Máster Interuniversitario en Zootecnia y Gestión Sostenible:

ganadería ecológica e integrada.

Instituto de Estudios de Postgrado

Universidad de Córdoba

J. De la Fuente INIA – Reproducción Animal y

Conservación Recursos Zoogenéticos

jfuente@inia.es

REPRODUCCIÓN ASISTIDA EN EL VACUNO DE LECHE FIV

Córdoba, Marzo 2012

Impacto de las Tecnologías de

Reproducción Asistida

Mejora Reproductiva Bovina

I.A.

FIV

Clonación

Transgénesis

MOET

Sexaje OPU

1

2

3

4 5

6

7

PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO (FIV):

ÍNDICE

1.- INTRODUCCIÓN

3.- VALORACIÓN DE OVOCITOS

4.- VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA FIV

2.- ASPIRACIÓN DE OVOCITOS :

- OVARIOS DE MATADERO

- DE ANIMALES VIVOS:

* PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA

* PUNCIÓN ECOGRÁFICA

• >200.000 ovocitos al nacer

• 1 ovulación por ciclo - 17 ciclos/año

• Media por vaca < 3 crías

• Descendencia limitada:

– Duración de la gestación

– 1-2 ovocitos ovulados

Cómo MEJORAMOS esto ?

FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE LA HEMBRA BOVINA

Fecundación in vitro

Cultivo In vitro In vivo

Aspiración Ovarios

Maduración Ovocitos

Transferencia

Capacitación Espermas

Fertilización

Embriones

ASPIRACIÓN DE OVOCITOS

1.- OVARIOS DEL MATADERO: En caso de accidente No repetible Aplicación en investigación

2.- ANIMALES VIVOS

2.1.- PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA: Requiere cirugía Repetibilidad limitada (bienestar animal y adhesiones

2.2.- PUNCIÓN ECOGRÁFICA: Repetible y poco invasivo Fácil para vacas gestantes y con problemas Posible en terneras

1.- OVARIOS DE MATADERO:

Aspiración de ovocitos

Búsqueda de ovocitos

2.1.- PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA:

Anestesia quirúrgica Puertos

Suturas

2.1.- PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA:

Ovario SOV

Aspiración

Punción

Producción de embriones in vitro, aspiración laparoscópica en prepúberes

Edad,

meses

Folículos

puncionados

Ovocitos

recuperados

Embriones

desarrollados

6

50

32 (64%)

3 (10%)

7

43

14 (33%)

2 (14%)

8

19

5 (26%)

3 (60%)

9

18

9 (50%)

4 (44%)

2.2.- PUNCIÓN ECOGRÁFICA: Aplicaciones

Vacas cíclicas: semen caro

problema: oviductos bloqueados

quistes ováricos

fallo en la SOV

fallo en la fecundación

post parto: durante el anoestro

gestantes: durante el primer trimestre

Novillas impúberes: desde el primer mes

– Aspiración ultrasonográfica:

– Aguja de 14g.

– 20-22 ml/min de presión de aspiración.

– Medio: PBS + BSA, surfactante.

Aspiración en animales prepúberes

– Tratamiento de superovulación:

• 750 a 1.000 ui de eCG.

• Neutra eCG + GnRH.

• A intervalos de 2 a 4 semanas.

– Intervalo de SOV a la obtención de 48 a 72h.

Punción en hembras prepúberes:

Modificación de la sonda para terneras

A) Rotación axial B) Plano vertical C) Craneal-caudal D) Plano horizontal

Direcciones y planos

Terneras de 6 meses

Imagen ultrasonográfica: ovario estimulado

Punción en hembras prepúberes:

Folículo aspiración transvaginal hembras prepúberes

Aguja de aspiración

Tamaño de los folículos

Punción en hembras prepúberes:

1. Aspiración folicular

4. Recuperación de ovocitos

2. Sedimentación

3. Búsqueda

Metodología de FIV:

OBTENCION DE OVOCITOS:

Primera visión

Denudados Poco CODs

SELECCION DE OVOCITOS:

NO

¿ ?

SI

Expandido

SELECCION DE OVOCITOS:

Vacuolizados

Picnóticos

Placa de

maduración

Grado 1 y 2

Grado 3 y 4

Maduración in vitro

1er corpúsculo polar

MIV durante 24 h

39o C, 5% CO2

Fecundación (FIV)

• Descongelar el semen.

• Capacitación - heparina.

• Selección espermática:

– Swim-up.

– Gradiente de densidad de Percoll.

• 0,5-1 X 106 spz/mL.

• Co-cultivo durante 24 h en 5% CO2 en aire.

Separación espermática con Swim-up

0.25 mL semen + 1 mL medio

DESCONGELACIÓN SPZ

Separación espermática con Percoll

Antes de centrifugar Después de centrifugar

Zigoto

FIV durante 24h

39o C, 5% CO2

Diferencias entre toros al fecundar in vitro e in vivo (7 réplicas por semental, P<0.001)

Toro

Ovocitos

Cultivo

% División

% Desarrollo

TNR (IAs)

A

1.212

73 a

21 a

78% (5.300)

B

1.207

64 b

14 b

73% (1.500)

C

684

56 b

12 b

-

D

615

44 c

5 c

-

Diferencias entre eyaculados de un mismo semental (17 réplicas, P<0.01)

Ovocitos cultivados

(%) División

(%) Eclosión

Eyaculado 1

2.817

70

19

Eyaculado 2

2.604

72

11*

Estabilidad de la cromatina (EC, explica el 36%).

Porcentaje de spz normales determinados por eosina/nigrosina (%ENOR, explica el 25%).

Porcentaje de embriones divididos (%D, explica el 16,8%)

Porcentaje de ovocitos penetrados in vitro (%P, explica el 3,6%).

Ecuación de Predicción de la Tasa de No Retorno (PTNR)

PTNR= 173,11 – 0,02 (EC) + 1,38 (%ENOR) + 0,95 (%D) + 0,39 (%P)

R2 = 0,82

La ecuación para predecir la fertilidad de los toros incluyó cuatro parámetros que explican el 82% de la variación en la fertilidad de los toros estudiados.

Día 2 Día 3 Día 4 Día 5

Día 6 Día 7 Día 8 - 9

Desarrollo de embriones cultivados in vitro

Cultivo in vitro de embriones a los 7-8 días

Pocillo completo

Blastocistos sin ZP, elongados

Blastocistos expandidos

Congelación y vitrificación de embriones producidos in vitro

10% ETG

10´

10% Gly 10% Gly

20% ETG

25% Gly

25% ETG

5´ 5´ 30´´

Viabilidad (%)

Eclosión (%)

Congelación

77/150 (51)

46/150 (31)

Vitrificación

82/147 (56)

52/147 (35)

Viabilidad post descongelación de embriones PIV vitrificados

Viabilidad

Eclosión

1 paso

55% (33/60)

35% (21/60)

2 pasos

56% (38/68)

41% (28/68)

3 pasos(4ºC)

72% (47/65)*

63% (41/65)*

0.5 M S 10 min 35ºC

Comparación entre ambos tipos de producción de embriones bovinos

In vivo

In vitro

Embriones/vaca/año +21 +80

Partos de embriones frescos 60 % 45 %

Partos de emb. congelados 50 % 20 %

Defectos congénitos 1 % 4 %

Distocias 6 % 11 %

Peso al nacimiento

>10 %

FECUNDACIÓN IN VITRO

• VENTAJAS

• Disminución del estrés de manejo.

• Sin interacción sobre la ovulación.

• Utiliza varios sementales sobre una misma vaca.

• Evita la transmisión de enfermedades.

• Realización durante largos períodos fisiológicos.

• Propicio para la investigación.

• Insustituible en la Conservación de Recursos Genéticos.

• INCONVENIENTES

• Bajos resultados en la congelación.

• Equipo y formación muy elevada.

• Síndrome del Ternero Gigante.