universidad de chile facultad de … de chile facultad de ciencias quÍmicas y farmacÉuticas...

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FARMACOLÓGICA Y TOXICOLÓGICA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA

“DISEÑO DE UNA METODOLOGÍA ANALÍTICA EN HPLC PARA ESTANDARIZAR UN EXTRACTO DE BUDDLEJA GLOBOSA

HOPE, BUDDLEJACEAE Y EVALUACIÓN DE LA CESIÓN DEL EXTRACTO DESDE UN GEL DERMATOLÓGICO”

PROFESOR PATROCINANTE DIRECTORES DE TESIS DRA. CARLA DELPORTE VERGARA PROF. OLOSMIRA CORREA BRIONES Depto. De Química Farmacológica y Depto. De Ciencias y Tecnología Toxicológica Farmacéutica. DIRECTORES DE TESIS PROF. EDDA COSTA CASTRO Depto. De Ciencias y Tecnología Farmacéutica.

MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUÍMICA FARMACÉUTICA

GABRIELA VALENZUELA BARRA

SANTIAGO – CHILE 2009

A mi madre

y hermano

AGRADECIMIENTOS

Primero que todo agradezco a Dios por todas las bendiciones que me ha

otorgado durante toda mi vida.

Además deseo expresar mi máxima gratitud, admiración y respeto hacia la

profesora Carla Delporte, una persona que representa un ejemplo de profesionalismo,

humanidad y un gran modelo a seguir. Para ella infinitas gracias por todo el apoyo,

aprecio y los hermosos momentos compartidos.

De igual forma quisiera agradecer a las profesoras Nadine Backhouse, Edda

Costa, Olosmira Correa y Silvia Erazo por todo el apoyo e interés brindado durante mi

carrera y la realización de mi memoria.

A mi madre le debo agradecer por ser el gran pilar de mi vida, nada de esto

hubiera sido posible sin su gran ejemplo de esfuerzo, sacrificio y amor. A mi hermano

mi más sincera gratitud por el apoyo e incondicionalidad.

También debo hacer un gran reconocimiento a Diego López una persona muy

especial que me ha apoyado durante todo este período y a la cual amo profundamente.

A mi gran amiga Karina Toledo y mis queridos compañeros y amigos de carrera

Nidia Zamorano, Angelina Rivas, Claudia Zúñiga, María José Reiman, Marta Samur,

Leslie Escobar José Luis García y Claudio Méndez, mi más sincero respeto por todo el

apoyo, aprecio y ayuda entregada durante todo este proceso.

Finalmente toda mi gratitud y cariño a la hermosa familia del Laboratorio de

Productos Naturales y en especial a Carlos Cartagena, María José Queupil, León

Goîty, Valentina Toro, Nicolás Cavas, Cindy Silva, Andrea Orellana, Marcelo Peña,

Pamela Zapata y David Aravena, por la ayuda incondicional y los hermosos momentos

atesorados en mi corazón. Sinceramente gracias.

I

INDICE GENERAL

RESUMEN ......................................................................................................... VIII

ABSTRACT .......................................................................................................... X

I.- INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1

II.-HIPÓTESIS ....................................................................................................... 4

III.- OBJETIVOS

1.- Objetivos Generales ................................................................................ 4

2.- Objetivos Específicos .............................................................................. 5

IV. ANTECEDENTES PREVIOS

1.- Descripción botánica de la planta ............................................................. 6

2.- Usos en la medicina tradicional ................................................................ 7

3.- Estudios previos de B. globosa

3.1.- Estudios químicos anteriores .......................................................... 7

3.2.- Estudios farmacológicos anteriores ............................................... 11

V.- MATERIALES Y MÉTODOS

1.- Reactivos ............................................................................................. 13

II

2.- Estudios químicos

2.1.-Obtención de los diferentes extractos de B. globosa ......................... 13

2.2.-Estudios cromatográficos

2.2.1. Análisis cualitativo por c.c.f del EET .................................... 14

2.2.2.-Defecación y fraccionamiento

2.2.2.1.- Defecación del EET ....................................... 14

2.2.2.2.- Fraccionamiento del EET. ............................. 15

3.- Análisis cuantitativo del EET

3.1.- Valoración del verbascósido expresado en ácido cafeico obtenido del

EET por metodología HPLC ................................................................ 22

3.2.- Preparación de las soluciones para HPLC ...................................... 22

4.- Evaluación de la cesión de los principios activos desde el gel de EET

4.1.- Elaboración de los geles

4.1.1.- Gel de EET al 1% ............................................................. 23

4.1.2.- Vehículo gel de carbomer ultra ........................................... 24

4.1.3.- Gel de ácido cafeico al 1% ................................................ 24

4.1.4.-Gel de 7-O-glucósido de luteolina al 1% .............................. 24

4.2.- Equipo de disolución .................................................................... 24

4.3.- Sistema de incorporación de las muestras al equipo de disolución...25

4.4.- Toma de muestras ....................................................................... 26

5.- Ensayo de inhibición de la enzima glicógeno fosforilasa (GPa) .................. 27

5.1.- Preparación de los reactivos ......................................................... 27

5.2.-Protocolo del ensayo de evaluación de la actividad inihibidora de la

GPa ................................................................................................... 30

III

VI.- RESULTADOS Y DISCUSIONES

1.- Estudio químico

1.1.- Obtención del EET ....................................................................... 34

1.2.- Defecación y fraccionamiento del EET

1.2.1.- Defecación del EET .......................................................... 35

1.2.2.- Fraccionamiento del EET .................................................. 36

2.- Análisis cuantitativo del EET

2.1.- Diseño de la metodología HPLC .................................................... 36

2.2.- Perfil cromatográfico del EET (HPLC) ........................................... 37

2.3.-Valoración del verbascósido expresado en ácido cafeico por

metodología HPLC

2.3.1.-Curva de calibración del ácido cafeico ................................. 38

2.3.2.- Valoración del verbascósido expresado en ácido cafeico ...... 40

3.- Evaluación de la cesión de verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina

3.1.- Determinación de la cesión del verbascósido .................................... 40

3.2.- Determinación de la cesión del 7-O-glucósido de luteolina ................ 44

4.- Ensayo de inhibición de la enzima Glicógeno fosforilasa (GPa) ............................. 44

VII.- CONCLUSIONES .......................................................................................... 46

VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 47

IV

INDICE DE FIGURAS

FIGURA 1: Flores y hojas de B. globosa Hope .......................................................... 6

FIGURA 2: Infrutescencia y arbusto de B. globosa Hope ........................................... 7

FIGURA 3: Equipo de disolución Pharma test (type PTW S III) ............................... 25

FIGURA 4: Sistema de incorporación del gel al equipo de disolución ...................... 26

FIGURA 5: Esquema comparativo de los rendimientos de los diferentes extractos

activos seriados de matico ..................................................................... 35

FIGURA 6: Cromatograma HPLC para el EET obtenido en Padre Las Casas (EET

1,58 mg/mL, en MeOH 100% a 365 nm) ................................................ 37

FIGURA 7: Cromatograma HPLC para el EET obtenido en el campus Antumapu

(EET 1, 87 mg/mL, en MeOH 100% a 365 nm)...................................... 38

FIGURA 8: Curva de calibración del ácido cafeico ................................................... 40

FIGURA 9: Cromatogramas patrón ácido cafeico y gel vehículo carbomer ultra .... 42

FIGURA 10: Cromatogramas gel de EET al 1% y gel de ácido cafeico al 1% ........... 43

V

INDICE DE TABLAS

TABLA 1: Compuestos aislados e identificados desde B. globosa .......................... 8

TABLA 2: Algunos constituyentes químicos de B. globosa ................................... 9

TABLA 3: Resumen de las actividades farmacológicas encontradas en diferentes

extractos e infusiones de B. globosa ...................................................... 11

TABLA 4: Esquema del fraccionamiento del EET mediante CC1Sil…..……………16

TABLA 5: Esquema del fraccionamiento del EET mediante CC2Sil…..……………17

TABLA 6: Esquema del fraccionamiento del EET mediante CC3Sil ...................... 18

TABLA 7: Resumen concentrado de fracciones CC3Sil …………………………. ... 19

TABLA 8: Resumen concentrado de fracciones de CC4Seph y CC55eph…….…...21

TABLA 9: Formulación gel de EET al 1%…………………………. ....................... …23

TABLA 10: Disposición de las muestras en el equipo de disolución ........................ 27

TABLA 11: Protocolo de trabajo del ensayo de inhibición de la enzima GPa……....32

VI

TABLA 12: Valores de concentración versus área empleados en la curva de

calibración del ácido cafeico .................................................................. 39

TABLA 13: Resultados del ensayo de Inhibición de la GPa…………………………45

VII

ABREVIATURAS

A : absorbancia

AcOEt : acetato de etilo

B : HEPES 50 mM (pH 7,2)

BS : buffer + sales (pH 7,2)

CC : columna cromatográfica

c.c.f : cromatografía en capa fina

CN : control negativo

CNE : control no enzimatico

DCM : diclorometano

DMSO : dimetilsulfóxido

DPPH radical 2,2-difenil-1-picril hidrazilo hidratado

EDCM : extracto de diclorometano

EET : extracto etanólico seriado de hojas secas y molidas recolectadas

en verano de B.globosa

EHEX : extracto de hexano

EtOH : etanol

Fase 4A : Acetato de etilo: ác. fórmico: ác. acético: agua = 10: 1,1: 1,1: 2,6

Gli : glicógeno

GPa : glicógeno fosforilasa

G1P : glucosa-1-fosfato

HEX : hexano

HPLC : cromatografía líquida de alta resolución

MeOH : metanol

NP : 2-aminoetil difenilborinato al 1% en metanol

Rpm : revoluciones por minuto

SD : medio de detención

TPA : 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato

UV : ultravioleta

VIII

RESUMEN

Existen diversos antecedentes de las propiedades farmacológicas de B.

globosa tanto de su actividad analgésica como antiinflamatoria en trabajos anteriores

realizados en nuestro laboratorio, como también en publicaciones científicas, esto

condujo a continuar con el estudio farmacológico y químico de esta especie.

Uno de los objetivos de nuestro trabajo consistió en aislar el verbascósido y el

7-O-glucósido de luteolina, además de comparar los rendimientos de los diferentes

extractos obtenidos a partir de hojas recolectadas en la localidad de Padre Las Casas,

IX Región, Temuco, en relación a los extractos obtenidos en el sector del Campus

Antumapu, RM, Santiago. Los extractos fueron fraccionados con solventes de

polaridad creciente. El seguimiento cromatográfico se realizó mediante cromatografía

en capa fina (c.c.f.) en gel de sílice, usando como fase móvil acetato de etilo: ácido

fórmico: ácido acético: agua en proporción 10: 1,1: 1,1: 2,6, (4A) revelando con 2-

aminoetil difenilborinato al 1% en metanol (NP) y comparando con sus

correspondientes patrones.

Se estableció la metodología analítica mediante cromatografía líquida de alta

resolución (HPLC) para cuantificar el contenido de verbascósido presente en el

extracto etanólico bioactivo (EET).

El estudio dermatológico consistió en la evaluación de la cesión de los geles de

EET al 1% y 10%, gel de 7-O-glucósido de luteolina 1% y gel de ácido cafeico al 1% a

través de una membrana semipermeable. Los resultados fueron analizados por

metodología HPLC

.

En la evaluación farmacológica se utilizó el ensayo de inhibición de la enzima

glicógeno fosforilasa (GPa), en el cual se evalúo el porcentaje de inhibición de la

enzima por parte del EET.

IX

Los resultados de esta investigación permitieron demostrar que no existe una

variación significativa entre los rendimientos de los extractos obtenidos en distintas

regiones, sin embargo esto no implica que la variación geográfica no influya en la

abundancia de los metabolitos secundarios activos.

En relación a la evaluación de la cesión de los geles, los resultados

demostraron que el verbascósido no es capaz de penetrar la membrana in vitro, lo

mismo ocurrió para el 7-O-glucósido de luteolina a diferencia del ácido cafeico que sí

pudo atravesar la membrana, esto nos llevó a postular que in vivo ocurre una hidrólisis

del verbascósido, mediada por enzimas cutáneas, liberándose ácido cafeico, quien

sería el responsable de generar las propiedades terapéuticas del gel.

En el ensayo de inhibición de la enzima GPa, el EET demostró ser capaz de

inhibir a la enzima en un 51%, presumiendo un posible efecto hipoglicemiante.

X

ABSTRACT

“DESIGN OF THE ANALYTICAL METHODOLOGY IN HPLC TO STANDARDIZE AN EXTRACT OF GLOBULAR BUDDLEJA HOPE, BUDDLEJACEAE AND

EVALUATION OF THE TRANSFER OF THE EXTRACT FROM A DERMATOLOGICAL GEL”.

Different antecedents of the pharmacological proprieties of B. globosa, about

analgesic and anti-inflammatory activities in previous experiments carried out in our

laboaratory, together with scientific publications led to continue whith the

pharmacological and chemical study of this species.

One of the aims of our study was to isolate verbascoside and luteolin-7-O-

glycoside and to compare the performance of the different extracts obtained from

leaves collected in Padre Las Casas, IX Region, Temuco, with those obtained from the

the Campus Antumapu, of the University of Chile, RM, Santiago specimens. The

extracts were fractionated with increasing polarity solvents. Chromatographic

monitoring was carried out with silica gel thin layer chromatography (TLC), using as

mobile phase ethyl acetate: formic acid: acetic acid: water 10: 1,1: 1,1: 2.6, (4A)

revealing with 2-aminoetil difenilborinato 1% in metanol (NP) and comparing with their

corresponding patterns.

Analytical methodology was established by high performance liquid

chromatography (HPLC) to quantify the content of present verbascoside in the bioactive

ethanolic extract (EET).

The dermatological study was the assessment of transfer of 1% and 10% EET

gel and 1% luteolin-7-O-glycoside and caffeic acid gels through a semipermeable

membrane. The results were analyzed by HPLC methodology.

XI

Pharmacological evaluation of the glycogen phosphorylase enzyme (GPa)

inhibition for EET was assessed. The results were expressed as percentage of

inhibition of the enzyme.

The results of this investigation allowed us to demonstrate that there is no

significant variation between the yields of extracts obtained in different regions.

However, this does not imply that geographical variation do not influence in the

abundance of active secondary metabolites.

In reference to the evaluation of the gels transfer, the results showed that

verbascoside cannot penetrate the membrane in vitro, occurring the same to luteolin-7-

O-glycoside unlike caffeic acid which could permeate through the membrane, this led

us to postulate that in vivo verbascoside hydrolysis occur mediated by cutaneous

enzymes releasing caffeic acid conducting to the therapeutic properties of the gel.

In the GPa enzyme inhibition assay, the EET proved to be capable to inhibit the

enzyme in a 51%, assuming a possible hypoglycemic effect.

INTRODUCCIÓN

1

I.- INTRODUCCIÓN Buddleja globosa, nv. matico, Buddlejaceae es un arbusto que se encuentra

distribuido geográficamente entre Chile, Argentina y Perú. En Chile habita desde

Santiago hasta la Patagonia, generalmente en sitios húmedos (Navas, 1979). También

es ampliamente cultivada como ornamento en parques y jardines de Gran Bretaña

(Hougthon, 1984).

La medicina folclórica utiliza esta especie por sus múltiples propiedades

terapéuticas y destaca el uso de las hojas y corteza en infusiones para ayudar en la

cicatrización de heridas, en el tratamiento de quemaduras y de úlceras externas e

internas (Pardo et al., 1993). El decocto de las hojas es utilizado para lavar heridas y

las hojas pulverizadas para el tratamiento de úlceras. El infuso de las hojas se emplea

para tratar la disentería crónica, hemorroides, hepatitis, infecciones urogenitales y

verrugas (Trim y Hill, 1952).

Estudios farmacológicos realizados anteriormente utilizando diferentes extractos

e infusiones de B. globosa, han permitido demostrar su actividad antihepatotóxica del

extracto acuoso de hojas y flores (Houghton y Hikino, 1998). Previamente, Pardo et al.

(1993) demostraron la actividad antibacteriana contra S. aureus y E. coli, del extracto

etanólico de sus hojas. Los extractos acuosos obtenidos de sus hojas presentan

propiedades antioxidantes y cicatrizantes in vitro (Campos y Lissy, 1995; Menash et al.,

1998).

Liao et al., (1999) demostraron la acción antiinflamatoria in vitro de los extractos

lipofílicos de las raíces. Posteriormente Menash et al. (2001) comprobaron que los

extractos lipofílicos obtenidos desde la corteza presentan actividad antifúngica in vitro.

Estudios realizados en nuestro laboratorio también han permitido demostrar los

efectos farmacológicos como cicatrizantes (Miranda et al., 2005), actividad

antiinflamatoria, analgésica y atrapadora de radicales libres de un preparado etanólico

estandarizado (Backhouse et al., 2008a y 2008b). Además se evaluó la eficacia de

INTRODUCCIÓN

2

preparados dermatológicos en base a extractos activos demostrándose la efectividad

de éstos en el tratamiento de los efectos adversos producidos por la quimioterapia

(eritrodisestesia plantar palmar) (Rubio et al., 2004; Araya et al., 2005). También se

evaluó la variación estacional y el impacto del solvente en la actividad analgésica y

antiinflamatoria, encontrándose que todos los extractos evaluados presentaron ambas

actividades farmacológicas, siendo la actividad analgésica mayor a la antiinflamatoria.

Sin embargo, los extractos alcohólicos de las hojas recolectadas en verano fueron más

efectivos que los extractos obtenidos con las hojas recolectadas en otoño. Además no

se encontraron diferencias, tanto químicas como farmacológicas, al usar etanol o

metanol como solvente (Apablaza, 2006).

En la literatura existen diversos trabajos en los cuales se describe el aislamiento

e identificación de numerosos compuestos de B. globosa. En las flores se han

encontrado compuestos tales como acaetina-7-0-rutinósido (linarina), apigenina-7-0-

glucósido, quercetina-3-0-rutinósido (rutina) y escutelareína-7-0-glucósido (Marin et al.,

1979). Desde sus hojas también se han aislado una gran cantidad de compuestos

destacándose principalmente la luteolina-7-0-glucósido (Harborne y Williams, 1971), β-

amirina, acetato de β-amirina, glutinol, esterol condrilasterol, ester metílico del ácido p-

cumárico, ester metílico del ácido ferúlico (López et al., 1979), 7-p-metoxi cinamoil

aucubina, 7-p-metoxi cinamoil catalpósido, equinacósido (Houghton y Hikino, 1989),

verbascósido (Pardo et al., 1993) y angarósido A (Pardo et al., 1997). En la corteza es

importante mencionar la identificación de deoxibuddlejona (Menash et al., 2001). En las

raíces fue posible encontrar buddlejona (Houghton et al., 1996), dihidrobuddledina A,

budledona A y B, buddledina A, B y C y zerumbona (Liao et al., 1999).

A partir de extractos seriados obtenidos desde las hojas de matico, como por

ejemplo desde el extracto hexánico se aisló e identificó una mezcla de α y β-amirinas

como componentes mayoritarios. En relación al extracto de diclorometano se ha

aislado una mezcla de esteroides siendo el glucósido de β-sitosterol el más abundante,

junto con estigmasterol, estigmastenol, estigmastanol, campesterol y β-sitosterol

(Rosales, 2003; Backhouse et al., 2008a). En los extractos hidroalcóholicos es posible

INTRODUCCIÓN

3

encontrar mayoritariamente verbascósido (un feniletanoide) y el 7-O-glucósido de

luteolina (una flavona) (Goîty, 2007; Backhouse et al., 2008a).

El objetivo de este trabajo consistió en valorar la cantidad de verbascósido

presente en el extracto etanólico bioactivo de las hojas de Buddleja globosa (EET), así

como determinar la cesión de este fenilpropanoide y del 7-O-glucósido de luteolina

desde una formulación gel elaborada a base del EET. Lo anterior resulta de gran

importancia para poder asegurar la calidad y eficacia de productos farmacéuticos ya

existentes y futuros elaborados en base a preparados obtenidos desde las hojas de

esta especie.

HIPÓTESIS

4

II.- HIPÓTESIS

La implementación de una metodología analítica por HPLC para cuantificar al

verbascósido presente en las hojas de matico, permitirá estandarizar un extracto

etanólico farmacológicamente activo (EET), permitiendo además la determinación de la

cesión desde una formulación dermatológica de este principio activo.

III.- OBJETIVOS

1.- Objetivos Generales

• Establecer una metodología analítica que permita la cuantificación del

verbascósido en el EET.

• Comparar la influencia de la variación geográfica en el rendimiento de los

diferentes extractos obtenidos desde las hojas de matico.

• Evaluar la cesión del verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina desde una

formulación dermatológica tipo gel en base al EET.

• Determinar el potencial efecto hipoglicemiante del EET.

OBJETIVOS

5

2.- Objetivos específicos

• Obtener el EET desde hojas recolectadas en verano.

• Obtener el rendimiento del fraccionamiento de las hojas recolectadas en el

Campus Antupamu, Universidad de Chile, RM, Santiago y comparar este valor

con el descrito previamente en la literatura para hojas recolectadas en la

localidad de Padre Las Casas, IX Región, Temuco.

• Aislar y purificar el verbascósido y el 7-O- glucósido de luteolina desde el EET.

• Establecer el perfil cromatográfico por HPLC para el EET.

• Cuantificar la cantidad de verbascósido presente en el EET expresado en ácido

cafeico, mediante metodología HPLC.

• Establecer la cesión in vitro del verbascósido y del 7-O-glucósido de luteolina

desde un gel dermatológico en base a EET.

• Evaluar la inhibición de la enzima GPa por parte del EET.

1

j

3

d

c

F

1.- Descripc

• FAM

• GÉN

• ESP

• NOM

• NOM

• DISThabit

(Nav

parq

Budd

jóvenes pub

3 a 15 cm

diámetro, fo

compactas,

Florece desd

ción botáni

MILIA

NERO

ECIE

MBRE CIENT

MBRE VULG

TRIBUCIÓNta desde Sa

vas, 1979).

ues y jardine

dleja globos

bescentes am

de ancho. L

ormando un

de color an

de noviembr

FIGU

• IV.- A

ca de la pla

TÍFICO

GAR

GEOGRÁFantiago has

También e

es de Gran

a Hope es

marillentas.

La infloresce

n racimo de

naranjado, a

re a mayo (N

URA 1: Flor

ANTECEDE

anta:

FICA

sta la Patag

es ampliam

Bretaña (Ho

un arbusto

Sus hojas s

encia es en

e 2 a 15 ca

amarillo y ro

Navas, 1979

res y hojas

ENTES PREV

: Buddle

: Buddlej

: B. glob

: Buddlej

: matico

Wilkomirsk

: Chile,

gonia, gener

mente cultiva

oughton, 198

de 1,5 a 3

son opuesta

n mono o bi

abezuelas.

ojo. El fruto

9).

de B. globo

ANTECED

VIOS

ejaceae

eja

bosa

eja globosa H

, palquil o pa

ky, 1985).

Argentina y

ralmente en

ada como

84)

metros de a

as, lanceolad

icabezuela,

Sus flores

es una cáp

osa Hope

DENTES PRE

Hope

añil (Montes

y Perú. En

n sitios húm

o ornament

altura con ra

das y aguda

de 1 a 2 c

son numer

sula subglo

EVIOS

6

s y

Chile

medos

to en

amas

as, de

cm de

rosas,

bosa.

ANTECEDENTES PREVIOS

7

FIGURA 2: Infrutescencia y arbusto de B. globosa Hope

2.- Usos en la medicina tradicional:

La medicina tradicional ha empleado el matico por sus múltiples propiedades

terapéuticas destacando el uso de las hojas y corteza en infusión, para ayudar en la

cicatrización de heridas, en el tratamiento de quemaduras y de úlceras externas e

internas (Pardo et al., 1993).

El decocto de las hojas es utilizado para lavar heridas y las hojas pulverizadas

para tratar úlceras y viejas heridas. El infuso de las hojas se administra oralmente para

tratar la disentería crónica, hemorroides, hepatitis y catarro. También se ha descrito su

uso para el tratamiento de úlceras y verrugas, usando los jugos e infusiones desde las

hojas. Además se han empleado las hojas como antisépticos urogenitales en la forma

de una infusión (Hougthon, 1984).

3.- Estudios previos de B. globosa:

3.1.- Estudios químicos anteriores

En la literatura existen diversos trabajos donde se describe el aislamiento e

identificación de numerosos compuestos obtenidos a partir de la especie en estudio

(TABLA 1 y 2)


8

TABLA 1: Compuestos aislados e identificados desde B. globosa

ORGANO

Nº COMPUESTO AUTOR(ES)

FLORES

1 Acacetina-7-O-rutinósido(linarina)

Marin et al., 1979 2 Apigenina-7-O-glucósido

3 Quercetina-3-O-rutinósido(rutina)

4 Escutelarreína-7-O-glucósido

HOJAS

5 Luteolina-7-O-glucósido Hougthon y Menash, 19996 6-hidroxi-luteolina-7-O-glucósido7 Aucubina Hougthon, 19848 Lupeol Marin et al., 19799 Ésteres bis-(2-metil propílico) del

ácido ftálico Calderón y López, 1975

10 Ésteres bis-(2-etil hexílico) del ácido ftálico

11 β-amirina López et al., 1979

12 Acetato de β-amirina13 Glutinol14 Esterol condrilasterol15 Éster metílico del ácido

p-cumarínico16 Éster metílico del ácido ferúlico 17 7-p-metoxi cinamoil catalpósido

Houghton y Hikino, 1989 18 7-p-metoxi cinamoil catalópsido19 Equinacósido20 Verbascósido Pardo et al., 199321 Angarósido A Pardo et al., 1997

CORTEZA

22 Ésteres de ácidos grasos fenólicos Houghton et al., 198923 Deoxibuddlejona Mensah et al., 2000

RAÍCES

24 Buddlejona Hpughton et al., 199625 Dihidrobuddledina A

Liao et al., 1999 26 Buddledona Ay B27 Buddledina A, B y C28 Zerumbona


9

TABLA 2: Algunos constituyentes químicos de B. globosa.

Nº ESTRUCTURA NOMBRE

FLAVONOIDES

1

Linarina (Acacetina-7-O-rutósido)

2

Escutelarreína-7-O-glucósido

FENILETANOIDES

3

R=H

Verbascósido R= Arabinosa

Angarósido A

IRIDOIDES

4

Aucubina

5

R= H

Catalpol R= CH3

Metilcatalpo


10

SESQUITERPENOIDES Y

DITERPENOIDES

6

Buddlejona

7

R= OH

Buddledina A R= H

Buddledina B R= OOCCH3

Buddledina C

TRITERPENOIDES

8

β-amirina

9

Lupeol


11

3.2.- Estudios Farmacológicos anteriores

En la TABLA 3 se resumen algunas propiedades terapéuticas de B. globosa,

además se especifica el tipo de extracto empleado en la determinación de dicha

actividad.

TABLA 3: Resumen de las actividades farmacológicas encontradas en diferentes extractos e infusiones de B. globosa

ACTIVIDAD

EXTRACTO EFECTO AUTOR(ES)

ANTIHEPATOTÓXICA

Extracto acuoso de hojas y flores

Inhibitorio de citotoxicidad inducida en un cultivo de hepatocitos. Efecto debido a los glicósidos fenilpropanoides

Houghton y Hikino, 1988

ANTIBACTERIANA

Extracto etanólico de las hojas

Antibacteriano contra S. aureus y E. coli. Esto condujo a la separación de un nuevo constituyente: verbascósido

Pardo et al., 1993

ANTIOXIDANTE

Infusión de las hojas

Propiedades antioxidantes en un test que midió el decolorado de cationes coloreados preformados

Campos y Lissi, 1995

Extracto seriado de hojas

Otros ensayos efectuados evaluaron las inhibición de la enzima xantino oxidasa, la inhibición de la lipoperoxidación en eritrocitos y el ensayo de decoloración del DPPH

Backhouse et al., 2008

CICATRIZANTE IN VIVO

Extracto acuoso de las hojas

Estimulador leve en la proliferación de fibroblastos de dermis humana

Mensah et al., 1998


12

ANTIINFLAMATORIA IN VITRO

Extractos lipofílicos de las raíces

Inhibitorio sobre la 5-LOX y la COX

Liao et al ., 1999

ANALGÉSICA Y ANTIINLAMATORIA IN VIVO

Extractos seriados de hojas

Inhibe mediadores involucrados en la cascada de inflamación (AA y TPA). Todos los extractos muetsran actividad farmacológica, siendo el EDCM el más activo

Vargas et al., 2000

Extractos alcohólicos fraccionados de hojas

Actividad analgésica tópica se presentó en los ensayos de aplicación de formalina en la cola y latigazo en la cola (Tail flick test) y analgesia oral en latigazo en la cola y la medición de contorsiones abdominales. La actividad antiinflamatoria tópica fue evaluada con la medición del edema inducido por TPA

Backhouse et al., 2008

ANTIFÚNGICA IN VITRO

Extractos lipofílicos de la corteza

Antifúngico contra tres especies de hongos dermatofíticos

Mensah et al., 2000

MATERIALES Y MÉTODOS

13

V. MATERIALES Y MÉTODOS 1.- Reactivos

Acetonitrilo y metanol para HPLC, ácido fórmico 98-100%, ácido clorhídrico

36%, solventes de grado de laboratorio para las extracciones, columnas

cromatográficas de Sephadex LH-20 y gel de sílice, cromatofolios para cromatografía

en capa fina (c.c.f.), además de solventes p.a para la reacción enzimática, fueron

adquiridos en Merck (Damstadt, Alemania). El agua desionizada fue preparada

empleando un sistema Milipore Mili-Q Plus (Milipore, Bedford, MA, USA).

Sustancias de referencia como ácido cafeico (C0625-25G), enzima glicógeno

fosforilasa (P1261-10MG), glicógeno (G088G-1G), glucosa-1-fosfato (G7018-1G) y

HEPES (H3375-100MG) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Oakville, ON, USA).

El agua desaireada empleada para evaluar la cesión de los principios activos

desde el gel en base a EET, fue preparada por calentamiento a 50°C durante 30

minutos y luego calentamiento a 100°C durante 15 minutos.

2. Estudios químicos

2.1. Obtención de los diferentes extractos de B. globosa

Las hojas de B. globosa con las cuales se efectuaron los estudios fueron

recolectadas en el Campus Antumapu de la Universidad de Chile, Santiago, RM, Chile,

durante el mes de enero del 2008, conservando un testigo herbario (SQF: 22439) en la

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile.

El material vegetal seco y molido (1,94 kg) se sometió a extracciones sucesivas

con disolventes de polaridad creciente, obteniendo: 40,15 g de extracto hexano

(EHEX), rendimiento equivalente a 2,1 %; 26,34 g de extracto diclorometano (EDCM),

rendimiento de 1,4% y 1,63 g de extracto etanólico (EET) con un 8,4% de rendimiento.


14

Cada extracción se realizo hasta total agotamiento del material vegetal,

utilizando temperatura adecuada en el evaporador rotatorio, según el disolvente y

dejando, entre cada extracción, secar el material vegetal a temperatura ambiente antes

de adicionar el nuevo disolvente.

El extracto seleccionado para continuar con el estudio químico fue el etanólico

(EET), con el fin de aislar dos de sus principios activos, verbascósido y el 7-0-glucósido

de luteolina. El EET fue sometido a una previa defecación para eliminar la clorofila

(Sanabria-galindo et al., 1998) antes de su fraccionamiento mediante sucesivas

columnas cromatográficas (CC).

2.2. Estudios cromatográficos

2.2.1. Análisis cualitativo por c.c.f del EET

Las c.c.f se realizaron en cromatofolios de gel de sílice 60 F254 de Merck. Como

fase móvil se empleó la Fase 4A, la cual contiene acetato de etilo: ácido fórmico: ácido

acético: agua (10: 1,1: 1,1: 2,6). Se observaron las placas bajo la luz UV a las

longitudes de onda 254 y 366 mn y se revelaron con 2-aminoetil difenilborinato al 1%

en metanol (NP Natural Products) (D9754-5G, Sigma Aldrich). Los flavonoides

presentaron fluorescencia anaranjada-rojiza y los feniletanoides, amarillo o amarillo

verdoso, al UV-366 nm.

2.2.2. Defecación y Fraccionamiento 2.2.2.1. Defecación del EET

Se decidió efectuar un proceso de defecación previamente al fraccionamiento,

para eliminar la clorofila, ya que ésta interfiere en el aislamiento de los principios

activos, como lo son el verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina. El verbascósido es

uno de los componentes mayoritarios del extracto y al cual se le atribuyen las


15

propiedades analgésicas de las hojas de matico (Goîty, 2007; Backhouse et al.,

2008a).

• Técnica de defecación

Se pesaron 9,0 g del EET y se disolvieron en 2,5 mL de etanol caliente (a punto

de ebullir) a esta solución se agregó 2,5 mL de una solución B que contenía acetato de

plomo al 4% y ácido acético al 0,5%. Al momento de adicionar la solución B se observó

la formación inmediata de un precipitado de color verde. Luego se sometió el EET a

reiterados procesos de centrifugación conservando siempre el sobrenadante. Este

sobrenadante se llevó a sequedad y se reconstituyó con metanol.

Como el plomo es tóxico e interfiere en los análisis, fue necesario corroborar la

ausencia de este elemento en el extracto obtenido, para ello se tomaron 2 tubos de

ensayos, en uno se adicionó una pequeña alícuota de la muestra (1 mL) y en el otro

(tubo control) una solución de PbSO4 al 1% p/v, a ambos tubos se les debió ajustar a

pH 9 con amoníaco. Luego se adicionó un volumen de 1 mL de Na2CO3 1% p/v a cada

tubo de ensayo. Se observó la presencia de un precipitado blanco y consistente en el

tubo control, pero no en la muestra, lo que confirmó la ausencia de plomo en ésta.

2.2.2.2. Fraccionamiento del EET

Con la finalidad de aislar el verbascósido y el 7-O-glucósido de luteolina se

efectuaron distintas CC con silicagel G-60 y Sephadex LH-20. Las fracciones fueron

analizadas por c.c.f. y utilizando NP como reactivo revelador.

I. Primera CC con gel de sílice G-60 (CC1Sil)

Se efectuó una primera CC exploratoria para estimar las polaridades en las

cuales se extraen los compuestos de interés, teniendo en cuenta antecedentes previos

en la literatura (Goîty, 2007; Backhouse et al., 2008a).


16

Condiciones de la CC1Sil:

• Diámetro de la columna= 4 cm

• Cuerpo columna= 22,2 cm de altura de silicagel

• Cabeza= 1cm de altura (4 g de muestra más 4 g de silicagel)

• Volumen eluyente= 250 mL

• Tratamientos previos muestra= No se efectúo defecación

Las distintas fracciones fueron obtenidas eluyendo la CC1Sil con disolventes de

orden creciente de polaridad, como se muestra a continuación en la TABLA 4:

TABLA 4: Esquema del fraccionamiento del EET mediante CC1Sil

Como el objetivo de CC1Sil fue estimar una polaridad aproximada para extraer

el verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina y ésta no entregó mayor información,

debido a que se efectuaron cambios significativos de polaridad, se decidió efectuar una

segunda CC la cual se describe a continuación.

II. Segunda CC con gel de sílice G-60 (CC2Sil)

El EET fue sometido a un fraccionamiento mediante la CC2Sil y los cambios de

polaridad de los solventes con que se eluyó esta nueva CC se realizaron en forma más

fina, tal como se muestra en la TABLA 5.

Fracción Solvente Proporción Compuesto

1-2 DCM: AcOEt 50:50 clorofila

3-4 DCM: AcOEt 30:70 clorofila

5-6 AcOEt 100 clorofila 7-8 MeOH 100 verbascósido y 7-O-glucósido de

luteolina


17



• Cuerpo columna= 23 cm de altura de silicagel

• Cabeza= 1,5 cm de altura (4 g de muestra más 4 g de silicagel)

• Volumen eluyente= 500 y 1000 mL

• Tratamientos previos muestra= No se efectúo defecación


Tanto en la CC1Sil como la CC2Sil, el principal interferente fue la clorofila, por lo

tanto se decidió pre-tratar el EET antes de fraccionarlo sometiéndolo a un proceso de

defecación para eliminar la clorofila y de este modo se procedió a realizar una tercera

CC denominada CC3Sil.

III. Tercera CC con gel de sílice G-60 (CC3Sil)

Se realizó una tercera CC denominada CC3Sil con el fin de aislar el

verbascósido y el 7-O-glucósido de luteolina. Los resultados de esta CC se muestran

en la TABLA 6.

Fracción Solvente Proporción Volumen Compuesto

1-9 DCM 100 500 mL clorofila

10-11 DCM: AcOEt 80:20 1000 mL clorofila





23-28 AcOEt 100 1000 mL verbascósido y clorofila

29-40 AcOEt: MeOH 95:5 1000 mL verbascósido y 7-O-

glucósido de luteolina

41-44 MeOH 100 1000 mL


18



• Cuerpo columna= 2 cm de altura de silicagel

• Cabeza= 22,5 cm de altura (4,3 g de muestra más 4,5 g de silicagel)


• Tratamientos previos muestra= defecación de la muestra


En las fracciones 18 a la 74 se observó el verbascósido y en las fracciones 75 a

la 89 se detectó junto al verbascósido el 7-O-glucósido de luteolina.

A continuación fueron seleccionadas las fracciones que contenían una mayor

cantidad de verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina por c.c.f.. Estas fracciones

fueron desde la 64 hasta la 71 de la CC3Sil, las que se juntaron en una y dieron origen

al concentrado VI (TABLA 7).

El concentrado VI de CC3Sil (305,2 mg) fue sometido a una purificación por una

cuarta CC de Sephadex LH-20 y que fue denominada CC4Sep.

Fracción Solvente Proporción Volumen Compuesto

1-5 DCM 100 500 mL

6-9 DCM: AcOEt 75:25 500 mL

10-12 DCM: AcOEt 50:50 500 mL

13-17 DCM: AcOEt 25:75 500 mL

18-74 AcOEt 100 500 mL verbascósido

75-89 AcOEt: MeOH 95:5 500 mL verbascósido y 7-O-

glucósido de luteolina

90-91 MeOH 100 500 mL


19

TABLA 7: Resumen concentrado de CC3Sil

IV. Cuarta CC de Sephadex LH-20 (CC4Seph)

El Sephadex LH-20 (Fluka Chemie, Suiza) permite la separación de los

compuestos según su peso molecular. Previamente se debió preparar la CC para lo

cual se suspendió 30 minutos en metanol y una vez incorporado a la columna se

ambientó agregando tres veces la fase móvil (HEX: DCM: MEOH = 2: 4: 4).

Posteriormente se incorporó el concentrado VI disuelto en la misma mezcla de solvente

y se eluyó con la mezcla mencionada.

Condiciones de la CC4Seph:


• Cuerpo columna= 44 cm de altura (en metanol)

• Volumen de muestra= 10 mL saturado con la muestra sin sólido remanente


• Fase móvil= HEX: DCM: MEOH = 2: 4: 4

CC3Sil

Concentrado Fracciones

I 1-7

II 8-28

III 29-35

IV 36-50

V 51-63

VI 64-71

VII 72-74

VIII 75-78

IX 79-84

X 85-89

XI 90-91


20

La composición química de cada una de las fracciones eluidas fue monitoreada

por c.c.f., usando como fase móvil 4A y revelando con NP.

De la columna CC4Seph se recolectaron 80 fracciones. Entre las fracciones 37

a la 41 se detectó el 7-O-glucósido de luteolina puro. Desde la 42 y hasta la 48 (106,7

mg) se observó el verbascósido impuro. Con el objetivo de purificar el verbascósido,

las fracciones correspondientes fueron sometidas a una segunda columna de

Sephadex denominada CC5Seph. La TABLA 8 resume los resultados de las columnas

de Sephadex.

V. Quinta CC de Sephadex LH-20 (CC5Seph) Condiciones de la CC5Seph:


• Cuerpo columna= 44 cm de altura (en metanol)

• Volumen de muestra= 8 mL saturado con la muestra sin sólido remanente


• Fase móvil= HEX: DCM: MEOH = 2: 4: 4

De la columna CC5Seph se recolectaron 80 fracciones. Desde la fracción 40

hasta la 55 se obtuvo al verbascósido puro (72,4 mg).


21

TABLA 8: Resumen concentrado de fracciones de CC4Seph y CC5Seph

Cabe señalar que uno de los objetivos de esta memoria fue obtener una mayor

cantidad de verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina, ya que éstos están siendo

empleados en otros estudios en colaboración con otros investigadores y además estos

compuestos aislados fueron utilizados como patrones para la valoración del EET y

posteriormente en la determinación de la cesión de los principios activos desde la

formulación tipo gel, mediante HPLC.

COLUMNA FRACCIONES COMPUESTO

CC4Seph

1-9

10-14

15-21

22-33

31-36

37-40 7-O- glucósido de luteolina

(75,6 mg)

41-48 verbascósido (106,7 mg)

49-54

55-80

CC5Seph

1-39

40-55 verbascósido (72,4 mg)

56-57

58-80


22

3.- Análisis cuantitativo del EET 3.1.- Valoración del verbascósido expresado en ácido cafeico obtenido del EET por metodología HPLC

La cuantificación del verbascósido se realizó por HPLC, basándose en la

metodología para la cuantificación de los flavonoides de Gingko biloba (Dubber y

Kanfer, 2004). Esta metodología fue adaptada para nuestros propósitos

estableciéndose las condiciones óptimas para la correcta definición de EET en HPLC.

Estas condiciones corresponden a:

• Columna : C18, LiChroCART® 250-4 Purospher®

STAR RP-18 (5µ). Merck (HX675529)

• Flujo : 0,5 mL/min

• Fase móvil : ácido fórmico 0,1%: acetronitrilo = 70: 30

• Volumen de inyección : 20 μL

• Longitud de onda : 365 nm

Todos los análisis fueron desarrollados en un equipo HPLC Waters 486

acoplado a un detector UV/Visible Waters con arreglo de diodos.

3.2.- Preparación de las soluciones para HPLC

Para obtener la curva de calibración se preparó una solución stock de 1850

ppm de ácido cafeico en metanol LiChrosolv para HPLC. Para el verbascósido se

preparó una solución stock de 300 ppm en metanol. Luego fueron sonicadas durante 5

minutos y filtradas por membrana GV (Durapore) 0,22 μm de poro (GVWP01300) en un

dispositivo Swinnex (SX0001300) adquiridos de Millipore Corp., Billerica, MA, USA y

acoplado a jeringa de vidrio. De la solución anterior de ácido cafeico se obtuvo por

dilución las concentraciones necesarias para los puntos del gráfico área versus

concentración.


23

4.- Evaluación de la cesión de los principios activos desde el gel de EET 4.1- Elaboración de los geles 4.1.1- Gel de EET al 1%

El siguiente estudio se realizó sobre una formulación preestablecida de un gel a

base de EET al 1% (Mora, 2006) como se muestra en la TABLA 9.

TABLA 9: Formulación gel de EET al 1%

Procedimiento de elaboración del gel:

1. En un recipiente previamente tarado, que contiene aproximadamente 2 tercios

de agua destilada recién hervida, se agregó una cantidad exactamente pesada

de carbomer 940 y 0,1 g de metilparabeno.

2. Se dispersó con agitador con un agitador mecánico a 3000 rpm durante 5

minutos.

3. La dispersión se llevó a pH 6 con una solución de trietanolamina al 20%.

4. Una vez frío el vehículo se agregó el EET disuelto en agua. Se agitó hasta

homogeneidad.

5. Se completó hasta el peso deseado.

Formulación

Materia Prima Cantidad (%)

EET 1,0

Propilenglicol 5,0

Carbomer 940 1,0

Trietanolamina sol. 20% c.s. pH 6

Metilparabeno 0,1

Agua c.s.p. 100


24

4.1.2.- Vehículo gel de carbomer ultra:

El gel de carbomer fue elaborado pesando 500 g de carbomer ultra y 5 g de

metil parabeno, acompañado de agitación.

4.1.3.- Gel de ácido cafeico al 1%

Debido a que el verbascósido in vivo podría generan ácido cafeico, se preparó

un gel de ácido cafeico al 1%, para lo cual se empleó 30 g del vehículo de carbomer

ultra y se adicionó 0, 31 g de ácido cafeico. Este último debió ser disuelto previamente

en una mezcla de H2O: MeOH (90:10) y posteriormente sonicado durante 5 minutos a

60ºC.

4.1.4.- Gel de 7-O-glucósido de luteolina al 1%

Con el fin de determinar inequívocamente la cesión del 7-O-glucósido de

luteolina, se pesaron 0,33 g de 7-O-glucósido luteolina, luego se disolvió en una

mezcla de H2O: EtOH (50:50) y fue sonicada durante 5 minutos a 60ºC. Posteriormente

se incorporó a 32 g del vehículo gel de carbomer ultra.

4.2.- Equipo de disolución

La cesión fue evaluada en un equipo de disolución Pharma test (type PTW S III)

(FIGURA 3), en las siguientes condiciones:

• Velocidad rotación paleta: 50 rpm

• Temperatura (T): 33ºC

• Volumen agua desaireada por vaso: 900 mL

• Nº de vasos (V) : 8


25

FIGURA 3: Equipo de disolución Pharma test (type PTW S III)

4.3.- Sistema de incorporación de las muestras al equipo de disolución

Cada uno de los geles fueron incorporados en recipientes, los cuales se

cubrieron en su parte superior con la membrana semipermeable Snake Skin® (3,5

MWCO), la cual cumple con las siguientes especificaciones:

• Tipo de membrana: Celulosa regenerada

• Grosor lámina de membrana: 22-30 µm

• Contenido de glicerol: trazas

• Contenido de azufre: 0.1 -0.15 %

• Contenido de metales pesados: trazas

• Capacidad: sostiene 3,7 mL/cm de muestra

El sistema armado se selló con un soporte adecuado y fue apretado con pinzas

para evitar la filtración de las muestras por los costados, tal como lo muestra la

FIGURA 4.


26

FIGURA 4: Sistema de incorporación del gel al equipo de disolución

El sistema armado (C, FIGURA 4) se colocó en los vasos del equipo Pharma

test que contenían 900 mL de agua desairada a la temperatura programada en el

equipo, es decir 33ºC.

4.4.- Toma de muestra

Se realizaron dos evaluaciones, tal como lo muestra la TABLA 10.

C

(A) soporte que evita la salida del gel. (B) recipiente contenedor del gel. (C) sistema armado, el cual está conformado por B, cubierto por la membrana y sellado con A y 2 pinzas laterales para prevenir filtraciones del sistema.

B A


27

TABLA 10: Disposición de las muestras en el equipo de disolución

Se evaluó la cesión durante 3 horas, para lo cual se tomaron muestras de 10

mL cada 30 minutos con reposición del volumen de muestra tomado, para lo cual se

tomaba el volumen correspondiente de agua del V4. Luego las muestras fueron

almacenadas bajo refrigeración a -4ºC para su posterior análisis por metodología

HPLC establecida previamente.

5.- Ensayo de inhibición de la enzima glicógeno fosforilasa (GPa) Este ensayo se basa en un método colorimétrico que detecta la liberación de

fosfato al medio, basado en el método modificado de Martin et al. (1998). En esta

prueba, la enzima GPa de músculo de conejo cataliza la reacción de síntesis de

glicógeno a partir de un partidor de glicógeno, incorporando unidades sucesivas de

glucosa proveniente de la glucosa-1- fosfato y liberando fosfato cuantificable.

5.1.- Preparación de los reactivos Debido a la sensibilidad del ensayo fue necesario tener la precaución de que

todo el material que fue empleado en la preparación de los siguientes reactivos se

encontrara libre de ión fosfato. Por ende, el material fue lavado con jabones libres de

fosfato y posteriormente enjuagados con agua destilada y finalmente con agua Milli-Q.

I II

Vaso Muestra Vaso Muestra

V1 Gel vehículo (blanco) V1 Gel vehículo (blanco)

V2 Gel de EET 1% V2 Gel de EET 10%

V3 Gel de ácido cafeico 1% V3 Gel de 7-O-glucósido de

luteolina 1%

V4 Sin muestra (agua reposición

toma de muestra) V4 Sin muestra (agua reposición

toma de muestra)


28

a) Solución B: HEPES 50 mM (pH 7,2)

La solución B se empleó para preparar las soluciones de glicógeno, glucosa-1-

fosfato y enzima.

• Para preparar 100 mL de solución B se pesó 1,302 g de HEPES y se agregó

una mínima cantidad de agua Milli-Q que permitió sumergir el detector del

electrodo del medidor de pH previamente calibrado. Posteriormente se agitó

con un magneto hasta obtener una total disolución.

• En agitación constante se ajustó pH agregando lentamente gotas de HCl al

37% p.a. hasta aproximarse a pH 7,8.

• Se diluyó una cantidad de HCl al 37% p.a. y se agregó gota a gota a la solución

hasta alcanzar un pH final de 7,2.

b) Solución BS: Buffer + sales (pH 7,2)

• Para preparar 25 mL de la solución BS se debió pesar 1085 mg de HEPES y se

agregó una mínima cantidad de agua Milli-Q que permitió sumergir el detector

del electrodo del medidor de pH previamente calibrado. Posteriormente se agitó

con un magneto hasta obtener una total disolución.

• En agitación constante se ajustó pH agregando lentamente gotas de HCl al

37% p.a. hasta aproximarse a pH 7,8.

• Se agregó en agitación constante 74,6 mg de KCl, 380,4 mg de EGTA y 95,2

mg de MgCl2.

• Luego se diluyó HCl al 37% a discreción con agua Milli-Q para realizar ajuste de

pH y alcanzar un pH final de 7,2.

c) Solución Glicógeno (gli) 4 mg/mL

• Para una preparar una solución de 10 mL de gli se pesó 40 mg de glicógeno.

• Se llevó a un volumen final de 10 mL con solución de HEPES 50 mM (pH 7,2).


29

• Se tomaron alícuotas de 200 µL y se almacenaron refrigerados en tubos

eppendorf.

d) Solución glucosa-1-fosfato (G1P) 1 mM

• Para obtener una solución de 25 mL se pesó 9 mg de G1P.

• Se llevó a un volumen final de 25 mL con solución de HEPES 50 mM (pH 7.2).

• Se tomaron alícuotas de 230 µL y se almacenaron refrigerados en tubos

eppendorf.

e) Solución de enzima GPa 100 μg/mL

• Se pesó en un tubo eppendorf de 1 mL, 1 mg de GPa.

• Se traspasó lentamente a un matraz de aforo de 5 mL con 4 porciones de 1000

μL de HEPES 50 mM (pH 7,2).

• Se aforó con HEPES 50 mM (pH 7,2) y se homogenizó lentamente sin agitar.

• Se tomaron alícuotas de 50 μL, las cuales fueron puestas en tubos eppendorf,

luego se adicionaron 50 μL de HEPES 50 mM (pH 7,2) y se homogenizó

lentamente sin agitar. Finalmente los tubos fueron refrigerados a -20ºC.

F) Medio de detención (SD):

• Se pesaron 1000 mg de molibdato de amonio tetrahidratado y 38 mg de

verde malaquita, los cuales fueron disueltos en 100 mL de HCl 1M.

G) Solución de EET 42 mg % (muestra):

• Para preparar 50 ml se pesaron 21, 5 mg del EET y se disolvió en 50 mL de

DMSO.


30

5.2.- Protocolo del ensayo de evaluación de la actividad inihibidora de la GPa

Todos los ensayos se realizaron en triplicado.

I.- Blanco

Se prepararon en dos tubos eppendorf de 1 mL soluciones blanco que

contenían:

1. 75 μL de BS

2. 150 μL de B

3. 25 μL de DMSO

4. 750 μL de SD

Posteriormente se leyó a 620 nm en espectrofotómetro (UV/Visible Unicam

UV3) en dos celdas (referencia y lectura) y se calibró el equipo a cero base.

II.- Control negativo (CN):

A partir de la solución de GPa 100 μg/mL se preparó un volumen de solución

enzimática de 30 μg/mL con solución B, suficiente para la evaluación de todas las

muestras (en triplicado). Se debió mantener la solución enzimática en frío.

En un tubo eppendorf se adicionó (en el mismo orden):

1. 75 μL de BS

2. 62,5 μL de Gli

3. 25 μL de DMSO

4. Se homogenizó con pipeta

5. 62,5 μL de G1P

6. 25 μL de GPa 35 μg/mL


31

7. Se cronometró y esperó 20 minutos

8. 750 μL de SD


10. Se leyó a 620 nm

Para proceder al siguiente paso, la absorbancia debió ser superior a 0,600 e

inferior a 0,800.

III.- Control no enzimático (CNE):

Para determinar la absorbancia de fosfato residual. Se leyó y registró la

absorbancia a 620 nm 5 minutos después de preparar en tubos eppendorf soluciones

que contenían:

1. 75 μL de BS

2. 150 μL de B

3. 25 μL de solución de EET 83 mg%

4. 750 μL de SD

IV.- Evaluación de la actividad inhibidora de la GPa del EET

Tal como fue señalado anteriormente, se procedió en triplicado en tubos

eppendorf de la siguiente forma siguiendo el mismo orden:

1. 75 μL de BS

2. 62,5 μL de Gli

3. 25 μL de solución de EET 83 mg%

4. Se Homogenizó con pipeta evitando salpicaduras

5. 62,5 μL de G1P

6. 25 μL de GPa 30 μg/mL

7. Se cronometró y se esperó 20 minutos

8. 750 μL de SD


32


10. Se leyó a 620 nm

Todo el protocolo se encuentra resumido en la TABLA 11, como se muestra a

continuación:

TABLA 11: Protocolo de trabajo del ensayo de inhibición de la enzima GPa

Blanco Control no enzimático

Control negativo

Muestra

Primera

etapa

BS 75 μL 75 μL 75 μL 75 μL

B 150 μL 150 μL --- ---

DMSO 25 μL --- 25 μL ---

Muestra --- 25 μL --- 25 μL

Gli --- --- 62,5 μL 62,5 μL

Preparar cronómetro

Segunda etapa

G1P --- --- 62,5 μL 62,5 μL

GPa --- --- 25 μL 25 μL

Cronometrar 20 minutos

Tercera etapa

SD

750 μL

750 μL

750 μL

750 μL

Cronometrar 5 minutos

Leer a 620 nm


33

V.- Obtención de los resultados

El porcentaje de inhibición de la GPa fue calculado de la siguiente

manera:

• Primero se calculó la absorbancia (A) corregida:

A corregida= A muestra - A Control fosfato

• Luego el % de actividad de la enzima :

% Actividad= (A corregida / A control negativo)*100

• Para finalizar el % de inhibición enzimática:

% Inhibición = 100 - % Actividad

RESULTADOS Y DISCUSIONES

34

VI.- RESULTADOS Y DISCUSIONES

1.- Estudios químicos 1.1.- Obtención del EET

De la extracción de las hojas secas y molidas de B. globosa recolectada en el

Campus Antumapu de la Universidad de Chile, RM, Santiago, en la época de verano,

se obtuvo el EET con un 8,4% de rendimiento. Si se comparan estos resultados con los

reportados por Goîty (2007), donde en dicha ocasión el material vegetal fue

recolectado en el sector de Padre Las Casas, Temuco, IX Región, obteniéndose en

dicha oportunidad un EET con un rendimiento de 9,0%, además de EHEX y EDCM con

rendimientos de 2,7% y 1,8% respectivamente (FIGURA 5). Estos resultados revelaron

que no existen grandes variaciones entre el material recolectado en la RM en

comparación al obtenido en la IX Región, sin embargo cabe destacar que esto no

permite concluir que la variación geográfica no influye en la abundancia de los

compuestos activos de los extractos.

1 1

d

v

r

p

e

m

m

FIGURA 5:

1.2.- Defeca

1.2.1.- Defe El pr

del contenid

verbascósid

resultó basta

A pe

purificación

eluída junto

misma pola

medida 7-O

An

Material vR

Material R

Material vR

Esquema c

ación y frac

cación del

roceso de d

do de cloro

o y 7-O-gluc

ante bajo (52

esar del baj

del verbasc

o a los princ

ridad donde

O-glucósido

ntumapu-RMVERAN

1,94 Kg de

vegetal agotaRendimiento

vegetal agoRendimiento

vegetal agotRendimiento

comparativoactivo

ccionamient

EET

efecación re

ofila, lo cua

cósido de lu

2,3·%)

jo rendimie

cósido, debi

cipios activo

e obteníamo

de luteolina

M-STGONO

hojas

ado con Hexo: 2,1%

otado con DCo: 1,4%

tado con ETo: 8,4%

o de los renos seriados

to del EET

esultó basta

al permitió

teolina. Sin

nto, la defe

do a que la

os a la pola

os las fraccio

a, esto perm

xano

CM

TOH

RE

ndimientos de matico

ante efectivo

facilitar el

embargo el

ecación fue

a clorofila an

ridad de Ac

ones ricas e

mitió que o

Padre Las

1

Material veR

Material vR

Material vR

ESULTADOS

de los difer

o en relación

proceso de

rendimiento

efectiva, y

ntes de este

cOEt al 100

en verbascó

obtuviéramos

Casas-IX RVERANO

1,00 kg de h

egetal agotaRendimiento

vegetal agotRendimiento

vegetal agotaRendimiento

S Y DISCUSIO

rentes extra

n a la dimin

purificación

o de este pro

ya que facil

e tratamient

0%, es decir

ósido y en m

s fracciones

Región- TemOhojas

ado con Hexa: 2,7%

tado con DC: 1,8%

ado con ETO: 9,0%

ONES

35

actos

ución

n del

oceso

itó la

o era

r a la

menor

s con

muco

ano

CM

OH


36

ausencia total de clorofila que se purificaban con mayor facilidad por las CC de

Sephadex LH-20.

1.2.2.- Fraccionamiento del EET

El fraccionamiento del EET en CC de gel de sílice llevó a la obtención de

verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina a partir de las fracciones eluídas con AcOEt

100% hasta AcOEt: MeOH 95:5 (TABLA 6).

De la CC3Sil se obtuvieron 305,2 mg de fracciones ricas en verbascósido, las

cuales fueron sometidas a un nuevo fraccionamiento en la CC4Seph consiguiendo

106,7 mg de verbascósido y 75,6 mg de 7-O-glucósido de luteolina. Los 106,7 mg de

verbascósido se purificaron en una nueva columna de Sephadex LH-20 (CC5Seph),

obteniéndose 72,4 mg de verbascósido puro (TABLA 8).

2.- Análisis cuantitativo del EET 2.1.- Diseño de la metodología HPLC

El trabajo con HPLC permitió visualizar los compuestos presentes en el EET.

Cabe destacar que se logró establecer en este estudio las mejores condiciones para el

trabajo en HPLC, probando diferentes fases móviles, solvente muestra, flujos y

longitudes de onda.

Se pudo constatar que la fase móvil así como el solvente del EET adquirieron

notable importancia en la resolución de los peak, mejorando considerablemente la

apariencia de éstos.

Como conclusión se determinó que las mejores condiciones fueron:


37

• Flujo : 0,5 mL/min

• Fase móvil : ácido fórmico 0,1%: acetronitrilo = 70: 30

• Solvente muestra : MeOH 100%

• Longitud de onda : 365

2.2.- Perfil cromatográfico del EET (HPLC):

Después de determinar las mejores condiciones para trabajar en el HPLC se

estableció el perfil cromatográfico para el EET (recolectado en el campus Antumapu) y

se comparó con el EET obtenido en Padre Las Casas, Temuco, IX Región. Las señales

fueron asignadas según patrones obtenidos anteriormente en el fraccionamiento del

EET.

Los resultados se muestran a continuación en las FIGURAS 6 y 7.

FIGURA 6: Cromatograma HPLC para el EET obtenido en Padre Las Casas (EET 1,58 mg/mL, en MeOH 100% a 365nm)

verbascósido7-O-glucósido de luteolina


38

FIGURA 7: Cromatograma HPLC para el EET obtenido en el campus Antumapu (EET 1,87 mg /mL, en MeOH 100% a 365nm)

Los tiempos de retención (Tr) del verbascósido y 7-O-glucósido para los EET

obtenidos desde hojas recolectadas en distintas localidades fueron similares, por ende

podemos concluir que no se observaron diferencias significativas entre el perfil

cromatográfico de los EET recolectadas en distintas regiones.

2.3.- Valoración del verbascósido expresado en ácido cafeico por metodología HPLC 2.3.1.- Curva de calibración del ácido cafeico

El ácido cafeico (180,15 g/mol) fue empleado como estándar para expresar el

contenido de verbascósido (feniletanoide) presente en el extracto. Se estableció por

regresión lineal la ecuación que representa la curva de calibración como se muestra a

continuación en la TABLA 12 y en la FIGURA 8.

verbascósido

7-O-glucósido de luteolina


39

TABLA 12: Valores de concentración versus área empleados en la curva de calibración del ácido cafeico

Concentración (ppm) Área Promedio

115,625 1523533

1862819,7 1985404

2079522

321,25 4152639

4033562,7 3990560

3957489

462,5 6839473

6983903,7 7081817

7030421

925 15630371

14636158 13920577

14357527

1850 28318420

29064993 28769850

30106708


40

FIGURA 8: Curva de calibración del ácido cafeico

2.3.2.- Valoración del verbascósido expresado en ácido cafeico

Para evaluar la cantidad del verbascósido presente en EET se inyectó 20 µL del

extracto a una concentración de 1,58 mg/mL en triplicado y se obtuvo un promedio de

integración de las áreas de los cromatogramas de 9329386, posteriormente

reemplazando este valor en la curva de calibración del ácido cafeico se obtuvo una

cantidad de 0,61 mg/mL de verbascósido expresado en ácido cafeico.

3.- Evaluación de la cesión de verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina

3.1. Determinación de la cesión del verbascósido

Con el objetivo de evaluar la cesión del verbascósido desde el gel elaborado en

base al EET, se llevó a cabo la primera evaluación de la cesión del gel de EET al 1% y

y = 15966x - 416796R² = 0,9985

-5000000

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

30000000

35000000

40000000

0 500 1000 1500 2000

Àre

a

Concentración ppm

Curva Ácido caféico


41

del gel de ácido cafeico al 1% (FIGURA 10). Las muestras obtenidas fueron analizadas

por HPLC.

Los cromatogramas de las muestras se compararon según los tiempos de

retención (Tr) con los cromatogramas del patrón de ácido cafeico y el gel vehículo

(blanco) demostrando que sólo el ácido cafeico es capaz de atravesar la membrana a

todos los tiempos evaluados, a diferencia del gel de EET que sólo presentó la señal del

gel base (FIGURA 9 y10).

Los resultados obtenidos para el verbascósido coinciden con los resultado de

un ensayo in vitro realizado por Marti-Mestres et al. (2006), ellos evaluaron la cesión

del verbascósido en orejas de cerdo, demostrando que éste no es absorbido y queda

retenido en las primeras capas de la piel. Además teniendo en cuenta que moléculas

con pesos moleculares mayores a 500 no atravesarían la piel y como antecedente

previo se sabe que el verbascósido posee un peso molecular de 624,6 g/mol, resulta

razonable que éste no sea capaz de penetrar la piel, es por esto que se decidió evaluar

la cesión del ácido cafeico, ya que postulamos que lo más probable que ocurra in vivo

sea una hidrólisis del verbascósido mediada por enzimas cutáneas generando ácido

cafeico y este último , quien fue capaz de atravesar la membrana in vitro (FIGURA 10),

sería en parte el compuesto responsable de la actividad farmacológica del EET.

FIGURA 9

9: Cromatoggramas patrrón ácido c

RE

cafeico y ge

ESULTADOS

l vehículo c

S Y DISCUSIO

carbomer u

Patrón

cafe

Tr= 8, 261

Gel veh

Carbome

-Tiempo

30 min.

-Tr= 6, 161

ONES

42

ltra

ácido ico

min

hículo er ultra

muestra:

1 min.


43

FIGURA 10: Cromatogramas gel de EET al 1% y gel de ácido cafeico al 1%

Gel de EET 1%

-Tiempo muestra:

60 min.

-Tr= 6, 166 min.

Gel ácido cafeico

1%

-Tiempo muestra:

60 min.

-Tr= 6, 674 min.

-Tr= 8,261 min.


44

3.2. Determinación de la cesión del 7-O-glucósido de luteolina

Debido a los resultados obtenidos en la primera evaluación y con el afán de

encontrar algún otro marcador diferente al verbascósido que fuese cedido por el gel de

EET, se decidió aumentar la concentración del EET en el gel a un 10% y probar

también con un gel de 7-O-glucósido de luteolina al 1%. Los resultados también fueron

negativos a todos los tiempos, ya que tanto el gel de EET al 10% como el gel de 7-O-

glucósido de luteolina al 1% presentaron sólo el peak del gel base, sin embargo en la

situación del 7-O-glucósido de luteolina, flavonoide que presenta un peso molecular de

448,8 g/mol, no se puede descartar que atraviese la piel in vivo.

4.- Ensayo de inhibición de la enzima Glicógeno fosforilasa (GPa)

Los resultados del ensayo se muestran en la TABLA 13 a continuación.


45

TABLA 13: Resultados del ensayo de inhibición de la GPa

Absorbancia (A)

Promedio

Control negativo

0,735

0,730 0,764

0,691

EET 42 mg %

0,414

0,405 0,354

0,446

Control fosfato

0,029

0,041 0,005

0,088

A corregida 0,364

% Actividad 49,9 %

% Inhibición EET 50,1 %

Los resultados demostraron que el EET presenta un efecto inhibidor de la GPa.

Esta actividad no se había determinado antes para B. globosa. Éste es un resultado

novedoso que abre las puertas a posteriores estudios para las hojas de esta especie

en el ámbito de cuadros hiperglicémicos y del síndrome metabólico.

Como se evaluó sólo el EET no se puede responsabilizar de este efecto a los

principales compuestos de él (verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina), por lo tanto,

se deberían probar los compuestos aislados por separado y evaluar nuevamente la

potencial inhibición de GPa.

CONCLUSIONES

46

VII.- CONCLUSIONES

• El rendimiento del los EHEX, EDCM y EET, obtenidos de las hojas recolectadas

en la localidad de Padre Las Casas, IX Región, no presentaron grandes variaciones en

comparación a los extractos obtenidos de las hojas recolectadas en el Campus

Antumapu de la Universidad de Chile, RM, sin embargo esto no implica que la

variación geográfica no influya en la abundancia de los metabolitos secundarios

activos.

• La defecación es una buena técnica para eliminar la clorofila y de este modo

facilitar la purificación del verbascósido y del 7-O-glucósido de luteolina, sin embargo el

proceso presentó un bajo rendimiento.

• No se apreciaron cambios significativos en los perfiles cromatográficos del EET

obtenido de las hojas recolectadas en el campus Antumapu en comparación al

obtenido de las hojas recolectado en el sector de Padre Las Casas.

• El verbascósido no es capaz de atravesar una membrana semipermeable, a

diferencia del ácido cafeico que si puede hacerlo. Por lo tanto, postulamos que in vivo

lo más probable que ocurra una hidrólisis del verbascósido liberando de este modo al

ácido cafeico, quien generaría el efecto farmacológico.

• El 7-O-glucósido de luteolina no es capaz de atravesar una membrana

semipermeable, pero esto no asegura que in vivo no sea capaz de atravesar la piel

• El EET es capaz de inhibir (50,1%) a la glicógeno fosforilasa, lo que

demostraría que EET podría presentar efecto hipoglicemiante, pero lo más adecuado

sería evaluar los principales componentes aislados del EET de B. globosa para

determinar los responsables de la actividad.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

47

VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

APABLAZA C. “Diseño de la estandarización química y evaluación de la actividad

analgésica tópica de un extracto activo de Buddleja globosa Hope, Buddlejaceae,

matico”. Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico. Santiago, Chile.

Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, 2006.

ARAYA P., Mora J., Blemith., Rubio B., Correa O., Costa E., Salgado A., Evaluación de

un gel de matico versus placebo como agente profiláctico de la radioepitelitis en

pancientes con cáncer de mama que reciben radioterapia. En: XIII Congreso

latinoamericano de mastología y VII Congreso Chileno de Mastología, noviembre 2005,

Santiago, Chile.

BACKHOUSE N., Rosales L., Apablaza C., Erazo. S., Negrete R., Theodoluz C.,

Rodríguez J., Delporte C. 2008a. Analgesic, anti-inflammatory and antioxidant

properties of Buddleja globosa, Buddlejaceae. J Ethnopharmacology 116(2): 263-269.

BACKHOUSE N, Delporte C., Apablaza C., Farías M., Goïty L., Arrau S., Negrete R.,

Castro C., Miranda H. 2008b. Antinociceptive activity of Buddleja globosa (matico) in

several models of pain. J Ethnopharmacology 119: 160-165.

CAMPOS A. y Lissi E. Evaluation of the Antioxidant Capacity of Herbal Teas by a

Procedure Based on the Bleaching of ABTS Radical Eations. Boletin de la Sociedad

Chilena de Quimica 40: 375-381, 1995.

DUBBER M. y Kanfer I. High-performance liquid chromatographic determination of

selected flavonols in Ginkgo biloba solid oral dosage forms. J.Pharmaceut Sol 7(3):303-

309, 2004.


48

GOÌTY L. “Estudio químico y farmacológico de un extracto activo de Buddleja globosa

Hope, Buddlejaceae, matico y diseño de la metodología analítica”. Memoria para optar

al título de Químico Farmacéutico. Santiago, Chile. Universidad de Chile, Facultad de

Ciencias Químicas y Farmacéuticas, 2007.

HARBORNE J., and Williams C. Leaf survey of flavonoids and simple phenols in the

genus Rhododendron. Phytochemistry 10:2727-2744, 1971.

HOUGHTON P.J. y Hikino H. Anti-hepatotoxic activity for extracts and constituents of

Buddleja species. Planta Med. 55(2): 123-6, 1989.

HOUGHTON P.J. Ethnopharmacology of some Buddleja species. J. Ethnopharmacol.

11(3): 293-308, 1984.

HOUGHTON P.J., Woldemariam T.Z., Candau M., Barnardo A., Khen Alafu O.,

Shangxiao L. Buddlejone, a diterpene from Buddleja albifora. Phytochemistry 42(2):

485-488, 1996.

LIAO Y., Houghton, P.J., Hoult, J.R.S. Novel and known constituents from Buddleja

species and their activity against leukocyte eicosanoid generation. J.Nat.Prod. 62(9):

1241-45, 1999.

LÓPEZ J., Sierra M., Vegazo E. and Cortés, M. Chemical Constituents of Buddleja

globosa Lam. Fitoterapia: 50(5):195-8, 1979

MARIN G., Jiménez B., Cortés M., Pardo F., Núñez J. y Naranjo J. Estudio

Fitoquímico de Buddleja globosa Lam. (Buddlejaceae). Revista Latinoam. Quim.

10(1):19-21, 1979.

MARTI-MESTRES G., Mestres J.P., Bres J., Martin S., Ramos J. The in vitro

percutaneous penetration of three antioxidant compounds. Journal of Pharmaceutics

331: 139-144, 2007.


49

MARTIN W. H.; Hoover, D. J.; Armento, S. J.; Stock, I. A.; McPherson, R. K.; Danley,

D. E.; Stevenson, R. W.; Barrett, E. J.; Treadway, J. L. Discovery of a human glycogen

phosphorylase inhibitor that lowers blood glucose in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

1998, 95, 1776 – 1781.

MENSAH A., Hougthon P., Hughes M., Cherry G. In vitro investigation of the wound-

healing properties of Buddleja globosa. J. Pharm. Pharmacol, 50:83, 1998.

MENSAH A. Y., Sampson P. J., Houghton P., Hylands P.J., Westbrook J., Dunn M.,

Hughes M.A., Cherry G.W. Effects of Buddleja globosa leaf and its constituents

relevant to wound healing. J. Ethnopharmacol. 77: 219-226, 2001.

MIRANDA D., Delporte C., Fernández M., Backhouse N. Evaluación de las

propiedades cicatrizantes de Buddleja globosa Hope. V reunión Latinoamericano de

Fitoquímica. I congreso latinoamericano del MERCOSUR, noviembre, 2005,

Montevideo, Uruguay.

MORA J. “Estadarización y evaluación clínica de un preparado dermatológico a base

de Buddleja globosa hope para prevenir la radioepitelitis en pacientes con cáncer de

mama sometidos a radioterapia”. Memoria para optar al título de Químico

Farmacéutico. Santiago, Chile. Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacéuticas, 2006.

NAVAS L.E. Flora de la cuenca de Santiago de Chile, Tomo III, Ediciones de la

Universidad de Chile, 1979.

PARDO F., Perich, F., Torres, R. Un nuevo glicósido de Buddleja globosa con actividad

bactericida. Boletín de la Sociedad Chilena de Química 42(1):101-104, 1997.

PARDO F., Perich, F., Villarroel, L., Torres, R. Isolation of verbascoside, an

antimicrobial constituent of Buddleja globosa leaves. J. of Ethnopharmacol, 39:221-

222, 1993.


50

ROSALES L. “Estudio químico, evaluación de las actividades analgésica y

antiinflamatoria de un extracto farmacológicamente activo de Buddleja globosa Hope,

Buddlejaceae. Diseño de un preparado dérmico. Memoria para optar al título de

Químico Farmacéutico. Santiago, Chile. Universidad de Chile, Facultad de Ciencias

Químicas y Farmacétuticas, 2003.

ROSALES L., Backhouse N.,

Costa E., Miranda D., Fernández M., Correa O. Investigación de las propiedades

cicatrizantes de Buddleja globosa n.c. matico: Desarrollo de un preparado cicatrizante.

En: Congreso de Cosmética COLAMIC XVI COLAMIQC (Congreso Latinoamericano de

Químicos Cosméticos). 2003, Cartagena de Indias, Colombia.

RUBIO B., Jara G., Gallardo J., Costa E., Correa O., Bartsch V., Delporte C., Negrete

R., Erazo S., Backhouse N. Evaluación de la eficacia clínica de un preparado de

matico en pacientes con tratamiento quimioterápico que presentan eritrodisestesia

palmar– plantar. En: XV Congreso Chileno de Cancerología: III Jornadas de

Enfermería y III Jornadas de Química y Farmacia Oncológica. Septiembre 2004,

Valdivia, Chile.

SANABRIA-GALINDO A., Arciniega N., e Suarez I. Timol y carbacrol sustancias

responsables de la actividad antimicrobiana de Ageratina ibaguensis. Rev. Colombiana

de ciencias Químico-Facarmacéuticas 28: 83-88, 1999.

TRIM A., and Hill R., The preparation and properties of aucubin, asperuloside and

some related glycosides. J. Biochem. 50:310-319, 1952.

WAGNER H., Bladt S., Plant drug analysis: A thin layer chromatography atlas. Second

Edition. Berlin, Springer, 1996.

universidad de chile facultad de … de chile facultad de ciencias quÍmicas y farmacÉuticas...

Documents