) una disminución del consumo voluntario de
alcohol por los animales.
3. OBJETIVO GENERAL. Determinar in vitro e in vivo si la transducción del gen que codifica una ADH de rata de
elevada actividad mediante vectores adenovirales, (i) aumenta los niveles y actividad
de la ADH en el hígado, (ii) aumenta los niveles de acetaldehído frente a la
administración de alcohol y (iii) disminuye el consumo de alcohol de animales
transducidos con estos vectores.
4. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
4.1. HIPÓTESIS 1: ESTUDIOS IN VITRO. La transducción de células de hepatoma de rata con vectores adenovirales codificantes
de las enzimas ADH nativa (rADH-47Arg) y mutada (rADH-47His) de rata, aumentan la
actividad y niveles de ADH y elevan los niveles de acetaldehído producidos en
presencia de alcohol.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ESTUDIOS IN VITRO.
4.2.1. Generar por mutación sitio dirigida un cDNA que codifique His47 en vez de
Arg47 en la ADH de la rata.
4.2.2. Determinar la expresión de plasmidios portando los cDNAs de ADH de rata
rAdh-47Arg y rAdh-47His en células HEK-293 (carentes de actividad ADH).
4.2.3. Determinar las propiedades cinéticas de las enzimas rADH-47Arg y rADH-
47His.
15
4.2.4. Obtener, amplificar, purificar y cuantificar vectores adenovirales codificantes de
las enzimas rADH-47Arg y rADH-47His.
4.2.5. Medir la actividad de la ADH y los niveles de acetaldehído generados en células
de hepatoma de rata transducidas con los vectores adenovirales al ser
incubadas en medio con etanol.
4.3. HIPÓTESIS 2. ESTUDIOS IN VIVO.
La administración a ratas bebedoras de alcohol (UChB) de un vector adenoviral que
codifica una ADH de rata de elevada actividad, aumenta la actividad y niveles de ADH
en el hígado, produce una elevación temporal de los niveles arteriales de acetaldehído
al administrar etanol, no modifica significativamente la velocidad de eliminación de
etanol y disminuye el consumo voluntario de etanol de los animales.
4.4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. ESTUDIOS IN VIVO.
4.4.1 Administrar los vectores adenovirales a ratas UChB para expresar in vivo los
cDNAs codificantes de rADH-47Arg y rADH-47His en el hígado de los animales.
4.4.2 Medir la actividad y los niveles de ADH en distintos tejidos de los animales
transducidos con los vectores adenovirales.
4.4.3 En el hígado de ratas transducidas con los vectores adenovirales determinar la
expresión de los cDNAs rAdh-47Arg y rAdh-47His mediante RT-PCR.
4.4.4 Determinar la Km aparente para NAD+ en sobrenadante de hígado de los
animales transducidos con los vectores adenovirales portando los cDNAs rAdh-
47Arg y rAdh-47His.
4.4.5 Determinar la actividad de la deshidrogenasa aldehídica (ALDH2) en el hígado
de los animales transducidos con los vectores adenovirales.
4.4.6 Medir los niveles de acetaldehído generados al administrar una dosis de alcohol
a los animales transducidos con los vectores adenovirales.
4.4.7 Medir el consumo voluntario de alcohol por los animales transducidos con los
vectores adenovirales.
4.4.8 Medir la velocidad de eliminación de etanol en los animales transducidos con
los vectores adenovirales.
4.4.9 Evaluar si existe toxicidad hepática asociada a la administración de los vectores
adenovirales a los animales.
16
5. MATERIALES.
5.1. MATERIAL BIOLÓGICO. 5.1.1. Animales.
Se utilizaron ratas hembras de la línea UChB (Universidad de Chile Bebedoras) del
genotipo Aldh21/Aldh21 y de las generaciones F80, F81 y F82, provenientes del Bioterio
del Laboratorio de Farmacogenética del Alcoholismo, Programa de Farmacología
Molecular y Clínica de la Facultad de Medicina Norte de la Universidad de Chile. Los
procedimientos experimentales se realizaron siguiendo las normas institucionales para
el manejo de animales de experimentación.
5.1.2. Líneas celulares. Se utilizaron dos líneas celulares; HEK-293 (ATCC CRL-1573) de riñón de embrión
humano y H4-II-E-C3 (ATCC CRL-1600) de hepatoma de rata, ambas provenientes de
American Type Culture Collection, Manasas, VA, EE.UU.
5.1.3. Cepas de Escherichia coli.
DH 5α: cepa con baja capacidad de recombinación (recA1), obtenidas del Laboratorio
de Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la
Universidad de Chile.
BJ 5183-AD-1: cepa con gran capacidad de recombinación (recBC) transformada con
el plasmidio AdEasy-1 que codifica el genoma del adenovirus del serotipo 5 (con
deleción de los genes E1 y E3). Se obtuvo en estado electrocompetente de Stratagene
(Cedar Creek, EE.UU.).
5.2. REACTIVOS.
5.2.1. Enzimas. Se utilizaron las enzimas BstX I, EcoR I, KspA I, Not I, y DNA ligasa del fago T4 de
Fermentas (Burlington, Canadá), BsrB I, Nar I, Pac I, Pme I de New England Biolabs
(Ipswich, MA, EE.UU.), Hind III de Gibco BRL (Grand Island, NY, EE.UU.), DNA
17
polimerasa Taq, DNA polimerasa Go-Taq, DNAsa RQ1 y transcriptasa inversa M-MLV
de Promega (Madison, WI, EE.UU.).
5.2.2. Anticuerpos.
Se utilizaron tres anticuerpos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.):
anti ADH (conejo, sc-22750), anti α-tubulina (conejo, sc-5546) y anti IgG de conejo-
HRP (cabra, sc-2004).
5.2.3. Reactivos de cultivo celular.
De Gibco BRL (Grand Island, NY, EE.UU.) se usaron los medios de cultivo Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM) y Optimem, y los reactivos fungizona, penicilina-
estreptomicina y tripsina. De Hyclone (Logan, UT, EE.UU.) se usaron los sueros fetal
de bovino analizado (SV30014.03) y suero de equino definido (SH30074.03).
5.2.4. Reactivos generales.
De Fermentas (Burlington, Canadá): estándar de peso molecular λ/Hind III. De
Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.): agar, agarosa, ampicilina, cloruro de cesio (CsCl),
dodecil sulfato de sodio (SDS), Lipofectamina 2000, estándar de peso molecular de
proteínas BenchMark, kanamicina, TRIzol. De Merck (Darmstadt, Alemania):
acetonitrilo, ácido acético glacial, ácido clorhídrico (HCl), cloroformo, cloruro de potasio
(KCl), cloruro de sodio (NaCl), crotonaldehído, etanol, extracto de levadura, fosfato
diácido de potasio (KH2PO4), fosfato monoácido de sodio (Na2HPO4), glicina, isoctano,
isopropanol, metanol, n-propanol, peptona de caseína, sacarosa. De Promega
(Madison, WI, EE.UU.): ditiotreitol (DTT), dNTPs, estándar de peso molecular de 1 kb y
100 pb. De Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.): acetaldehído, acetato de sodio, acrilamida,
azul de bromofenol, bicarbonato de sodio, bis-acrilamida, pirazol, bromuro de etidio,
cloruro de magnesio (MgCl2), 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH), ácido etilendiamino
tetraacético (EDTA), estreptomicina, hidróxido de sodio (NaOH), NAD+, NADH,
persulfato de amonio, propionaldehído, semicarbazida, rojo Ponceau S, N,N,N’,N’-
tetrametiletilendiamina (TEMED), Tritón X-100, Trizma base, Tween-20. De Winkler
(Santiago, Chile): ácido perclórico (HClO4), albúmina de suero bovino (BSA), agua libre
de nucleasas, formaldehído 37%, fosfato de sodio diácido monohidratado (NaH2PO4 x
H2O).
18
5.3. PLASMIDIOS. pAAV-MCS: forma parte del sistema AAV Helper Free (Stratagene). Este plasmidio
(4,7 kb) contiene el promotor del CMV seguido del intrón de la β-globina humana y
otros elementos que permiten un gran nivel de expresión en células de mamífero
cuando el transgén es clonado en el sitio de múltiple clonación.
pAAV-rADH-47Arg: derivado de pAAV-MCS. Contiene el cDNA de la enzima
deshidrogenasa alcohólica de rata ADH1 (GenBank NM_019286.3) desde el nucleótido
47 al 1259. El cDNA de ADH1 (1.212 pb) flanqueado en su extremo 5’ por AGC TTC
TGC AGG y en su extremo 3’ por GAC TCT AG está clonado en el sitio Hinc II en
sentido respecto al promotor del CMV. Construido por Casilda Mura y Fernando
Ezquer, 2004.
pAAV-GFP: derivado de pAAV-MCS. Contiene el gen de la proteína fluorescente verde
mejorada (eGFP, enhanced green fluorescent protein) bajo el control del promotor del
CMV. Construido por Alejandro Rosas en la Facultad de Ciencias, Universidad de
Chile.
pShuttle: forma parte del sistema de generación de adenovirus AdEasy (ATCC JHU-
23, Rockville, MD, EE.UU.). Actúa como transportador del gen terapéutico; contiene un
sitio de múltiple clonación que está bajo el control del promotor del CMV.
pAdTrack-CMV: forma parte del sistema de generación de adenovirus AdEasy,
sirviendo como transportador del gen terapéutico. Contiene un sitio de múltiple
clonación río abajo del promotor del CMV, seguido de un casete de expresión de eGFP
bajo el control del promotor del CMV.
pAdEasy-1: forma parte del sistema de generación de adenovirus AdEasy; contiene el
genoma del adenovirus del serotipo 5, con deleciones en las regiones E1 (nucleótidos
1 al 3.533) y E3 (nucleótidos 28.130 al 30.820).
19
5.4. OLIGONUCLEÓTIDOS. Los oligonucleótidos usados como partidores en las reacciones de transcripción
inversa (RT) y reacción de polimerización en cadena (PCR) se sintetizaron en la
Unidad de Síntesis y Análisis de Biomoléculas del Centro de Equipamiento y Servicios
de Apoyo Tecnológico (CESAT), Facultad de Medicina Norte, Universidad de Chile
(Tabla 5.1).
Tabla 5.1. Oligonucleótidos utilizados en las reacciones de PCR y RT-PCR.
Partidor Secuencia 5`- 3` Posición Acceso
GenBank
TG-179 TTT TTT TTT TTT TTT TTT ----- ----
TG-241 CAA CGT GCT GGT CTG TGT GC 1262-1283 (pAAV-MCS) AF_396260
TG-242 CTG GAG TGG CAA CTT CCA GG 1457-1437(pAAV-MCS) AF_396260
TG-247 CTT CTA CAA TGA GCT GCG TG 308-327(h β-actina) X_00351
TG-248 GAG GAT CTT CAT GAG GTA GTC 620-600(h β-actina) X_00351
TG-266 GTC ACA GGG ATG CCA CCC 1396-1414(pAAV-MCS) AF_396260
TG-267 AGC GAA GGA CAG CAT GAG CAC AGC 66-89 (rADH-47Arg) NM_019286.3
TG-268 TGT GAT GTG GCT GGC GCT TGA TTC 1276-1253 (rADH-47Arg) NM_019286.3
TG-332 CAA ACT AAG AAT CTG ACA CAG C 418-439 (rADH-47Arg) NM_019286.3
TG-370 AGT CTG CCA CTC AGA CGA TC 213-232 (rADH-47His) ----
TG-371 GAT CGT CTG AGT GGC AGA CT 332-313 (rADH-47His) ----
En los partidores mutagénicos TG-370 y TG-371 se destacan en negritas los nucleótidos que
permitieron generar la mutación G204A.
20
6. MÉTODOS.
6.1. SECUENCIACIÓN DE DNA. Los cDNAs rAdh-47Arg y rAdh-47His se secuenciaron en el Servicio de Secuenciación
de la Pontificia Universidad Católica de Chile. El equipo utilizado fue un secuenciador
ABI PRISM 3100 (electroforesis capilar) usando el sistema de marcación Big Dye
Terminator v3.1 de Applied Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.).
6.2. GENERACIÓN Y CLONACIÓN DEL cDNA MUTADO DE ADH DE RATA (rAdh-47His).
6.2.1. Obtención del cDNA de rADH-47His por mutagénesis puntual dirigida.
El cDNA rAdh-47His se obtuvo mediante la incorporación de la mutación G204A en el
cDNA de la ADH silvestre de rata rAdh-47Arg mediante mutagénesis sitio dirigida de
acuerdo al método descrito por Ho y cols. (1989). Usando como molde el plasmidio
pAAV-rADH-47Arg se realizaron dos reacciones de PCR mutagénicas independientes
para amplificar el fragmento 5’ y el fragmento 3’ del cDNA rAdh-47His. Para obtener el
fragmento 5’ se usaron los partidores TG-241 y TG-371 y para obtener el fragmento 3’
se usaron los partidores TG-370 y TG-242 (Figura 6.1). Para las reacciones de PCR se
mezclaron 2 unidades de DNA polimerasa Taq, 50 ng del plasmidio pAAV-rADH-47Arg,
2 µM de cada partidor, 200 µM de cada dNTP y MgCl2 (1,2; 1,6; 2,0 y 2,4 mM) en Tris-
HCl 10 mM (pH 9,0), KCl 50 mM, Tritón X-100 0,1% (se usó el tampón comercial 10X
de Promega) en un volumen de 50 µL. En un termociclador MJ Research PTC-100
(Watertown, MA, EE.UU.) las mezclas de reacción se sometieron a una etapa inicial de
desnaturación a 94ºC durante 3 minutos y luego a 35 ciclos que comprenden una
desnaturación a 94ºC durante 1 minuto, 2 minutos de apareamiento a 60ºC y 2 minutos
de extensión a 72ºC. Finalmente se realizó una etapa de extensión durante 10 minutos
a 72ºC. Los amplicones obtenidos de 269 pb (fragmento 5’) y 1177 pb (fragmento 3’) se
visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 0,8% y bromuro de etidio
0,1 µg/mL en tampón TAE y exposición a luz UV de 302 nm en un transiluminador UVP
21
TM20 (Upland, CA, EE.UU.). Para la electroforesis, se usaron cámaras horizontales
CBS Scientific (Del Mar, CA, EE.UU.) y una fuente de poder Bio-Rad PowerPac2000
(Hercules, CA, EE.UU.). Ambos amplicones se purificaron del gel de agarosa usando el
sistema QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). Luego se combinaron
ambos amplicones y se utilizaron como molde (50 ng c/u) para generar por PCR
(mismas condiciones anteriores) usando los partidores TG-241 y TG-242 el cDNA
rAdh-47His en su secuencia completa.
Figura 6.1. Mutagénesis sitio dirigida del cDNA nativo de la ADH de rata rAdh-47Arg para obtener el cDNA mutado rAdh-47His. El cDNA de la ADH silvestre de rata (rAdh-47Arg) codifica una enzima cuyo aminoácido 47 es arginina,
mientras que el cDNA con el cambio G204A (rAdh-47His) codifica una enzima ADH que contiene una
histidina en la posición 47.
CGC
GCG
A
T
5´
3´
3´
5´
TG-371
TG-370TG-241
TG-242
Vector
Vector
Vector
Vector
PCR 1TG-241 y TG-371
CAC5´ Vector
GTG3´ Vector
3´
5´
PCR 2TG-242 y TG-370
CAC5´ 3´Vector
GTG3´ 5´Vector
CACVector 3´
GTG 5´Vector
PCR 3
5´
3´
269 pb
1.177 pb
Primer Ciclo
TG-241 y TG-24234 Ciclos
CAC5´ 3´VectorVector
GTG 3´VectorVector
CGC5´ 3´VectorVector
GCG 5´VectorVector3´
cDNA rAdh-47Arg
cDNA rADH-47His1.427 pb
22
6.2.2. Obtención de plasmidios. Utilizando los sitios EcoR I e Hind III que flanquean el cDNA rAdh-47His, se clonó de
forma dirigida este cDNA en el vector de expresión pAAV-MCS/EcoR I, Hind III. De
esta forma el cDNA rAdh-47His quedó en sentido respecto del promotor del CMV. Para
ello, se digirieron 2 µg del amplicón que contenía el cDNA rAdh-47His y 2 µg del
plasmidio pAAV-MCS con 10 U de Hind III a 37ºC durante 14 horas en 100 µL de Tris-
HCl 50 mM (pH 8,0), MgCl2 10 mM y NaCl 50 mM (se uso el tampón comercial 10X de
Gibco BRL). Luego se realizó una extracción con fenol: cloroformo (1:1) para inactivar
la enzima y el DNA presente en la fase acuosa se precipitó agregando un décimo de
volumen de acetato de sodio 3M, dos volúmenes de etanol 100% y centrifugación a
20.800 x g durante 10 minutos a 4ºC en una centrífuga Eppendorf 5415C (Hamburgo,
Alemania). El DNA precipitado se lavó con etanol 75%, se centrifugó a 20.800 x g
durante 5 minutos a 4ºC, se eliminó la mayor parte del sobrenadante, se secó al vacío
durante 5 minutos y se resuspendió en 20 µL de agua. Luego, el amplicón y el
plasmidio pAAV-MCS digeridos con Hind III, se volvieron a digerir esta vez con 10 U de
EcoR I a 37ºC durante 14 horas en 100 µL de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM,
NaCl 100 mM, Tritón X-100 0,02% y BSA 0,1 mg/mL (se usó el tampón comercial 10X
de Fermentas). La enzima se inactivó mediante extracción con fenol: cloroformo (1:1) y
los productos obtenidos se visualizaron en gel de agarosa al 0,8%, bromuro de etidio
(0,1 µg/mL) y exposición a luz UV.
La reacción de ligación se realizó mezclando 150 ng del amplicón y 50 ng del vector
pAAV-MCS (doblemente digeridos con Hind III y EcoR I), con 5 U de DNA ligasa del
fago T4 en un volumen final de 19 µL. Esta mezcla de reacción se incubó a 22ºC
durante 16 horas.
6.2.3. Clonación del cDNA de rADH-47His. Se transformaron E. coli DH5α competentes (100 µL) con la mitad del producto de
ligación. Se incubó la mezcla durante 30 minutos en hielo y posteriormente se incubó a
42ºC durante 2 minutos. Las bacterias se recuperaron del proceso de transformación
en 1 mL de LB sin antibióticos durante 90 minutos a 37ºC con agitación orbital
permanente de 250 rpm en un agitador de bacterias Lab-Line (Melrose Park, IL,
23
EE.UU.). Luego las bacterias se sembraron en placas agar-LB con antibióticos
(ampicilina o kanamicina, 50 µg/mL) y se incubaron a 37ºC durante toda la noche en
una incubadora VWR 1535 (Cornelius, OR, EE.UU.). Las colonias seleccionadas se
cultivaron en 3 mL de LB con antibióticos (50 µg/mL) a 37ºC y 250 rpm durante toda la
noche.
Se realizó un barrido de búsqueda de los clones candidatos utilizando una purificación
rápida de plasmidios, que consistió en mezclar 100 µL de cultivo con 50 µL de fenol
saturado en Tris-HCl (pH 8,0) y 10 µL de solución de carga (azul de bromofenol 0,25%
y glicerol 30%), se agitó fuertemente a mano y se centrifugó a 20.800 x g durante 5
minutos. De la fase acuosa se tomaron 30 µL y se cargaron en un gel de agarosa al
0,8%. Se eligieron plasmidios cuya velocidad de migración correspondiera a la
esperada usando plasmidios de tamaño conocido como referencia. La identidad y
estructura de los plasmidios candidatos se determinó purificándolos mediante el
método de lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y analizándolos mediante digestión
enzimática con enzimas de restricción.
En el caso de la clonación del cDNA rAdh-47His en el plasmidio pAAV-MCS, los
plasmidios candidatos se confirmaron mediante digestión con EcoR I, que reconoce un
sitio en el vector, y KspA I, que reconoce un sitio en el cDNA rAdh-47His. Primero se
digirieron 2 µg de plasmidio con 10 U de EcoR I a 37ºC durante 14 horas. Se realizó
una extracción con fenol: cloroformo y el plasmidio linearizado se digirió con 10 U de
KspA I a 37ºC durante 14 horas en 100 µL de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM y
BSA 0,1 mg/mL (se uso el tampón comercial 10X de Fermentas). Los productos de la
doble digestión se analizaron en gel de agarosa al 0,8%. Los clones deseados
generaron dos fragmentos de 965 y 4.918 pb. El clon elegido se confirmó mediante
secuenciación automática con los partidores TG-241, TG-242, TG-267 y TG-332, y se
denominó pAAV-rADH-47His.
24
6.3. EXPRESIÓN DE LOS cDNAs DE rADH-47Arg y rADH-47His EN CÉLULAS HUMANAS HEK-293.
6.3.1. Cultivo de células HEK-293.
Las células HEK-293 se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM),
suplementado con 1,5 g/L de NaHCO3, esterilizado mediante filtros de nitrocelulosa de
0,2 µm (Whatman, Dassel, Alemania) y complementado con 100 U/mL de penicilina;
0,1 mg/mL de estreptomicina, 0,25 µg/mL de anfotericina B (Fungizona) y 10 % de
suero fetal de bovino en un incubador Napco 6101F-1 (Chicago, IL, EE.UU.) a 37ºC, en
una atmósfera de 5% de CO2. Las células se cultivaron en placas de poliestireno
(Corning, Corning, NY, EE.UU.) de 35, 60 y 100 mm, matraces de cultivo de
poliestireno (Corning) de 25 y 75 cm2 y placas de poliestireno (Corning) de 6 y 96
pocillos.
6.3.2. Lipofección de células HEK-293. Se estudió la funcionalidad de los dos cDNAs de ADH de rata en células humanas
HEK-293. Para ello, se transfectaron utilizando liposomas catiónicos (Lipofectamina
2000) células HEK-293 con 2 µg de los plasmidios pAAV-rADH-47Arg o pAAV-rADH-
47His y como control de transfección se utilizaron los plasmidios pAAV-GFP o pAAV-
MCS. Veinticuatro horas antes de la transfección, en placas de cultivo de 35 mm se
sembraron 1 x 106 células HEK-293 en 2 mL de DMEM suplementado a un 10% con
SFB. En el día de la transfección las células llegaron a un 70% de confluencia. En un
tubo se mezclaron 2 µg de plasmidio con medio Optimem a un volumen total de
125 µL. En otro tubo se mezclaron 5 µL de Lipofectamina 2000 con Optimem también
en un volumen de 125 µL. Se incubaron ambos tubos a temperatura ambiente durante
5 minutos, luego se mezclaron ambas soluciones y se incubaron a temperatura
ambiente durante 20 minutos. En el intertanto el medio de cultivo de las células se
reemplazó por 1 mL de Optimem. Luego se adicionó la mezcla DNA/Lipofectamina
gota a gota por toda la superficie de la placa. Se incubó la placa durante 6 horas a
37ºC en una atmósfera con 5% de CO2. Al final de la incubación, se agregaron a la
placa 1,25 mL de DMEM con antibióticos y suplementado con SFB a un 20%. La placa
se incubó durante 48 horas a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO2. Luego de 48
25
horas postransfección las células HEK-293 lipofectadas con pAAV-GFP se analizaron
mediante microscopía de fluorescencia en un microscopio invertido Eclipse TS-100
(Nikon, Tokio, Japón) asociado a una fuente de epi-fluorescencia C-SHG (Nikon, Tokio,
Japón) y usando un filtro EF-4FITC/TRITC (Nikon, Tokio, Japón). Se cuantificó el
número de células que presentaron fluorescencia verde en un campo visual para
determinar el porcentaje relativo de transfección.
6.3.3. Análisis de la expresión de los cDNAs de ADH por RT-PCR. Luego de 48 horas postlipofección se purificó el RNA total de cada placa. Para ello, las
células transducidas se homogeneizaron en 1 mL del reactivo TRIzol utilizando una
micropipeta Gilson P-1000 (Villiers le Bel, Francia) y se traspasaron a un tubo de 1,5
mL. La mezcla se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente, se agregó 0,2 mL
de cloroformo y se agitó fuertemente a mano. La mezcla se centrifugó a 12.000 x g
durante 15 min a 4ºC y la fase acuosa se transfirió a otro tubo. El RNA obtenido, se
precipitó con 0,5 mL de isopropanol, se incubó a temperatura ambiente durante 10
minutos y se centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. El RNA se disolvió en
50 µL de agua libre de nucleasas y se cuantificó mediante espectrofotometría a 260 nm
(Shimadzu UV-1201, Japón). La integridad del RNA se confirmó mediante la
visualización en gel de agarosa al 1,5 % de las bandas de los RNAs ribosomales de
18S y 28S. Para eliminar cualquier contaminación con DNA, el RNA obtenido se trató
con DNasa RQ1. Para ello, se trataron 3 µg de cada RNA con 3 U de DNasa RQ1 en
un volumen de 10 µL y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Para detener la
reacción se agregó 1 µL de EGTA 20 mM (solución de inactivación comercial de
Promega) y se incubó a 65ºC durante 10 minutos.
Los RNAs mensajeros (mRNAs) para ADH y β-actina se detectaron mediante
reacciones de transcripción inversa (RT) seguidas por una reacción de polimerización
(PCR). Para la reacción de RT se mezclaron 1 µg de RNA y 37,5 pmoles de un partidor
poli(dT) en 7 µL de agua y se incubó a 70ºC durante 5 minutos. Luego se agregaron
100 U de transcriptasa inversa M-MLV y 6,25 nmoles de dNTPs en Tris-HCl 50 mM (pH
8,3), KCl 75 mM, MgCl2 3 mM, DTT 10 mM (se usó el tampón comercial 5X de
Promega) en un volumen final de 12,5 µL. La mezcla se incubó a 42ºC durante 1 hora.
26
Para las reacciones de PCR se mezclaron 2 µL de la reacción de RT, 1,5 U de DNA pol
Taq, 2 µM de cada partidor (TG-332 y TG-268 para ADH; TG-247 y TG-248 para β-
actina), 200 µM de cada dNTP y 1,2 mM de MgCl2 en Tris-HCl 10 mM pH 9,0, KCl 50
mM, Tritón X-100 0,1% (tampón comercial 10X de Promega) en un volumen de 25 µL.
La mezcla se sometió a una etapa inicial de desnaturación a 94ºC durante 3 minutos y
luego a 35 ciclos que comprenden una desnaturación a 94ºC durante 1 minuto, 2
minutos de apareamiento a 60ºC y 2 minutos de extensión a 72ºC. Finalmente se
realizó una etapa de extensión durante 10 minutos a 72ºC. Los amplicones obtenidos
(837 pb para ADH y 300 pb para β-actina) se visualizaron mediante electroforesis en
geles de agarosa al 2%.
6.3.4. Obtención de los lisados celulares. Para obtener los lisados celulares, se retiró el medio de cultivo, se agregó a las células
0,5 mL de tampón de lisis (Tritón X-100 1%, DTT 0,33 mM) y se despegaron usando
una micropipeta P-1000. Los lisados se sometieron a 5 ciclos de sonicación/vórtex y se
centrifugaron a 20.800 x g durante 20 minutos a 4ºC. Se traspasó el sobrenadante a un
tubo nuevo.
6.3.5. Determinación de la concentración de proteínas. Las proteínas se cuantificaron mediante el sistema comercial Bio-Rad Protein Assay
(Bio-Rad, Hércules, CA, EE.UU.), que está basado en el método de Bradford para
cuantificación de proteínas (Bradford, 1976). Para ello, en un tubo de ensayo se
mezclaron 100 µL de lisado con 5 mL del reactivo de tinción (diluido en agua, 1:4). La
mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se determinó su
absorbancia a 595 nm. Para calcular la concentración de proteínas en las muestras, los
valores de absorbancia se interpolaron en una curva de calibración (0,2 – 0,9 mg/mL)
realizada con albúmina de suero bovino (BSA).
6.3.6. Determinación de la actividad de la deshidrogenasa alcohólica. La actividad de la ADH se determinó mediante espectrofotometría a través del cambio
en la absorbancia a 340 nm generado por la reducción de NAD+ a NADH. La medición
se realizó mezclando aproximadamente 500 µg de proteína total, Tris-HCl 0,5 M (pH
27
7,0 o 10,0), DTT 0,33 mM, NAD+ 5 mM y semicarbazida 24 mM. Esta mezcla se
estabilizó durante 4 minutos a 37ºC y luego se agregó etanol a una concentración final
10 mM. Como blanco se utilizó la misma mezcla de reacción pero en presencia de
pirazol a una concentración de 1 mM. Se graficaron los cambios de absorbancia
respecto al tiempo y se calculó la pendiente de las rectas para determinar la actividad
de la ADH que se expresó en términos de nanomoles de NADH generado por minuto
por milígramo de proteína en el caso de los experimentos en cultivo celular y como
micromoles de NADH generado por minuto por kilo de animal en el caso de las
mediciones realizadas en tejidos de rata.
6.3.7. Determinación de los niveles de ADH mediante análisis de Western.
i) Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS: Los geles de poliacrilamida-SDS se
prepararon con un gel concentrador al 5% (acrilamida: bisacrilamida 29:1 en peso) en
tampón Tris-HCl (pH 8,8) y un gel resolutivo al 10% (acrilamida: bisacrilamida 29:1 en
peso) en tampón Tris-HCl (pH 6,8). Se diluyeron aproximadamente 60 µg de proteínas
en un volumen de tampón de Laemmli 2X (Tris-HCl 100 mM, SDS 4%, azul de
bromofenol 0,2%, glicerol 20%, DTT 200 mM, pH 6,8) y la mezcla se incubó a 100ºC
durante 5 minutos. Se cargaron los geles de poliacrilamida-SDS en un rango de 3 a 20
µg de proteínas totales. Se cargaron también 15 µL de estándar de peso molecular de
proteínas. La electroforesis se desarrolló en tampón de electroforesis de proteínas
(Tris-HCl 2,5 mM, glicina 192 mM, SDS 1%, pH 8,3) a 100 V y 25 mA durante la
migración en el gel concentrador y a 150 V y 25 mA en el gel resolutivo.
ii) Transferencia de las proteínas a membrana de nitrocelulosa: La transferencia se
realizó en un “sandwich” formado por dos esponjas de fibra, dos láminas de papel
Whatman 3MM, una membrana de nitrocelulosa Trans Blot (Bio-Rad) y el gel resolutivo
de poliacrilamida-SDS, sujeto entre dos soportes plásticos. Este conjunto se colocó en
una cámara de transferencia Trans Blot (Bio-Rad) con la membrana de nitrocelulosa
hacia el ánodo y el gel hacia el cátodo. La cámara de transferencia se cubrió con hielo
y la transferencia se realizó a 100 V durante 60 minutos en tampón de transferencia
(Trizma base 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20%, SDS 0,025%).
28
iii) Tinción de proteínas con rojo Ponceau S: Con el objeto de comprobar la
transferencia de las proteínas, la membrana de nitrocelulosa se incubó en una solución
de rojo Ponceau S 0,1% y acido acético 50% durante 5 minutos a temperatura
ambiente. Se extrajo el exceso de solución y se lavó cuidadosamente con agua.
iv) Reacción antígeno–anticuerpo: Para bloquear los sitios de unión inespecíficos se
incubó la membrana de nitrocelulosa en tampón TBST (Tris-HCl 20 mM, NaCl 137 mM,
Tween-20 0,1%, pH 7,6) suplementado con 5% de leche descremada Svelty (Nestlé,
Graneros, Chile) a 4ºC durante 2,5 horas. La membrana se lavó cinco veces con
tampón TBST y se incubó con los anticuerpos anti ADH (dilución 1:2000 en TBST) y
anti α-tubulina (dilución 1:1000 en TBST) durante 2 horas, a 4ºC y con agitación. La
membrana se lavó cinco veces con tampón TBST y se incubó con el anticuerpo
secundario asociado a la enzima peroxidasa del rabanito (dilución 1:3000 en TBST)
durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego la membrana se lavó cinco veces con
tampón TBST.
v) Revelado de la reacción antígeno–anticuerpo: La membrana se incubó con un
reactivo quimioluminiscente que detecta a la HRP (Pierce ECL, Rockford, IL, EE.UU.)
durante 5 minutos y luego, en oscuridad, una película BioMax XAR (Kodak, Rochester,
NY, EE.UU.) se expuso a la quimioluminiscencia de la membrana en un rango de
tiempo de 5 a 60 segundos. La película se reveló en una solución reveladora Kodak
6MX durante 2 minutos, se lavó con agua y se fijó en una solución fijadora Agfa G-334
(Morstel, Bélgica) durante 2 minutos.
6.4. MEDICIÓN DE LAS CONSTANTES CINÉTICAS DE rADH-47Arg y rADH-47His.
6.4.1. Medición de la Km para NAD+.
Para calcular la Km para NAD+, se determinó la actividad de la ADH (velocidad inicial) a
las siguientes concentraciones de NAD+: 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 y 3,0 mM. Para determinar
en cada caso el valor de la Km para NAD+ se graficaron los datos según el método de
29
Lineweaver-Burk (Lineweaver y Burk, 1934). El valor de la Km se derivó del valor del
intercepto en el eje X (-1/Km).
6.4.2. Medición de la Ki para NADH.
Para calcular la Ki para NADH, se determinó la actividad de la ADH (velocidad inicial) a
una concentración fija de NAD+ (0,3 mM) a las siguientes concentraciones de NADH: 0,
25, 50 y 100 µM. Para determinar en cada caso el valor de la Ki para NADH se
graficaron los datos según el método de Dixon (Dixon, 1953). El valor de la Ki se derivó
del valor del intercepto en el eje X (-Ki).
6.5. PRODUCCIÓN DE LOS VECTORES ADENOVIRALES. Para la construcción de los vectores adenovirales se utilizó el sistema AdEasy. Este
método se basa en la recombinación homóloga entre un plasmidio de gran tamaño
portador de los genes adenovirales (pAdEasy-1) y un plasmidio transportador de
menor tamaño en el que se inserta el gen terapéutico que se desea expresar a partir
de los vectores adenovirales (He y cols., 1998). A diferencia de los métodos
tradicionales en que la recombinación homóloga entre ambos plasmidios se realiza en
células HEK-293, en el método AdEasy este proceso se efectúa en la cepa de E. coli
BJ5183, cuya elevada actividad de recombinación homóloga permite que este proceso
se realice con gran eficiencia. La recombinación homóloga entre ambos plasmidios da
origen a un plasmidio adenoviral recombinante de aproximadamente 37 kilobases
que contiene los genes adenovirales y el gen de interés y que, al ser incorporado en
células empaquetadoras de adenovirus (HEK-293), permite obtener vectores
adenovirales en títulos elevados (Figura 6.2).
30
Figura 6.2. Sistema AdEasy para la obtención de vectores adenovirales. Etapa 1: el gen de interés se clona en un plasmidio transportador (pShuttle-gen). Etapa 2: se transforman
bacterias E. coli BJ5183 (rec+) portadoras del plasmidio adenoviral pAdEasy-1 con pShuttle-gen y por
recombinación homóloga se obtiene un plasmidio adenoviral recombinante (pAd-gen) portador de los
genes adenovirales y el gen de interés. Etapa 3: el vector adenoviral se genera en células HEK-293
transducidas con el genoma adenoviral liberado de pAd-gen. Etapa 4: los vectores adenovirales se
amplifican en células HEK-293 y se purifican por gradientes de CsCl o columnas de afinidad.
Ad5 (menos E1)
Brazo homólogo derecho
Brazo homólogo izquierdopBR322 ori
Ampicilina
pAdEasy-133,5 kb
E. coli BJ5183
pAdEasy-133,5 kb
pShuttle-gen
pAd-gen
Ori
Kan
LITR
gen de interés
Zonas de Recombinación
Homóloga
Ad5 (menos E1)
RITR
Ori
Kan
LITRψ
CMV
gen de interés
SV40 pA
E. coli BJ5183 E. coli BJ5183
LITR RITRCMV Poli A
DNA Adenoviral - ∆E1GEN
Señal de encapsidación
Transfección de células HEK 293 (E1)
Plasmidio con gen de interés
Enzima de restricción Xxx
Liberación gen
Kanamicina
Pac IL-ITR
ES P CMV
MCS
SV40 pA
Brazo homologo izquierdo
R-ITRPac I
Pme I
pBR322 ori
pShuttle-CMV
Ligasa
Kanamicina
P CMV
gen de interés
SV40 pA
Brazo homólogo derecho
Brazo homólogo izquierdo
pBR322 ori
pShuttle-gen
Xxx
Xxx
Enzima de restricción Xxx
(presente en MCS)
Brazo homologo derecho
Pme I
ψ
ψ
1.- Clonación del gen de interés
Pac I
Pac I
2.- Recombinación homóloga en E. coli BJ5183
3.- Producción de adenovirus en células 293
1.- Linearizar con Pme I
2.- Transformar E.coli BJ5183(células portadoras de pAdEasy-1)
Purificación
4.- Purificación de los adenovirus y enriquecimiento del título.
Gradiente de CsCl Columna de afinidad
Linearizar con Pac I
31
6.5.1. Obtención de los plasmidios transportadores. En la Figura 6.3 se muestra el esquema experimental utilizado para obtener los
plasmidios transportadores de los cDNAs de la ADH mutada de rata (pShuttle-rADH-
47His), de la ADH nativa de rata (pShuttle-rADH-47Arg) y del intrón de la β-globina
humana (pShuttle-control). Los casetes de expresión que contienen los cDNAs de las
enzimas rADH-47His (2.996 pb) y rADH-47Arg (2.996 pb) se obtuvieron mediante
digestiones consecutivas con Nar I y Not I de los plasmidios pAAV-rADH-47His y
pAAV-rADH-47Arg. El casete que contiene el intrón de la β-globina (1.763 pb) se
obtuvo mediante digestión del plasmidio pAAV-MCS con Not I. Los casetes de
expresión se purificaron de geles de agarosa utilizando el sistema QIAquick Gel
Extraction Kit y se clonaron en el sitio Not I del plasmidio pShuttle siguiendo el
procedimiento descrito en el punto 6.2.3. La estructura de los plasmidios pShuttle-
rADH-47His, pShuttle-rADH-47Arg y pShuttle-control se confirmó mediante digestión
con las enzimas Hind III, BstX I y Not I.
Figura 6.3. Obtención de los plasmidios transportadores de los genes de interés. Los brazos de homología izquierdo (I) y derecho (D) destacados amarillo, son los segmentos que permiten
la recombinación homóloga entre los plasmidios transportadores y pAdEasy-1 que contiene el genoma
adenoviral ∆ (E1, E3). Las reacciones de digestión se realizaron mezclando 2 µg de plasmidio y 10 U de
enzima en un volumen de 100 µL, seguido de una incubación a 37ºC (55 ºC para BstX I) durante 14 horas.
pAAV-rADH-47His5883 pb
PCMV
intrónß-globina
rADH-47His
Not I (142)Not I (3138)
pApAAV-rADH-47Arg
5883 pb
PCMV
intrónß-globina
rADH-47Arg
Not I (142)
Not I (3138)
pApAAV-MCS4650 pb
PCMV
intrónß-globina
Not I (142)
Not I (1905)
pApShuttle6625 pb
Km
pBR322 ori
Not I (364)
Brazo homología I
Brazo homología D
Not INar I
Nar I (3287) Nar I (3287)
Not INot I
2996 pb
Not INot I
2996 pb
Not INar I
Not INot I
1763 pb
Not I
Not I
Not I
Not I
Ligación pShuttle/ Not I Ligación pShuttle/ Not ILigación pShuttle/ Not I
pShuttle-
rADH-47His
9621 pb
pShuttle-
rADH-47Arg
9621 pb
pShuttle-control
8388 pb
32
6.5.2. Obtención de los plasmidios recombinantes adenovirales. Los plasmidios transportadores de los genes de interés pShuttle-rADH-47His, pShuttle-
rADH-Arg, pShuttle-control y pAdTrack-CMV (portador del cDNA de eGFP) se
digirieron y linearizaron con la enzima Pme I. Para ello, se digirieron 3,5 µg de
plasmidio con 30 U de Pme I durante 14 horas a 37ºC en 100 µL de Tris-acetato 20
mM (pH 7,9), KCH3COO 50 mM, Mg(CH3COO)2 10 mM, DTT 1 mM, BSA 0,1 mg/mL
(se uso el tampón comercial 10X de New England BioLabs). Los productos de la
digestión se purificaron de geles de agarosa mediante el sistema QIAquick Gel
Extraction Kit y se ajustaron a una concentración de 40 ng/µL. Se tomaron 40 µL de
células BJ5183-AD-1 electrocompetentes y se colocaron en una cubeta de
electroporación de 400 µL (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) junto con 120 ng de
plasmidio transportador linearizado. Usando un electroporador Electroporator 2510
(Eppendorf) se aplicó a la mezcla una diferencia de voltaje de 2500 V durante 5 ms.
Las células se recuperaron en 1 mL de medio LB a 37ºC durante 1 hora y se
sembraron en placas LB/agar/Km (50 µg/mL) y se incubaron a 37ºC durante 8 horas.
Se eligieron 10 colonias aisladas resistentes a Km y se cultivaron en 5 mL de LB/Km
(50 µg/mL) a 37ºC durante 14 horas. Se purificaron los plasmidios adenovirales
recombinantes presentes en los clones seleccionados mediante lisis alcalina y se
analizó la estructura de los plasmidios mediante digestión con la enzima Pac I, para
ello se mezclaron 2 µg de plasmidio y 4 U de Pac I a 37ºC durante 6 horas en 100 µL
de Tris-HCl 10 mM (pH 7,0), MgCl2 10 mM y BSA 0,1 mg/mL (se uso el tampón
comercial 10X de New England BioLabs). Los plasmidios recombinantes de la
estructura correcta se amplificaron en gran cantidad en células E. coli DH5α, se
purificaron mediante el sistema JETstar Plasmid Mini (Genomed, Löhne, Alemania) y
se analizaron mediante digestión con Eco RI y BamH I. Los plasmidios recombinantes
adenovirales obtenidos se denominaron pAdV-rADH-47Arg, pAdV-rADH-47His,
pAdV-GFP (portador del cDNA de GFP) y pAdV-control (portador del intrón de la β-
globina).
6.5.3. Obtención de los vectores adenovirales. Los vectores adenovirales se obtuvieron por transfección de células HEK-293 con el
genoma adenoviral presente en los plasmidios adenovirales recombinantes. Para
33
liberar el genoma adenoviral se digirieron 5 µg de plasmidio adenoviral recombinante
con 10 U de Pac I durante 14 horas a 37ºC en un volumen de 100 µL de Tris-HCl 10
mM (pH 7,0), MgCl2 10 mM y BSA 0,1 mg/mL (tampón comercial 10X de New England
BioLabs). Veinticuatro horas antes de la transfección, en un matraz de cultivo de
25 cm2 se sembraron 2 x 106 células HEK-293 en 7 mL de DMEM sin antibióticos y
suplementado a un 10% con SFB. En el día de la transfección las células llegaron a un
70% de confluencia. En un tubo se mezclaron 5 µg de DNA con medio Optimem a un
volumen total de 250 µL. En otro tubo se mezclaron 20 µL de Lipofectamina 2000 con
Optimem también en un volumen de 250 µL. Se incubaron ambos tubos a temperatura
ambiente durante 5 minutos, se mezclaron ambas soluciones y se incubaron a
temperatura ambiente durante 20 minutos. En el intertanto el medio de cultivo de las
células se reemplazó por 2,5 mL de Optimem. Luego se adicionó la mezcla
DNA/Lipofectamina gota a gota por la superficie del cultivo. El matraz se incubó
durante 6 horas a 37ºC en una atmosfera de 5% de CO2. Al final de la incubación, se
agregaron a la placa 3 mL de DMEM con antibióticos y suplementado con SFB a un
20%. Después de 10 a 15 días de cultivo se observaron cambios morfológicos en las
células, que presentaban un aspecto redondeado diferente al aspecto estrellado
normal, además de una pérdida de adherencia y desprendimiento de la placa (efecto
citopático). Cuando el 50% de las células presentaron efecto citopático, se despegaron
de la placa de cultivo con un raspador de células, se resuspendieron en 3 mL de PBS y
se lisaron mediante 4 ciclos de congelamiento (-80ºC) y descongelamiento (37ºC).
6.5.4. Amplificación de los vectores adenovirales. El primer ciclo de amplificación consistió en la infección de 2 x 106 células HEK-293 en
un matraz de 25 cm2 con 1,5 mL del lisado obtenido en el punto 6.5.3. Las células se
incubaron en DMEM (10% SFB, con antibióticos) a 37ºC y atmósfera con 5% de CO2.
Al cabo de 3 a 4 días de cultivo las células presentaron efecto citopático, se
despegaron y se concentraron en 5 mL de medio de cultivo y se lisaron mediante 4
ciclos de -80ºC/37ºC. El segundo ciclo de amplificación consistió en la infección de 7 x
106 células HEK-293 en un matraz de 75 cm2 con 3 mL del lisado obtenido en la
primera amplificación. Al cabo de 3 a 4 días de cultivo las células presentaron efecto
citopático, se despegaron y concentraron en 10 mL de medio de cultivo y se lisaron
34
mediante 4 ciclos de -80ºC/37ºC. El tercer ciclo de amplificación consistió en la
infección de 7 x 106 células HEK-293 en cada uno de 3 matraces de 75 cm2 con 600 µL
del lisado obtenido en la segunda amplificación. Al cabo de 3 a 4 días de cultivo las
células presentaron efecto citopático, se despegaron y concentraron en 25 mL de PBS
(NaCl 140 mM; KCl 2,7 mM; Na2HPO4 8,1 mM; KH2PO4 1,5 mM) y se lisaron mediante
4 ciclos de -80ºC/37ºC. La amplificación final se efectuó en 40 a 50 matraces de 75 cm2
infectando 7 x 106 células HEK-293 en cada uno con 350 µL del lisado obtenido en la
tercera amplificación. Al cabo de 3 a 4 días de cultivo las células presentaron efecto
citopático, se despegaron, se concentraron en 8 mL de PBS y se lisaron mediante 4
ciclos de -80ºC/37ºC.
6.5.5. Purificación de los vectores adenovirales. Los adenovirus se purificaron mediante doble gradiente de cloruro de cesio (CsCl). En
una botella de policarbonato de 10,4 mL (Beckman, Palo Alto, CA, EE.UU.) se formó
una gradiente discontinua de CsCl: se agregaron en primer lugar 2,8 mL de una
solución de CsCl de densidad 1,4 g/mL y sobre ella se agregaron 2,1 mL de una
solución de CsCl de densidad 1,2 g/mL. Sobre esta gradiente se agregó el lisado
obtenido en la amplificación final (previamente clarificado mediante centrifugación a
7.000 x g durante 10 minutos) y se centrifugó a 42.000 x g a 4ºC durante 90 minutos en
una ultracentrífuga Optima XL-90 (Beckman, Palo Alto, CA, EE.UU.), utilizando un rotor
Beckman 80 Ti, sin freno al término de la corrida. La banda que contenía los vectores
adenovirales maduros se extrajo de la gradiente con una pipeta Pasteur. En una botella
de policarbonato de 10,4 mL la banda que contenía los vectores adenovirales se
resuspendió en una solución de CsCl de densidad 1,35 g/mL y se centrifugó a 190.000
x g a 15ºC durante 18 horas en una ultracentrífuga Optima XL-90, utilizando un rotor
Beckman 80 Ti, sin freno al término de la corrida. La banda que contenía los vectores
adenovirales (1 mL aprox.) se extrajo con una pipeta Pasteur y se transfirió a un casete
de diálisis (10.000 MWCO, 0,5-3 mL, Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Los adenovirus se
dializaron a 4ºC en 650 mL de tampón de diálisis (Tris-HCl 10 mM, MgCl2 2mM,
sacarosa 5%, pH 8,0) en tres etapas de 4, 16 y 4 horas. Finalmente los vectores
adenovirales se dividieron en alícuotas de 25 µL y se almacenaron a -80°C en tampón
de diálisis.
35
6.5.6. Titulación de los vectores adenovirales mediante absorbancia a 260 nm. La cuantificación de las partículas virales totales por espectrofotometría a 260 nm se
basa en la cuantificación de los genomas adenovirales (Miterreder y cols., 1996). Se
realizaron 5 diluciones (entre 1:2 y 1:50) de la preparación adenoviral en tampón de
lisis viral (SDS 0,1%, Tris-HCL 10 mM pH: 7,4, EDTA 1mM) y se incubaron a 56°C
durante 10 minutos con agitación. Se realizaron lecturas de absorbancia a 260 nm de
las diluciones virales, usando como blanco el tampón de lisis viral. El título viral
(partículas virales/mL) de cada dilución se obtuvo usando la Fórmula 1:
Partículas Virales/mL= (absorbancia 260 nm) x (dilución) x 1,1 x 1012 (1)
El título adenoviral final se obtuvo del promedio de los resultados obtenidos para cada
una de las diluciones.
6.5.7. Titulación de los vectores adenovirales mediante el método de la Dosis Infectiva 50 (TCID50). Este método se basa en la observación del efecto citopático producido en cultivos de
células HEK-293 transducidos con diluciones seriadas de un vector adenoviral
(QBIOgene, 2001; LaBarre y Lowy, 2001). Para ello se sembraron 1 x 104 células HEK-
293 en 100 µL de DMEM (2% SFB, con antibióticos) en cada pocillo de una placa de
cultivo de 96 pocillos. Al día siguiente, se prepararon diluciones de la preparación
adenoviral en un rango de 10-1 a 10-12 y se agregaron 100 µL de cada dilución (de 10-5
a 10-12) a 10 pocillos de la placa. A los pocillos control (dos por cada dilución) se les
agregó 100 µL de medio de cultivo. Las placas se incubaron a 37ºC, en una atmósfera
de 5% de CO2 durante 10 días. Al término de este período se observó al microscopio
cada pocillo para consignar la presencia de efecto citopático (CPE). El título (t) de la
preparación adenoviral en términos de TCID50/mL está dado por la Fórmula 2: t = 10 1+d(S-0,5) (2)
Donde, d = log10 de la dilución inicial (como la dilución inicial es de 10 veces, este
factor tiene un valor de 1), y S = sumatoria de las razones Pocillos con CPE/Pocillos
totales para cada dilución.
36
El título (T) de la preparación adenoviral en términos de partículas formadoras de placa
(PFU/mL) está dado por la Fórmula 3: T = t – 0,7 log10 (3)
6.6. EXPRESIÓN IN VITRO DE LOS cDNAS DE rADH-47His y rADH-47Arg EN CÉLULAS DE HEPATOMA DE RATA.
6.6.1. Cultivo de células H4-II-E-C3 de hepatoma de rata.
Las células H4-II-E-C3 se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM),
suplementado con 1,5 g/L de NaHCO3, esterilizado mediante filtración por membranas
de nitrocelulosa de 0,2 µm y complementado con 100 U/mL de penicilina; 0,1 mg/mL
de estreptomicina, 0,25 µg/mL de anfotericina B (Fungizona), 10% de suero de equino
y 5% de suero fetal de bovino a 37ºC, en una atmósfera de 5% de CO2. Las células se
cultivaron en placas de poliestireno de 35, 60 y 100 mm.
6.6.2 Curva dosis-respuesta: dosis de vector adenoviral versus actividad de la ADH en células H4-II-E-C3. Previo al estudio del efecto de distintas dosis de los vectores adenovirales en la
actividad de la ADH de células hepáticas de rata H4-II-E-C3 en cultivo, se realizaron
estudios para determinar el tiempo óptimo postransducción, es decir, el período de
tiempo necesario para obtener el mayor nivel de expresión del gen de interés. Para
ello, las células H4-II-E-C3 se sembraron en placas de 6 pocillos a una concentración
de 2 x 106 células por pocillo. Cuando las células alcanzaron 90 % de confluencia (día
2) se transdujeron con el vector adenoviral AdV-GFP a una dosis o multiplicidad de
infección (MOI) de 1 PFU/célula. Las células se incubaron en medio DMEM (10 %
SEQ, 5 % SFB, con antibióticos) a 37ºC, en una atmósfera de 5% de CO2 y la
expresión del cDNA de GFP se determinó mediante citometría de flujo a las 24, 48, 72
y 96 horas postransducción. La citometría de flujo se realizó en un citómetro
FACSCanto II (Becton Dickinson, San José, CA, EE.UU.) con excitación a 488 nm con
un láser de argón y detección de la emisión a 525 nm.
37
Para estudiar el efecto de la transducción de células H4-II-E-C3 con diferentes dosis de
los vectores AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg y AdV-control sobre la actividad de la
ADH, se sembraron células H4-II-E-C3 en placas de 6 pocillos a una concentración de
2 x 106 células por pocillo (día 1). Cuando las células alcanzaron 90 % de confluencia
(día 2) se transdujeron con los vectores adenovirales a las siguientes dosis o
multiplicidad de infección (MOI): 1, 5, 10 y 25 PFU/célula. Las células se incubaron en
medio DMEM (10 % SEQ, 5 % SFB, con antibióticos) a 37ºC, en una atmósfera de 5%
de CO2 durante 48 horas. Al término de este período (día 4), las células se lisaron en
500 µL de tampón de lisis y se determinó la actividad de la ADH en los lisados y los
niveles de ADH mediante análisis de Western.
6.6.3. Acumulación de acetaldehído en cultivo de células H4-II-E-C3.
Se determinó la acumulación de acetaldehído en el medio de cultivo de células
H4-II-E-C3 transducidas con los vectores adenovirales AdV-rADH-47His,
AdV-rADH-47Arg y AdV-control. Para ello se sembraron células H4-II-E-C3 en placas
de 6 pocillos a una concentración de 2 x 106 células por pocillo. Al día siguiente se
transdujeron con los vectores adenovirales a una MOI de 5 PFU/célula. Después de 48
horas postransducción se retiró el medio de cultivo y las células se lavaron 3 veces con
PBS frío. Luego se agregaron 3 mL de medio DMEM sin suero, suplementado con
alcohol a una concentración de 10 mM. Las células se incubaron 60 minutos a 37ºC, y
para evitar la evaporación tanto del alcohol como del acetaldehído formado, las placas
se taparon herméticamente con tapones de goma nº 8. La cuantificación del
acetaldehído se realizó de acuerdo al método descrito por Lucas y cols. (1986), que se
basa en una reacción de derivación del acetaldehído con 2,4-dinitrofenilhidrazina
(DNPH) y considera el uso de crotonaldehído como estándar interno. Para ello, se
tomaron 500 µL del medio de cultivo y se agregaron a 4 mL de una solución de NaCl
0,15 M, HClO4 0,6 M, en tubos de polipropileno de 15 mL. Luego de agitar las
soluciones, se agregaron 100 µL de DNPH 0,5 mg/mL preparado en HCl 6M y 10 µL de
crotonaldehído 0,62 M disuelto en metanol y se incubaron 1 hora a 40ºC en un baño
termorregulado. Transcurrida la incubación, se neutralizó la reacción mediante la
adición de 2 mL de acetato de sodio 3 M. A continuación se agregaron 2 mL de
isoctano y se agitaron enérgicamente los tubos en un agitador de bacterias a 250 rpm
38
durante 20 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente los tubos se centrifugaron
a 10.408 x g durante 10 minutos y se recuperó 1,5 mL de la fase orgánica que se llevó
a sequedad en un desecador de policarbonato a presión negativa. El residuo obtenido
se resuspendió en 100 µL de una mezcla agua: acetonitrilo en una razón de 35:65. De
la suspensión obtenida, se inyectaron 20 µL en un HPLC Shimadzu (inyector SIL-10A,
controlador SCL-10A, bomba LC-10AD, detector UV-visible SPD-10AV, interfaz CBM-
101; Tokio, Japón) implementado con una columna Supelcosil LC18 (Supelco,
Bellefonte, PA, EE.UU.). La separación se realizó usando una mezcla agua: acetonitrilo
35:65 con un flujo de 1,25 mL/min. El acetaldehído derivado se detectó a 365 nm y los
cromatogramas se procesaron con el programa CLASS-LC10 (Shimadzu, Tokio,
Japón). Paralelamente se realizó una curva estándar con concentraciones de
acetaldehído entre 1 y 100 µM que se procesaron de la misma forma.
6.7. SOBREEXPRESIÓN IN VIVO DE LOS cDNAs DE rADH-47His Y rADH-47Arg EN
RATAS UChB. Los experimentos de sobreexpresión in vivo de los genes de las enzimas rADH-47Arg
y rADH-47His se realizaron en ratas hembras Wistar de la línea UChB (Universidad de
Chile Bebedoras), sin experiencia previa de consumo de alcohol (“naive”) (Mardones y
Segovia-Riquelme, 1983; Quintanilla y cols., 2006). Los animales se mantuvieron en
jaulas individuales en un ciclo de 12 horas de luz y oscuridad (ciclo de luz: 06:00 a
18:00 horas; ciclo de oscuridad: 18:00 a 06:00 horas). El alimento y el agua estuvieron
a libre disposición las 24 horas del día.
6.7.1. Administración de los vectores adenovirales a ratas UChB. La sobreexpresión in vivo de las enzimas rADH-47Arg y rADH-47His en las ratas UChB
se logró mediante la administración de los vectores adenovirales AdV-rADH-47Arg,
AdV-rADH-47His y AdV-control como vector control no codificante. Se utilizaron 15
ratas hembras con un peso de 150 - 200 gramos (16 semanas de edad) y se
distribuyeron en 3 grupos de 5 animales, destinando un grupo para cada tipo de
adenovirus (Figura 6.4). El mismo día de la administración, los vectores adenovirales
se descongelaron y se diluyeron a la concentración requerida en tampón de diálisis.
39
Manteniendo todo en hielo, los adenovirus se traspasaron a una jeringa de insulina
Ultra-Fine II de 500 µL (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) y se administró
a cada animal una dosis adenoviral de 5 x 1012 pv/kg en un volumen de 500 µL por vía
intravenosa, mediante una inyección intravenosa lenta (30 segundos) por la vena de la
cola. Una vez tratados, los animales se devolvieron a sus jaulas individuales. Para
registrar cualquier reacción adversa a la administración de los vectores adenovirales,
los animales se mantuvieron bajo observación durante una hora. A partir del cuarto día
de la transducción con los vectores adenovirales y durante 13 días, se estudió el
consumo voluntario de alcohol de los animales mediante un acceso limitado a alcohol
de 1 hora diaria; y a las tres semanas postransducción se determinó la velocidad de
eliminación de etanol y los niveles de acetaldehído sanguíneo después de una dosis
estándar de etanol (1 g/kg). Una vez finalizados estos estudios, los animales se
sacrificaron y se recolectaron muestras de sangre y tejidos (Figura 6.4).
Figura 6.4. Administración de los vectores adenovirales a ratas UChB y cronograma de los estudios realizados. En el período comprendido entre las administración de los vectores adenovirales (día 0) y el día 4 no se
administró alcohol, se reservó esta ventana de tiempo para que los tejidos transducidos generaran niveles
adecuados de las enzimas codificadas en los adenovirus.
CGCGCGCAC
GTG
CACGTG
AdV-rADH-47ArgAdV-rADH-47His AdV-control
0
Administración de losvectores adenovirales
• Dosis adenoviral: 5x1012 pv/kg• Vía: vena de la cola• N=5 animales/grupo
4 17
Consumo voluntario de una solución de alcohol 10%
Registro diario:• consumo de alcohol (1 hora)• consumo de agua (24 horas)
20
Administración i.p. de alcohol (1g/kg) y determinación de:
• los niveles arteriales de acetaldehído.
• la velocidad de eliminación de etanol.
27
Extracción de tejidos y análisis de:• la actividad de la ADH.• los niveles de la ADH.
Día
40
6.7.2. Registro del consumo voluntario de alcohol en ratas UChB. El efecto de la expresión de los genes de las enzimas rADH-47Arg y rADH-47His sobre
el consumo voluntario de alcohol en ratas UChB se determinó mediante un estudio de
acceso limitado a alcohol que promueve la intoxicación. Este estudio se inició al cuarto
día desde la administración de los adenovirus y consistió en ofrecer a los animales en
pipetas graduadas una solución de etanol al 10% (vol/vol) o agua durante una hora
diaria por un período de 14 días. Cada sesión de acceso limitado a alcohol se realizó
entre las 13:00 horas y 14:00 horas. Al término de cada sesión de una hora, se registró
el consumo de alcohol y se expresó como gramos de etanol consumidos por kilo de
peso de animal por hora. Se registró también el consumo de agua cada 24 horas y se
expresó como mililitros de agua consumidos por kilo de peso por día. El peso de los
animales se registró cada 4 días.
6.7.3. Medición de la velocidad de eliminación de alcohol en ratas UChB.
Tres semanas después de la administración de los vectores adenovirales, se determinó
el efecto en ratas UChB de la expresión de los genes de las enzimas rADH-47Arg y
rADH-47His sobre la velocidad de eliminación de alcohol. Las mediciones fueron
realizadas por las profesoras María Elena Quintanilla, Lutske Tampier, y el Sr. Juan
Santibáñez en el Laboratorio de Farmacogenética del Alcoholismo de la Facultad de
Medicina de la Universidad de Chile. Los animales recibieron una dosis intraperitoneal
de alcohol (1 g/kg, administrados en una solución 20 % v/v en NaCl 0,9 %) y los niveles
sanguíneos de etanol se midieron a los 60, 90, 120 y 150 minutos después de la
administración del etanol en muestras de 0,1 mL de sangre que se obtuvieron
mediante el corte de la punta de la cola. La cuantificación del alcohol en las muestras
de sangre se realizó mediante cromatografía de gases en un equipo PerkinElmer SRI
8610 (Waltham, MA, EE.UU.) usando n-propanol como estándar interno. Las muestras
de sangre se agregaron a 0,9 mL de una solución de n-propanol 3,2 mg % en frascos
herméticamente cerrados con válvulas Mininert (Supelco, Bellefonte, PA, EE.UU.).
Después de incubar la mezcla a 60ºC durante 15 minutos, se tomó 1 mL de la fase
gaseosa y se inyectó en el cromatógrafo de gases equipado con una columna Porapak
T (Waters Co., Milford, MA, EE.UU.) a una temperatura del horno de 80ºC y usando
nitrógeno como gas de arrastre a una velocidad de flujo de 65 mL/min. La detección del
41
etanol se realizó mediante un detector de ionización de llama. Para calcular la
concentración de etanol en la muestra de sangre se dividió el área del pico del etanol
por el área del pico del propanol (estándar interno) y la razón resultante se comparó
con la razón obtenida al incubar un frasco que contenía 0,1 mL de etanol 40 mg % más
0,9 mL de n-propanol 3,2 mg %.
La velocidad de eliminación de etanol (b) de los animales, se obtuvo del cuociente
entre la dosis administrada (D) y el tiempo total de eliminación de la dosis (t) (Wallgren
y Barry, 1970), según indica la Fórmula 4.
b = D/t (4)
Donde la dosis de etanol (D) fué de 1000 mg/kg y el tiempo de eliminación total de la
dosis (t) es igual al intercepto con el eje X de la extrapolación de la curva de
concentración sanguínea de etanol versus tiempo obtenida para cada animal (Figura
6.5). La velocidad de eliminación de etanol (b) se expresó en términos de mg de
etanol/kg/hora.
Figura 6.5. Determinación de la velocidad de eliminación de etanol a partir de los valores de alcoholemia. En el ejemplo se muestran los valores de alcoholemia a las 1; 1,5; 2 y 2,5 horas después de administrar
una dosis de etanol (1000 mg/kg i.p.) a una rata UChB transducida con 5 x 1012 pv/kg del vector AdV-
rADH-47Arg. El valor de la velocidad de eliminación (b) se obtuvo de la razón entre la dosis administrada
(D) y el tiempo total de eliminación (t).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
R=0,99
Tiempo de eliminación de la
dosis (t): 3,1 horas
Velocidad de eliminación (b)= D/tb= 1000 mg/kg / 3,1 h
b= 322,6 mg/kg/h
Tiempo (horas)
Alc
ohol
emia
(mg
%)
42
6.7.4. Medición de los niveles arteriales de acetaldehído en ratas UChB. Tres semanas después de la administración de los vectores adenovirales, se determinó
el efecto en ratas UChB de la expresión de los genes de las enzimas rADH-47Arg y
rADH-47His sobre los niveles arteriales de acetaldehído generados por una dosis de
alcohol. Las mediciones fueron realizadas por las profesoras María Elena Quintanilla,
Lutske Tampier, y el Sr. Juan Santibáñez en el Laboratorio de Farmacogenética del
Alcoholismo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile. Para ello, los
animales recibieron una dosis intraperitoneal de alcohol (1 g/kg, administrados en una
solución 20 % v/v en NaCl 0,9 %) y los niveles de acetaldehído se midieron a los 1
(cuando fue posible), 2,5; 5; 10; 15 y 30 minutos en muestras de 0,1 mL de sangre, que
se obtuvieron de la arteria carótida en ratas previamente sedadas y anestesiadas con
maleato de acepromazina (2 mg/kg) y clorhidrato de ketamina (60 mg/kg i.m.) (Drug
Pharma, Santiago, Chile). La cuantificación del acetaldehído en las muestras de sangre
se realizó mediante cromatografía de gases en un equipo PerkinElmer SRI 8610
usando el método descrito por Quintanilla y cols. (2007). Brevemente, las muestras de
sangre se recibieron en 0,9 de agua mantenida a 4ºC, en frascos herméticamente
cerrados con tapas provistas de válvulas Mininert. Después de incubar la mezcla a
60ºC durante 15 minutos, se tomó 1 mL de la fase gaseosa y se inyectó en el
cromatógrafo de gases equipado con una columna Porapak T usando nitrógeno como
gas de arrastre a una velocidad de flujo de 65 mL/min. La detección del acetaldehído
se realizó mediante un detector de ionización de llama. Paralelamente se realizó una
curva estándar con concentraciones de acetaldehído entre 1 y 100 µM que se
procesaron de la misma forma.
6.7.5. Preparación de las muestras de tejido para la medición de la actividad enzimática. Una vez finalizada la determinación de los niveles arteriales de acetaldehído, los
animales se sacrificaron mediante decapitación y rápidamente se extrajeron el cerebro,
pulmones, hígado, corazón, riñones y bazo. Los tejidos se lavaron con PBS frío, se
secaron con una toalla de papel, se registró su peso y se almacenaron envueltos en
papel de aluminio a -80ºC.
43
La actividad de la ADH se determinó en cada tejido recolectado, mientras que la
actividad de la ALDH2 se determinó solamente en el hígado. Se pesó
aproximadamente 0,5 g de tejido, se cortó en trozos pequeños y se resuspendió en
2,5 mL de tampón de homogeneización (sacarosa 0,25 M, Trizma base 5 mM, EDTA
0,5 mM, DTT 0,5 mM) para la medición de la actividad de la ADH y en 2,5 mL de
tampón de lisis para la medición de la actividad de la ALDH2. El tejido se homogeneizó
utilizando un equipo Ultra Turrax T25 (Janke & Kunkel, Staufen, Alemania) con el
vástago de dispersión más pequeño. Se efectuaron 5 ciclos de homogeneización (30 s)
e incubación en hielo (1 min). La mezcla se traspasó a un tubo de vidrio Corex de 15
mL y se centrifugó a 1.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Luego se tomaron 2 mL de
sobrenadante, se traspasaron a un tubo plástico de 2 mL y se centrifugó a 20.800 x g
durante 20 minutos a 4ºC. Finalmente, el sobrenadante se dividió en alícuotas de
150 µL y se almacenaron a -80ºC para su análisis posterior. La concentración de
proteínas en los homogeneizados se determinó mediante el sistema comercial BioRad
Protein Assay.
6.7.6. Determinación de la expresión de los cDNAs de rADH-47His y rADH-47His en el hígado de ratas UChB. Se determinó la expresión de los cDNAs rAdh-47His y rAdh-47Arg mediante la
detección del mRNA de las enzimas rADH-47Arg y rADH-47His en el hígado de ratas
transducidas con los vectores AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg y AdV-control. Para
ello se realizaron reacciones de transcripción inversa (RT) seguidas de una reacción de
polimerización en cadena (PCR) en RNA total. En las reacciones de PCR se utilizó una
pareja de partidores (TG-267 y TG-242) que permitió amplificar selectivamente los
mRNAs de las ADHs codificadas en los vectores adenovirales, sin amplificar el mRNA
de la ADH endógena presente en los hígados. Aprovechando el hecho de que la
mutación G204A incorporada en el cDNA rADH-47His elimina un sitio único de corte
para la enzima BsrB I, se identificó el tipo de mRNA presente en los productos de
RT-PCR mediante digestión con BsrB I (Figura 6.6).
44
Figura 6.6. Esquema experimental para la detección e identificación del mRNA de rADH-47His y rADH-47Arg en hígado de rata. A partir de mRNA total de hígado de ratas tratadas con los vectores AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg y
AdV-control, se realizaron reacciones de RT con un partidor poli(dT) para obtener el cDNA total y
utilizando los partidores TG-267 (mRNA de ADH de rata) y TG-242 (región 3’ no traducida) se amplificó
selectivamente el mRNA de las ADH codificadas en los adenovirus. La identificación de los mRNAs se
realizó mediante digestión con BsrB I.
Se purificó el RNA total de aproximadamente 100 mg de hígado de ratas tratadas con
los vectores adenovirales AdV-rADH-47Arg, AdV-rADH-47His y AdV-control utilizando
1 mL de reactivo TRIzol. El tejido se homogeneizó utilizando un equipo Ultra Turrax
T25 con el vástago de dispersión más pequeño en tubos plásticos de 15 mL. Se
efectuaron 5 ciclos de homogeneización (30 s) e incubación en hielo (1 min). La mezcla
se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente, se agregó 0,2 mL de cloroformo
y se agitó fuertemente a mano. La mezcla se centrifugó a 12.000 x g durante 15 min a
4ºC y la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo. El RNA obtenido se precipitó con
0,5 mL de isopropanol, se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos y se
centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. El RNA se disolvió en 200 µL de
agua libre de nucleasas y se cuantificó mediante espectrofotometría a 260 nm. La
integridad del RNA se confirmó mediante la visualización en gel de agarosa al 1,5 % de
las bandas de RNA ribosomal de 18S y 28S.
TG-267
TG-242
TG-267
TG-242 TG-242
rADH-47His
BsrB IBsrB IX
3’-UTR3’-UTR 3’-UTR
PCR PCRPCR
Sin Producto1324 pb 1324 pb
BsrB IBsrB I
1324 pb 1209 pb
105 pb
AdV-rADH-47His AdV-rADH-47Arg AdV-control
Productode la RT
Productode la PCR
Productodigestióncon BsrB I
rADH-47Arg
rADH-47His rADH-47Arg
45
Para eliminar cualquier contaminación con DNA, el RNA obtenido se trató con la
enzima DNAasa RQ1, para ello se mezclaron 20 µg de cada RNA con 5 unidades de la
DNAsa RQ1 en un volumen de 100 µL y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Para
detener la reacción y recuperar el RNA se realizó una extracción con 100 µL de fenol:
cloroformo (1:1). Para la reacción de RT se mezclaron 4 µg de RNA total, 60 pmoles de
un partidor poli(dT) en 11 µL de agua y se incubó a 70ºC durante 5 minutos. Luego se
agregaron 100 unidades de transcriptasa inversa M-MLV y 10 nmoles de dNTPs en
Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KCl 75 mM, MgCl2 3 mM, DTT 10 mM (se usó el tampón
comercial 5X de Promega) en un volumen final de 20 µL. La mezcla se incubó a 42ºC
durante 1 hora. Para las reacciones de PCR se mezclaron 10 µL de la RT, 1,5 U de
DNA polimerasa Go-Taq, 2 µM de los partidores TG-267 y TG-242, 200 µM de cada
dNTP y 1,4 mM de MgCl2 y 10 µL de tampón comercial (Green GoTaq Flexi 5X de
Promega) en un volumen de 50 µL. La mezcla se sometió a una etapa inicial de
desnaturación a 94ºC durante 3 minutos y luego a 35 ciclos que comprenden una
desnaturación a 94ºC durante 1 minuto, 2 minutos de apareamiento a 62ºC y 2 minutos
de extensión a 72ºC. Finalmente se realizó une etapa de extensión durante 10 minutos
a 72ºC. Los amplicones obtenidos se visualizaron mediante electroforesis en geles de
agarosa al 2%. Para determinar la identidad de los amplicones obtenidos, se digirieron
con la enzima BsrB I. Para ello se digirieron 150 ng de amplicón con 5 U de BsrBI
durante 14 horas a 37°C en 100 µL de Tris-acetato 20 mM (pH 7,9), KCH3COO 50 mM,
Mg(CH3COO)2 10 mM, DTT 1 mM, BSA 0,1 mg/mL (se uso el tampón comercial 10X de
New England BioLabs). Los productos de la digestión se visualizaron en gel de
agarosa al 2%.
6.7.7. Determinación de la Km aparente para NAD+ en homogeneizado de hígado de rata. Se determinó la Km aparente para NAD+ en los homogeneizados de hígado obtenidos
de las ratas tratadas con los vectores adenovirales AdV-rADH-47Arg, AdV-rADH-47His
y AdV-control. Se determinó la actividad de la ADH agregando 50 µL de
homogeneizado de hígado a una mezcla de reacción constituida por Tris-HCl 0,5 M
(pH 10), DTT 0,33 mM, semicarbazida 24 mM y etanol 10 mM a concentraciones de
NAD+ de 0,1; 0,5; 1 y 2 mM. Para cada caso el valor de la Km aparente para NAD+ se
determinó del intercepto con el eje X (-1/Km) de la extrapolación de las curvas de doble
46
recíproco de la actividad inicial de la ADH versus concentración de NAD+ (Lineweaver y
Burk, 1934).
6.7.8. Determinación de la toxicidad hepática de la administración de los vectores adenovirales. El estudio de los efectos tóxicos a nivel hepático en las ratas UChB tratadas con los
vectores adenovirales se realizó mediante la medición de la actividad plasmática de la
enzima alanina aminotransferasa (ALT) y por análisis histológico de cortes de hígado
tratados con tinción eosina-hematoxilina.
Se determinó la actividad plasmática de ALT en sangre de ratas UChB tratadas con los
vectores AdV-rADH-47Arg, AdV-rADH-47His, AdV-control y con vehículo salino. Las
muestras de sangre (500 µL aproximadamente) se recolectaron al sacrificar los
animales (21 días postransducción) en tubos de 1,5 mL a los que previamente se les
había agregado 20 µL de EDTA 0,34 M (pH 7,2) como agente anticoagulante. Las
muestras se centrifugaron a 720 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y se
recuperó el plasma desde el sobrenadante. La actividad plasmática de la ALT se
determinó utilizando el sistema comercial de detección ALAT/ALT/GPT-LS de la
compañía Valtek (Santiago, Chile). Los resultados de la actividad de la ALT se
expresaron en términos de unidades internacionales por litro (UI/L).
Se tomaron muestras del hígado de ratas tratadas con los vectores adenovirales y
vehículo salino inmediatamente después del sacrificio de los animales. Las muestras
consistieron en 2 trozos pequeños de tejido de aproximadamente 1,5 cm de largo, 0,5
cm de alto y 0,5 cm de ancho tomados desde lóbulos distintos. Las muestras se
almacenaron en una solución tamponada de formalina (formaldehído 3,7%, NaH2PO4 x
H2O 29 mM, Na2HPO4 46 mM, pH 6,8) en frascos de vidrio con tapa de 40 mL. Las
muestras se enviaron al Laboratorio de Cito-Histopatología BiopsCyt (Santiago, Chile)
donde se realizó la inclusión de las muestras en moldes de parafina, la obtención de
cortes (5 µm de espesor), la tinción de las muestras con eosina - hematoxilina y el
montaje en medio hidrófobo permanente. Para el análisis de la morfología de las
muestras de hígado se obtuvieron fotografías de los cortes con un aumento de 100X
47
utilizando una cámara digital FinePix S8000fd (Fujifilm, Tokio, Japón) acoplada a un
microscopio invertido Eclipse TS-100 (Nikon, Tokio, Japón).
6.7.9. Determinación de la actividad de la ALDH2 en hígado de rata.
Se determinó la actividad de la ALDH2 en los homogeneizados de hígado de las ratas
transducidas con los vectores adenovirales de acuerdo al método descrito por
Ocaranza y cols. (2008). Para ello se mezclaron 500 µg de proteína total con NAD+
800 µM en Na2HPO4 34 mM pH 8,5; DTT 4 mM, MgCl2 5 mM, pirazol 10 mM y NADH
10 µM en un volumen final de 800 µL. La mezcla se incubó a 37ºC durante 10 minutos
y la reacción se inició agregando propionaldehído a una concentración de 21 µM. Se
registró la absorbancia a 340 nm cada 30 segundos en un espectrofotómetro Shimadzu
UV1210. Se graficaron los cambios de absorbancia respecto al tiempo y se calculó la
pendiente de las rectas obtenidas para determinar la actividad de la ALDH2 que se
expresó en términos de nanomoles de NADH generados por minuto por milígramo de
proteína.
6.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO. Todos los experimentos se realizaron como mínimo tres veces y los resultados se
expresaron como el promedio de los resultados ± el error estándar de la media (SEM).
Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p<0,05. El cálculo de
la significancia de los resultados para cada experimento se realizó mediante análisis de
t de Student o por análisis de varianza ANOVA para muestras repetidas y análisis post
hoc (Student-Neuman-Keuls) cuando fue necesario. Se utilizó el programa Primer of
Biostatistics: The Program, Versión 1.0 (McGraw-Hill, 1988).
48
7. RESULTADOS.
7.1. SECUENCIACIÓN DEL cDNA NATIVO DE LA ADH DE RATA.
La secuenciación del cDNA nativo de la ADH de rata (rAdh-47Arg) presente en el
plasmidio pAAV-rADH-47Arg mostró que este clon obtenido de hígado de rata y
amplificado usando la polimerasa Pfu tenía la secuencia descrita en la base de datos
GenBank (acceso NM_019286.3). Ver Anexo.
7.2. OBTENCIÓN DEL cDNA DE LA ADH MUTADA DE RATA (rAdh-47His). Para obtener el cDNA de una ADH de rata que codifique una enzima con el cambio
Arg47His, se construyó un cDNA de ADH de rata en el cual el triplete original (CGC)
que codifica para arginina en la posición 47 fue mutado generando un triplete
codificante de histidina (CAC). Para ello se incorporó el cambio nucleotídico G204A en
el cDNA de la ADH silvestre de rata (rAdh-47Arg) mediante mutagénesis sitio dirigida
(Ho y cols., 1989). La Figura 7.1 muestra los resultados que llevaron a generar tal
cambio. Se usó como molde el plasmidio pAAV-rADH-47Arg y se realizaron dos
reacciones de PCR mutagénicas independientes que permitieron obtener y amplificar
el fragmento 5’ (269 pb) y el fragmento 3’ (1177 pb) del cDNA de la ADH de rata con la
mutación G204A. Luego se combinaron ambos amplicones y utilizando partidores
externos se generó por PCR un amplicón de 1.427 pb que contenía el cDNA completo
de la ADH mutada de rata rADH-47His (Figura 7.1). En el amplicón que contenía el
cDNA mutado rAdh-47His se identificaron sitios de restricción para las enzimas EcoR I
e Hind III que permitieron clonarlo en el plasmidio pAAV-MCS, quedando ubicado río
abajo del promotor del CMV. La secuenciación (Ver Anexo) del clon seleccionado
mostró que la mutación G204A fue correctamente incorporada (Figura 7.2). Este clon
que contiene el cDNA rAdh-47His se denominó pAAV-rADH-47His.
49
Figura 7.1. Obtención por PCR del cDNA mutado de ADH de rata rAdh-47His. Los fragmentos 5’ de 269 pb (A) y 3’ de 1177 pb (B) se utilizaron como molde para obtener por PCR el
cDNA completo de la enzima de rata mutada rADH-47His (C).
Figura 7.2. Clonación y secuenciación del cDNA rAdh-47His. El cDNA rAdh-47His fue clonado dirigidamente entre los sitios EcoR I e Hind III de pAAV-MCS,
obteniéndose el nuevo plasmidio denominado pAAV-rADH-47His. La estructura del plasmidio
pAAV-rADH-47His (A) fue confirmada por análisis de restricción con EcoR I y KspA I (B) y secuenciación
automática (C). En el electroforetograma se destaca la correcta incorporación de la mutación G204A (en el
codón CAC que codifica His).
pAAV-rADH-47His
EcoR IHind III
EcoR IKspA I
Estándar1 kb
4615 pb
1268 pb
4918 pb
965 pb
Obtención por PCR del fragmento 5’ de rADH-47His
MgCl2 (mM)
1,2 1,6 2,0 2,4
Estandar100 pb269 pb
MgCl2 (mM)
1,2 1,6 2,0 2,4
Estandar100 pb
Obtención por PCR del fragmento 3’ de rADH-47His
1.177 pb
Estandar1000 pb
Obtención por PCR del cDNA comopleto rADH-47His
1.427 pb
10000 pb
3000 pb
1000 pb
A B C
A
C
B
pAAV-rADH-47His5883 pb
EcoR I(1)
Hind III(1268)
KspA I (965)GTG
CAC
HisCysVal Ser AspHisCysVal Ser Asp
190 200 215
50
7.3. EXPRESIÓN DE LOS cDNAs rAdh-47His Y rAdh-47Arg EN CÉLULAS HEK-293. Se estudió la funcionalidad de estos dos cDNAs de ADH de rata en células humanas
HEK-293. Para ello, se transfectaron células HEK-293 con los plasmidios pAAV-rADH-
47His o pAAV-rADH-47Arg. Como control de transfección se usaron los plasmidios
pAAV-GFP y el plasmidio no codificante pAAV-MCS. En este experimento se usaron
células HEK-293 por sus características de facilidad de transfección y por no presentar
actividad de la ADH. Después de 48 horas de la lipofección, las células transfectadas
fueron analizadas mediante microscopía de fluorescencia, RT-PCR, análisis de
Western y medición de la actividad de la ADH.
El análisis de microscopía de fluorescencia de las células HEK-293 transfectadas con
el plasmidio pAAV-GFP (datos no mostrados), indicó que aproximadamente un 50% de
las células presentaron fluorescencia verde. Basados en la similitud estructural de los
plasmidios que codifican ADH y GFP, se estimó que en general la eficiencia de
transfección fue de 50%. Los resultados de la RT-PCR para el mRNA de ADH
indicaron que sólo las células transfectadas con pAAV-rADH-47Arg (carril 1, Fig. 7.3) y
pAAV-rADH-47His (carril 6, Fig. 7.3) generaron el amplicón de 837 pb correspondiente
a parte del mRNA de ADH. Los controles transfectados con los plasmidios pAAV-GFP
(carril 3, Fig. 7.3) y pAAV-MCS (carril 8, Fig. 7.3) no generaron este amplicón.
Figura 7.3. Expresión de los cDNA rAdh-47His y rAdh-47Arg en células HEK-293. La expresión de los cDNA rAdh-47His y rAdh-47Arg se determinó mediante RT-PCR del mRNA de ADH,
obteniéndose un amplicón de 837 pb que corresponde a parte del mRNA de ADH. Carriles: 1. pAAV-rADH-
47Arg; 2. pAAV-rADH-47Arg/sin RT; 3. pAAV-GFP; 4. pAAV-GFP/sin RT; 5. Estándar 100 pb; 6. pAAV-
rADH-47His; 7. pAAV-rADH-47His/sin RT; 8. pAAV-MCS; 9. pAAV-MCS/sin RT; 10. Blanco de PCR.
Detección mRNA ADH1 752 863 4 9
837 pb
10
51
El análisis de Western de las células HEK-293 transfectadas con los plasmidios
pAAV-rADH-47His, pAAV-rADH-47Arg, pAAV-GFP y pAAV-MCS mostró que sólo en
las células transfectadas con los plasmidios pAAV-rADH-47His y pAAV-rADH-47Arg se
detectó la presencia de ADH (Figura 7.4). Los niveles de ADH detectados en ambos
homogenizados fueron similares, lo que indica que ambos plasmidios expresan con
una fuerza similar el cDNA de la ADH, lo que se traduce en la generación de niveles
comparables de proteína. El análisis del control de carga del análisis de Western, en
este caso la detección de la tubulina(s), mostró que la cantidad de proteína cargada en
cada caso fue similar.
Figura 7.4. Niveles de ADH en células HEK-293 transfectadas con los plasmidios pAAV-rADH-47His, pAAV-rADH-47Arg y pAAV-MCS. Cuarenta y ocho horas después de la transfección las células se lisaron y se determinaron los niveles de
ADH en el sobrenadante mediante análisis de Western. Como control de la cantidad de proteína cargada
en el gel de poliacrilamida se determinaron los niveles de tubulina.
El análisis de actividad de la ADH en los sobrenadantes de las células HEK-293
transfectadas con pAAV-rADH-47His y pAAV-rADH-47Arg confirmó la existencia de
actividad ADH (Figura 7.5). La actividad fue en todos los casos totalmente inhibida por
pirazol 10 mM, un inhibidor de la ADH (datos no mostrados), que confirmó que la
actividad observada es consecuencia de la actividad de la ADH y no de otra enzima
capaz de reducir NAD+. Los resultados mostraron que la actividad generada por la
enzima mutada rADH-47His fue 3,6 veces mayor a la generada por la enzima nativa
rADH-47Arg (13,6 ± 0,49 vs 3,76 ± 0,41 nmol NADH/min/mg proteína; P<0.001).
pAAVrADH-47Arg
pAAVrADH-47His
pAAVMCS
Anti-ADH
Anti-tubulina
Anticuerpo
Plasmidio
52
Figura 7.5. Actividad de la ADH en células HEK-293 transfectadas con los plasmidios pAAV-rADH-47His, pAAV-rADH-47Arg y pAAV-MCS. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se lisaron y la actividad de la ADH (pH 7,0 y
NAD+ 5 mM) se determinó en el sobrenadante. En los cultivos transfectados con el plasmidio control
pAAV-MCS no se detectó actividad de la ADH. Los resultados representan el promedio ± SEM de tres
experimentos realizados por duplicado.
7.4. PROPIEDADES CINÉTICAS DE LAS ENZIMAS rADH-47His Y rADH-47Arg. Las enzimas humanas ADH1B*1 y ADH1B*2 presentan diferencias en sus afinidades
por NAD+ y NADH que determinan sus diferencias cinéticas (Hurley y cols., 1990). Para
estudiar si la sustitución del Arg47His, modifica las propiedades cinéticas de la ADH de
rata, se determinaron los valores de Km para NAD+ y Ki para NADH de las enzimas
ADH de rata mutada rADH-47His y nativa rADH-47Arg en sobrenadante de células
HEK-293 transfectadas con los plasmidios pAAV-rADH-47His y pAAV-rADH-47Arg. La
actividad de la ADH (velocidad inicial) se determinó en el sobrenadante de células
HEK-293 a distintas concentraciones de NAD+. Las curvas de velocidad de la ADH
versus concentración de NAD+ se ajustaron a un modelo cinético de Michaelis-Menten
(Figura 7.6). La Km para NAD+ de la enzima mutada rADH-47His fue de 0,93 mM ±
0,05, mientras que para la enzima nativa rADH-47Arg fue de 0,1 mM ± 0, 01 (p<0,001).
02
468
1012
1416
pAAVrADH-47Arg
pAAVrADH-47His
pAAVMCS
nmol
NA
DH
/min
/mg
prot
eína
P < 0,001
P < 0,001
P < 0,001
53
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
-11 -6 -1 4 91/
act
ivid
adA
DH
1/ NAD+ (mM-1)
rADH-47His(R= 0,99)
rADH-47Arg(R= 0,99)
Figura 7.6. Determinación de la Km para NAD+ de las enzimas rADH-47His y rADH-47Arg. Gráfico de Lineweaver-Burk (doble recíproco) de los valores de actividad de la ADH versus concentración
de NAD+ de las enzimas rADH-47His y rADH-47Arg. La figura muestra los resultados de un experimento;
el valor de la Km (intercepto en el eje X = -1/Km) para NAD+ se obtuvo del promedio de tres experimentos
independientes.
La actividad de la ADH (velocidad inicial) se determinó en el sobrenadante de células
HEK-293 transfectadas con los plasmidios pAAV-rADH-47His y pAAV-rADH-47Arg a
una concentración fija NAD+ (0,3 mM) y concentraciones variables de NADH como
inhibidor. En las curvas de velocidad inicial versus concentración de NADH (Figura
7.7), se observó que para ambas enzimas (rADH-47His y rADH-47Arg) al incrementar
la concentración de NADH se produjo una disminución de la velocidad inicial, siendo
este efecto inhibitorio más acentuado para la enzima nativa rADH-47Arg que para la
enzima mutada rADH-47His. La Ki aparente para NADH de la enzima mutada rADH-
47His fue de 90 µM ± 4,8 y para la enzima nativa rADH-47Arg fue de 49 µM ± 1,9
(p<0.001).
54
Figura 7.7. Determinación de la Ki para NADH de las enzimas rADH-47His y rADH-47Arg. Gráfico de Dixon del recíproco de los valores de actividad versus concentración de NADH (inhibidor) de las
enzimas rADH-47His y rADH-47Arg. La figura muestra los resultados de un experimento; el valor de la Ki
(intercepto en el eje X = -Ki) para NADH se obtuvo del promedio de tres experimentos independientes. La
concentración de NAD+ se mantuvo a 0,3 mM.
7.5. PRODUCCIÓN DE LOS VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA GENERACIÓN. Como se indicara en Métodos 6.5, en la construcción de los vectores adenovirales se
utilizó el sistema AdEasy (He y cols., 1998). Este método se basó en la obtención de
un plasmidio que contuviese ambos, el gen de interés y el genoma adenoviral (∆E1,
∆E3), por recombinación homóloga en bacterias. En esencia el plasmidio transportador
del gen de interés (ver Fig. 7.2) se fusionó con el plasmidio comercial pAdEasy-1 (ver
Fig. 6.2) para obtener un plasmidio recombinante adenoviral que contiene los genes
necesarios para generar los vectores adenovirales.
7.5.1. Generación de los plasmidios transportadores de los cDNAs rAdh-47His y rAdh-47Arg. La primera etapa en la generación de los vectores adenovirales consistió en la
obtención de los plasmidios transportadores de los genes de interés (ver Métodos
6.5.1). Para ello, los casetes de expresión presentes en los plasmidios
pAAV-rADH-47Arg, pAAV-rADH-47His y pAAV-MCS (intrón) fueron clonados en el
plasmidio pShuttle, obteniéndose los plasmidios pShuttle-rADH-47Arg,
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
-110 -60 -10 40 90NADH (µM)
1/ a
ctiv
idad
AD
H rADH-47His(R= 0,98)
rADH-47Arg(R= 0,99)
55
pShuttle-rADH-47His y pShuttle-control (intrón) respectivamente. La estructura
deseada de estos dos primeros versus el control fue confirmada mediante análisis con
enzimas de restricción (Figura 7.8).
Figura 7.8. Análisis de restricción de los plasmidios transportadores. La estructura deseada de los plasmidios transportadores (A): pShuttle-rADH-47His y (B),
pShuttle-rADH-47Arg fue diferenciada de (C) pShuttle-control mediante análisis de restricción con las
enzimas Hind III, BstX I y Not I. (Las bandas marcadas con un asterisco corresponden a digestiones
incompletas del plasmidio con la enzima BstX I).
7.5.2. Generación de los plasmidios adenovirales recombinantes. En la siguiente etapa se utilizaron bacterias E. coli BJ5183 de elevada capacidad
recombinante, para recombinar por homología los plasmidios transportadores con el
plasmidio adenoviral pAdEasy-1 (ver Métodos 6.5.2). De esta forma se obtuvieron los
Hind III BstX I Not I
576 1212
9045 6625
2996
1770
6639
pShuttle-rADH-47His (9621 pb)
Hind III BstX I Not I
576 1212
9045 6625
2996
1770
6639
pShuttle-rADH-47Arg (9621 pb)
Hind III BstX I Not I
576 537
7812 6625
1763
1212
6639
pShuttle-control (8388 pb)
Hind III
Hind III
Hind III
BstX I
BstX I
BstX I
Not I
Not I
Not I
Est.1 kb
Est. 1 kb
Est.1 kb
Est.1 kb
Est1 kb
Est.1 kb
Est.1 kb
Est. 1 kb
Est.1 kb
*
*
*
A
B
C
9045
576
6639
1770 1212
6625 2996
9045
576
6639
1770 1212
6625 2996
7812
576
6639
1212
6625 *
537
1763
56
plasmidios adenovirales recombinantes pAdV-rADH-47Arg, pAdV-rADH-47His,
pAdV-control y pAdV-GFP. Para verificar que la recombinación homóloga entre los
plasmidios transportador y pAdEasy fue efectiva y en el lugar correcto, los plasmidios
recombinantes se analizaron con la enzima de restricción Pac I. Si la recombinación
fue correcta, la digestión de los plasmidios recombinantes con Pac I, debía mostrar una
banda de 3 o 4,5 kb siendo ambos tipos de plasmidios recombinantes adecuados para
la obtención de los vectores adenovirales (Luo y cols., 2007). Tales resultados
dependen de una recombinación en la región comprendida entre los brazos de
recombinación homologa I y D (fragmento de 3 kb) o en la región comprendida entre el
origen de replicación y el brazo de homología D (fragmento de 4,5 kb). Los resultados
mostraron (Figura 7.9), que la digestión con Pac I de los plasmidios pAdV-control (carril
2, Fig. 7.9), pAdV-GFP (carril 5, Fig. 7.9) y pAdV-rADH-47Arg (carril 9, Fig. 7.9)
liberaron un fragmento de 4,5 kb. El plasmidio pAdV-rADH-47His (carril 7, Fig. 7.9)
liberó un fragmento de 3 kb. La integridad del resto de la estructura de los plasmidios
recombinantes y la presencia del gen terapéutico fue confirmada por análisis de
restricción con las enzimas EcoR I y BamH I (datos no mostrados).
Figura 7.9. Confirmación de la obtención de los plasmidios adenovirales recombinantes mediante digestión con Pac I. La obtención de los plasmidios adenovirales recombinantes pAdV-control, pAdV-GFP, pAdV-rADH-47His y
pAdV-rADH-47Arg fue confirmada mediante la digestión de los plasmidios candidatos con la enzima Pac I.
La liberación de un fragmento de 3 o 4,5 kb (destacados con un asterisco) indicó que la obtención de cada
plasmidio recombinante fue exitosa.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1. Estándar λ/Hind III 2. pAdV-control/Pac I 3. pAdV-control 4. Estándar 1kb 5. pAdV-GFP/Pac I 6. pAdV-GFP 7. pAdV-rADH-47His/Pac I 8. pAdV-rADH-47His 9. pAdV-rADH-47Arg/Pac I 10. pAdV-rADH-47Arg
* * * *
23 kb
4,3 kb 2 kb
30 kb
4,5 kb
3 kb
57
7.5.3. Obtención de los vectores adenovirales. Los plasmidios adenovirales recombinantes fueron linearizados con la enzima Pac I, y
utilizados para transfectar células empaquetadoras de adenovirus HEK-293 que
proveen en trans los genes E1 y E3 (ver Métodos 6.5.3). Después de 10 a 15 días de
cultivo de las células transducidas se observaron cambios en su morfología normal,
pasando desde el aspecto estrellado normal de estas células a un aspecto
redondeado, seguido de una pérdida de adherencia y despegue desde la placa. Este
fenómeno propio de la infección viral, se conoce como “efecto citopático” y es indicativo
de la producción exitosa de vectores adenovirales. Los vectores adenovirales
obtenidos en el sobrenadante después de la lisis celular se amplificaron en células
HEK-293 mediante el aumento secuencial del tamaño y número de las placas de
cultivo de células HEK-293 y los ciclos de infección con las partículas adenovirales,
hasta llegar a infectar 40-50 matraces de 75 cm2. La purificación de los vectores
adenovirales se realizó mediante dos gradientes consecutivas de cloruro de cesio
(Figuras 7.10 A y B).
Figura 7.10. Purificación de los vectores adenovirales mediante ultracentrifugación en gradientes de CsCl. (A) Resultado de la purificación inicial de los vectores adenovirales en una gradiente discontinua de CsCl.
Los vectores adenovirales maduros se concentran en la banda inferior más gruesa.
(B) Resultado de la segunda purificación de los vectores adenovirales en una gradiente continua de CsCl.
Los vectores adenovirales maduros se concentran en la banda central. Bandas superiores menores (no
claramente visibles en la fotografía) corresponden a vectores inmaduros que no fueron separados
completamente en la primera gradiente.
A B
58
El título de los vectores adenovirales amplificados en 45 matraces de cultivo de 75 cm2
determinado por absorbancia del DNA viral a 260 nm fue de 1 x 1013 partículas virales
totales en un volumen ajustado a 1 mL. La determinación de la cantidad de partículas
virales infectivas de la preparación adenoviral se realizó mediante el método TCID50,
encontrándose que de las 1 x 1013 partículas virales totales, 5 x 1010 partículas eran
infectivas expresadas en términos de unidades formadoras de placa (PFU).
7.6. TRANSDUCCIÓN DE LAS CÉLULAS DE HEPATOMA DE RATA CON VECTORES ADENOVIRALES. Previo al estudio del efecto de los vectores adenovirales en la actividad ADH de células
de hepatoma de rata, se determinó el tiempo óptimo de transducción, es decir, el
tiempo necesario para obtener el mayor nivel de expresión del gen de interés. Para ello
se trataron células H4-II-E-C3 con una dosis de 1 PFU/célula del vector AdV-GFP y la
expresión de la proteína GFP se determinó por citometría de flujo a las 24, 48, 72 y 96
horas. Los resultados (datos no mostrados), indicaron que el máximo nivel de
fluorescencia se logró a las 48 horas postransducción. La transducción de cultivos de
células H4-II-E-C3 con distintas dosis (1, 5, 10 y 25 PFU/célula) de los vectores
AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg mostró que la actividad ADH de las células
aumentó a todas las dosis estudiadas. En la figura 7.11 se muestra que a una MOI de
5 PFU/célula del vector AdV-rADH-47His, la actividad de la ADH en las células
aumentó 14 veces respecto de los cultivos transducidos con el vector no codificante
AdV-control (215,6 ± 6,7 versus 15,7 ± 1,2 nmol NADH/min/mg de proteína, P<0.001).
A esta misma MOI el vector que codifica la ADH nativa de rata AdV-rADH-47Arg
aumentó sólo 2,5 veces la actividad ADH respecto al control (40 ± 0,9 versus 15,7 ± 1,2
nmol NADH/min/mg de proteína, P<0.001). A MOI mayores de 5 PFU/célula la
actividad de la ADH no aumentó proporcionalmente a la dosis de vector adenoviral.
Los niveles de ADH determinados por Western blot mostraron que las células
transducidas (MOI=5; 48 horas) con los vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg
presentaron en ambos casos niveles 2,5 veces (125%) más elevados de ADH que las
células transducidas con el vector AdV-control (Figura 7.12), indicando que la
diferencia en el aumento de la actividad ADH generada por los vectores
59
AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg se debió principalmente a las diferencias cinéticas
entre ambas enzimas.
Figura 7.11. Actividad de la ADH en células H4-II-E-C3 transducidas con los vectores AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg o AdV-control. Células H4-II-E-C3 se transdujeron con 5 PFU/célula (1 x 103 pv/célula) de los vectores adenovirales.
Cuarenta y ocho horas después de la transducción, las células se lisaron y se midió la actividad de la ADH
en el sobrenadante. Los resultados de la actividad ADH son el promedio ± SEM de cinco experimentos
independientes.
Figura 7.12. Niveles de la ADH en células H4-II-E-C3 transducidas con los vectores AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg o AdV-control. Células H4-II-E-C3 se transdujeron con 5 PFU/célula (1 x 103 pv/célula) de los vectores adenovirales
AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg y AdV-control. Cuarenta y ocho horas después de la transducción, las
células se lisaron y se determinó los niveles de la ADH en el sobrenadante mediante análisis de Western.
Como control de la cantidad de proteínas cargadas se midieron los niveles de tubulinas.
0
50
100
150
200
250
1 2 3
Act
ivid
ad A
DH
(nm
olN
AD
H/m
in/m
gpr
otei
na)
AdV-rADH-47His AdV-rADH-47Arg AdV-control
P < 0,001
P < 0,001
P < 0,001
VectorAdenoviral
AdVrADH-47Arg
AdVrADH-47His
AdVcontrol
Anti ADH
Anti tubulina
60
7.7. ACUMULACIÓN DE ACETALDEHÍDO EN CULTIVO DE CÉLULAS H4-II-E-C3 TRANSDUCIDAS CON LOS VECTORES ADENOVIRALES. Se estudió el efecto de la transducción de los genes de la ADH mutada rADH-47His y
nativa rADH-47Arg en la producción de acetaldehído por células H4-II-E-C3 en cultivo.
Para ello se transdujeron durante 48 horas células de hepatoma de rata con los
vectores adenovirales AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg y AdV-control a una MOI de
5 PFU/célula. Luego se incubaron los cultivos en medio DMEM suplementado con
etanol 10 mM por 1 hora y los niveles de acetaldehído en el medio de cultivo se
determinaron por HPLC. Los resultados en la Figura 7.13 muestran que la transducción
de cultivos de células de hepatoma de rata con el vector AdV-rADH-47His aumentó la
producción de acetaldehído 9 veces respecto del cultivo control transducido con AdV-
control (97,4 µM ± 3,6 versus 11,1 ± 0,6 µM; P<0,01). Las células tratadas con el vector
adenoviral que codifica la enzima nativa AdV-rADH-47Arg aumentaron su producción
de acetaldehído en 7 veces (79,9 µM ± 4,6 versus 11,1 ± 0,6 µM; P<0,01). (Ver
Discusión)
Figura 7.13. Niveles de acetaldehído acumulado en el medio de cultivo de células de H4-II-E-C3 transducidas con los vectores adenovirales. Cultivos de células H4-II-E-C3 se trandujeron con 5 PFU/célula de los vectores adenovirales
AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg y AdV-control. A las 48 horas postransducción los cultivos se
incubaron con DMEM suplementado con etanol 10 mM durante 1 hora y la concentración de acetaldehído
en el medio de cultivo se determinó mediante HPLC. Las barras corresponden al promedio ± SEM de tres
experimentos independientes realizados por duplicado.
0
20
40
60
80
100
120P < 0,001
P < 0,001
P = 0,04
Con
cent
raci
ónA
ceta
ldeh
ído
(µM
)
AdV-rADH-47His AdV-rADH-47Arg AdV-control
61
7.8. ESTUDIOS IN VIVO. ACTIVIDAD DE LA ADH EN DIVERSOS ÓRGANOS DE RATAS TRATADAS CON LOS VECTORES ADENOVIRALES. Los vectores adenovirales AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg y AdV-control se
administraron a ratas UChB hembras por la vena de la cola en una dosis de 5 x 1012
pv/kg (5 ratas por cada grupo). Tres semanas después de la administración de los
adenovirus, los animales fueron sacrificados y se determinó el grado de transducción
en distintos tejidos en los animales. Para ello se midió la actividad de la ADH en los
siguientes órganos: bazo, cerebro, corazón, hígado, pulmón y riñón. Los resultados
obtenidos indicaron que los animales transducidos con los vectores AdV-rADH-47His y
AdV-rADH-47Arg mostraron un marcado aumento en la actividad de la ADH en el
hígado pero no en otros órganos (Figura 7.14). En los animales tratados con el vector
AdV-rADH-47His la actividad de la ADH en el hígado aumentó 88% respecto a los
animales tratados con AdV-control (113 ± 15,4 versus 60,1 ± 4,0 µmol NADH/min/kg;
P<0,01). En los animales tratados con el vector AdV-rADH-47Arg el aumento de la
actividad de la ADH en el hígado fue de 32% respecto a los controles (79,6 ± 4,4
versus 60,1 ± 4,0 µmol NADH/min/kg; P < 0,01) (ver Discusión). En el resto de los
tejidos analizados, no se detectó actividad de la ADH a excepción del bazo de los
animales tratados con el vector AdV-rADH-47His en los que se registró una pequeña
actividad de ADH (1,4 ± 0,57 µmol NADH/min/kg).
Los niveles de ADH en el hígado de las ratas tratadas con los vectores adenovirales se
determinaron mediante Western blot. Los resultados en el inserto de la Figura 7.14
muestran que los niveles de ADH en el hígado de los animales tratados con los
vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg fueron similares entre sí y
aproximadamente 30% más elevados que los niveles encontrados en el hígado de los
animales controles tratados con el vector AdV-control.
62
Figura 7.14. Actividad de la ADH en tejidos de ratas UChB tratadas con los vectores AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg o AdV-control. Tres semanas después de la administración de los vectores, los animales fueron sacrificados y se
determinó la actividad de la ADH en cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón y bazo. Las barras
representan la actividad promedio de la ADH ± SEM de 5 animales por grupo, expresada como µmol
NADH/min/kg peso. **P<0,01 respecto a AdV-control. El inserto muestra los niveles de la ADH
determinados por análisis de Western en el hígado de ratas tratadas con los vectores AdV-rADH-47His,
AdV-rADH-47Arg y AdV-control.
7.9. DETECCIÓN DEL mRNA DE rADH-47His Y rADH-47Arg EN EL HÍGADO DE RATAS TRANSDUCIDAS CON LOS VECTORES ADENOVIRALES. La detección del mRNA de rADH-47Arg y rADH-47His en el hígado de ratas
transducidas con los vectores AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg y AdV-control se
realizó mediante reacciones de transcripción inversa (RT) seguidas de una reacción de
polimerización en cadena (PCR) en RNA total. Para ello se realizaron reacciones de
PCR utilizando una pareja de partidores que permitió amplificar selectivamente los
mRNA de las ADH codificadas en los vectores adenovirales, sin amplificar el mRNA de
la ADH endógena presente en los hígados. Adicionalmente, como la mutación G204A
incorporada en el cDNA rADH-47His elimina un sitio único de corte para la enzima
0
20
40
60
80
100
120
140
1 2 3 4 5 6Cerebro PulmónHígadoCorazón
AdV-rADH-47His
AdV-rADH-47Arg
AdV-control
Act
ivid
ad d
e la
AD
H(µ
mol
NA
DH
/min
/kg)
**
BazoRiñón
AdVrADH-47His
AdVrADH-47Arg
AdVcontrol
Niveles hepáticos de ADH
**
63
BsrB I, se identificó el tipo mRNA (rADH-47His o rADH-47Arg) presente en los
productos de RT-PCR mediante digestión con esta enzima (ver Métodos 6.7.6). La
Figura 7.15 muestra que sólo en los hígados de las ratas tratadas con los vectores
AdV-rADH-47His (ratas 34 y 36) y AdV-rADH-47Arg (ratas 25 y 31) se obtuvo el
producto de 1324 pb correspondiente al mRNA de las ADH codificadas en los vectores
adenovirales, que no fue detectado en el hígado de ratas tratadas con el vector
AdV-control (rata 60). La identidad del mRNA presentes en los productos de RT-PCR
se confirmó mediante digestión con BsrB I. Los resultados muestran que los productos
de PCR obtenidos del hígado de ratas transducidas con el vector AdV-rADH-47His (34,
36) no fueron sensibles a la digestión con BsrB I mientras que los productos de PCR
obtenidos de ratas transducidas con el vector AdV-rADH-47Arg (25 y 31) fueron
digeridos con BsrB I resultando en dos fragmentos de 1209 y 105 pb.
Figura 7.15. Expresión de los cDNAs rAdh-47His y rAdh-47Arg en hígado de rata. A partir de mRNA total de hígado de ratas tratadas con los vectores AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg y
AdV-control, se amplificó selectivamente el mRNA de las ADH codificadas en los adenovirus. La
identificación de los productos de RT-PCR obtenidos para cada animal se realizó mediante digestión con
BsrB I y análisis por electroforesis en gel de agarosa.
1500 pb
1000 pb
500 pb
Rata nº 34 36 25 31 60
Bsr BI +- +- +- +- +-
AdV-rADH-47His AdV-rADH-47Arg AdV-control
1324 pb1209 pb
105 pb
Estándar100 pb
64
0
0,5
1
1,5
2
2,5
AdV-rADH-47His AdV-rADH-47Arg AdV-control
P < 0,05
P < 0,05
P = 0,9
K mN
AD+
(mM
)
7.10. Km APARENTE PARA NAD+ EN EL HÍGADO DE RATAS TRANSDUCIDAS CON LOS VECTORES ADENOVIRALES. Para determinar si la administración a ratas UChB de los vectores adenovirales AdV-
rADH-47His, AdV-rADH-47Arg y AdV-control provocó los cambios esperados en la Km
aparente para NAD+ en el hígado, se determinó la actividad hepática de la ADH de
estos animales a distintas concentraciones de NAD+ y se determinó el valor de la Km
aparente para NAD+. Los resultados muestran en la Figura 7.16 que los hígados de las
ratas tratadas con el vector AdV-rADH-47His presentaron un aumento de 2,6 veces en
la Km aparente para NAD+ en el hígado respecto de los animales controles tratados con
el vector AdV-control (1,8 ± 0,5 versus 0,7 ± 0,05 mM; P < 0,05). Como se esperaba,
los animales tratados con el vector AdV-rADH-47Arg no presentaron diferencias en el
valor de la Km aparente para NAD+ en el hígado respecto de los controles tratados con
el vector AdV-control (0,7 ± 0,1 versus 0,7 ± 0,05 mM; P=0,9).
Figura 7.16. Efecto de la administración de los vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg en la Km aparente para NAD+ en hígado de rata. Ratas de la línea UChB recibieron una dosis de 5 x 1012 pv/kg de los vectores adenovirales AdV-rADH-
47His (n=5), AdV-rADH-47Arg (n=5) y AdV-control (n=5). Tres semanas después de la administración de
los adenovirus se determinó la Km aparente para NAD+ en el hígado. Los valores de la Km aparente para
NAD+ están expresados en términos de concentración de NAD+. Las barras representan el promedio de la
Km aparente para NAD+ de cada grupo ± SEM.
65
0
2
4
6
8
10
AdV-rADH-47His AdV-rADH-47Arg AdV-control
Act
ivid
adAL
DH
2(n
mol
NAD
H/m
in/m
g pr
oteí
na)
P= 0,1
P= 1,0
P= 0,2
7.11. ACTIVIDAD DE LA ALDH2 EN EL HÍGADO DE RATAS TRATADAS CON LOS VECTORES ADENOVIRALES. Para confirmar que la administración de los vectores adenovirales no provocó cambios
en la actividad de la ALDH2 en el hígado, se determinó la actividad de la ALDH2 en
homogenizado de hígado de ratas transducidas con los vectores adenovirales AdV-
rADH-47His, AdV-rADH-47Arg y AdV-control. Los resultados en la Figura 7.17
muestran que las ratas tratadas con el vector AdV-rADH-47His no presentaron cambios
significativos de la actividad de la ALDH2 en el hígado comparado con los animales
controles que recibieron el vector AdV-control (6,4 ± 0,2 versus 7,3 ± 0,4 nmol
NADH/min/mg proteína; P=0,1). Los animales tratados con el vector AdV-rADH-47Arg
tampoco presentaron diferencias significativas en la actividad de la ALDH2 en el
hígado respecto de los controles tratados con el vector AdV-control (6,4 ± 0,4 versus
7,3 ± 0,4 nmol NADH/min/mg proteína; P=0,2).
Figura 7.17. Efecto de la administración de los vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg en la actividad de la ALDH2 en hígado de rata. Ratas UChB recibieron una dosis de 5 x 1012 pv/kg de los vectores adenovirales AdV-rADH-47His (n=5),
AdV-rADH-47Arg (n=5) y AdV-control (n=5). A las tres semanas de la administración de los adenovirus se
determinó la actividad de la ALDH2 en homogenizado de hígado mediante espectrofotometría. Las barras
representan el promedio de la actividad de la ALDH2 en el hígado de cada grupo ± SEM.
66
7.12. CONSUMO VOLUNTARIO DE ALCOHOL POR LAS RATAS TRANSDUCIDAS CON LOS VECTORES ADENOVIRALES. El efecto de la sobreexpresión de las enzimas rADH-47His y rADH-47Arg en el hígado
de ratas UChB sobre el consumo voluntario de alcohol de estos animales, se determinó
mediante un método de acceso limitado a alcohol que promueve la intoxicación. Este
se inició el día 4 desde la administración de los adenovirus y consistió en ofrecer a los
animales en pipetas graduadas una solución de etanol al 10% (vol/vol) o agua durante
una hora diaria por un período de 13 días. Los resultados obtenidos con este método
de acceso limitado a alcohol (Figura 7.18), mostraron que durante los 13 días de
acceso a alcohol los animales tratados con los vectores adenovirales AdV-rADH-47His
presentaron una reducción de 48% en el consumo espontáneo intoxicante de alcohol
versus los animales controles que recibieron el vector AdV-control (0,30 ± 0,02 vs 0,55
± 0,03 g alcohol/kg/hora; ANOVA P<0,001). En el caso de las ratas tratadas con el
vector AdV-rADH-47Arg la reducción del consumo de alcohol fue de 27% (0,41 ± 0,03
vs 0,55 ± 0,03 g alcohol/kg/hora; ANOVA P< 0,01), sin embargo en este grupo de
animales el efecto inhibitorio sobre el consumo de alcohol desapareció rápidamente.
Figura 7.18. Consumo voluntario de alcohol de ratas UChB tratadas con los vectores adenovirales. Ratas de la línea UChB (n= 5 por grupo) fueron transducidas con 5 x 1012 pv/kg de los vectores
adenovirales AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg o AdV-control. Cuatro días (día 1 en los gráficos)
después a los animales se les ofreció a elegir entre una solución de alcohol al 10% o agua durante 1 hora
diariamente, se registró el consumo de alcohol y se expresó como gramos de alcohol consumidos por hora
por kilo de peso. Cada punto representa el promedio ± SEM del consumo diario de alcohol de cada grupo.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 4 8 120
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 4 8 12
Con
sum
o de
alc
ohol
(g/k
g/h)
Con
sum
o de
alc
ohol
(g/k
g/h)
AdV-control
AdV-rAdh-47His
AdV-control
AdV-rAdh-47Arg
Tiempo (días) Tiempo (días)
ANOVA p<0,001 ANOVA p<0,01
67
Los resultados del registro del consumo diario de agua muestran en la Figura 7.19 que
no se registraron diferencias significativas en el consumo diario de agua en ninguno de
los grupos estudiados. Los valores del consumo promedio de agua para cada grupo en
los 13 días de registro fueron: AdV-rADH-47His: 86,8 ± 4,1 mL agua/kg/día;
AdV-rADH-47Arg: 77,3 ± 2,8 mL agua/kg/día; AdV-control: 82,9 ± 3,1 ml agua/kg/día).
Figura 7.19. Consumo diario de agua de ratas UChB tratadas con los vectores adenovirales. Ratas de la línea UChB (n= 5 por grupo) fueron transducidas con 5 x 1012 pv/kg de los vectores
adenovirales AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg o AdV-control. En la gráfica se muestra consumo diario
de agua a partir del cuarto día desde la administración de los vectores adenovirales. El consumo de agua
se expresó como mililitros de agua por día por kilo de peso. Cada punto representa el promedio ± SEM del
consumo diario de agua de cada grupo.
7.13. NIVELES SANGUÍNEOS DE ACETALDEHÍDO GENERADOS POR LA ADMINISTRACIÓN DE ETANOL EN LAS RATAS TRANSDUCIDAS CON LOS VECTORES ADENOVIRALES. Se estudió el efecto de la sobreexpresión en el hígado de rata de las enzimas rADH-
47His y rADH-47Arg en los niveles de acetaldehído generados después de una dosis
controlada de etanol. Tres semanas después de la administración de los vectores
adenovirales, los animales se inyectaron con etanol (1 g/kg i.p.), se obtuvieron
muestras de sangre de la arteria carótida a los 1; 2,5; 5; 10; 15 y 30 minutos y los
niveles de acetaldehído se determinaron por cromatografía gaseosa.
0
25
50
75
100
125
150
0 4 8 120
25
50
75
100
125
150
0 4 8 12
AdV-controlAdV-rADH-47His
AdV-controlAdV-rADH-47Arg
Con
sum
ode
agu
a(m
L/kg
/día
)
Con
sum
ode
agu
a(m
L/kg
/día
)
Tiempo (días) Tiempo (días)
ANOVA P=0,2 ANOVA P=0,1
68
Los resultados en la Figura 7.20 indicaron que al recibir una dosis de alcohol, los
animales tratados con los vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg mostraron un
aumento en los niveles de acetaldehído arterial, siendo mayor en los animales que
recibieron el vector AdV-rADH-47His. En ambos casos, este pico de acetaldehído
arterial fue transitorio y alcanzó un máximo a los 2,5 minutos de administrar el alcohol.
Los niveles de acetaldehído arterial alcanzados en las ratas transducidas con el vector
AdV-rADH-47His fueron 5,2 veces más altos que en los controles (87,7 ± 9,3 µM vs
17,5 ± 2,5 µM; P< 0,001), mientras que en las ratas tratadas con el vector AdV-rADH-
47Arg los niveles de acetaldehído fueron 3,3 veces más altos que en los controles
(58.8 ± 5,0 µM vs 17.5 ± 2,5 µM; P<0,001).
Figura 7.20. Concentraciones arteriales de acetaldehído después de administrar alcohol a ratas tratadas con los vectores adenovirales. Los animales fueron tratados con una dosis i.p. de 1 g/kg de etanol. Cada punto representa el promedio ±
SEM de la concentración sanguínea de acetaldehído de 5 animales por grupo. *** P < 0,001; ** P < 0,01;
* P < 0,05 respecto de AdV-control. ### P < 0,001 respecto de AdV-rADH-47Arg. El análisis ANOVA para
muestras repetidas reveló la existencia de diferencias significativas entre los tratamientos [F(2,14)=11.6,
P<0.01]. El análisis post hoc mostró diferencias significativas (P<0.05) entre los grupos tratados con
AdV-rADH-47His y AdV-control y también entre los grupos tratados con AdV-rADH-47Arg y AdV-control.
Entre los grupos AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg no se encontraron diferencias significativas.
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30
AdV-rADH-47His
AdV-control
AdV-rADH-47Arg
Ace
tald
ehíd
o ar
teria
l (µM
)
Tiempo (min)
***
***
**
**
69
El análisis de estos resultados mostró que la relación entre los valores máximos de
acetaldehído (5,2/3,3=1,6) fue consistente con la relación entre el porcentaje de
disminución del consumo voluntario de alcohol (48/27=1,8) observado en estos
animales. Es decir, el valor máximo del acetaldehído en sangre arterial a los 2,5
minutos es una buena reflexión de los cambios en el consumo de alcohol por los
animales transducidos con los vectores Adv-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg. Sin
embargo, este análisis no considera los animales controles que fueron inyectados con
el vector AdV-control (vector vacío).
Por consiguiente, se comparó para los tres grupos de animales (AdV-rADH-47His,
AdV-rADH-47Arg y AdV-control) tanto el valor máximo de acetaldehído a los 2,5
minutos (Figura 7.21) como el área bajo la curva (ABC) de los niveles arteriales de
acetaldehído a los 15 minutos (Figura 7.22) en relación al consumo voluntario de
alcohol que presentaron los animales.
Figura 7.21. Correlación entre la concentración arterial de acetaldehído a los 2,5 minutos y el consumo voluntario de alcohol en ratas transducidas con los vectores adenovirales.
0
20
40
60
80
100
120
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
Acet
alde
hído
arte
rial (µM
)
Consumo de etanol(g/kg/hora)
AdV-rADH-47His
AdV-rADH-47Arg
AdV-control
R2= 0,9989P= 0,02
70
Figura 7.22. Correlación entre el ABC de los niveles arteriales de acetaldehído a los 15 minutos y el consumo voluntario de alcohol en ratas transducidas con los vectores adenovirales.
Los resultados muestran que tanto el nivel máximo de acetaldehído arterial a los 2,5
minutos como el ABC de los niveles arteriales de acetaldehído a los 15 minutos
después de una dosis i.p. de etanol (1g/kg) se correlacionan negativa y linealmente con
el consumo voluntario de alcohol de los animales; encontrándose, sin embargo una
mejor significancia estadística (P<0,05) al correlacionar el nivel arterial de acetaldehído
a los 2,5 minutos con el consumo de alcohol. 7.14. VELOCIDAD DE ELIMINACIÓN DE ETANOL EN LAS RATAS TRANSDUCIDAS
CON LOS VECTORES ADENOVIRALES. Se determinó el efecto de la administración a ratas UChB de los vectores codificantes
de las enzimas ADH de rata mutada rADH-47His y nativa rADH-47Arg en la velocidad
de eliminación de etanol. Para ello a las tres semanas de la administración de los
vectores adenovirales, los animales fueron tratados con una dosis de etanol (1 g/kg
i.p.), mediante el corte de la punta de la cola se obtuvieron muestras de sangre a las 1;
1,5; 2 y 2,5 horas después de la inyección del alcohol y los niveles de etanol en las
0
200
400
600
800
1000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
ABC
(µM
x m
in)
Consumo de etanol(g/kg/hora)
R2= 0,9827P= 0,08
AdV-rADH-47His
AdV-rADH-47Arg
AdV-control
71
muestras se determinaron mediante cromatografía gaseosa. La velocidad de
metabolización de etanol se obtuvo de las gráficas de concentración sanguínea de
etanol versus tiempo (ver Métodos 6.7.3). Los resultados muestran en la Figura 7.23
que las ratas tratadas con el vector adenoviral codificante de la ADH mutada de rata
AdV-rADH-47His presentaron un aumento menor pero no significativo en la velocidad
de eliminación de etanol comparados con los animales controles que recibieron el
vector AdV-control (345 ± 12 versus 305 ± 15 mg de etanol/kg/hora; P=0,07). Los
animales tratados con el vector codificante de la ADH nativa de rata AdV-rADH-47Arg
tampoco presentaron diferencias significativas en la velocidad de eliminación de etanol
respecto de los controles tratados con el vector AdV-control (323 ± 8 versus 305 ± 15
mg de etanol/kg/hora; P=0,3).
Figura 7.23. Velocidad de eliminación de etanol en ratas transducidas con los vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg. Ratas UChB recibieron una dosis de 5 x 1012 pv/kg de los vectores adenovirales AdV-rADH-47His (n=6),
AdV-rADH-47Arg (n=4) y AdV-control (n=4). A las tres semanas de la administración de los vectores
adenovirales se determinó la velocidad de eliminación de etanol en cada animal después de la
administración de etanol (1 g/kg i.p.). Las barras representan el promedio de la velocidad de eliminación de
etanol de cada grupo ± SEM.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
1
Velo
cida
dde
elim
inac
ión
deet
anol
(mg
etan
ol/k
g/h)
AdV-rADH-47His AdV-rADH-47Arg AdV-control
P= 0,07
P= 0,3P= 0,2
N= 6 N= 4 N= 4
72
7.15. CORRELACIÓN ENTRE LA ACTIVIDAD HEPÁTICA DE LA ADH, EL NIVEL ARTERIAL DE ACETALDEHÍDO Y EL CONSUMO DE ALCOHOL EN LAS RATAS TRANSDUCIDAS CON LOS VECTORES ADENOVIRALES. De los datos obtenidos en las ratas UChB tratadas con los vectores AdV-rADH-47His,
AdV-rADH-47Arg y AdV-control, se determinó el tipo de correlación existente entre: i) la
actividad hepática de la ADH, ii) el máximo nivel arterial de acetaldehído generado por
una dosis de etanol y iii) el promedio del consumo voluntario de alcohol durante los 13
días de acceso limitado. Los resultados de la Figura 7.24 indican que existe una
correlación negativa entre la actividad hepática de la ADH y el consumo voluntario de
alcohol (R= -0,72; P= 0,004). Los mayores niveles de actividad hepática de la ADH y
los menores consumos de alcohol se encontraron en ratas tratadas con el vector
AdV-rADH-47His, mientras que los menores niveles de actividad hepática de la ADH y
los mayores consumos de alcohol se encontraron en ratas tratadas con el vector
AdV-control.
Figura 7.24. Correlación entre la actividad hepática de la ADH y el consumo voluntario de alcohol en ratas UChB. (r=0,72, p<0,004).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 50 100 150 200
R= - 0,72P= 0.004
Actividad hepática de la ADH(µmol/min/kg)
Con
sum
ode
alc
ohol
(g e
tano
l/kg/
h)
AdV-rADH-47HisAdV-rADH-47ArgAdV-control
73
Los resultados en la Figura 7.25 muestran una correlación positiva entre la actividad
hepática de la ADH y los niveles arteriales de acetaldehído (R= 0,61; P= 0,016). Los
mayores niveles de actividad hepática de la ADH y los mayores niveles de
acetaldehído se encontraron en ratas tratadas con el vector AdV-rADH-47His, mientras
que los menores niveles de actividad hepática de la ADH y los menores niveles de
acetaldehído se encontraron en ratas tratadas con el vector AdV-control.
Figura 7.25. Correlación entre la actividad hepática de la ADH y los niveles arteriales de acetaldehído en ratas UChB. (r=0,61, p<0,016).
Los resultados de la Figura 7.26 muestran que existe una tendencia a una correlación
negativa entre los niveles arteriales de acetaldehído y el consumo voluntario de alcohol
(R= -0.5; P= 0,06). Los mayores niveles de acetaldehído y los menores consumos de
alcohol se registraron en ratas tratadas con el vector AdV-rADH-47His, mientras que
los menores niveles de acetaldehído y los mayores consumos de alcohol se
encontraron en ratas tratadas con el vector AdV-control.
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200
R= 0,61P= 0.016
Actividad hepática de la ADH(µmol/min/kg)
Acet
alde
hído
arte
rial (
µM
) AdV-rADH-47HisAdV-rADH-47ArgAdV-control
74
Figura 7.26. Correlación entre los niveles de acetaldehído arterial y el consumo voluntario de alcohol en ratas UChB. (r=0,5, p<0,06).
7.16. TOXICIDAD HEPÁTICA DE LA ADMINISTRACIÓN DE LOS VECTORES ADENOVIRALES. Considerando el marcado tropismo por el hígado que presentaron los vectores
adenovirales, los estudios de toxicidad se centraron en la evaluación de los posibles
efectos tóxicos de los vectores adenovirales a nivel hepático. Para ello, en los animales
tratados con los vectores adenovirales y con vehículo salino, se midió la actividad
plasmática de la enzima alanina aminotransferasa (ALT) y se analizó la histología de
muestras de hígado obtenidas de estos animales.
La alanina aminotransferasa (ALT) es una enzima citoplasmática cuya actividad
aumentada en el plasma es altamente indicativa de daño hepático de origen viral o
tóxico. Se determinó la actividad de la ALT en plasma de los animales tratados con los
vectores adenovirales y con vehículo salino como control. Los resultados muestran en
la Figura 7.27, que después de administrar los vectores adenovirales, ninguno de los
grupos presentó niveles de actividad de ALT en plasma (AdV-rADH-47His: 54,7 ±
6,8 UI/L; AdV-rADH-47Arg: 55,3 ± 5,3 UI/L; AdV-control: 39,3 ± 7,9 UI/L) mayores a los
detectados en los animales que recibieron vehículo salino (63,3 ± 12,1 UI/mL).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 50 100 150
R= - 0,5P= 0.06
Acetaldehído arterial (µM)
Con
sum
ode
alc
ohol
(g e
tano
l/kg/
h)
AdV-rADH-47HisAdV-rADH-47ArgAdV-control
75
Figura 7.27. Actividad plasmática de la alanina aminotransferasa (ALT) en ratas UChB tratadas con los vectores adenovirales o con vehículo salino. Ratas de la línea UChB recibieron una dosis de 5 x 1012 pv/kg de los vectores AdV-rADH-47His (n=5),
AdV-rADH-47Arg (n=3), AdV-control (n=4) o de un volumen equivalente de vehículo salino (n=5). Tres
semanas después se determinó la actividad de la ALT en plasma que se expresó como unidades
internacionales por litro (UI/L). Los barras corresponden al promedio de la actividad plasmática de la ALT
en cada grupo ± SEM.
Tres semanas después de la administración de los vectores adenovirales, los animales
se sacrificaron y se tomaron muestras hepáticas para su análisis histológico. El análisis
de las muestras hepáticas de los animales tratados con los vectores adenovirales no
mostró alteraciones respecto de la histología observada en las muestras de hígado
obtenidas de los animales tratados con el vehículo salino (Figura 7.28). En ningún
grupo de animales, ya sea tratado con los vectores adenovirales o con vehículo salino,
se detectaron signos patológicos como necrosis celular o inflamación.
0
20
40
60
80
UI/L
Activ
idad
ALT
(UI /
L)
AdVADH-47His
AdVADH-47Arg
AdVADH-47His
Vehículosalino
76
Figura 7.28. Histología del hígado de ratas UChB tres semanas después del tratamiento con los vectores adenovirales o vehículo salino. Las fotografías corresponden a muestras hepáticas de ratas UChB tratadas con una dosis de 5 x1012 pv/kg
de los vectores AdV-rADH-47His, AdV-rADH-47Arg, AdV-control y vehículo salino. Se obtuvieron cortes de
5 µM de espesor de las muestras fijadas e incluidas en parafina, que luego se tiñeron con eosina-
hematoxilina (aumento de 100 X).
AdV-rADH-47His AdV-rADH-47Arg
AdV-control Vehículo salino
77
8. DISCUSIÓN Numerosos estudios han mostrado que poblaciones del sudeste Asiático y del medio
Oriente presentan una elevada frecuencia del alelo ADH1B*2 que codifica para una
enzima ADH de elevada actividad, encontrándose además que los individuos
portadores de este alelo están protegidos en 50% a desarrollar alcoholismo (Goedde y
cols., 1992; Neumark y cols., 1998; Chen y cols., 1999; Borràs y cols., 2000; Chambers
y cols., 2002; Wall y cols., 2005; Zintzaras y cols., 2006; Li y cols., 2007). Estudios
recientes en Taiwán y Corea indican que esta protección puede llegar al 85% (Kim y
cols., 2008; Chen y cols., 2009). A pesar del conocimiento de este efecto protector
contra el alcoholismo que presentan los portadores del alelo ADH1B*2 supera los 30
años (Stamatoyannopoulos y cols., 1975), el mecanismo por el cual se genera esta
protección aún no ha sido dilucidado (Chen y cols., 2009).
El objetivo de este trabajo fue investigar, mediante el aumento de la actividad hepática
de la ADH en animales por transferencia génica, el posible mecanismo por el cual los
portadores del alelo ADH1B*2 están protegidos del alcoholismo. Para ello se utilizaron
ratas bebedoras de la línea UChB, que fueron transducidas con un vector adenoviral
codificante de una ADH de rata (rADH-47His) especialmente desarrollada en este
trabajo como un análogo de la enzima humana ADH1B*2. Las ratas transducidas con
el gen de la enzima rADH-47His presentaron un aumento de 90% en la actividad
hepática de la ADH y una reducción de 50% del consumo voluntario de alcohol. Al
administrar una dosis estándar de etanol, los animales portadores del gen de la enzima
rADH-47His, presentaron a los pocos minutos un aumento transitorio de los niveles
arteriales de acetaldehído que alcanzó concentraciones 5 veces más elevadas que los
animales controles. Considerando los efectos aversivos del acetaldehído, es posible
que la reducción del consumo voluntario que presentaron estos animales este asociado
a un aumento transitorio de los niveles de acetaldehído al consumir etanol. La
reducción de 50% en el consumo de voluntario de alcohol que presentaron los
animales transducidos con la ADH mutada de rata rADH-47His es similar a la
protección contra el alcoholismo que presentan los individuos portadores del alelo
ADH1B*2 (Zintzaras y cols., 2006).
78
Basados en los resultados obtenidos en este modelo animal, el mecanismo por el cual
los portadores del alelo ADH1B*2 están protegidos contra el alcoholismo, podría
deberse a una reacción aversiva al consumo de alcohol causada por el aumento
transitorio de los niveles sanguíneos de acetaldehído.
A continuación se discutirán los principales resultados de este trabajo, se profundizará
el análisis de los modelos celulares y animales utilizados, y se analizarán las
proyecciones posibles de los resultados obtenidos en esta tesis.
8.1. GENERACIÓN DE UNA ADH DE RATA ANÁLOGA A LA ENZIMA HUMANA ADH1B*2: TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS CARENTES DE ADH. Para estudiar el mecanismo de protección contra el alcoholismo conferido por la
enzima rápida humana ADH1B*2, la idea inicial en esta tesis fue aumentar solamente
la actividad hepática de la ADH en los animales mediante la administración de un
vector adenoviral que portara el gen de la ADH silvestre de rata (ADH1). Sin embargo,
al comparar la secuencia aminoacídica de la enzima ADH1B*1 humana (de actividad
normal) con la de la ADH silvestre de rata, no solo se encontró que presentaban una
alta homología aminoacídica (81%), sino que además en el sitio activo donde se une el
cofactor NAD+, ambas enzimas presentan una arginina en la posición 47, a diferencia
de la enzima humana rápida ADH1B*2 que presenta una histidina en esta posición
(Niederhut y cols., 2001). Como la diferencia entre los alelos ADH1B*1 y ADH1B*2 es
sólo una mutación puntual, surgió la posibilidad de incorporar esta mutación en el
cDNA de la ADH silvestre de rata (ADH1) mediante mutagénesis sitio dirigida. La
posibilidad de obtener un análogo de rata de la enzima ADH1B*2 humana, permitiría
acercar un modelo animal a la condición genética de los portadores del alelo ADH1B*2,
y si le lograba obtener una enzima más activa que la enzima silvestre, probar de mejor
forma la hipótesis propuesta.
79
En la enzima humana ADH1B*1, el cambio Arg47His reduce notablemente la afinidad
de la enzima por el NAD+ (Hurley y cols., 1990). En los experimentos de transducción
de células HEK-293 (carentes de actividad ADH) con plasmidios portadores de los
cDNAs de la ADH mutada de rata rADH-47His y silvestre rADH-47Arg, se encontró que
en la ADH de rata el cambio Arg47His también reducía su afinidad por NAD+, lo que se
expresó en un aumento de la Km (de 100 µM a 910 µM). En la enzima humana
ADH1B*2 también se produce una reducción en la afinidad por el NADH, el cual se
genera en el mismo sitio activo en que se une el NAD+ (Hurley y cols., 1990). Como
para la ADH, la liberación del NADH desde su sitio activo constituye la etapa limitante
de la reacción enzimática (Cronholm, 1985; Stone y cols., 1993), la Vmax de la enzima
ADH1B*2 (purificada) es casi 100 veces mayor respecto de la Vmax de la ADH1B*1. En
el caso de la ADH de rata, la incorporación del cambio Arg47His redujo en un 50% la
afinidad de la enzima por el NADH y la Vmax inicial (en condiciones de saturación de
NAD+) de rADH-47His aumentó 8 veces respecto de la enzima nativa rADH-47Arg.
8.2. CÉLULAS DE HEPATOMA DE RATA COMO MODELO PARA ESTUDIAR LOS EFECTOS DEL AUMENTO DE LA ACTIVIDAD DE LA ADH. Los cDNAs de las enzimas ADH de rata rADH-47His y rADH-47Arg fueron
incorporados en vectores adenovirales de primera generación. Estos vectores
adenovirales, permitieron entregar con elevada eficacia los cDNAs de ADH de rata a
células de hepatoma de rata en cultivo (y luego en el hígado de rata en los
experimentos realizados in vivo).
Se utilizó la línea celular de hepatoma de rata H4-II-E-C3 como un modelo in vitro del
hígado de rata, con el objeto de determinar (i) si las enzimas de ADH de rata
codificadas en los vectores adenovirales eran funcionales en células hepáticas de rata
y (ii) para estudiar in vitro el efecto de aumentar la actividad de la ADH en células
H4-II-E-C3 sobre la generación de acetaldehído.
Las células H4-II-E-C3 demostró ser un buen modelo in vitro del hígado de la rata
porque expresan la mayoría de la enzimas presentes en el metabolismo hepático del
80
etanol en ratas. Las células H4-II-E-C3 expresan las deshidrogenasas alcohólicas
ADH1, ADH3 y ADH4 (Martínez, 2002) y a una concentración moderada de etanol de
10 mM, la actividad ADH que presentan estas células es generada principalmente por
la ADH1 (Km= 1,4 mM), ya que la ADH3 no metaboliza etanol y la ADH4 tiene una Km
para etanol de 340 mM (Parés y cols., 1994). En cuanto a las enzimas que metabolizan
el acetaldehído, esta línea celular presenta un patrón de expresión similar a la de los
hepatocitos normales, encontrándose que un 66% de la enzima total ALDH
corresponde a la enzima mitocondrial de baja Km ALDH2 y el 30% restante se
distribuye entre otras variantes de la ALDH localizadas en el citosol y la fracción
microsomal (Huang y Lindahl, 1990).
La transducción de las células H4-II-E-C3 con los vectores adenovirales que portaban
los cDNAs de la ADH silvestre (rADH-47Arg) y mutada (rADH-47His) resultó en un
aumento de 2,5 y 14 veces, respectivamente, en la actividad de la ADH respecto de los
cultivos controles, confirmando que en células hepáticas la enzima ADH mutada de
rata rADH-47His era aproximadamente 6 veces más activa que la ADH silvestre
rADH-47Arg. Al incubar estos cultivos con etanol 10 mM durante 1 hora y luego medir
la cantidad acumulada de acetaldehído en el medio, se encontró que los niveles de
acetaldehído alcanzados por los cultivos tratados con el vector AdV-rADH-47His fueron
9 veces mas elevados que los controles (97,4 vs. 11,1 µM), pero sólo 1,2 veces mas
elevados que en los cultivos transducidos con el vector AdV-rADH-47Arg (97,4 vs 79,9
µM), resultado que fue inesperado considerando que la actividad in vitro de la enzima
mutada rADH-47His fue 8 veces mayor la de la ADH silvestre rADH-47Arg.
Debe notarse que la acumulación in vitro de acetaldehído puede no ser comparable
con la velocidad de generación de este metabolito. Una posible explicación a esta
diferencia podría deberse a que a niveles elevados de acetaldehído (> 100 µM), otras
ALDH de mayor Km como por ejemplo la ALDH microsomal (Huang y Lindahl, 1990),
podrían metabolizar el acetaldehído limitando su acumulación e impidiendo a la vez
que la diferencia de actividad entre la ADH mutada y silvestre se viera reflejada en una
mayor diferencia en la acumulación del acetaldehído en el medio de cultivo. La
utilización de un inhibidor de la ALDH, permitiría demostrar si efectivamente la
actividad de otras ALDH de elevada Km para acetaldehído limita la acumulación de
81
acetaldehído en el medio de cultivo de células de hepatoma de rata. En este sentido,
Karahanian y cols., (2005) observó que al incubar células de hepatoma de rata
pretratadas con cianamida (inhibidor de la ALDH), en medio de cultivo con etanol
(10mM), éstas llegaron a alcanzar concentraciones de acetaldehído de 350 µM en el
medio de cultivo, es decir 3,5 veces más elevadas que las concentraciones alcanzadas
en esta tesis.
8.3. RATAS BEBEDORAS UChB COMO MODELO ANIMAL PARA ESTUDIAR EL MECANISMO DE PROTECCIÓN CONTRA EL ALCOHOLISMO DE LA ENZIMA HUMANA ADH1B*2.
Para estudiar el mecanismo por el cual los portadores de la enzima ADH1B*2 están
protegidos contra el alcoholismo, en este estudio se desarrolló un modelo en que ratas
fueron transducidas con el gen de la ADH mutada de rata rADH-47His -análoga a la
humana ADH1B*2- y se estudió su comportamiento al alcohol, incluyendo su consumo
voluntario y metabolismo.
La rata es un buen modelo del metabolismo del etanol en humanos, ya que en ambas
especies el etanol es metabolizado a acetaldehído principalmente por una sola isozima
ADH, específicamente la enzima ADH1B en humanos (Lee y cols., 2006) y la ADH1 en
ratas (Crabb y cols., 1983). De la misma forma, en ambas especies el acetaldehído es
oxidado a acetato mayoritariamente por la ALDH mitocondrial de alta afinidad ALDH2
(Huang y Lindahl, 1990).
Como el objetivo primordial de esta investigación era estudiar un mecanismo de
protección contra el alcoholismo de las enzimas rápidas de metabolización de etanol,
era necesario que el animal a ser usado presentara en su estado silvestre un consumo
elevado de alcohol. Para ello se utilizó la línea de ratas bebedoras de alcohol UChB,
que fue desarrollada en la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile mediante el
cruzamiento selectivo de ratas Wistar de acuerdo a su alto consumo de alcohol,
superando actualmente las 80 generaciones (Mardones y Segovia-Riquelme, 1983;
82
Quintanilla y cols., 2006). Si a estas ratas UChB se les permite el libre acceso a una
solución de etanol al 10% durante las 24 horas, al cabo de tres semanas presentan un
consumo de etanol entre 7 a 7,5 g de etanol/kg/día (Quintanilla y cols., 2006). Si el
acceso a la solución de etanol se restringe a sólo 1 hora al día, al cabo de dos
semanas de acceso las ratas UChB presentan un consumo de 1 a 1,2 g de
etanol/kg/hora (Quintanilla y cols., 2007), lo que equivale en un hombre a consumir en
una hora una botella de vino (12°; 750 mL).
En humanos la actividad de la ADH en el hígado no ha mostrado ser un factor
determinante en la velocidad de eliminación de etanol (Neumark y cols., 2004;
Duranceaux y cols., 2006). Por esta razón, en el desarrollo de este estudio era
importante que las ratas a utilizar presentaran una elevada actividad de la ADH en el
hígado, de esta forma se esperaba que (i) la actividad de la ADH no fuera la limitante
de la eliminación del etanol y (ii) que la velocidad de eliminación del etanol no
aumentara al transducir los animales con los genes codificantes de ADH. Dado que en
la línea de ratas UChB, las ratas hembra presentan el doble de la actividad y niveles de
ADH que en los ejemplares macho (Quintanilla y cols., 2007), en este estudio se
utilizaron ratas UChB hembras.
Tomando en consideración que la protección contra el alcoholismo que presentan los
individuos portadores de la ADH1B*2 tendría su génesis en las primeras experiencias
desagradables al consumir bebidas alcohólicas, en este trabajo se decidió utilizar ratas
“naive" de la cepa UChB, es decir animales que nunca habían consumido alcohol.
8.4. TRANSDUCCIÓN IN VIVO DE RATAS UChB CON LOS VECTORES ADENOVIRALES CODIFICANTES DE rADH-47His O rADH-47Arg. La administración por vía sistémica (vena de la cola) de ambos vectores adenovirales
codificantes de ADH, resultó en un aumento de la actividad de la ADH, casi
exclusivamente en el hígado. Los animales transducidos con el vector codificante de la
ADH mutada (rADH-47His) presentaron un aumento de la actividad hepática de la ADH
de 90%, mientras que en los animales transducidos con el vector codificante de la ADH
silvestre (rADH-47Arg) el aumento fue de 30%. No se detectó actividad de la ADH en
83
otros tejidos analizados como el cerebro, bazo, pulmones, riñones y corazón; los que
fueron elegidos de acuerdo a la elevada irrigación sanguínea in vivo que presentan
tales tejidos. La actividad de la ADH en cada órgano se expresó en términos de la
actividad ADH presente en cada órgano y fue normalizada en relación al peso corporal
de cada animal (kilogramo de peso). Al expresar de esta forma la actividad de la ADH,
se pudo apreciar de mejor forma el aporte relativo de cada órgano al nivel sanguíneo
de acetaldehído alcanzado en los animales después de administrar una dosis de
etanol. Esta forma de expresar la actividad de la ADH presenta ventajas sobre otras
unidades de medida de actividad normalizadas por gramo de tejido o por mg de
proteína, las que no reflejan la fracción del peso total que representa cada tejido. Por
ejemplo, se podría haber encontrado que el hígado y el bazo presentaban la misma
actividad ADH por gramo de tejido, sin embargo el peso del hígado es más de 13
veces el peso del bazo, por lo que el aporte que realizaría el hígado al nivel sanguíneo
de acetaldehído sería también 13 veces mayor que el aportado por el bazo.
El tropismo hepático que presentan los vectores adenovirales administrados por vía
sistémica ha sido ampliamente descrito (Fechner y cols., 1999; Herrmann y cols., 2004;
Kalyuzhniy y cols., 2008; Di Paolo y cols., 2009). Si bien los vectores adenovirales
tienen la capacidad de transducir in vitro cualquier tipo celular, al ser administrados in
vivo por vía intravenosa, su tamaño de aproximadamente 70 nm (Mittereder y cols.,
1996) es demasiado grande para atravesar los pequeños poros (<20 nm) en los
capilares de la mayoría de los tejidos. Sin embargo, en el hígado los capilares
(sinusoides) presentan poros (fenestraciones) de un diámetro mayor (entre 300 y 1000
nm), lo que permite a los vectores adenovirales un fácil acceso a los hepatocitos y su
posterior transducción. En la Figura 8.1 se puede observar una microfotografía
electrónica de barrido en donde se aprecian las fenestraciones presentes en los
sinusoides hepáticos.
84
Figura 8.1. Microfotografía electrónica de barrido de un sinusoide de hígado de rata. En esta microfotografía de un sinusoide hepático, se puede apreciar el gran número de fenestraciones
(poros) que presentan los capilares de este tejido. Las flechas destacan algunas fenestraciones de gran
tamaño. Aumento 30.000 X. (Fotografía obtenida por Robin Fraser, Universidad de Otago, Nueva
Zelandia. Uso autorizado por el autor. www.en.wikipedia.org)
Otros dos tejidos; el bazo y la médula ósea también presentan capilares con
fenestraciones de un tamaño similar a los encontrados en los capilares hepáticos
(Junqueira y Carneiro, 2005). Sin embargo, y a pesar de no existir una barrera física,
éstos tejidos son mínimamente transducidos por los vectores adenovirales (Fechner y
cols., 1999). Estudios recientes han mostrado que en el tropismo hepático de los
vectores adenovirales, también estaría involucrada la interacción de proteínas de
superficie del adenovirus (hexón) con proteínas presentes en la sangre (factores de la
coagulación), formando complejos que serían reconocidos con gran afinidad por
receptores presentes solamente en la superficie de los hepatocitos (Di Paolo y cols.,
2009).
85
8.4.1. Actividad de la ADH mutada rADH-47His en células de hepatoma y en el hígado de rata. (a) Hepatoma de Rata. La transducción de células de hepatoma de rata
(H4-II-E-C3) con los vectores codificantes de la ADH silvestre rADH-47Arg y mutada
rADH-47His resultó en un incremento de 2,5 veces en los niveles de proteína ADH
para ambas ADHs pero en un aumento de 2,5 y 14 veces respectivamente en la
actividad, mostrando que en hepatoma de rata la enzima mutada es aproximadamente
8 veces mas activa (13/1,5= 8,6) que la enzima silvestre.
(b) Hígado in vivo. La transducción in vivo de ratas UChB con los vectores
AdV-rADH-47Arg y AdV-rADH-47His, resultó en un incremento de sólo 1,3 veces en los
niveles hepáticos de proteína ADH para ambos vectores y en un aumento de 1,3 y 1,9
veces respectivamente en la actividad hepática de la ADH, indicando que en hígado de
rata la ADH mutada rADH-47His sería sólo 3 veces mas activa (0.9/0.3=3) que la ADH
silvestre.
(c) Multiplicidad de Infección. En experimentos que involucran la transducción de
células con vectores virales, la multiplicidad de infección (MOI) es una medida de la
cantidad de virus administrada por cada célula blanco presente, y se expresa en
términos de pv/célula. La MOI utilizada en la transducción in vitro de las células de
hepatoma de rata fue de 1 x 103 pv/célula. La MOI teórica en los hepatocitos de las
ratas transducidas con los vectores adenovirales (5 x 1012 pv/kg) puede estimarse en
consideración que el hígado representa el 3,0 % del peso del animal (Britton y cols.,
1984) y que existen 13 x107 hepatocitos/g hígado (Marcos y cols., 2007). El resultado
de la MOI teórica por hepatocito in vivo es de 0,94 x 103 pv/hepatocito, siendo este
valor casi idéntico a la MOI de 1 x 103 pv/célula que se utilizó en la transducción in vitro
de las células de hematoma de rata. Sin embargo, otros factores como la inactivación
de una parte importante de los vectores adenovirales por acción de las células de
Kupffer (Wolf y cols., 1997; Xu y cols., 2008) o la transducción de células endoteliales
de los vasos sanguíneos, pudieron disminuir de forma importante el valor de la MOI
efectiva alcanzada en los hepatocitos, determinando un menor nivel de transducción y
de generación de proteína ADH.
86
(d) Composición dimérica de la ADH. La menor actividad que presentó la ADH
mutada de rata rADH-47His en hígado de rata respecto de la actividad mostrada en
células de hepatoma, estaría determinada por la menor proporción de ADH mutada
versus ADH silvestre que se logró en el hígado. En células de hepatoma de rata, la
transducción con el vector AdV-rADH-47His resultó en un aumento de 2,5 veces en los
niveles de ADH, es decir que por cada una subunidad de ADH silvestre podíamos
encontrar 1,5 subunidades de ADH mutada. Esta mayor proporción de subunidades
mutadas pudo favorecer la formación de homodímeros de ADH mutada de elevada
actividad y de heterodímeros rADH-47His/rADH-47Arg de posible actividad intermedia,
determinando el aumento de 14 veces en la actividad de la ADH que presentaron estas
células. Sin embargo, en el hígado de las ratas tratadas con el vector AdV-rADH-47His,
los niveles de ADH sólo aumentaron en 1,3 veces, es decir que por cada subunidad
nativa podíamos encontrar sólo 0,3 subunidades mutadas. Esta mayor proporción de
enzima nativa en el hígado, pudo determinar que las pocas subunidades mutadas
presentes se distribuyeran formando principalmente heterodímeros con la enzima
nativa, lo que explicaría la menor actividad que presentó la ADH mutada rADH-47His
en el hígado de rata.
Una diferencia similar a la descrita en estos estudios para la enzima ADH mutada de
rata rADH-47His se observa también para la enzima humana ADH1B*2. Estudios
realizados con enzimas purificadas muestran que la Vmax de la enzima ADH1B*2 es
100 veces mayor que la Vmax de la enzima ADH1B*1 (Hurley y cols., 1990). Sin
embargo, la actividad hepática de la ADH en los portadores de la enzima ADH1B*2 es
sólo 4 veces mayor que la actividad que presentan los portadores de la ADH1B*1 (von
Wartburg y cols., 1965; Harada y cols., 1980).
8.5. EL AUMENTO TRANSITORIO DE LOS NIVELES SANGUÍNEOS DE ACETALDEHÍDO. Ratas transducidas con los vectores codificantes de la ADH mutada de rata
(AdV-rADH-47His) y la ADH silvestre de rata (AdV-rADH-47Arg) mostraron un aumento
transitorio en los niveles sanguíneos de acetaldehído con niveles máximos a los 2,5
87
minutos después de la administración del alcohol, los que fueron 5,2 y 3,3 veces
mayores que los niveles en animales controles. La relación entre los valores máximos
de acetaldehído es consistente con el aumento de la actividad hepática de la ADH
(medida in vitro a concentraciones saturantes de NAD+, ver Resultados 7.8). Un factor
adicional que puede afectar la actividad de la rADH-47His in vivo es su mayor Km para
NAD+ (900 µM) que la que presenta la rADH-47Arg (100 µM). Asumiendo que ambas
enzimas se encontraran formando solamente homodímeros y que la concentración
intracelular de NAD+ esta en el rango de 350-400 µM (Yamada y cols., 2006; Yang y
cols., 2007); al utilizar ecuación de Michaelis-Menten, se estimó que en condiciones in
vivo la velocidad de la rADH-47His podría ser sólo 1,9 veces mayor que la rADH-
47Arg. Esta diferencia de 1,9 veces en la velocidad in vivo entre ambas enzimas, se
correlacionaría mejor con la diferencia de 1,6 veces observada en los niveles máximos
de acetaldehído sanguíneo. Adicionalmente, las diferencias en la Ki para NADH entre
ambas enzimas (90 µM para rADH-47His y 49 µM para rADH-47Arg), también pudieron
afectar la actividad in vivo de estas enzimas, siendo la rADH-47His posiblemente
menos sensible a la inhibición por los altos niveles de NADH que se generan en la
metabolización del etanol por la ADH (Veech y cols, 1972).
Los niveles de acetaldehído alcanzados en los animales transducidos con el vector
AdV-rADH-47His (80-90 µM) se encuentran en el rango de los niveles de acetaldehído
que inhiben el consumo voluntario de alcohol de ratas tratadas con disulfiram (Tampier
y cols., 2008) y en individuos portadores de la enzima ALDH2*2 que presentan una
marcada protección contra el alcoholismo (Mizoi y cols., 1994; Peng y cols., 2007).
En relación a la cinética que presentaron los niveles de acetaldehído en los animales
transducidos con los vectores AdV-rADH47His y AdV-rADH-47Arg, se encontró que en
ambos grupos de animales los niveles aumentados de acetaldehído se extendieron por
cerca de 15 minutos.
El estado redox y su relación con la actividad de la ADH.
Debe notarse que los niveles sanguíneos de acetaldehído en los animales a los que se
lea aumentó la actividad hepática de la ADH, presentaron una subida inicial y luego
una bajada de los niveles de acetaldehído a pesar de que la cantidad de ADH es
88
constante en tales hígados. Puede por consiguiente proponerse que es la actividad de
la enzima la que cambia a diferentes tiempos. Se conoce que 2 factores cambian al
metabolizar etanol; (a) existe una disminución en los niveles de NAD+ y (b) un aumento
en los niveles de NADH. Ambos factores tienden a reducir la actividad de la ADH. Dado
que los niveles citoplasmáticos de NAD+ y NADH libre no son fácilmente medibles,
investigadores han determinado sus niveles relativos a través de la medición de la
relación lactato/piruvato, sustratos que están en equilibrio con los de NAD+ y NADH por
medio de la reacción de la enzima lactato deshidrogenasa, una enzima 100 veces mas
activa que la ADH (Potter y cols., 2003). La reacción se encuentra favorecida hacia la
utilización de piruvato y NADH y la formación de lactato y NAD+ (Schwert, 1969):
Cualquier cambio en la razón NADH/NAD+ intracelular se ve reflejada en un cambio en
la razón lactato/piruvato. Experimentos realizados en humanos y animales, han
mostrado que el metabolismo del etanol aumenta 2-4 veces la razón lactato/piruvato,
reflejando una disminución en el estado oxidativo intracelular por una disminución de
los niveles de NAD+ y un aumento de los niveles de NADH (Wahid y cols., 1981; Veech
y cols., 1972; Lecky y cols., 2002). Recientemente, Quintanilla y cols., (2007)
observaron que al administrar etanol a ratas previamente tratadas con una dosis de
piruvato, se generaban niveles elevados de acetaldehído solo durante los 5 primeros
minutos de administrar etanol, mostrando que una elevada razón NAD+/NADH inicial
(inducida por la administración de piruvato) permite una elevada actividad in vivo de la
ADH y por consiguiente una gran producción de acetaldehído en los primeros minutos.
Por lo tanto, la cinética de generación de acetaldehído en las ratas transducidas con
los vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg, caracterizada por una rápida
generación de acetaldehído durante los primeros minutos, estaría determinada no sólo
por el alto nivel de NAD+ y bajo NADH presentes al comienzo de la metabolización,
sino que también por los niveles de piruvato, derivados por múltiples tejidos y
disponibles al hígado, que permitirían mantener elevada la razón NAD+/NADH durante
un tiempo limitado, y permitiendo a la ADH expresar una velocidad cercana a la
máxima. Al cabo de unos minutos de metabolización, la disminución de la razón
Piruvato + NADH Lactato + NAD+LDH
89
NAD+/NADH reduciría la velocidad de la ADH y los niveles de acetaldehído
disminuirían hasta llegar a un estado estacionario que estaría determinado
principalmente por la velocidad de reoxidación mitocondrial NADH a NAD+ y la
remoción del acetaldehído por la enzima aldehído deshidrogenasa.
8.6. REDUCCIÓN DEL CONSUMO VOLUNTARIO DE ALCOHOL EN LAS RATAS TRANSDUCIDAS CON LOS cDNAs DE rADH-47HIS Y rADH-47ARG. Para estudiar el efecto de la expresión de los cDNAs de rADH-47His y rADH-47Arg
sobre el consumo voluntario de alcohol de ratas bebedoras (UChB), los animales se
sometieron a un acceso limitado a alcohol de una hora al día. La utilización de un
paradigma de acceso a alcohol limitado a sólo una hora en vez de un acceso libre a
alcohol, permitió obtener una mayor concentración sanguínea de etanol en los
animales, ya que las ratas UChB ante un acceso a alcohol limitado a una hora
consumen entre 0,8 a 1 g etanol/kg/hora, mientras que en un acceso sin restricción
presentan un consumo de alcohol de aproximadamente 7 g de etanol/kg/día, que
equivale a un consumo de sólo 0,3 g etanol/kg/hora (Quintanilla y cols., 2006;
Quintanilla y cols., 2007). Este aspecto era muy importante, ya que ante una
alcoholemia demasiado baja en los animales posiblemente no se hubiesen generado
niveles de acetaldehído lo suficientemente elevados (y consistentes con una
intoxicación alcohólica en humanos) para producir un efecto farmacológico. Si se
considera además que una rata necesita más de 3 horas para eliminar una dosis de
etanol de 1 g/kg, el paradigma de acceso a alcohol limitado a una hora permite detectar
principalmente los cambios en la farmacodinamia del etanol, más que los posibles
cambios en su farmacocinética.
Las ratas transducidas con los vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg
presentaron una reducción del consumo voluntario de alcohol de un 50% y 30%
respectivamente. En las ratas transducidas con el vector codificante de la enzima
mutada rADH-47His se observó que desde el primer día de acceso a alcohol, los
animales presentaron una reducción de 50% en el consumo voluntario de alcohol
respecto de los animales controles, manteniendo esta reducción durante los 13 días de
90
acceso limitado a alcohol. Esta reducción de 50% en el consumo de alcohol es similar
a la protección contra el alcoholismo que presentan los individuos portadores del alelo
ADH1B*2 (Zintzaras y cols., 2006). En las ratas transducidas con el vector codificante
de la ADH silvestre rADH-47Arg, sólo a partir del segundo día de acceso a alcohol se
registró una disminución de su consumo, la que se mantuvo (con gran variabilidad)
durante sólo 6 días. Es destacable el hecho de que la reducción en el consumo de
alcohol se hizo evidente en ambos grupos desde el primer o segundo día de acceso al
alcohol, lo que implicó una asociación negativa inmediata de los animales al consumo
de alcohol.
En los animales transducidos con el vector control (AdV-control) se observó un patrón
cíclico en el consumo voluntario de alcohol con máximos y mínimos de consumo que
se repiten aproximadamente cada cuatro días. Este patrón no se observó en los
animales transducidos con los vectores codificantes de ADH, especialmente con la
ADH mutada rADH-47His que presentaron un aumento de los niveles de acetaldehído
al administrar etanol.
Un factor que pudo determinar la variabilidad del consumo de alcohol en el grupo
control, fue que los animales utilizados en estos experimentos no tenían experiencia
previa en el consumo de alcohol y tampoco a una limitación de este consumo por un
metabolito aversivo. Por consiguiente, en estos animales genéticamente seleccionados
como bebedores, se sugiere que “explorarían” su capacidad de consumo de alcohol,
poniendo a prueba su límite de consumo en cada sesión para optimizar los efectos
reforzantes del etanol versus los efectos aversivos. De esta forma, en cada ciclo los
animales aumentarían su consumo de alcohol gradualmente hasta un cierto límite
determinado posiblemente por efectos negativos (aversivos) del alcohol; para luego
disminuír su consumo y comenzar un nuevo ciclo. Es concebible que en un período de
tiempo mayor al estudiado en este trabajo, un aprendizaje por los animales de los
niveles de ingesta reforzantes versus aversivos, llevaría a la estabilización del
consumo de alcohol.
91
El hecho de que los animales transducidos con la ADH mutada de rata no presentaran
este patrón cíclico en el consumo voluntario de alcohol, es posible sea causado por los
elevados niveles de acetaldehído y efectos aversivos que experimentarían estos
animales al consumir alcohol, los que romperían el patrón cíclico que se observa en los
animales controles, al imponer tempranamente un “límite” al consumo de alcohol.
Esta asociación entre niveles elevados de acetaldehído y rechazo al consumo de
alcohol ya había sido observada en otros estudios realizados en ratas (Garver y cols.,
2000; Quintanilla y cols., 2007; Ocaranza y cols., 2008). En los estudios realizados por
Garver y cols. (2000) se utilizaron ratas Lewis previamente pretratadas con disulfiram
(inhibidor de la ALDH2) y sin experiencia de consumo de alcohol. Las ratas se privaron
de agua durante 16 horas por lo que al re-hidratarse consumieron grandes volúmenes
de agua que contenía etanol al 6%, generando elevados niveles sanguíneos de
acetaldehído (40-60 µM). Los animales pretratados con disulfiram sólo consumieron la
solución de alcohol durante una hora, mientras que los controles siguieron
consumiéndolo ávidamente hasta por 5 horas. Por su parte, en el estudio realizado por
Ocaranza y cols. (2008) se utilizaron ratas UChB entrenadas en el consumo de alcohol
a las que se administró un vector adenoviral codificante de un gen antisentido
destinado a silenciar la enzima ALDH2 (que elimina el acetaldehído), observándose
que estos animales presentaron una reducción de 50% en su consumo voluntario de
alcohol respecto de los controles.
8.7. ACTIVIDAD HEPÁTICA DE LA ADH Y LA VELOCIDAD DE ELIMINACIÓN DE ETANOL EN RATAS. La determinación de la velocidad de eliminación de etanol en los animales transducidos
con los vectores adenovirales codificantes de ADHs no mostró ser significativamente
distinta a la que presentaron los animales controles. Si se considera que las ratas
transducidas con los vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg aumentaron su
actividad hepática de la ADH en 90% y 30% respectivamente, estos resultados
indicarían que en ratas, la velocidad de eliminación de etanol no está determinada
mayormente por la actividad de la ADH.
92
Estudios realizados en mamíferos han mostrado que la velocidad de metabolización de
etanol dependería más del metabolismo basal (utilización de oxígeno) de cada especie
que de los niveles hepáticos de la ADH (Wallgren y Barry, 1970). Como un
metabolismo basal elevado implica una mayor generación de energía, la capacidad
mitocondrial de reoxidar NADH a NAD+ en el proceso de fosforilación oxidativa del ADP
a ATP también se ve aumentada. Si se considera que la actividad de la ADH depende
de una elevada razón NAD+/NADH en el citoplasma, una mayor capacidad mitocondrial
de reoxidar el NADH determinaría a su vez una mayor actividad de esta enzima y por
lo tanto una mayor velocidad de eliminación de etanol. En este sentido, la
administración a ratas del desacoplador mitocondrial 2-4 dinitrofenol, que aumenta
considerablemente la oxidación de NADH a NAD+ en la mitocondria, provoca un
incremento importante en la velocidad de metabolización de etanol tanto in vivo e in
vitro (Israel y cols., 1970; Seiden y cols., 1974).
En el presente trabajo se observó que los animales transducidos con el cDNA de la
ADH mutada de rata rADH-47His, presentaron un aumento cercano al 10%, aunque no
significativo estadísticamente, en la velocidad de eliminación de etanol. Un incremento
de similar magnitud en la velocidad de eliminación de etanol también ha sido reportado
en individuos portadores de la enzima rápida ADH1B*2 (Neumark y cols., 2004).
8.8. CORRELACIÓN ENTRE LA ACTIVIDAD HEPÁTICA DE LA ADH, EL NIVEL ARTERIAL DE ACETALDEHÍDO Y EL CONSUMO DE ALCOHOL EN RATAS UChB.
(a).- Correlación entre la actividad hepática de la ADH y el consumo de alcohol.
Los resultados mostraron que existe una correlación estadísticamente significativa
(p<0,004) entre la actividad hepática de la ADH y el consumo de alcohol. El valor del
coeficiente de regresión lineal (R=0,72; R2= 0,5) obtenido para esta correlación, indicó
que la actividad hepática de la ADH sería responsable en un 50% de los cambios
observados en el consumo voluntario de alcohol. Sin embargo, se observa que en
algunas ratas, principalmente en aquellas transducidas con la ADH mutada, a igual
actividad (elevada) de la ADH en el hígado presentan consumos de alcohol muy
93
distintos. Esto podría deberse a diferencias genéticas entre las ratas UChB (línea no
consanguínea de animales), que podrían determinar una respuesta variable a los
efectos aversivos del acetaldehído a nivel periférico (Quintanilla et al, 2005) versus los
efectos reforzantes del acetaldehído a nivel del sistema nervioso, que han sido
reportados por otros investigadores para este metabolito del etanol (Amit y Smith,
1985; Rodd y cols., 2005).
(b).- Correlación entre la actividad hepática de la ADH y los niveles arteriales máximos
de acetaldehído.
Aunque la correlación entre estas variables es estadísticamente significativa (p<0,016)
se encuentra que algunos animales transducidos con la ADH mutada presentan
niveles elevados de acetaldehído a pesar de tener actividades hepáticas de la ADH
muy distintas (75 y 150 µmol NADH/min/kg, por ejemplo). Debe notarse que los niveles
de acetaldehído representan no tan solo la generación de este metabolito sino que el
balance entre la generación y su utilización periférica. Existen sin duda otros factores
de error implícitos en el método experimental; que podrían deberse a variaciones
propias del método de determinación de acetaldehído o, como se indicara
anteriormente, a la actividad de otras enzimas ALDH de elevada Km en una línea de
ratas no homogénea.
(c).- Correlación entre el consumo de alcohol y los niveles arteriales máximos de
acetaldehído.
El análisis individual de cada animal para estas variables no fue estadísticamente
significativo (p=0,06), principalmente por la variación respecto de la tendencia que
presentaron los animales transducidos con la ADH mutada. Como se mencionó
anteriormente la existencia de diferencias en la respuesta de los animales a los efectos
farmacológicos del acetaldehído, la actividad de otras enzimas ALDH de elevada Km
para acetaldehído y la variabilidad del método de determinación de acetaldehído
podrían dar cuenta de la baja correlación encontrada entre los niveles arteriales de
acetaldehído y el consumo de alcohol. La utilización de un mayor número de animales
en estos experimentos podría haber aumentado el poder estadístico y resultado en
mejores correlaciones entre las variables estudiadas.
94
Sin embargo, se encontró una correlación estadísticamente significativa cuando se
realizó este mismo análisis promediando los valores cada grupo (mas allá de examinar
la variación en el método o la variación biológica real). Ello se realizó resultando en
sólo tres puntos a graficar (ver Figura 7.19) y por consiguiente con un menor poder
estadístico.
8.9. POSIBLE MECANISMO DE PROTECCIÓN CONTRA EL ALCOHOLISMO DEL
ALELO ADH1B*2 EN HUMANOS.
Los resultados obtenidos en este trabajo realizado en animales podrían sugerir un
mecanismo por el cual los individuos portadores del alelo ADH1B*2 están protegidos
del alcoholismo. En un posible estudio clínico destinado a confirmar estos hallazgos se
deberían considerar dos aspectos claves: (i) la medición de los niveles sanguíneos de
acetaldehído debería comenzar a tiempos cortos (minutos) después de la
administración de etanol, ya que en este trabajo los máximos niveles de acetaldehído
se verificaron a los 2,5 minutos de la administración de etanol, y (ii) los niveles
sanguíneos de acetaldehído deben determinarse en sangre arterial y no en sangre
venosa. En este sentido, experimentos realizados en humanos y ratas han mostrado
que al administrar una dosis de alcohol, se detectan niveles de acetaldehído (30 - 100
µM) al tomar muestras directamente desde la vena hepática (enriquecida en
acetaldehído) o desde arterias (Nuutinen y cols., 1984; Quintanilla et al 2005; 2007)
mientras que en sangre venosa antecubital los niveles de acetaldehído son casi
indetectables en humanos (Nuutinen y cols., 1984) y en ratas no superan
concentraciones de 1 a 3 µM (Garver y cols., 2001). Esta gradiente en la concentración
de acetaldehído existente entre sangre arterial y venosa se explicaría por la abundante
actividad de la ALDH2 que existe en los vasos sanguíneos y tejidos (Tampier y cols.,
1993; Stewart y cols., 1996), que metabolizaría casi completamente el acetaldehído
que logra escapar del hígado, dejando niveles indetectables de este metabolito en la
sangre venosa luego de su paso por los capilares.
95
8.10. PROYECCIONES DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN ESTA TESIS. (a) Mecanismo de protección contra el cáncer del alelo ADH1B*2.
Estudios realizados en individuos alcohólicos, muestran que los portadores
heterocigotos del alelo ALDH2*2 tienen 5 a 20 veces más riesgo de desarrollar cáncer
esofágico y/o del tracto respiratorio superior comparados con los individuos
homocigotos para el alelo ALDH2*1 (Yokoyama y cols., 2001; Chen y cols., 2006). Los
individuos heterocigotos para el alelo ALDH2*2 presentan en todos los tejidos sólo un
15% de la actividad de la ALDH2 que los homocigotos ALDH2*1 (Enomoto y cols.,
1991), por lo que al ingerir alcohol presentan durante horas una acumulación de 5
veces en los niveles sanguíneos de acetaldehído (Chen y cols., 2009). La mayor
incidencia de cáncer digestivo y respiratorio alto que presentan alcohólicos portando el
alelo ALDH2*2, estaría relacionada con las elevadas concentraciones de acetaldehído,
que se alcanzan en todos los tejidos al ingerir bebidas alcohólicas (Homann y cols.,
1997). El mecanismo de carcinogénesis del acetaldehído sería a través de la formación
de aductos con el DNA y por interferencia con los procesos de síntesis y reparación del
DNA (Wang y cols., 2006; Seitz y Stickel, 2007). Sin embargo, llama la atención su
localización preferencial en el esófago y tracto respiratorio, versus el hígado en el que
no se generan neoplasias (Takeshita y cols., 2000) a pesar de que en éste órgano se
encuentran las mayores concentraciones de acetaldehído. Es posible que la
predisposición de los tejidos digestivo y respiratorio superiores a desarrollar cáncer se
deba a una deficiente protección antineoplásica en los tejidos afectados (mecanismos
de reparación del DNA) o a la generación de peróxido de hidrógeno producido en el
metabolismo de acetaldehído por aldehído oxidasas y xantino deshidrogenasas
(Moriwaki y cols., 1998; Deitrich y cols., 2007).
Paradójicamente, en un efecto totalmente contrario, bebedores excesivos y alcohólicos
portadores de la enzima rápida ADH1B*2 presentan una protección de 60 a 90% a
desarrollar cáncer digestivo y respiratorio alto respecto a alcohólicos portadores de la
enzima de actividad normal ADH1B*1 (Chen y cols., 2006; Yokoyama y cols., 2001).
Basados en los resultados obtenidos en nuestro estudio, podríamos sugerir que la
protección a desarrollar cáncer en los individuos ADH1B*2, podría estar relacionada
con la exposición transitoria (minutos) de estos tejidos a niveles elevados de
96
acetaldehído al consumir alcohol. En un fenómeno conocido como hormesis, algunas
toxinas o agentes estresantes, pueden ser beneficiosos en dosis bajas o exposiciones
cortas, mientras que a dosis altas o exposiciones prolongadas son dañinos (Calabrese
y Baldwin, 2003). Aunque no se conocen completamente los mecanismos de la
hormesis, condiciones de estrés como el ejercicio físico, la reducción calórica y la
isquemia controlada, o agentes normalmente tóxicos como la radiación, al ser
aplicados en exposiciones cortas o en bajas dosis son capaces de inducir los
mecanismos de detoxificación de radicales libres y de reparación del ADN en la célula
(Kojda y Hambrecht, 2005; Masoro, 2007; Yellon y Downey, 2003; Feinendegen, 2005).
En un estudio realizado en Drosophila se encontró que el acetaldehído también
presenta un efecto hormético, ya que las moscas expuestas previamente a dosis bajas
de acetaldehído presentan una mayor sobrevida frente a dosis letales de esta
sustancia (Parsons, 1989). En un estudio reciente se encontró que la exposición in vitro
de linfocitos humanos a concentraciones de acetaldehído similares a las observadas
durante el consumo de alcohol, es capaz de inducir mecanismos de reparación del
DNA en estas células (Marietta y cols., 2009). En este sentido, un estudio realizado en
ratones encontró que la administración diaria de dosis moderadas de etanol
aumentaba el tiempo de vida en los animales, pero en dosis altas tenía un efecto
contrario, reduciendo la longevidad de los animales (Schmidt y cols., 1987).
(b) Una posible terapia del alcoholismo.
La terapia actual del alcoholismo esta basada en el uso del disulfiram que es un
inhibidor inespecífico de la ALDH. Los individuos tratados con este fármaco, al
consumir alcohol, generan elevados niveles de acetaldehído en todos los tejidos,
incluyendo los del tracto respiratorio y digestivo superior (boca, laringe, esófago) que
han mostrado ser susceptibles a los efectos tóxicos del acetaldehído (Yokoyama y
cols., 2001; Chen y cols., 2006). Por el contrario, una terapia del alcoholismo basada
en el aumento de la actividad hepática de la ADH se caracterizaría por una elevación
de pocos minutos en los niveles sanguíneos de acetaldehído.
Para el desarrollo de una posible una terapia del alcoholismo basada en el aumento de
la actividad hepática de la ADH, sería necesario utilizar otro tipo de entrega génica
97
distinta a los vectores adenovirales de primera generación, los que han mostrado ser
una herramienta poderosa en la investigación, pero que no resultan ser adecuados en
la terapéutica debido a la respuesta inmune que desarrolla el hospedero contra las
proteínas virales codificadas en el vector adenoviral, limitando el tiempo de expresión
de los transgenes a no más de 2 meses (Quantin y cols., 1992; Yang y cols., 1994).
Para aumentar el tiempo de expresión del transgén, se han desarrollado vectores
adenovirales de tercera generación, en los cuales se han reemplazado los genes de
las proteínas virales por DNA de relleno, dejando solamente las secuencias necesarias
para la correcta formación de las partículas adenovirales (Kochanek y cols., 1996;
Dormond y cols., 2009). La menor inmunogenicidad que presentan estos vectores
adenovirales de tercera generación permite aumentar el tiempo de expresión del
transgén hasta 2 años (Morral y cols., 1999; Toietta y cols., 2005).
Adicionalmente, la utilización de un promotor específico para tejido hepático, podría
aportar a la seguridad de una posible terapia génica, al no permitir la expresión de la
ADH en tejidos distintos al hígado que (i) normalmente no expresan esta enzima (ii)
que podrían ser sensibles a los efectos tóxicos del acetaldehído, como el esófago y la
laringe o (iii) que presentan una alta concentración de linfocitos, como los ganglios
linfáticos y el bazo (Weeratna y cols., 2001; Mamani-Matsuda y cols., 2008), cuya
transducción podría gatillar una mayor respuesta inmune.
98
8.11. ESQUEMA PROPUESTO DE LOS PRINCIPALES HALLAZGOS DE ESTA TESIS.
(1).- Al consumir etanol, los animales portadores de la enzima mutada rADH-47His (análoga de
ADH1B*2) presentan un aumento transitorio en la generación de acetaldehído en el hígado.
(2).- Este aumento en la generación de acetaldehído supera la capacidad de la ALDH2 de
metabolizarlo, liberándose acetaldehído al torrente sanguíneo (sangre arterial).
(3).- Los efectos aversivos asociados al aumento de los niveles arteriales de acetaldehído
determinan una disminución del consumo voluntario de alcohol.
(4).- El carácter transitorio del aumento de los niveles arteriales de acetaldehído está
determinado por el efecto inhibitorio sobre la actividad de la rADH-47His que ejerce el aumento
de la concentración de NADH en el hígado (Cronholm, 1985; Stone y cols., 1993).
(5).- Durante los primeros minutos de la metabolización hepática del etanol, la actividad de la
rADH-47His se mantiene elevada principalmente por los niveles de piruvato presentes en el
hígado y en otros tejidos, que al reducirse a lactato por acción de la deshidrogenasa láctica
(LDH), mantienen bajos los niveles de NADH en el hígado (Quintanilla y cols., 2007).
Consumo de Etanol
Etanol Acetaldehído
rADH-47His(ADH1B*2)
NAD+ NADH
Lactato PiruvatoLDH
ALDH2
Acetato
Acetaldehído
Acetaldehído
Hígado
SangreArterialSangre
Venosa
1
Acetaldehído
Otros tejidos y capilares
ALDH2
Aversión
2
3
4
5
99
9. CONCLUSIONES.
i) La incorporación del cambio aminoacídico Arg47His en la ADH silvestre de rata
(rADH-47Arg), resultó en una enzima ADH mutada de rata (rADH-47His) con
propiedades cinéticas (Km para NAD+, Ki para NADH, Vmax) análogas a las que
este mismo cambio aminoacídico genera en la enzima humana ADH1B*2
(47His).
ii) La utilización in vivo de vectores adenovirales de primera generación, permitió
transducir de una forma selectiva el hígado de ratas de la línea UChB con los
genes codificantes de las ADHs de rata.
iii) La administración in vivo a ratas UChB de un vector adenoviral codificante de la
ADH mutada de rata rADH-47His resultó en (i) un aumento transitorio (minutos)
de 5 veces en los niveles arteriales de acetaldehído, (ii) un aumento de 90% en
la actividad hepática de la ADH y (iii) una disminución de 50% del consumo
voluntario de alcohol.
iv) La disminución de 50% en el consumo voluntario de alcohol en las ratas UChB
transducidas con el gen de la ADH mutada de rata rADH-47His, es similar a la
protección contra el alcoholismo que presentan los individuos portadores del
alelo ADH1B*2.
v) Los resultados obtenidos en esta tesis indican que el posible mecanismo por el
cual los individuos portadores del alelo ADH1B*2 están protegidos contra el
alcoholismo, sería por una elevación transitoria de los niveles sanguíneos de
acetaldehído (metabolito con efectos aversivos) que se generaría a los pocos
minutos de ingerir el alcohol.
vi) Los resultados obtenidos podrían constituir la base de una posible terapia
génica del alcoholismo basada en el aumento de la actividad de la ADH en el
hígado.
100
10. REFERENCIAS. Amit Z, Smith BR. A multi-dimensional examination of the positive reinforcing properties of acetaldehyde. Alcohol 2: 367-370 (1985) Birnboim HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res 7: 1513-1523 (1979) Bisaga A, Evans SM. Acute effects of memantine in combination with alcohol in moderate drinkers. Psychopharmacology 172: 16-24 (2004) Boleda MD, Julià P, Moreno A, Parés X. Role of extrahepatic alcohol dehydrogenase in rat ethanol metabolism. Arch Biochem Biophys 274: 74-81 (1989)
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11. ANEXO. Tabla 11.1. Secuenciación de los cDNAs silvestre (rAdh-47Arg) y mutado
(rAdh-47His) de la ADH de rata. Posiciones según acceso Gen Bank NM_019286.3.
(Tamaño cDNA: 1804 pb. Región codificante: 62 – 1192)
cDNA Partidor Orientación Posiciones
*TG-266 > 49 - 589
TG-332 > 455 - 1000 rAdh-47Arg
TG-268 < 778 - 1203
TG-241 > 49 -85
TG-267 > 77 -532
TG-332 > 427 -978 rAdh-47His
TG-242 < 963 -1259
* Reacción de secuenciación realizada por C. Mura.