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REVISTA MEXICANA DE MEDICINA DE LA

Volumen 1, número 3, enero-marzo 2009

Asociación Mexicana de Medicina de la Reproducción, A.C.

Dr. Gerardo Velázquez CornejoPresidente

Dr. Fernando Gaviño GaviñoVicepresidente

Dr. Ranferi Gaona ArreolaSecretario

Dr. Julio Francisco de la Jara DíazProsecretario


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Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 1, núm. 3, enero-marzo, 2009


Volumen 1, número 3, enero-marzo, 2009

CONTENIDO CONTENTS

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EDITORIAL

87 Gerardo Velázquez Cornejo

ARTÍCULO DE REVISIÓN

89 Reproducción asistida: a 30 años del primer nacimiento de fertilización in vitro

Alberto Kably Ambe, Sergio Estévez González

ARTÍCULOS ORIGINALES

96 Vitrificaciónencryotop,técnicadealtorendi-miento para la criopreservación de ovocitos humanos

Luis Arturo Ruvalcaba Castellón, Martha Isolina García Amador, José Medina Flores, Edgar Quiróz Torres, Rocío Martínez Armas

102 Sensibilidad de los canales de calcio depen-dientes de voltaje al pH intracelular en el espermatozoide humano capacitado. Efecto modulador del AMPc

Paloma del Carmen Neri Vidaurri, Víctor Torres Flores, Marco Tulio González Martínez

CASO CLÍNICO

109 Primer nacido vivo en México luego de trans-ferencia de embrión único obtenido a partir de cigotosvitrificados.Comunicacióndelcaso

Martha Isolina García Amador, Alejandro Chávez Badiola, José Medina Flores, Edgar Quiróz Torres, Rocío Martínez Armas, Luis Arturo Ruvalcaba Castellón

EDITORIAL

87 Gerardo Velázquez Cornejo

REVIEW ARTICLE

89 Assistedreproduction:afterthirtyyearsofthefirstbirthofin vitro fertilization

Alberto Kably Ambe, Sergio Estévez González

ORIGINAL ARTICLES

96 Vitrificationincryotop,highperformancetech-niqueforcrypreservationofhumanoocytes

Luis Arturo Ruvalcaba Castellón, Martha Isolina García Amador, José Medina Flores, Edgar Quiróz Torres, Rocío Martínez Armas

102 Voltage-dependent calcium channels’ sensitivi-tyyointracellularpHinthecapacitatedhumansperm. cAMP mudulator effect

Paloma del Carmen Neri Vidaurri, Víctor Torres Flores, Marco Tulio González Martínez

CLINICAL CASE

109 First alive born in Mexico after transfer of uni-queembryoobtainedfromvitrifiedzygotes.Areport of the case

Martha Isolina García Amador, Alejandro Chávez Badiola, José Medina Flores, Edgar Quiróz Torres, Rocío Martínez Armas, Luis Arturo Ruvalcaba Castellón

87Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 1, núm. 3, enero-marzo, 2009

Editorial

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción 2009;1(3):87

Este número de la Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción está conformado por dos artículos originales, un artículo de revisión y un caso clínico.

El trabajo de investigación se refiere a la vitrificación en cryotop, técnica de alto rendimiento para la criopre-servación de ovocitos humanos. Esta contribución tuvo como propósito describir la evolución de 1,191 ovocitos humanos propios y donados luego de vitrificación en cryotop, en un centro de reproducción asistida. Este estu-dio reporta tasas de supervivencia, fertilización y clivaje comparables con las reportadas por otros autores para la vitrificación de ovocitos humanos, independientemente del dispositivo utilizado para el depósito final de éstos. La proporción de embarazos es similar a la informada para ciclos en fresco, transferencia de embriones obteni-dos a partir de ovocitos propios, donados o vitrificados. Llama la atención que, hasta ahora, los nacidos luego de un proceso de vitrificación de ovocitos, al parecer tienen incidencia de anomalías congénitas no mayor que la de los nacidos de embarazos espontáneos en mujeres férti-les. Es indudable que aún hace falta más investigación al respecto, con mayor cantidad de material de estudio y con una metodología más compleja que aumente su nivel de evidencia. Es loable el interés de los grupos mexicanos de infertilidad no sólo en la atención de pacientes, sino en reportar sus experiencias para hacerlas del conocimiento de la comunidad médica internacional.

El otro artículo resultado de una investigación original versa sobre la sensibilidad de los canales de calcio depen-dientes de voltaje al pH intracelular en el espermatozoide humano capacitado. Este ensayo tuvo como propósito examinar la repercusión de incrementar el AMPc intra-celular con el inhibidor de fosfodiesterasas papaverina,

y cuantificar el aumento de la concentración del calcio intracelular inducido con progesterona. Los autores de este trabajo consideran que los bioensayos con esperma-tozoides no capacitados incubados con papaverina, para la inseminación de ovocitos de mamíferos inferiores, abren camino para que puedan usarse en pacientes con astenozoospermia o biopsia testicular con fines de repro-ducción asistida, en donde por lo general se administra pentoxifilina con tiempos más largos de incubación.

El artículo de revisión es una visión retrospectiva de 30 años de reproducción asistida. Más allá de su valor histórico, es una fuente de información bibliográfica importante para quienes se incian en el estudio de la especialidad en reproducción humana. La lectura de este trabajo permitirá al lector percatarse que la evolución en tres décadas ha sido por demás impresionante, no sólo por el número de investigadores que esta especialidad ha atraído, sino también por sus logros y el refinamiento de sus técnicas.

El caso clínico es de una paciente con esterilidad pri-maria de cinco años de evolución y es el reporte del primer embarazo en México a partir de cigotos vitrificados. Esto demuestra que la vitrificación es una técnica útil para la criopreservación de tejidos, ovocitos, cigotos y blastocis-tos, entre otros, con tasas de recuperación exitosas.

Aprevechamos la oportunidad para reiterarles que la continuidad de nuestra Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción es una responsabilidad que nos compete a todos los que nos dedicamos a la reproducción humana. La del editor está limitada a la respuesta y venebolencia de quienes asumen su compromiso de fortalecer y aportar para que nuestra publicación alacance pronto el recono-cimiento que esperamos.

Dr. Gerardo Velázquez CornejoEditor

La versión completa de este artículo también está disponible en: www.revistasmedicasmexicanas.com.mx


Artículo de revisión

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción 2009;1(3):89-95

Alberto Kably Ambe,* Sergio Estévez González*

Reproducción asistida: a 30 años del primer nacimiento de fertilización in vitro

RESUMEN

La hiperestimulación ovárica controlada se creó para obtener una mayor cantidad de ovocitos y un número adecuado de embriones de buena calidad para transferir. En un principio hubo estimulaciones exageradas en las que se capturaban más de 20 óvulos, ya que las técnicas de micromanipulación como la inyección intracitoplasmática y la eclosión asistida eran deficientes; por tanto, se ha buscado la estimulación óptima que incluye: el estudio clínico de la mujer y pruebas de laboratorio y gabinete. Es importante descartar enfermedades que interfieran en el desarrollo de la estimulación ovárica, como el hipogonadismo hipogonadotrófico, hiperprolactinemia, hipotiroidismo y trastornos de la alimentación como la obesidad y la anorexia. La tendencia es buscar medicamentos de depósito que permitan disminuir el número de aplicaciones a la paciente y hacer un protocolo más accesible, por lo que se encuentra en desarrollo una hormona denominada coriofolitropina. La tendencia será regresar a la no estimulación, en cuanto sea más eficaz la selección del embrión a transferir y se incremente la tasa de embarazo. La captura de ovocitos por vía transvaginal, con guía ultrasonográfica, ha demostrado ser altamente efectiva, rápida e inocua. Gracias a la técnica PICSI se han logrado mejores índices de fertilización en parejas con falla en la fertilización o bloqueo de embriones o para aquellas con un factor masculino severamente dañado. En la actualidad se busca reducir el número de embriones a transferir sin afectar la tasa de embarazo, sobre todo si la transferencia se realiza entre los días 3 y 5. Durante estos 30 años se ha demostrado la necesidad del soporte de la fase lútea. Actualmente se encuentran en estudio métodos de depósito para hacer más sencilla su aplicación.Palabras clave: reproducción asistida, hiperestimulación ovárica controlada.

ABSTRACT

Controlled ovarian hyper-stimulation was created to obtain a higher quantity of ovocytes and an adequate number of embryos of good quality to transfer. At the beginning there were exaggerated stimulations in which more than 20 ovules were captured, because micro-manipulation techniques such as intracytoplasmic injection and assisted hatching were deficient; thus, optimal stimulation has been searched including: the clinical study of women and lab tests. It is important to underline diseases interfering in the developing of ovarian stimulation, such as hypogonadotrophic hypogonadism, hyperprolactinemia, hypothyroidism and eating disorders, such as obesity and anorexia. The trend is to look for depot drugs leading to diminish the number of applications to the patient and to do a more accessible protocol, thus a hormone denominated corifollitropin is under development. The trend will be to return to no-stimulation, when the selection of embryo to transfer is more efficient and pregnancy rate increases. Ovocytes capture by vaginal way, with ultra-sonographic guide, has been demonstrated to be highly effective, quick and safe. Due to the technique PICSI, better fertilization rates have been reached in couples with fertilization failure or embryo blocking or for those couples with a severely damaged male factor. Nowadays the purpose is to reduce the number of embryos to transfer without affecting pregnancy rate, especially if transfer is done between days 3 and 5. During these 30 years it has been demonstrated the need of luteal phase support. Currently depot methods to do simpler its application are under study.Keywords: assisted reproduction, controlled ovarian hyper-stimulation.

* Centro Especializado para la Atención de la Mujer, Unidad de Reproducción Asistida, Hospital Ángeles de las Lomas.

Correspondencia: Dr. Alberto Kably A. Hospital Ángeles de las Lomas. Avenida Vialidad de la Barranca s/n, colonia Valle de las Palmas, Huixquilucan, Estado de México, 52763.Recibido: septiembre, 2008. Aceptado: diciembre, 2008.

Este artículo debe citarse como: Kably AA, Estévez GS. Repro-ducción asistida: a 30 años del primer nacimiento de fertilización in vitro. Rev Mex Reprod 2009;1(3):89-95.La versión completa de este artículo también está disponible en: www.revistasmedicasmexicanas.com.mx

HIPERESTIMULACIÓN OVÁRICA CONTROLADA

Hace tres décadas nació Luis Brown, producto de un ciclo natural sin estimulación, cuando sólo existía experiencia para la inducción de ovulación técnica destinada a pacientes con anovulación. Sin embargo, al poco tiempo se creó la hiperestimulación ovárica contro-lada para obtener una mayor cantidad de ovocitos y un número adecuado de embriones de buena calidad para


Kably Ambe A y Estévez González S

ción de más ovocitos maduros. Al poco tiempo surgió la duda de probables contaminantes y la relación de los mismos en la variación de la respuesta a la estimulación, aun en la misma paciente con los mismos medicamentos, creando las gonadotropinas altamente purificadas que inclusive separan la FSH de la LH, aunque en la mayoría de los casos se administraban a la paciente incluso con la misma jeringa y al mismo tiempo.9

Sin embargo, el incremento masivo de estos proce-dimientos generó una demanda que con el tiempo se volvería imposible cubrir, además de que se creyó que existía una variación entre los lotes de producción. Como respuesta, se crearon nuevas gonadotropinas con tecno-logía recombinante que han demostrado más grado de inocuidad, estar libres de reacciones alérgicas e incluso dar mejores resultados en pacientes con mala respuesta, como las mujeres mayores o quienes no respondieron adecuadamente con las menotropinas. No obstante, con el tiempo, en diversos metanálisis acerca de la administra-ción de menotropinas, menotropinas altamente purificadas o gonadotropinas, e inclusive en la LH recombinante,10,11 la tasa de embarazo no se ha modificado.

Durante todos estos años, la tendencia es buscar medi-camentos de depósito que permitan disminuir el número de aplicaciones a la paciente y hacer un protocolo más accesible, por lo que se encuentra en desarrollo una hor-mona denominada coriofolitropina con una vida media hasta de siete días, que sustituya al menos cinco días de inyecciones de FSHr y demuestre la misma tasa de embarazo en relación con los protocolos con FSHr.12

Durante años de estudio se ha confirmado que la respuesta a la estimulación ovárica no es dosis-depen-diente, sino que se relaciona con el tipo de paciente y, específicamente, con el tipo de receptores que tiene para las gonadotropinas. Éstos son estudios caros y muy específicos, que sólo serán importantes en las bajas o en las hiperrespondedoras, en el resto de las pacientes existe un consenso mundial a no superar la dosis diaria de 300 unidades, ya que no existe diferencia al respecto y sólo incrementa de manera notable el riesgo de padecer síndrome de hiperestimulación ovárica.13,14

La tendencia será regresar a la no estimulación, en cuanto sea más eficaz la selección del embrión a transfe-rir y se incremente la tasa de embarazo. Este hecho se ha estudiado por diversos autores para las mujeres de más

transferir. En un principio hubo estimulaciones exage-radas en las que se capturaban más de 20 óvulos, ya que las técnicas de micromanipulación como la inyección intracitoplasmática y la eclosión asistida se encontraban en etapas tempranas de desarrollo, eran poco efectivas y causaba daño a los óvulos, lo que provocaba bajas tasas de fertilización. Esto llevaba, a su vez, a la cancelación de un número importante de transferencias por falta de embriones para este fin.

Desde hace varios años se demostró que la estimu-lación exagerada generaba concentraciones de estradiol muy elevadas e interferían en la implantación del em-brión, por lo que se busca realizar una estimulación óptima. En general, se reporta que es suficiente la captura de 10 a 14 ovocitos; de éstos, generalmente se encuentran maduros 80% (metafase II).1,2

El primer paso para tener una estimulación óptima es el estudio clínico de la mujer, principalmente el patrón menstrual y el antecedente de cirugías ováricas dentro de la historia clínica; deben realizarse pruebas de labora-torio y gabinete para evaluar cualitativamente la reserva ovárica, número de folículos antrales, tamaño y volumen de los ovarios, las hormonas denominadas basales (folí-culo estimulante, luteinizante y estradiol); las cuales se realizan los primeros días del ciclo menstrual (días 2 a 4). Todo lo anterior será suficiente para predecir una falla ovárica, una baja respuesta o una respuesta exagerada, como sucede con las pacientes que padecen síndrome de ovarios poliquísticos.3-5

Si bien existen hormonas ligeramente más específicas para una hiperrespuesta, como la hormona antimülle-riana, es importante considerar que a diferencia del conteo de folículos antrales, su determinación tiene un costo elevado y es difícil de reproducir,6 por lo que se le descarta como estudio de tamizaje.7

También es importante descartar otras enfermeda-des que interfieran en el desarrollo de la estimulación ovárica, como el hipogonadismo hipogonadotrófico, hiperprolactinemia, hipotiroidismo y trastornos de la alimentación como la obesidad y la anorexia.8

Para lograr este objetivo fue necesario un mayor re-clutamiento y desarrollo de folículos antrales, por lo que se creó la extracción de gonadotropinas urinarias de mu-jeres menopáusicas, de ahí el nombre de menotropinas, se purifican en laboratorio, logrando al inicio la obten-


edad con baja respuesta a la estimulación, y otros con la idea de capturar ovocitos y llevar a cabo la maduración in vitro, que ha mostrado muy buenos resultados.15

Captura de ovocitos Al inicio fue uno de los principales problemas de las técnicas de alta complejidad, ya que este paso necesitaba una cirugía mayor, incluso por medio de una laparotomía generaba el subsecuente riesgo anestésico y un tiempo largo de recuperación posquirúrgico. Con la invención de la laparoscopia, se acortó el tiempo de recuperación y el procedimiento fue menos doloroso, pero se agregaron nuevos riesgos generados por el proceso endoscópico como el enfisema o las lesiones vasculares en órganos ad-yacentes. La creación de la captura transvaginal con guía ultrasonográfica fue uno de los mayores avances en la reproducción asistida, hecho que también permitió saber que la probabilidad de capturar un ovocito metafase II es mayor cuando el diámetro del mismo es igual o mayor a 18 mm. Difícilmente se considera una nueva forma de capturar los ovocitos, puesto que en la actualidad la vía transvaginal, con guía ultrasonográfica, ha demostrado ser altamente efectiva, rápida e inocua, prácticamente sin complicaciones en manos experimentadas. Los últimos avances se encuentran en el material y la forma de las agujas transvaginales para este procedimiento, cada vez más refringentes al ultrasonido y más delgadas, lo que facilita capturar ovocitos para maduración in vitro, donde los folículos son más pequeños.16

La adición de nuevas tecnologías al ultrasonido, como el uso de Doppler a color para valorar la vascularidad perifolicular, únicamente ha demostrado una mayor probabilidad de capturar un ovocito en un folículo mejor irrigado, pero no influye en la calidad, grado de madurez o potencial reproductivo.17 El Doppler de poder con medición de los flujos vasculares, como el índice de resistencia, aún se encuentra en experimentación y des-afortunadamente con resultados poco alentadores.18 Por lo anterior, la captura ovocitaria es uno de los procesos que ha experimentado más cambios durante estos años pero que difícilmente mostrará mayor evolución.

MicromanipulaciónLa inyección intracitoplásmica de espermatozoides (ICSI) fue el inicio de la micromanipulación de gameto

y durante todo este tiempo la evolución se encuentra destinada a nuevas técnicas para la selección adecuada del espermatozoide a inyectar; se ha demostrado que a pesar de tener una clasificación de criterio estricto (Kruger), dentro de parámetros normales, existen parejas con falla en la fertilización o bloqueo de embriones.19 Para este tipo de parejas o para aquellas con un factor masculino severamente dañado, es necesario otro tipo de selección en relación con el grado de fragmentación del ADN.20 Con este objetivo existe una propuesta para utilizar una nueva técnica denominada PICSI, que consiste en nuevas cajas de Petri que contienen gotas de hialuron, en las que se selecciona el espermatozoide a inyectar de la siguiente manera: se vierte la muestra seminal capacitada en estos discos en donde los esperma-tozoides con menor fragmentación del ADN se adhieren al hialuron y son los que se seleccionan para realizar la inyección intracitoplasmática de un espermatozoide. Gracias a esta tecnología se han logrado mejores índices de fertilización en este tipo de pacientes.

La eclosión asistida (denominada assisted hatching en inglés) fue el siguiente paso importante en la mi-cromanipulación. Al inicio se realizaba de manera mecánica, con el tiempo se sustituyó con la química; sin embargo, el procedimiento requiere un gran adies-tramiento para poder llevarlo a cabo. En esta técnica suele emplearse tecnología nueva como el láser, el cual sólo necesita programarse con una computadora, por lo que es más fácil y nítido el corte. Gracias a esto ya no es necesaria la curva de aprendizaje que normalmente existía en un embriólogo. Seguramente en un futuro cercano demostrará su utilidad incrementando la tasa de embarazo.

Otra avance de gran importancia fue el desarrollo del diagnóstico de preimplantación. Se pensó que sería la solución al problema de las parejas no sólo con padecimientos genéticos hereditarios o con riesgo incrementado durante el embarazo (como las mujeres mayores de 37 años), sino también algunas con otros padecimientos como la pérdida gestacional recurrente (tres o más abortos) o falla en la implantación (trans-ferencia de seis o más embriones de buena calidad sin lograr implantación). Pero el estudio genético de una o dos células al embrión previo a su implantación es un proceso difícil de realizar, por lo que es necesario un




número adecuado de embriones, algo sumamente difícil debido a que, como ya se mencionó, este procedimiento se realiza en mujeres mayores de 37 años y bajas res-pondedoras, por lo que se emplea únicamente en parejas con sospecha o alto riesgo de daño cromosómico.21 No obstante, es necesario desarrollar técnicas específicas con tecnologías como el FISH para la detección de alteraciones genéticas.22

Para el tratamiento de la azoospermia obstructiva, gracias a la inyección intracitoplasmática de un esper-matozoide, se realiza una biopsia testicular en lugar de aspiración directa del epidídimo, ya que la primera es más fácil de hacer y pueden criopreservarse muestras de tejido testicular para nuevos intentos, u otro embarazo, sin necesidad de repetir el procedimiento.

Finalmente, otro cambio importante en los últimos años se dirigió a disminuir el probable daño ocasionado por las diferentes técnicas, por lo cual los micromanipu-ladores se equiparon con nuevas agujas anguladas para facilitar la inyección del espermatozoide (recordemos que el microscopio cuenta de dos dimensiones). También se han desarrollado nuevas tecnologías como el Oosight o el poloscope unido al microscopio, un sistema com-putado con el que puede observarse el huso acromático, con el fin de no dañarlo al momento de la inyección intracitoplasmática del espermatozoide.

Transferencia embrionariaEn este procedimiento cae mucha responsabilidad por-que todo el esfuerzo logrado hasta este momento puede ser desperdiciado si la transferencia no es adecuada, por lo que una enseñanza importante durante este tiempo de evolución es realizar un ensayo denominado prueba de transferencia durante la programación del procedimien-to. Este paso quedó en desuso por la creación de nuevos catéteres, que incluyen camisas de diferentes formas y calibres que permiten no exponer a los embriones a hipoxia o a hipotermia durante los intentos por pasar el catéter en transferencias difíciles. La importancia de este paso previo radica en que tiene una alta capacidad para identificar las transferencias con alto grado de dificultad. Lo anterior se comprobó después de hacer un protoco-lo de estudio que demostró que si bien las pruebas de transferencia fáciles no siempre lo son, las de dificultad elevada prácticamente siempre serán complicadas y son

las importantes de detectar, para tener la precaución de contar con diferentes instrumentos como catéteres más refringentes ultrasonográficamente, delgados, curvos o semirrígidos, que faciliten el procedimiento. Además, toda paciente con una transferencia difícil debe tener sedación anestésica para reducir la complejidad y evitar el dolor a la paciente.

En relación con el tipo de catéteres, no existe duda que los flexibles son menos agresivos con el endometrio y, por tanto, cuentan con las mejores tasas de embarazo. Cada vez los catéteres flexibles tienen menor calibre para ser aun menos invasores con el endometrio. De los múltiples diseños existentes, ninguno ha demostrado ser mejor y el éxito dependerá de la experiencia de la persona que lo utilice.

El cambio constante entre los múltiples catéteres para realizar este proceso se enfoca al material con el que se producen y al tipo, forma y longitud de las guías o camisas que evitan el daño a los embriones.

La nueva tendencia mundial al cambio radica en el número de embriones a transferir, con la finalidad de reducir una de las principales complicaciones de las técnicas de reproducción asistida de alta complejidad, que es el embarazo de alto orden fetal.23,24 Histórica-mente se ha demostrado que la transferencia de más de tres embriones no disminuye la tasa de embarazo por transferencia, pero incrementa en forma importante el porcentaje de gestaciones triples o mayores.

En la actualidad se concentran esfuerzos para reducir el número de embriones a transferir sin afectar la tasa de embarazo, sobre todo si la transferencia se realiza entre los días 3 y 5. En algunos países europeos, en donde por razones de legislación sólo se permite transferir uno o dos embriones, se ha visto que el porcentaje de emba-razos se afecta en forma insensible. En Latinoamérica y México es difícil que esto ocurra a largo plazo; sin embargo, la postura de transferencia máxima de tres em-briones tiene una posibilidad menor de 1% de embarazos triples. Esta tendencia es sumamente importante porque ha permitido conocer características embriológicas como factores de buen pronóstico de implantación; además, junto con las técnicas de reproducción asistida de alta complejidad, surgieron nuevos procedimientos como la micromanipulación de gametos o embriones, así como nuevas opciones de embarazo en mujeres mayores,


como las que ingresan a los protocolos de donación de óvulos. Junto con esto se observó un incremento en la incidencia de complicaciones perinatales, como la en-fermedad hipertensiva inducida por el embarazo, rotura prematura de membranas, diabetes gestacional, retardo de crecimiento intrauterino y placentación anómala.25 Recientemente se demostró que todas estas complica-ciones se encuentran ligadas de manera estrecha con el incremento en la incidencia de embarazo múltiple (más evidente en los de alto orden fetal) y no con la edad de la paciente o con la incompatibilidad genética, como se pensaba en las receptoras de óvulos donados. Por lo anterior, el objetivo mundial se encuentra encaminado a reducir estos embarazos y la forma más fácil de lograrlo es transferir un menor número de embriones.

Con la reducción de la cantidad de embriones a trans-ferir, disminuyó la tasa de embarazo clínico y de recién nacido vivo, por lo que surgió una nueva estrategia que fue mejorar la selección de embriones a transferir. Para ello, se comenzó a transferir en el día 5 de poscaptura, en etapa de blastocisto, en lugar de hacerlo en el día 2 o 3. Esto es una prueba de sobrevivencia preembrionaria, en la cual, obviamente, un embrión que llega a la etapa de blastocisto en un medio artificial es un embrión de buena calidad y, por tanto, mejora la posibilidad de implanta-ción y de un embarazo a término. Desafortunadamente, es más difícil mantener un embrión fuera de su hábitat natural, por lo que las pacientes en estos protocolos tie-nen un alto riesgo de quedar sin embriones a transferir. Debido a esto, si no se considera la tasa de embarazo por transferencia sino la tasa de embarazo por ciclo, los resultados no son nada alentadores. Por este motivo aún son pocas las clínicas que realizan transferencia en etapa de blastocisto, pero sin duda es otra tendencia primordial en relación con la transferencia embrionaria.

No obstante lo anterior, no todos los autores están de acuerdo con que la transferencia en el día 5 sea superior a la del día 3, por lo que no hay consenso.

Soporte de la fase lútea Esta etapa es la menos estudiada en los procedimientos de reproducción asistida de alta complejidad y un terreno donde hay más preguntas que respuestas.

Al inicio, el soporte de la fase lútea fue altamente criticado, primero se pensó que durante la captura de los

ovocitos, la punción de los folículos originaría un mal funcionamiento del cuerpo lúteo y éste era el motivo de iniciar un soporte. Sin embargo, hace 20 años estudios prospectivos metanalíticos descartaron esta hipótesis.26 No hay que olvidar que al inicio el procedimiento se realizaba con un ciclo natural, pero con el transcurrir de los años surgió la hiperestimulación ovárica controlada y para este fin era necesario evitar una luteinización pre-matura de los folículos, por lo que se agregaron agonistas y antagonistas de la GnRH para suspender la función de la hipófisis o inhibir la producción de la hormona luteinizante. También era necesario el desarrollo de múltiples folículos, por lo que se inició la administración de gonadotropinas exógenas, ocasionando una eleva-ción de estradiol a concentraciones suprafisiológicas. Además, algunos fármacos como los agonistas de la GnRH mantienen suprimida la hipófisis hasta dos o tres semanas después de la suspensión de los mismos, por lo cual se retomó el estudio del soporte de la fase lútea, ya que no existe una elevación de hormona luteinizante necesaria para mantener la producción de progesterona a través de los cuerpos lúteos. Estudios en donadoras de ovocitos, en quienes se evaluó la calidad endometrial, demostraron la importancia del soporte de la fase lútea en los nuevos protocolos de estimulación.27

Actualmente existen tres tipos de progestágenos ad-ministrados con este fin: progesterona, didrogesterona y crinona, aunque se cuestiona la efectividad de los mismos, la vía de administración y la bioequivalencia. Al inicio se administró oralmente; sin embargo, el paso por el hígado disminuye su biodisponibilidad a tan sólo 10%, por lo que para las técnicas de alta complejidad se encuentra completamente descartada. La controversia está ente la vía intramuscular y la vaginal. Después de diversos estudios clínicos controlados, se demostró que no existe diferencia en la efectividad siempre y cuando se administre la dosis adecuada (intramuscular 50 mg cada 12 horas y para la vaginal 200 mg cada 8 h). En relación con las ventajas entre estas dos vías, la intramus-cular cuenta con concentraciones séricas mayores, pero como desventaja es necesario que sea administrada de manera profunda. Desafortunadamente, y por lo general, la inyección la aplica la pareja de la paciente, quien no tiene experiencia en hacerlo, por lo que existe riesgo de infección; también puede desencadenarse una reacción




alérgica al medicamento. La vía vaginal tiene la ventaja de ser más cómoda, menos dolorosa y puede ser aplica-da por la misma paciente; incluso algunos autores han demostrado una mayor concentración del fármaco en el endometrio a pesar de ser menor la concentración sérica en relación con la intramuscular, pero como desventaja causa una irritación importante al epitelio vaginal, lo que puede causar un ligero sangrado transvaginal.

Durante estos 30 años se ha demostrado la necesidad del soporte de la fase lútea. Actualmente se encuentran en estudio métodos de depósito para hacer más sencilla su aplicación: anillos vaginales, geles o soluciones acuosas para la aplicación de microesferas de liberación prolongada, lo que hace menos dolorosa su aplicación cada cinco a siete días en lugar de cada 12 a 24 horas. Sin embargo, aún se encuentran en experimentación.

Otra controversia es la dosis administrada, se conclu-yó, después de una búsqueda extensiva en la bibliografía, que está en función de la vía de administración, las más aceptadas son de 50 mg cada 24 horas para la proges-terona intramuscular y de 20 mg cada 8 h para la vía vaginal.28

Finalmente, la última controversia es la adición de otras sustancias diferentes a la progesterona. En primer lugar tenemos a la gonadotropina coriónica humana urinaria, altamente efectiva; sin embargo, ya no se administra debido al riesgo elevado de desencadenar un síndrome de hiperestimulación ovárica porque está demostrado que inicia la producción del factor de cre-cimiento vascular, lo que provoca porosidad vascular y, por tanto, fuga al espacio intersticial, hecho que final-mente ocasiona desde ascitis hasta anasarca.

Otro gran debate durante estos años, a partir de la creación de las técnicas de reproducción asistida de alta complejidad, es el momento de inicio del soporte de la fase lútea: hay que recordar que el embrión se implanta en el útero después de cinco o seis días de haber com-pletado la fertilización; por otro lado, la mayor parte de los centros dedicados a estas técnicas de reproducción asistida realizan la transferencia tres a cinco días después de la captura de ovocitos, ya sean propios o donados. Por lo anterior, es indispensable el inicio del soporte de la fase lútea el día de la captura en las pacientes receptoras de ovocitos que carecen de cuerpos lúteos porque será más tardado el cambio por parte del endometrio a una

fase secretora. Un estudio realizado en Holanda com-probó que el inicio del soporte de la fase lútea no tiene importancia, siempre y cuando se lleve a cabo antes del día de la transferencia. Este estudio comparó tres grupos según el tiempo de inicio, uno el día de la aplicación de la hCG, otro el día de la captura y un tercer grupo que inició el día de la transferencia embrionaria.29

REFERENCIAS

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* Instituto Mexicano de Infertilidad (IMI), Centro Médico Puerta de Hierro, Guadalajara, Jalisco, México.

Correspondencia: Dr. Luis A Ruvalcaba C. Correo electrónico: [email protected]: septiembre, 2008. Aceptado: diciembre, 2008.

Luis Arturo Ruvalcaba Castellón,* Martha Isolina García Amador,*José Medina Flores,* Edgar Quiróz Torres,* Rocío Martínez Armas*

Artículo original


Vitrificaciónencryotop,técnicadealtorendimientoparalacriopreservación de ovocitos humanos

Este artículo debe citarse como: Ruvalcaba CLA, García AMI, Medina FJ, Quiróz TE, Martínez AR. Vitrificación en cryotop, técnica de alto rendimiento para la criopreservación de ovocitos humanos. Rev Mex Reprod 2009;1(3):96-101.La versión completa de este artículo también está disponible en: www.revistasmedicasmexicanas.com.mx

RESUMEN

Introducción: la vitrificación de ovocitos asociada con la utilización de cryotop es uno de los mejores avances en la criopreservación de los últimos años.Objetivo: describir la evolución de 1,191 ovocitos humanos propios y donados luego de vitrificación en cryotop, en un centro de reproducción asistida.Materialymétodo: se vitrificaron ovocitos maduros (MII) de 69 pacientes en ciclo de fertilización in vitro y de donantes en 87 ciclos de donación, de julio de 2004 a mayo de 2008 en el Instituto Mexicano de Infertilidad de Guadalajara. Los óvulos (MII) aspirados, previa separación de la acumulación, se sumergieron en la solución de equilibrio (etilenglicol al 7.5% y dimetilsulfóxido al 7.5%) durante 10 minutos y luego se trasladaron a la solución de vitrificación compuesta por etilenglicol 15%, dimetilsulfóxido 15% y sucrosa 0.5 M. Posteriormente, se depositaron sobre la superficie del cryotop cerca de la punta, y éste se sumergió directamente en nitrógeno líquido para colocar su cubierta protectora. Los ovocitos se descongelaron con solución descongelante (TS) y de lavado (WS1-2). Los supervivientes se microinyectaron por medio de microinyección intracitoplásmica de espermatozoides (ICSI). Se transfirieron embriones el día 2 de desarrollo.Resultados: de los 1,191 ovocitos descongelados, 453 (38%) eran propios y 738 (62%) de donantes, con una supervivencia de 86.9 y 93.9%, respectivamente. Luego de la microinyección intracitoplásmica de espermatozoides fertilizaron 90% y en el día 2 dividió en 4 células 93.7%. Se lograron embarazos en 18/69 (27%) pacientes y 50/87 (58%) receptoras. Han nacido 56 bebés saludables.Conclusión: la vitrificación es una técnica de alto rendimiento para la criopreservación de ovocitos humanos porque proporciona altos índices de supervivencia, fertilización, división embrionaria y embarazo.Palabras clave: ovocitos, criopreservación, vitrificación, congelación, cryotop.

ABSTRACT

Background: The vitrification of oocytes associated to the use of cryotop is one of the best advances in cryopreservation in recent years.Objective: To describe the evolution of 1,191 own and donated human oocytes after thawing by cryotop method in an assisted re-production center.Material and method: There were vitrified mature oocytes of 69 patients ongoing in vitro fertilization cycles and 87 donation cycles, since July 2004 to May 2008 at Instituto Mexicano de Infertilidad, IMI-Guadalajara. The aspired oocytes were separated from the cu-mulus and placed in equilibrating solution (ES) (ethylene glycol 7.5% and dimethyl sulfoxide 7.5%) during 10 minutes; then they were changed to vitrification solution (VS) (ethylene glycol 15%, dimethyl sulfoxide 15%, and sucrose 0.5 M). Afterwards, the oocytes were put on the surface of the cryotop, near the tip, and then submerged directly into liquid nitrogen, and the cover was fixed. They were thawed with thawing solution (TS) and washed in two steps with washing solution (WS). The surviving oocytes were microinjected (ICSI). The embryos were transferred on day 2 under ultrasound guide.Results: There were thawed 1,191 oocytes, 453 (38%) own and 738 (62%) donated, with a survival rate of 86.9 and 93.9% respec-tively. After microinjection (ICSI) 90% fertilized and 93.7% divided into 4 cells on day 2. There have succeeded pregnancy in 18/69 (27%) of patients and 50/87 (58%) of recipients. There have been born 56 healthy babies.Conclusion: Vitrification is a high performance technique for the cryopreservation of human oocytes, which provides high survival, fertilization, embryo division and pregnancy rates.Keywords: vitrification, oocyte, cryopreservation, freezing, cryotop.


En 19861 se reportó el primer embarazo a partir de un ovocito criopreservado por medio de congelación lenta y dimetilsulfóxido como crioprotector. Sin embargo, con el tiempo la

técnica de congelación lenta convencional resultó en bajas tasas de supervivencia ovocitaria y embarazo,2-5 esto impulsó múltiples ensayos, modificando el tipo de crioprotector utilizado, el volumen o sus concen-traciones,6-10 con el objetivo de alcanzar resultados verdaderamente alentadores.

La idea de vitrificar, o alcanzar un estado similar al vidrio, fue descrita por primera vez en 1860 y retomada por Luyet en 1937. Cincuenta años más tarde (1985), Rall y Fahy11 la describieron como una alternativa po-tencial a la congelación lenta y consiste en solidificar una solución por enfriamiento rápido, lo que forma un estado vidrioso por elevación extrema de su viscosidad. Trounson12 fue el primero en sumergir un ovocito direc-tamente en nitrógeno líquido, reportó supervivencia y fertilización aceptables, pero bajas tasas de clivaje.

Los procedimientos actuales de vitrificación exponen la célula a un volumen reducido de crioprotectores a elevadas concentraciones por periodos muy breves, seguidos de congelación rápida en nitrógeno líquido. La alta osmolaridad de la solución de vitrificación rápida-mente deshidrata la célula. Sumergirla bruscamente en nitrógeno líquido la solidifica, de manera que el agua intracelular no tiene tiempo para formar cristales ni de provocar daño a los organelos intracelulares,13 y así se incrementa su potencial de supervivencia.

Varios autores han mencionado otros daños atribuibles a la célula derivados de las bajas temperaturas, uno de los más importantes son las alteraciones en la segregación de los cromosomas durante la meiosis II.14-16 Al respecto, la evidencia es aún insuficiente y un tanto controvertida porque otros sugieren que el huso meiótico puede so-brevivir a procesos de congelación-descongelación sin consecuencias, o al menos sin incremento en el número de aneuploidías en los embriones resultantes.17-20

Un programa efectivo de criopreservación de ovo-citos resulta de gran ayuda a mujeres que, por razones médicas o personales, necesitan diferir la posibilidad de embarazo por amenaza de pérdida de la función ovárica, por padecer alguna enfermedad oncológica que requiera quimioterapia o radioterapia o por restricciones ético-

religiosas que limiten la criopreservación de embriones. Entre sus beneficios más laxos podemos mencionar: permite preservar los ovocitos excedentes de ciclos de hiperestimulación en técnicas de reproducción asistida y facilita a los centros de reproducción la posibilidad de un banco de óvulos eficiente.

OBJETIVO

A pesar de los beneficios reconocidos para la técnica de vitrificación, la evidencia reportada aún resulta insufi-ciente.21 Este estudio tiene por objetivo dar a conocer la evolución de más de 1,000 ovocitos humanos propios y donados luego de su vitrificación en cryotop en un centro de reproducción asistida.

MATERIAL Y MÉTODO

Estudio descriptivo, observacional, realizado en el Ins-tituto Mexicano de Infertilidad, de julio de 2004 a mayo de 2008. Se vitrificaron los ovocitos propios excedentes de 69 pacientes en 149 ciclos de fertilización in vitro y 87 ciclos de donantes.

Hiperestimulación ováricaSe estimuló el ovario con recombinantes o menotropinas el día 2 o 3 del ciclo menstrual. Se aplicó antagonista del GnRH cuando al menos dos folículos alcanzaron 14 mm de diámetro. Se administraron 10,000 UI de hCG cuando dos o más folículos alcanzaron 18 mm de diámetro. Los ovocitos fueron aspirados 36 horas después y colocados en medio de cultivo Upgraded B2 INRA (CCD) previa-mente gasificado, durante 18 horas en promedio a 37 °C y 5% de CO2 donde permanecieron, en promedio, dos horas. En seguida se separaron de la acumulación. Se identificaron los ovocitos en metafase II por la extrusión del primer cuerpo polar y se vitrificaron.

TécnicadevitrificaciónUna vez separados de la acumulación los ovocitos me-tafase II fueron:1. Depositados en la primera gota de un plato de cul-

tivo que contenía tres gotas de solución de 30 µL. La primera de solución de lavado y las otras de solución de equilibrio, se hicieron puentes entre

Vitrificación en cryotop, técnica de alto rendimiento para la criopreservación de ovocitos humanos


Ruvalcaba Castellón LA y col.

ellas con la pipeta Pasteur en dos ocasiones, cada tres minutos.

2. Se trasladaron a la solución de equilibrio donde permanecieron 10 minutos.

3. Después se depositaron en la solución de vitrifica-ción durante un minuto.

4. En ésta se aspiraron, se devolvieron con pipeta unas tres veces y se depositaron sobre la superficie del cryotop (Kitazato Supply Co., Fujinomiya, Japón). El cryotop consiste en una lámina muy delgada de polipropileno de 0.4 mm de ancho x 20 mm de largo x 0.1 mm de espesor, con una cubierta protectora, también plástica (3 cm de longitud), figura 1.

Descongelación1. Los ovocitos se depositaron en solución desconge-

lante durante un minuto.2. Luego se sumergieron en una solución diluyente

durante tres minutos.3. Se trasladaron a la solución de lavado dos veces,

cinco minutos cada vez.4. Los ovocitos supervivientes se dejaron en el medio

de cultivo de 2 a 4 horas y posteriormente fueron microinyectados mediante la técnica convencional de microinyección intracitoplásmica de espermato-zoides (ICSI).

El equipo de soluciones utilizadas en la técnica es de Kitazato Supply Co., Fujinomiya, Japón.

Transferencia embrionariaLos embriones se transfirieron a las pacientes y re-ceptoras el día 2 de desarrollo, bajo guía ecográfica con ultrasonido marca Aloka SSD500. En el ciclo de preparación endometrial se utilizó agonista del GnRH para la supresión hipofisiaria en las mujeres con función ovárica y estradiol en dosis progresivas: se inició con 2 mg los primeros ocho días del ciclo de preparación, 2 mg cada 12 horas los días 9, 10 y 11 y 2 mg cada ocho horas a partir del día 12. Para el soporte lúteo se administró progesterona en perlas de 200 mg el día de la descongelación de los ovocitos en horas de la tarde y se administró cada 12 horas hasta el día de la transferencia de los embriones. El día de la transferencia embrionaria se incrementó la dosis a 200 mg por vía oral cada ocho

5. El cryotop se sumergió rápida y directamente en un recipiente con nitrógeno líquido para la colocación de su cubierta protectora (figuras 2 y 3).

Estos dos últimos pasos son decisivos, ya que deben efectuarse en un minuto, quien los realiza debe dominar perfectamente el volumen ideal de solución y tener la habilidad de colocar los ovocitos sobre la superficie del cryotop.

Figura 3. Colocación de la cubierta protectora.

Figura 1. Cryotop.

Figura 2. El cryotop se sumerge directamente en el recipiente con N2 líquido.


horas, y se incluyó progesterona en ampolletas de 50 mg, una dosis diaria por vía intramuscular. En promedio, el estrógeno y la progesterona se mantuvieron hasta la semana 8 de gestación.Análisis: Utilizamos estadística descriptiva, cuadros

de frecuencia y porcentaje, medidas de tendencia central y dispersión.

RESULTADOS

Se descongelaron 1,191 ovocitos obtenidos de 69 pa-cientes en 149 ciclos de fertilización in vitro (ovocitos propios) y 87 ciclos de donación. Se descongelaron 453 ovocitos propios y 738 donados con una supervivencia de 87 y 94%, respectivamente. Fertilizaron después de la microinyección intracitoplásmica de espermatozoides 341/390 (87.4%) propios y 638/689 (92.6%) donados. Dividieron en cuatro células el día 2 de desarrollo 921 embriones (93.7%), cuadro 1.

en el grupo de las pacientes embarazadas a partir de ovocitos propios.

DISCUSIÓN

La vitrificación conjuga altas concentraciones de crio-protectores en mínimo volumen y elevadas velocidades de congelación (15,000-30,000 °C/min),22 lo que impide la formación de cristales de hielo durante los procesos de congelación-descongelación,23 permite una mejor conservación de la ultraestructura y menor daño en la fisiología ovocitaria.24 Boriniy col. han señalado que pro-tocolos subóptimos para la criopreservación de ovocitos pueden causar daño subletal asociado con habilidad limi-tada para la fertilización;25 nosotros observamos que, en forma proporcional, la mejor supervivencia corresponde con mejores tasas de fertilización y clivaje.

En este estudio reportamos tasas de supervivencia, fertilización y clivaje comparables con las reportadas por otros autores para la vitrificación de ovocitos hu-manos, independientemente del dispositivo utilizado para el depósito final de los ovocitos: cryotop, cryotip, cryoloop, cryoleaf, etc.26-30

La proporción de embarazo es similar a la reportada para ciclos en fresco, de forma indistinta para cuando transferimos embriones obtenidos a partir de ovocitos propios o donados vitrificados. Hasta ahora, los nacidos reportados para la vitrificación de ovocitos parecieran tener una incidencia de anomalías congénitas (2.5%)31 no mayor a la reportada para los nacidos de embarazos espontáneos en mujeres fértiles, o en mujeres infértiles

Cuadro 1. Evolución de los ovocitos vitrificados según su ori-gen

Ovocitos Propiosn (%)

Donadosn (%)

Globaln (%)

Descongelados 453 (38) 738 (62.0) 1,191 (100)

Supervivientes 390 (86.9) 689 (93.9) 1,079 (90.4)

Fertilizados 341 (87.4) 638 (92.6) 979 (90.0)

Divididos 316 (92.6) 605 (94.8) 921 (93.7)

Instituto Mexicano de Infertilidad, 2004-2008.

La edad promedio fue de 34 ± 3.8 años en las pacientes y de 40 ± 5.3 años en las receptoras. Se transfirieron 316 embriones a 69 pacientes en 87 ciclos y 605 a 87 recep-toras en 149 ciclos; se obtuvieron 18/69 (26.1%) y 50/87 (57.5%) embarazos, respectivamente (cuadro 2).

Han nacido 56 bebés, producto de 36 gestaciones únicas y 10 dobles. Todos saludables a excepción de una niña, hija de madre diabética de 42 años de edad que sufrió una comunicación interventricular. De los nacidos vivos, 15/56 (27%) pertenecen al grupo de los ovocitos propios y 41/56 (73%) al de los ovocitos donados.

Trece embarazos no llegaron a término, entre ellos un embarazo ectópico cornual. No hubo ninguna pérdida

Cuadro 2. Generalidades y proporción de embarazo en pacientes y receptoras, ovocitos propios y donados

Propios n

Donados n

Pacientes 69 87Ciclos 87 149Edad promedio 34 ± 3.8 40 ± 5.3Embriones transferidos 316 605Embarazos/ciclos 18/87 (20.6%) 50/149 (33.5%)Embarazos/paciente 18/69 (26.1%) 50/87 (57.5%)Nacidos vivos 15 41Abortos - 13 (19%)*

Instituto Mexicano de Infertilidad, 2004-2008.* Un embarazo ectópico cornual.



Ruvalcaba Castellón LA y col.

en ciclos frescos de fertilización in vitro.32 En nuestra se-rie de nacidos vivos (56), reportamos una comunicación interventricular en una bebé hija de madre diabética, dato que corresponde a 1.78% de los casos y que muy probablemente no tenga relación con la técnica.

No hemos realizado diagnóstico genético pre-implantatorio en nuestros embriones; sin embargo, consideramos que la proporción de nacidos saludables reportada sustenta la inocuidad de la técnica.

CONCLUSIÓN

La vitrificación de ovocitos humanos en cryotop es una técnica de congelación que proporciona elevada super-vivencia ovocitaria, fertilización, clivaje y embarazo. Es una técnica sencilla y altamente reproducible, que al momento ha reportado una proporción de nacidos vivos saludables capaz de sustentar sus ventajas e inocuidad.

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Paloma del Carmen Neri Vidaurri,* Víctor Torres Flores,** †Marco Tulio González Martínez**

Artículo original


Sensibilidad de los canales de calcio dependientes de voltaje al pH intracelular en el espermatozoide humano capacitado. Efecto modulador del AMPc

RESUMEN

Antecedentes: durante su camino hacia el ovocito, el espermatozoide aumenta su motilidad, hiperactivándola e iniciando la capaci-tación espermática que implica la vía AC/AMPc/PKA y, por medio de la zona pelúcida 3 del óvulo, sobreviene la reacción acrosómica. Estos fenómenos requieren mecanismos dependientes de transporte de calcio. A través de técnicas ópticas se han detectado canales de calcio dependientes de voltaje que se estimulan durante la capacitación espermática y por la acción de la progesterona, además de que su actividad se incrementa con la alcalinización del pH intracelular.Objetivos: examinar el efecto de incrementar el AMPc intracelular con el inhibidor de fosfodiesterasas papaverina, y cuantificar el aumento de la concentración del calcio intracelular inducido con progesterona.Materialymétodos: se realizó un estudio prospectivo con muestras de semen de sujetos normoespérmicos. Se investigó el efecto del AMPc sobre los canales de calcio dependientes de voltaje y su sensibilidad al pH intracelular en el espermatozoide humano bajo dos enfoques: 1) el uso de espermatozoides no capacitados a los que se les elevó el AMPc in vitro y 2) espermatozoides capacitados que de por sí tienen el AMPc elevado. Las muestras capacitadas y no capacitadas se trataron con fura-ff (detector de calcio) o con BCECF (detector de pH intracelular). Para elevar el AMPc en espermatozoides no capacitados se usó papaverina, 0.5 mM cinco minutos.Resultados:la cantidad de AMPc se duplicó durante la capacitación y la exposición con papaverina cuadriplicó los valores (de 1.1 ± 0.4 a 5.2 ± 0.7 pmol/107) con respecto de los espermatozoides no capacitados y por arriba de la pentoxifilina. En el espermatozoide capacitado la sensibilidad aumentó alrededor de siete veces.Conclusiones: los canales de calcio dependientes de voltaje en el espermatozoide humano son sensibles a factores asociados con la capacitación, como el pH intracelular y el AMPc, favoreciendo la permeación a calcio. Este mecanismo explica por qué sólo los espermatozoides capacitados contactan la zona pelúcida del óvulo y muestran reacción acrosomal, evento en el que los canales de calcio dependientes de voltaje juegan un papel central como mecanismo de entrada de calcio.Palabras clave: AMPc, canales de calcio dependientes de voltaje, papaverina, pentoxifilina.

ABSTRACT

Background: During their journey through the uterine tract, mammalian sperm increases its motility, beginning sperm capacitation, that involves the activation of the AC/cAMP/PKA pathway, and the acrosome reaction induced by egg-pellucid zone. These phenomena require calcium transport mechanisms among them; voltage-dependent calcium channels (VDCC) have been involved as calcium entry mechanism. These channels are highly stimulated during the sperm capacitation progesterone and by intracellular pH alkalization. Objective: To investigate the effect of increasing intracellular AMPc with phosphodiesterase inhibitor papaverin, and to quantify the increased intracellular calcium level induced by progesterone. Material and methods: A prospective study was done with semen samples from normosperm subjects. The effect of cAMP on VDCC was investigated, as well as their sensitivity to intracellular pH in human spermatozoid under two approaches: 1) the induction of cAMP increase in non capacitated sperm and 2) the use of capacitated sperm which naturally produces increased levels of cAMP as compared with non capacitated cells. Samples were loaded with fura ff or with BCECF (a intracellular pH detector). To increase the intracellular AMPc content in non-capacitated sperm, papaverine was used, 0.5 mM incubated 5 minutes. Results: cAMP content increased 2-fold during capacitation and papaverin exposure increased 4-fold (from 1.1 ± 0.4 to 5.2 ± 0.7 pmol/107) with regard to non-capacitated and was higher than pentoxifiline’s. In capacitated sperm sensitivity increased near 7-fold.Conclusions: Human sperm voltage-dependent calcium channels are sensitive to regulators associated to sperm capacitation, that is, the intracellular pH alkalization and AMPc content, favoring the calcium influx. These phenomena may be physiologically relevant since only capacitated sperm is capable to undergo the acrosome reaction induced by pellucid zone 3, an event that requires the activation of voltage-dependent calcium channels as a major mechanism of calcium entry.Keywords: cAMP, voltage-dependent calcium channels, papaverine, pentoxifiline.


* Centro Especializado en Esterilidad y Reproducción Huma-na, Hospital Ángeles, México.

** Laboratorio de Biomembranas del Departamento de Far- macología, Facultad de Medicina, Ciudad Universitaria, México, DF.

Correspondencia: Dra. Paloma del Carmen Neri Vidaurri. Centro Especializado en Esterilidad y Reproducción Humana. Hospital Ángeles, México. Agrarismo 208, 1er piso, Torre A, int. 102, cononia Escandón, CP 11800, México, DF. Correo electrónico:

En el espermatozoide humano, la modulación de la concentración del calcio intracelular es fundamental para entender los mecanismos relacionados con aspectos específicos de la

fisiología del espermatozoide, como la capacitación espermática y la reacción acrosomal.1

La capacitación espermática es un proceso depen-diente de calcio que, en condiciones normales, ocurre en el aparato genital femenino y está relacionado con una cascada de cambios bioquímicos.2 Estos cambios comprenden un incremento en la concentración de AMPc intracelular, el cual desencadena la activación de la enzima proteína-cinasa-A (PKA),3 y un incremento en la actividad de la proteína-tirosina-cinasa (PTK).4 Du-rante el proceso también hay una ligera pero consistente alcalinización del pH intracelular de aproximadamente 0.14 unidades5 (figura 1).

Una vez que está capacitado el espermatozoide es capaz de responder a los receptores de la zona pelúci-da, incrementar la concentración de calcio intracelular

Figura 1. Principales eventos de transducción de señales durante la capacitación in vitro del espermatozoide de ratón (modificado de Baldi, 1996).

[email protected]: enero, 2009. Aceptado: febrero, 2009.

Este artículo debe citarse como: Neri VPC, Torres FV, Gonzá-lez MMT. Sensibilidad de los canales de calcio dependientes del voltaje al pH intracelular en el espermatozoide humano capacitado. Efecto modulador del AMPc. Rev Mex Reprod 2009;1(3):102-8.La versión completa de este artículo también está disponible en: www.revistasmedicasmexicanas.com.mx

y, por tanto, inducir la reacción acrosomal, un proceso que permite al espermatozoide cruzar la zona pelúcida y fusionarse con el oolema del ovocito.

Los mecanismos de entrada de calcio inducidos por la fusión del espermatozoide con los receptores de la zona pelúcida son muy estudiados en esperma de ratón, en donde se ha demostrado que se produce un flujo iónico que origina una despolarización y un pico de calcio en milisegundos en espermatozoides capacitados y, consecuentemente, la apertura de canales de calcio dependientes de voltaje tipo T.6,7

A través de estudios realizados en el espermatozoide humano, nuestro laboratorio ha detectado la apertura de canales de calcio dependientes de voltaje que podrían tener un papel muy similar al encontrado en el esper-matozoide de ratón.8

Dichos canales se detectaron en espermatozoides no capacitados incubados con el marcador fluorescen-te fura-2, en los cuales se observó: incremento en el influjo de calcio intracelular inducido por una despo-larización con potasio,7 una inactivación en 90 seg en medio libre de calcio y una hiperestimulación de su actividad al alcalinizar el pH intracelular y al llevar a cabo la capacitación espermática.7-9 De manera que los canales de calcio dependientes de voltaje se estimulan durante la capacitación espermática y al alcalinizar el pH intracelular.

De acuerdo con la sensibilidad que muestran los canales de calcio dependientes de voltaje al pH en el espermatozoide humano capacitado, éstos podrían contribuir en alrededor de 30% de la estimulación total observada en este proceso.10 Esto sugiere que, además de la alcalinización del pH intracelular, existen otros reguladores bioquímicos que se activan durante la capa-citación espermática, los cuales modifican los canales al incrementar aún más la permeación al calcio.

Sensibilidad de los canales de calcio dependientes de voltaje al pH intracelular en el espermatozoide humano capacitado


Neri Vidaurri PC y col.

OBJETIVO

Al considerar lo anterior, examinamos el efecto de incrementar el AMPc intracelular con el inhibidor de fosfodiesterasas papaverina durante 5 min en esper-matozoides no capacitados a una concentración de 0.5 mM (concentración seleccionada con un bioensayo) y se cuantificó el aumento del calcio intracelular inducido con progesterona, una hormona que se encuentra de ma-nera natural en el aparato femenino y que participa en la capacitación espermática y la reacción acrosomal.

MATERIAL Y METODO

Se realizó un estudio prospectivo con muestras de semen de pacientes normoespérmicos (previa autorización del consentimiento informado), obtenidas en el laboratorio de andrología del Centro Especializado en Esterilidad y Re-producción Humana del Hospital Ángeles, México, DF.

Se utilizó el marcador fluorescente fura ff-AM (Molecular Probes) que permite la detección de calcio intracelular y BCECF (Sigma Aldrich) para la medición del pH intracelular, y un medio para esperma humano con buffer de HEPES (H-HSM) diseñado por Suárez y col.7 El medio de capacitación fue el mismo, a excepción que el HEPES se sustituyó por 25 mM de NaHCO3 y 3 mg/mL de HSA (Sigma, fraction V) [figura 2].

Para medir el aumento del AMPc, los espermatozoi-des se obtuvieron previa centrifugación en gradientes de percoll y se incubaron 40 min con 5 µM de fura ff-AM. Al término de la incubación se retiró el exceso

Carga (5 μM)

Fura ff-AM40 min 37 ºC,en 1 mL HSM-H

Lavado por centrifugación

Capacitados

30 min 1μM BCECF-AM

Fluorometría30K 30K 30K 30K 1.25 NH 5NH 10NH

No capacitados

Figura 2. Diseño experimental para la detección de calcio.

del marcador mediante lavado y cada muestra se dividió en tres grupos experimentales con aproximadamente 100x106 espermatozoides/mL: a) espermatozoides in-cubados con 0.5 mM de papaverina, b) espermatozoides sin papaverina y c) espermatozoides capacitados sin papaverina. Todos incubados a 37 °C (figura 3). Para la alcalinización progresiva del medio de cultivo se utilizaron diferentes concentraciones de NH4Cl y al mismo tiempo se registró su efecto en los tres grupos experimentales de espermatozoides.

Carga (5 μM)

Fura ff-AM40 min 37 ºC,en 1 mL HSM-H

Lavado por centrifugación

Papaverina 0.5 mM5 min en HSM-H

4μM P4

Fluorometría

Capacitados

1000g20ºC20 min

5 min en HSM-H

Figura 3. Diseño experimental para la medición del AMPc.

Para corroborar el efecto de la papaverina sobre el aumento del AMPc, éste se midió con el equipo de inmunoensayo para AMPc EIA (Zymed Laboratories) [figura 4].

RESULTADOS

La fluorescencia se detectó a 488 nm, los valores se con-virtieron a valores de calcio intracelular con la ecuación de Grynkiewicz. Los resultados se reportaron como el promedio ± desviación estándar. Los grupos se compa-raron por ANOVA o t pareada. Los resultados p < 0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

La figura 5 muestra el efecto del pH intracelular sobre la apertura de los canales de calcio dependientes de voltaje de espermatozoides capacitados y no capacitados, en la capacitación espermática produce una estimulación de la entrada de calcio dependiente del voltaje que dependió de la concentración de NH4Cl, se duplicó aproximadamente con 10 mM de NH4Cl. La capacitación de las mismas células produjo una estimulación notable de los canales de calcio dependientes de voltaje y una potenciación alrededor de


10 veces en su respuesta al NH4Cl. Por ejemplo, en el no capacitado, la despolarización con 10 mM NH4Cl produjo un Δ[Ca2+]i de 1.35 ± 1 µM, en tanto que en el espermato-zoide capacitado el resultado fue de 8 ± 2 µM.

La figura 6 muestra el registro temporal de pH in-tracelular en células no capacitadas y capacitadas y sus respuestas a las diferentes concentraciones de NH4Cl utilizadas. Como era de esperarse, el valor de pH intrace-lular en los espermatozoides capacitados fue más alcalino (6.80) respecto a los no capacitados (6.65). El NH4Cl indujo en ambos grupos elevaciones cuasi instantáneas del pH intracelular; pero en el caso de los espermatozoides capacitados, éstas fueron más alcalinas.

El NH4Cl produce una mayor alcalinización en los espermatozoides capacitados que en los no capacitados. El pH intracelular de reposo en espermatozoides capaci-tados (6.80 ± 0.02) fue 0.15 unidades más alcalino que el de los espermatozoides no capacitados (6.65 ± 0.03).

En la figura 7 se observa que, aun cuando la alcalini-zación del pH intracelular (pHi) en células capacitadas fue mayor, el influjo de calcio a través de los canales de calcio dependientes de voltaje es mucho mayor en las células capacitadas, con una tasa de incremento de 49 μM/pHi, mientras que para los espermatozoides no capacitados fue de 6.7 μM/pHi; esto es, la sensibilidad de los canales de calcio dependientes de voltaje al pH intracelular se incrementó alrededor de siete veces en condiciones de capacitación. Este resultado sugiere que cuando el espermatozoide se capacita, el pH intra-celular modula de manera cualitativamente diferente los canales de calcio dependientes de voltaje e indica la posibilidad de que exista un modulador central en la capacitación; en este caso el AMPc pudiera intervenir en dicha estimulación.

Semen50%75%

HCI 0.05M

spz

AMPc

CentrifugarSobrenadante

1:1Buffer de acetatos

AMPc- -PNP FA

Hervir 3’Hielo

1000Xg20 ºC20 min

Ac-AMPc

Figura 4. Métodología del equipo de inmunoensayo para AMPc EIA (Zymed Laboratories).

Figura 5. Efecto del NH4Cl en el influjo de calcio: indujo una despolarización en espermatozoides no capacitados y en capa-citados. En ambas condiciones fisiológicas la estimulación del influjo de calcio dependió de la cantidad de NH4Cl adicionada.




Figura 6. Efecto del NH4Cl en el pH intracelular de esperma-tozoides no capacitados y capacitados. Se comparan los pH intracelulares alcanzados con las adiciones de NH4Cl-KCl en espermatozoides no capacitados y capacitados.

Para corroborar la participación del AMPc sobre los canales de calcio dependientes de voltaje (CCDV), en la figura 8 se observa el efecto de la exposición a papa-verina en el influjo de calcio a través de los CCDV en: a) espermatozoides no capacitados, b) espermatozoides no capacitados + papaverina y c) espermatozoides ca-pacitados. Se observó que la papaverina produce una notable estimulación en la entrada de calcio inducida por despolarización (adición de NH4Cl).

La estimulación con papaverina aumentó significa-tivamente el calcio intracelular en espermatozoides no

capacitados; sin embargo, el influjo de calcio observado en los espermatozoides con papaverina capacitados es aún mayor.

El efecto de la papaverina se comparó con el de la pentoxifilina, un inhibidor ampliamente usado en la clínica. Fue interesante que la preincubación con pentoxifilina no incrementó el calcio tanto como la papaverina (figura 9).

Debido a estos hallazgos se cuantificó el conteni-do de AMPc en: a) espermatozoides no capacitados, b) espermatozoides no capacitados + papaverina, c)

Figura 7. Influjo de calcio dependiente del voltaje en función del pH intracelular en espermatozoides humanos no capacitados y capacitados.

0123456789

Cal

cio

intra

celu

lar (μ

M)

No capacitados No capacitados + papaverina

Capacitados

Figura 8. Efecto de la papaverina en el incremento del calcio intracelular inducido por progesterona. Los 5 min de incubación con papaverina aumentaron cinco veces el calcio en esperma-tozoides no capacitados (control), no capacitados + papaverina y capacitados.


espermatozoides no capacitados + pentoxifilina y d) espermatozoides capacitados.

Con base en los resultados anteriores, la cantidad de AMPc se duplicó durante la capacitación y la exposición con papaverina cuadriplicó los valores (de 1.1 ± 0.4 a 5.2 ± 0.7 pmol/107) con respecto de los espermato-zoides no capacitados y por arriba de la pentoxifilina (figura 10).

Figura 10. Cuantificación del la concentración de AMPc en es-permatozoides no capacitados (control), expuestos a papaverina, a pentoxifilina y capacitados.

0

1

2

3

4

5

6

7

Cal

cio

intra

celu

lar (μ

M)

a b c d e f g h i

Control Papaverina Pentoxifilina

Figura 9. Efecto comparativo de la papaverina y la pentoxifilina en el aumento de calcio intracelular inducido por progesterona. Espermatozoides no capacitados se incubaron con pentoxifilina o papaverina.a: control; b,f: 0.25 mM; c,g: 0.5 mM; d,h: 1.0 mM; e,i: 2.0 mM de papaverina y pentoxifilina.

00.5

11.5

22.5

33.5

44.5

5

AM

Pc

pmol

/107

célu

las

Control Papaverina Pentoxifilina Capacitados

tipo T en el espermatozoide humano.8 Estudios recientes mencionan que el espermatozoide de mamífero (ratón) tiene un canal llamado Catsper 1, una forma de canales de calcio dependientes de voltaje requerido para adquirir la motilidad9 y también se ha relacionado con astenozo-ospermia en el espermatozoide humano.10

Se ha sugerido que reguladores bioquímicos tales como AMPc, proteína-cinasa-A (PKA) o proteína-tiro-sina-cinasa (PTK), los cuales incrementan su actividad durante la capacitación espermática,3 podrían producir cambios en los canales de calcio dependientes de voltaje (CCDV) como resultado del incremento observado en la sensibilidad al pH intracelular. Dada la participación de los CCDV en la reacción acrosomal inducida, prin-cipalmente por la zona pelúcida,5 consideramos que el incremento de la sensibilidad al pH intracelular de los CCDV, reportado en este trabajo, puede ser el meca-nismo por el cual la zona pelúcida induce la reacción acrosomal sólo en espermatozoides capacitados. Se observó que una ligera alcalinización del pH intracelular estimula de manera potencial la apertura de los CCDV en espermatozoides humanos capacitados alrededor de siete veces, es decir, la sensibilidad de los CCDV al pH intracelular depende de las condiciones fisiológicas de la célula.

En este trabajo también demostramos que una ligera exposición (5 min) de los espermatozoides humanos no capacitados con 0.5 mM de papaverina incrementó el contenido de AMPc, observado en el aumento de calcio intracelular, con concentraciones más altas que las obtenidas con pentoxifilina.

Consideramos realizar a futuro bioensayos con espermatozoides no capacitados incubados con papa-verina para la inseminación de ovocitos de mamíferos inferiores, para que posteriormente se use también la papaverina en pacientes con astenozoospermia o biopsia testicular con fines de reproducción asistida, en donde generalmente se usa pentoxifilina con tiempos más lar-gos de incubación; para así no sólo disminuir ese tiempo, sino también incrementar con mayor efectividad su movilidad aumentando con certeza las concentraciones de calcio intracelular, que en el espermatozoide humano es fundamental en los mecanismos implicados en la capacitación espermática, y sobre todo en la reacción acrosomal.


CONCLUSIONES

Aunque los canales de calcio dependientes de voltaje (CCDV) se han identificado sólo en espermatozoides de ratón, las evidencias sugieren la existencia de CCDV


REFERENCIAS

1. Darszon A, Nishigaki T, Wood C, Treviño CL, et al. Calcium channels and Ca2+ fluctuations in sperm physiology. Int Rev Cytol 2005;243:79-172.

2. Baldi E, Luconi M, Bonaccorsi L, Forti G. Signal transduc-tion pathways in human spermatozoa. J Reprod Immunol 2002;53:121-31.

3. Luconi M, Porazzi I, Ferruzzi P, Marchiani S, et al. Tyrosine phosphorylation of the a kinase anchoring protein 3 (AKAP3) and soluble adenylate cyclase are involved in the increase of human sperm motility by bicarbonate. Biol Reprod 2005;72:22-32.

5. Cross N, Razy-Faulkner P. Control of human sperm intracel-lular pH by cholesterol and its relationship to the response of the acrosome to progesterone. Biol Reprod 1997;56:1169-74.

6. Arnoult C, Kazam IG, Visconti PE, Kopf GS, et al. Control of the low voltage-activated calcium channel of mouse sperm by egg ZP3 and by membrane hyperpolarization during capacitation. Proc Natl Acad Sci (USA) 1999;96:6757-62.

7. Suarez SS, Wolf DP, Meizel S. Induction of the acrosome reaction in human spermatozoa by a fraction of human fol-licular fluid. Gamete Res 1986;14:107-21.

8. Carlson AE, Westenbroek RE, Quill T, Ren D, et al. CatSper1 required for evoked Ca2+ entry and control of flagellar func-tion in sperm. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:14864-8.

9. Schuhmann K, Voelker C, Höfer GF, Pflügelmeier H, et al. Essential role of the beta subunit in modulation of C-class L-type Ca2+ channels by intracellular pH. FEBS Lett 1997;408:75-80.

10. Fraire-Zamora JJ, González-Martínez MT. Effect of intracel-lular pH on depolarization-evoked calcium influx in human sperm. Am J Physiol (Cell Physiol) 2004;287:1688-96.



* Instituto Mexicano de Infertilidad (IMI). Guadalajara, Jalisco, México.

Correspondencia: Dra. Martha I García A. Correo electrónico: [email protected]: octubre, 2008. Aceptado: diciembre, 2008.

Este artículo debe citarse como: García AMI, Chávez BA, Medina FJ, Quiróz TE y col. Primer nacido vivo en México luego de trans-ferencia de embrión único obtenido a partir de cigotos vitrificados. Comunicación del caso. Rev Mex Reprod 2009;1(3):109-12.La versión completa de este artículo también está disponible en: www.revistasmedicasmexicanas.com.mx

Caso clínico


Martha Isolina García Amador,* Alejandro Chávez Badiola,* José Medina Flores,* Edgar Quiróz Torres,* Rocío Martínez Armas,* Luis Arturo Ruvalcaba Castellón*

Primer nacido vivo en México luego de transferencia de embrión únicoobtenidoapartirdecigotosvitrificados.Comunicacióndelcaso

RESUMEN

Paciente de 29 años de edad, con esterilidad primaria de cinco años de evolución, con índice de masa corporal de 18.7 kg/m2, en primer ciclo de FIVTE. La estimulación ovárica se realizó con 2,450 UI de menotropinas. Se administró el antagonista del GnRh en el día 9 del ciclo. Se efectuó la inducción final de la maduración ovocitaria con 10,000 UI de hCG el día 12 del ciclo y la aspiración de los ovocitos 36 horas después. Se obtuvieron 26 ovocitos, 23 en metafase II. No se transfirieron en fresco por datos de hiperestimu-lación. Se vitrificaron 13 óvulos y se microinyectaron 10. De los ovocitos microinyectados fertilizaron 7, y se vitrificaron en cryotops distintos 3 cigotos y 3 embriones en cuatro células. Los tres cigotos se desvitrificaron dos meses después. Sobrevivió uno. Se realizó la transferencia del embrión a la cavidad uterina el día 2 de desarrollo (4 células, 5% de fragmentos, 2 de simetría), bajo guía ecográ-fica transvaginal. Dos semanas después se reportó una prueba de gonadotropina coriónica (hCG) en sangre positiva. Se confirmó el embarazo en la sexta semana de gestación por la presencia de latido cardiaco. En mayo de 2007, a las 37.5 semanas de gestación, nació por cesárea una bebé saludable de 3,300 gramos de peso, Apgar 8/9 a uno y cinco minutos del nacimiento, respectivamente. La vitrificación de cigotos es un estado alternativo de criopreservación que en algunos casos puede resultar conveniente. Deberán realizarse estudios prospectivos para sustentar sus beneficios.Palabras clave: cigotos, vitrificación, criopreservación.

ABSTRACT

A 29-year-old patient diagnosed with primary infertility and a body mass index (BMI) of 18.7 kg/m2 underwent her first in vitro fertilization cycle. Ovarian stimulation was achieved with a total FSH dose of 2,450 IU. GnRh antagonist was started on day 9. Ovum pick-up was performed 36 hours following ovulation induction with hCG 10,000 IU, on day 12 of the cycle. A total of 26 oocytes were retrieved, from which 23 were mature (metaphase II). A total of 13 oocytes were vitrified and 10 underwent ICSI, from which seven were fertilized. Embryo transfer was delayed due to signs of ovarian hyperstimulation syndrome and fertilized embryos were vitrified in different stages (3 zygotes and 3 four-stage cell embryos). Vitrification was performed with the cryotop method. Two months following initial stimulation, zygotes were thawed, but only one survived. A single embryo transfer was performed under transvaginal ultrasound guidance on day two of embryo development (four cell, 5% fragments). A positive pregnancy test in blood was confirmed two weeks following embryo transfer and a single sac and fetal heartbeat identified on week six. On May 2007, a healthy female baby was born following cesarean section at 37.5 weeks. Birth weight was 3,300 grams, one and five minute Apgar 8/9, respectively. Zygote vitrification is an alternative stage for embryo cryopreservation, which in some cases might be the best option in cryopreservation. Still, prospective studies should be started in order to fully assess its potential benefits.Keywords: zygotes, vitrification, cryopreservation.

La vitrificación es una técnica útil para la crio-preservación de tejidos, ovocitos, cigotos y blastocistos, entre otros, con tasas de recupe-ración exitosas. La vitrificación en pronúcleos

es uno de los mejores estados para la criopreservación al comparar los resultados. Se reporta la recuperación de 100%1 con alentadoras tasas de clivaje, implantación y embarazo.2,3 Es un estado alternativo de criopreservación para los países donde la regulación prohíbe la congela-ción de embriones en estado de clivaje.4


CASO CLÍNICO

Paciente de 29 años de edad, con esterilidad primaria de cinco años, peso: 56 kg, talla: 1.73 m, IMC de 18.7; en primer ciclo de fertilización in vitro. Fue estimulada con 2,450 UI de FSHu. Se inició el antagonista el día 9 del ciclo. Se administraron 10,000 UI de hCG el día 12 del ciclo. La aspiración ovular se realizó 36 horas después. Se obtuvieron 26 ovocitos. Los ovocitos cap-turados se colocaron en medio de cultivo Upgraded B2 INRA (CCD) previamente gasificado (por 18 horas en promedio a 37 °C y 5% de CO2), durante un periodo de 2 horas. Luego de decumulados, se identificaron 23 ovocitos maduros. No se realizó transferencia en fresco por datos clínicos de hiperestimulación; así pues, 10 ovocitos se microinyectaron en fresco y 13 se destina-ron a vitrificación. De los ovocitos microinyectados en fresco fertilizaron 7, y se vitrificaron 3 en estado de dos pronúcleos en un cryotop, y 3 embriones en 4 células (día 2) en otro (figura 1).

El proceso de vitrificación para todos los estadios (ovocitos, cigotos y embriones) se llevó a cabo de la siguiente forma: 1) Se depositaron en la solución de equilibrio compuesta por etilenglicol y dimetilsulfóxi-do, ambos al 7.5%. 2) Se trasladaron a la solución de vitrificación compuesta por etilenglicol, 15%; dimetil-sulfóxido, 15%; y sucrosa, 0.5 M; en ésta se aspiraron y se devolvieron con pipeta unas tres veces en un minuto. 3) Se colocaron en la superficie del cryotop (Kitazato Su-pply Co., Fujinomiya, Japón). 4) El cryotop se sumergió bruscamente en un recipiente con nitrógeno líquido para la colocación de su cubierta protectora. 5) Se depositó en el tanque de almacenamiento.

Para la descongelación de los cigotos, se utilizó solución descongelante (TS-sucrosa 1 M), solución diluyente (DS-sucrosa 0.5 M) y solución de lavado en dos pasos (WS1, WS2, Kit vitrificación-Kitazato). Una vez descongelados, los cigotos se colocaron en medio de cultivo Upgraded B2 INRA (CCD), previamente gasificado, donde evolucionaron al estado de cuatro células. El estado de los cigotos, antes y después del procedimiento de vitrificación, puede observarse en las figuras 2 y 3.

Captura

23 ovocitos enmetafase II

No transferencia en fresco

Vitrificación de 13ovocitos

Microinyecciónintracitoplásmica deespermatozoides a 10 ovocitos

Fertilización de 7

Vitrificación de 3 cigotos(2 pronúcleos) y 3 embriones (día 2)

Figura 1. Descripción del flujo ovocitario posterior a la aspiración de los folículos.

Figura 2. Cigotos en fresco.

Tres cigotos se descongelaron dos meses después de su vitrificación. Sobrevivió uno. Dos días después se transfirió a la cavidad un embrión (4 células, 5% de fragmentos, 2 de simetría), bajo guía ecográfica trans-vaginal con cánula de Kitazato.

García Amador MI y col.


Primer nacido vivo en México luego de transferencia de embrión único obtenido a partir de cigotos vitrificados

La transferencia embrionaria se realizó en el ciclo posterior de preparación endometrial con estradiol vía oral, 2 mg diarios los primeros ocho días; cada 12 horas los días 9, 10 y 11; y cada 8 horas a partir del día 12. Se administró progesterona en perlas de 200 mg, 24 horas antes de la descongelación de los cigotos; y 50 mg diarios por vía intramuscular a partir del día de la transferencia embrionaria. El resultado de la subunidad beta de hCG en el día 14 posterior a la transferencia embrionaria fue de 129 mUI/mL y de 320 mUI/mL a las 48 horas.

RESULTADOS

Se confirmó la presencia de un saco gestacional en la semana 5 y latido cardiaco a las 6.3 semanas de gesta-ción. En la semana 37.5 de gestación nació por cesárea una bebé saludable, con peso de 3,300 gramos y Apgar 8/9; sin malformaciones congénitas.

DISCUSIÓN

El proceso de fecundación comprende una serie de eventos que comienzan por la fusión del ovocito con el espermatozoide, que lleva a la aparición de dos pro-núcleos situados juntos, 12 y 16 horas después de la inseminación y que tienden a desaparecer a las 20-22 horas después de la misma.

La vitrificación se basa en la congelación de una mezcla de crioprotectores que, a bajas temperaturas, aumentan su viscosidad y forman un vidrio “sin forma-ción de hielo”.5

Vitrificar en estado de pronúcleos permite la fecun-dación del ovocito en fresco, obviando así la posibilidad potencial de daño al huso meiótico por efecto de las bajas temperaturas, ya que cada vez más estudios sustentan que el riesgo de daño es bajo porque el huso normal-mente desparece durante la congelación y se reestructura después de la descongelación y el cultivo.6-8

Cuando hay cigotos excedentes conviene seleccionar el o los cigotos a vitrificar o a evolucionar. La selección puede llevarse a cabo siguiendo los parámetros de cali-dad establecidos,9-11 cuya aplicación ha demostrado una buena correlación entre calidad del cigoto y posibilidad de implantación; sin embargo, para el caso que se comu-nica no tuvimos la posibilidad de seleccionar los cigotos a vitrificar. La indicación para el procedimiento no fue solamente el excedente en fresco, sino la existencia de datos de hiperestimulación que hacían inconveniente la transferencia embrionaria en fresco.

CONCLUSIÓN

El reporte del primer embarazo en México a partir de cigotos vitrificados refuerza la utilidad de la técnica de vitrificación para la criopreservación exitosa de diferen-tes estructuras biológicas.

Vitrificar en estado de pronúcleos es una forma al-ternativa de criopreservación embrionaria, que en casos específicos puede resultar conveniente.

REFERENCIAS

1. Kuwayama M, Teramoto S, Osada H, Hata K, Kato O. Clini-cal efficiency of vitrification of human embryos. Abstract (P-399) of the 20th Annual Meeting of the ESHRE 2004. Berlín, Alemania.

2. Selman HA, El-Danasouri I. Pregnancies derived from vitri-fied human zygotes. Fertil Steril 2002;77:422-3.

3. Park SP, Kim EY, Oh JH, Nam HK, et al. Ultra-rapid freezing of human multipronuclear zygotes using electron microscope grids. Hum Reprod 2000;15:1787-90.

4. Oriefa Y, Nikolettosb N, AL-Hassanic S. Cryopreservation of two pronuclear stage zygotes. Reviews in Gynaecological Practice 2005;5:39-44.

5. Fahy GM, MacFarlane DR, Angell CA, Meryman HT. Vitri-fication as an approach to cryopreservation. Cryobiology 1984;21:407-26.

6. Gook DA, Osborn SM, Bourne H, Johnston WI. Fertilization of human oocytes following cryopreservation; normal karyo-types and absence of stray chromosomes. Hum Reprod

Figura 3. Cigotos postvitrificación.


1994;9:684-91.7. Rienzi L, Martínez F, Ubaldi F, Minasi MG, et al. Polscope

analysis of meiotic spindle changes in living metaphase II human oocytes during the freezing and thawing procedures. Hum Reprod 2004;19:655-9.

8. Bianchi V, Coticchio G, Fava L, Flamigni C, Borini A. Meiotic spindle imaging in human oocytes frozen with slow freez-ing procedure involving high sucrose concentration. Hum Reprod 2005;20(4);1078-83.

9. Scott LA, Smith S. The successful use of pronuclear embryo

transfers the day following oocyte retrieval. Hum Reprod 1998;13:1003-13.

10. Tesarik J, Greco E. The probability of abnormal preim-plantation development can be predicted by a single static observation on pronuclear stage morphology. Hum Reprod 1999;14:1318-23.

11. Kattera S, Chen C. Developmental potential of human pro-nuclear zygotes in relation to their pronuclear orientation. Hum Reprod 2004;19:294-9.

García Amador MI y col.

Los manuscritos deben elaborarse siguiendo las recomendaciones del Comité Internacional de Editores de Revistas Médicas (N Engl J Med 1997;336:309-15) y se ajustan a las siguientes normas:1. El texto deberá entregarse impreso, por cuadruplicado, en hojas tamaño carta

(21 × 27 cm), a doble espacio, acompañado del disquete con la captura co-rrespondiente e indicando en la etiqueta el título del artículo, el nombre del autor principal y el programa de cómputo con el número de versión. (Ejemplo: Estrógenos en el climaterio. Guillermo Martínez. Word 6.0).

2. Las secciones se ordenan de la siguiente manera: página del título, resumen estructurado, abstract, introducción, material y método, resultados, discu-sión, referencias, cuadros, pies de figuras.

3. La extensión máxima de los originales será de 15 hojas, de los casos clíni-cos 8 hojas y cuatro figuras o cuadros. Las revisiones no excede rán de 15 hojas.

En la primera página figurará el título completo del trabajo, sin superar los 85 caracteres, los nombres de los autores, servicios o departamentos e institución (es) a que pertenece (n) y la dirección del primer autor. Si todos los autores pertenecen a servicios diferentes pero a una misma institución el nombre de ésta se pondrá una sola vez y al final. La identificación de los autores deberá hacerse con uno hasta cuatro asteriscos (*,**,***,****); si son más autores utilice números en super índice.

4. Para fines de identificación cada hoja del manuscrito deberá llevar, en el ángulo superior izquierdo, la inicial del nombre y el apellido paterno del primer autor y en el ángulo derecho el número progresivo de hojas.

5. Todo material gráfico deberá enviarse en diapositivas, en color o blanco y negro, nítidas y bien definidas. En el marco de cada diapositiva se ano-tará, con tinta, la palabra clave que identifique el trabajo, el número de la ilustración, apellido del primer autor y con una flecha se indicará cuál es la parte superior de la figura. Si la diapositiva incluyera material previamente publicado, deberá acompañarse de la autorización escrita del titular de los derechos de autor.

6. Las gráficas, dibujos y otras ilustraciones deben dibujarse profe sionalmente o elaborarse con un programa de cómputo y adjuntarlas al mismo disquete del texto señalando en la etiqueta el programa utilizado.

7. Los cuadros (y no tablas) deberán numerarse con caracteres arábigos. Cada uno deberá tener un título breve; al pie del mismo se incluirán las notas ex-plicativas que aclaren las abreviaturas poco conocidas. No se usarán líneas horizontales o verticales internas. Todos los cuadros deberán citarse en el texto.

8. Tipo de artículos: la revista publica artículos originales en el área de inves-tigación clínica o de laboratorio, editoriales, artículos de revisión, biotecno-logía, comunicación de casos y cartas al editor. Se reciben artículos en los idiomas español e inglés.

9. Resumen. La segunda hoja incluirá el resumen, de no más de 250 palabras y deberá estar estructurado en antecedentes, material y método, resultados y con-clusiones. Con esta estructura se deberán enunciar claramente los propósitos, procedimientos básicos, metodología, principales hallazgos (datos concretos y su relevancia estadística), así como las conclusiones más relevantes. Al final del resumen proporcionará de 3 a 10 palabras o frases clave. Enseguida se incluirá un resumen (abstract) en inglés.

10. Abstract. Es una traducción correcta del resumen al inglés.11. Texto. Deberá contener introducción, material y métodos, resultados y dis-

cusión, si se tratara de un artículo experimental o de observación. Otro tipo de artículos, como comunicación de casos, artículos de revisión y editoria-les no utilizarán este formato.a) Introducción. Exprese brevemente el propósito del artículo. Resuma

el fundamento lógico del estudio u observación. Mencione las refe-rencias estrictamente pertinentes, sin hacer una revisión extensa del tema. No incluya datos ni conclusiones del trabajo que está dando a conocer.

b) Material y método. Describa claramente la forma de selección de los sujetos observados o que participaron en los experimentos (pacientes

o animales de laboratorio, incluidos los testigos). Identifique los mé-todos, aparatos (nombre y dirección del fabricante entre paréntesis) y procedimientos con detalles suficientes para que otros investigadores puedan reproducir los resultados. Explique brevemente los métodos ya publicados pero que no son bien conocidos, describa los métodos nuevos o sustancialmente modificados, manifestando las razones por las cuales se usaron y evaluando sus limitaciones. Identifique exacta-mente todos los medicamentos y productos químicos utilizados, con nombres genéricos, dosis y vías de administración.

c) Resultados. Preséntelos siguiendo una secuencia lógica. No repita en el texto los datos de los cuadros o figuras; sólo destaque o resuma las observaciones importantes.

d) Discusión. Insista en los aspectos nuevos e importantes del estu-dio. No repita pormenores de los datos u otra información ya pre-sentados en las secciones previas. Explique el significado de los resultados y sus limitaciones, incluidas sus consecuencias para la investigación futura. Establezca el nexo de las conclusiones con los objetivos del estudio y absténgase de hacer afirmaciones generales y extraer conclusiones que carezcan de respaldo. Proponga nueva hipótesis cuando haya justificación para ello.

e) Referencias. Numere las referencias consecutivamente siguiendo el orden de aparición en el texto (identifique las referencias en el tex-to colocando los números en superíndice y sin paréntesis). Cuando la redacción del texto requiera puntuación, la referencia será anotada después de los signos pertinentes. Para referir el nombre de la revis-ta utilizará las abreviaturas que aparecen enlistadas en el número de enero de cada año del Index Medicus. No debe utilizarse el término “comunicación personal”. Sí se permite, en cambio, la expresión “en prensa” cuando se trata de un texto ya aceptado por alguna revista, pero cuando la información provenga de textos enviados a una revista que no los haya aceptado aún, citarse como “observaciones no publi-cadas”. Se mencionarán todos los autores cuando éstos sean seis o menos, cuando sean más se añadirán las palabras y col. (en caso de autores nacionales) o et al.(si son extranjeros). Si el artículo referido se encuentra en un suplemento, agregará Suppl X entre el volumen y la página inicial.

La cita bibliográfica se ordenará de la siguiente forma en caso de revis-ta:

Torres BG, García RE, Robles DG y col. Complicaciones tardías de la diabetes mellitus de origen pancreático. Rev Gastroenterol Mex 1992;57:226-9.

Si se trata de libros o monografías se referirá de la siguiente forma: Hernández RF. Manual de anatomía. 2ª ed. México: Méndez Cervan-

tes, 1991;pp:120-9. Si se tratara del capítulo de un libro se indicarán el o los autores del ca-

pítulo, nombre del mismo, ciudad de la casa editorial, editor del libro, año y páginas.

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