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REVISTA MEXICANA DE MEDICINA DE LA

Volumen 3, número 4, abril-junio 2011

Asociación Mexicana de Medicina de la Reproducción, A.C.

Dr. Ranferi Gaona ArreolaPresidente

Dr. Carlos Gerardo Salazar López OrtizVicepresidente

Dr. Alfonso Orta GarcíaSecretario

Dr. Víctor Saúl Vital ReyesProsecretario


Dr. Álvaro Santibáñez Morales Tesorero

Dr. Raymundo Preciado RuizProtesorero

Dr. Gerardo Andrés Alba JassoDr. Juan Carlos Alcivia GarcíaDra. Gabriela García JiménezDra. Laura Hernández Gurrola

Dr. Marcelino Hernández ValenciaVocales

Mesa Directiva 2010-2011

Comité Editorial para la Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción

EditorDr. Gerardo Velázquez Cornejo 2008-2011

Co-EditoresDr. Juan Carlos Hinojosa Cruz 2008-2011Dr. Carlos G. Salazar López Ortiz 2008-2011Dr. Manuel Mario Matute González 2008-2011Dra. Imelda Hernández Marín 2008-2011Dr. Guillermo Santibáñez Moreno 2010-2011

Comité Editorial 2008-2011

Distrito Federal

Dra. Judith Ablanedo AguirreDr. Manuel Álvarez NavarroDr. Luis Ignacio Aviña CuetoDr. Juan Carlos Barros DelgadilloDr. Gerardo Barroso VillaMVZ Esperanza Carballo MondragónDr. Silvio Cuneo ParetoDr. Julio Francisco de la Jara DíazDr. Ranferi Gaona ArreolaDr. Fernando Gaviño GaviñoDra. Imelda Hernández MarínDr. Marcelino Hernández ValenciaDr. Juan Carlos Hinojosa CruzDr. Alberto Kably AmbeDra. Olivia Marín RomeroDra. Ma. Teresa Márquez CristinoDr. Manuel Mario Matute González Dr. Héctor Mondragón AlcocerDr. Carlos Morán VillotaM. en C. Paloma Neri Vidaurri

Dr. Carlos G. Salazar López OrtizDr. Héctor Rogelio Santana GarcíaDr. Álvaro Santibáñez MoralesDr. Claudio Serviere ZaragozaDra. Rosario Tapia SerranoDr. Sergio Téllez VelascoDr. René Toro CalzadaBiol. Gerardo Villegas MorenoDr. Víctor Saúl Vital Reyes

Otras sedes

Dr. Álvaro Sevilla y RuizDr. Ernesto Gallardo LozanoDr. Efraín Pérez PeñaDr. Carlos Félix ArceDr. Rafael Alfonso Sánchez UsabiagaDr. Eduardo del RíoDr. Adán Olivero CeballosDr. Alfonso Batiza ReséndizDr. Antonio Gutiérrez GutiérrezDr. Luis Arturo Ruvalcaba Castellón

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011


Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011

CONTENIDO CONTENTS

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción es el Órgano Oficial de la Asociación Mexicana de Medicina de la Reproduc-ción, A.C. Los artículos y fotografías son responsabilidad exclusiva de los autores. La reproducción parcial o total de este número sólo podrá hacerse previa autorización del editor en jefe. Toda correspondencia relacionada con el contenido y suscripciones deberá dirigirse al editor en jefe: WTC Montecito 38, piso 15, oficina 29, colonia Nápoles, CP 03810, México, DF. Tel.: 9000-2863. E-mail: [email protected] Mexicana de Medicina de la Reproducción: Certificado de Licitud de Título en trámite. Certificado de Licitud de Contenido en trámite. Registro de Reserva del Derecho de Autor número 04-2008-063018255800-102. Autorización como Publicación Periódica por Sepomex en trámite. Publicación realizada, comercializada y distribuida por EDICIÓN Y FARMACIA, SA de CV, José Martí 55, colonia Escandón, CP 11800, México, DF. Tel.: 5678-2811, fax: 5678-4947. Correo electrónico: [email protected] por Computipo Scanner Editorial S.A. Azafrán 313 y 315, Colonia Granjas México, Delegación Iztacalco, CP. 08400. México, DF.

EDITORIAL139 57,481,307 mujeres mexicanas… Gerardo Velázquez Cornejo

ARTÍCULOS DE REVISIÓN143 Vitrificación de ovocitos y embriones Martha Isolina García Amador, Rocío Martínez Armas, Luis Arturo

Ruvalcaba Castellón150 El papel de la proteómica en la definición del secretoma

embrionario humano MG Katz Jaffe, S McReynolds, DK Gardner, WB Schoolcraft160 Fragmentación del ADN espermático: mecanismos de origen,

repercusión en los resultados reproductivos y análisis Denny Sakkas, Juan G Álvarez

ARTÍCULOS ORIGINALES176 Características que optimizan la selección de donantes de

óvulos Laura Fabiola Guadarrama García, Heidi Trejo Castañeda, Zarela

Lizbeth Chinolla Arellano, Jeimy Pedraza Cepeda, Felipe Caldiño Soto, Sandra Cubillos García, Silvio Cuneo Pareto

182 El valor de la suplementación de la fase lútea con valerianato de estradiol y progesterona en un programa de reproducción asistida

Israel Obed Carmona Ruiz, Roberto Santos Haliscak, Pedro Galache Vega, Samuel Hernández Ayup, Víctor Alfonso Batiza Reséndiz, Pablo Díaz Spíndola, María Lidia Arenas Montezco

188 Incidencia de embarazo múltiple en el Hospital Ángeles Lo-mas y su relación con las técnicas de reproducción asistida

Alberto Kably Ambe, Jorge Alberto Campos Cañas, Heidy Ortiz Reyes, Jaime Ignacio Cevallos Bustillos, Diana Elena Monzalbo Núñez

193 Determinantes en el resultado de inseminación intrauterina: análisis de 1,040 ciclos consecutivos

Julio González Cofrades, Carlos Linder Efter, Gustavo Aguirre Ramos, Pablo Vilchis Nava, José Smeke Befeler, Carlos Navarro Martínez, José Antonio Rodríguez Martínez

199 Índice de materias del volumen 3

201 Índice onomástico del volumen 3

EDITORIAL139 57,481,307 Mexican women Gerardo Velázquez Cornejo

REVIEW ARTICLES143 Vitrification of oocytes and embryos Martha Isolina García Amador, Rocío Martínez Armas, Luis Arturo

Ruvalcaba Castellón150 The role of proteomics in defining the human embryonic

secretome MG Katz Jaffe, S McReynolds, DK Gardner, WB Schoolcraft160 Sperm DNA fragmentation: mechanisms of origin impact on

reproductive outcome, and analysis Denny Sakkas, Juan G Álvarez

ORIGINAL ARTICLES176 Characteristics optimizing the selection of oocytes do-

nors Laura Fabiola Guadarrama García, Heidi Trejo Castañeda, Zarela

Lizbeth Chinolla Arellano, Jeimy Pedraza Cepeda, Felipe Caldiño Soto, Sandra Cubillos García, Silvio Cuneo Pareto

182 The value of luteal phase supplementation with estradiol valerianate and progesterone in an assisted reproduction program

Israel Obed Carmona Ruiz, Roberto Santos Haliscak, Pedro Galache Vega, Samuel Hernández Ayup, Víctor Alfonso Batiza Reséndiz, Pablo Díaz Spíndola, María Lidia Arenas Montezco

188 Incidence of multiple pregnancies at Angeles Lomas Hospital and its relation to assisted reproduction techniques


193 Determinants on the results of intrauterine insemination: analysis of 1,040 consecutive cycles


199 Subject index of volume 3

201 Author index of volume 3

139Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción Volumen 3, núm. 4, abril-junio, 2011

Editorial

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción 2011;3(4):139-141

57,481,307 mujeres mexicanas…

Con motivo de la reciente presentación de los resultados definitivos del Censo de Pobla-ción y Vivienda 2010, en este editorial se analizan algunos de sus resultados, particu-

larmente los relacionados con la población femenina. El Instituto Nacional de Estadística y Geografía

(INEGI) es el organismo autónomo responsable de coordinar y dirigir el Sistema Nacional de Información Estadística y Geográfica y de producir y difundir todos sus análisis. El Censo de Población y Vivienda 2010 se realizó del 31 de mayo al 25 de junio.

Los resultados preliminares del censo se dieron a conocer el 25 de noviembre de 2010 y los definitivos, el 3 de marzo de 2011. Al 12 de junio de 2010 el cen-so contabilizó 112,336,538 personas residentes en el territorio mexicano, con una tasa de crecimiento anual de 1.4% para el periodo 2000 a 2010. Desde 1895, año en que iniciaron los censos, la población ha mostrado un crecimiento sostenido, excepto entre 1910 y 1921, periodo en el que la tasa de crecimiento anual fue de 0.5%. La tasa de crecimiento anual alcanzó un máximo de 3.4% en el decenio de 1960 y, desde entonces, ha ido disminuyendo hasta la tasa actual de 1.4%.

Del total de residentes en México en 2010, se con-tabilizaron 54,855,231 hombres (48.8%) y 57,481,307 mujeres (51.2%), lo que significa que hay 95 hombres por cada 100 mujeres.

Llama la atención que nacen más de 103 hombres por cada 100 mujeres, pero en los primeros años la mortalidad de los niños es mayor que la de las niñas. Entre los 15 y 19 años de edad el número de hombres y mujeres es similar; sin embargo, a partir de los 20 años se incrementa el número de mujeres debido, principal-mente, a la mayor migración internacional masculina y

a la mortalidad más elevada de los hombres. Es notoria la diferencia entre los sexos después de la edad de 70 años: por cada 100 mujeres en ese grupo de edad hay 84 hombres, situación que se da por la mayor supervivencia de las mujeres.

De los datos proporcionados por el censo, es posible estimar la población de mujeres en edad reproductiva (15 a 50 años de edad), aunque haya mujeres por debajo y arriba de esas edades que también se reproducen. De las 57,481,307 mujeres, 31,420,895 (54.6%) están en edad reproductiva (Figura 1). Si esa información se ex-trapola a algunos problemas reproductivos que afectan a las mujeres, podrían hacerse algunas estimaciones muy interesantes. Por ejemplo, si la prevalencia de endometriosis se calcula en 10% en mujeres en edad reproductiva, significa que podría haber 3,142,089 mu-jeres afectadas por este padecimiento. Si se calcula que una de cada cuatro mujeres después de la edad de 30 años tiene miomas uterinos, ello implica que –al haber 16,253,635 mujeres entre 30 y 50 años de edad (28.2% del total de mujeres)– aproximadamente 4,063,408 mexicanas podrían estar afectadas por miomas uterinos,

www.nietoeditores.com.mxFigura 1. Mujeres en edad reproductiva.

9.5% 8.8%

7.9%

Edad

7.7% 7.5%

6.3% 6.6%

0

1,000,000

2,000,000

3,000,000

4,000,000

5,000,000

6,000,000

15 a 19

25 a 29

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35 a 39

40 a 44

45 a 50

20 a 24


Editorial

esto sin considerar que las mujeres menores y mayores de esos límites de edad también pueden tener miomas.

Por último, si consideramos que del total de mujeres mexicanas 39.5% están casadas y 14.1% viven en unión libre, significa que 53.6% de ellas se encuentran en pareja. En ese mismo orden de ideas, de las 31,420,895 mujeres que se encuentran en edad reproductiva, alre-dedor de 16,841,599 están formando una pareja. Si se estima que una de cada seis parejas es infértil, entonces en nuestro país hay aproximadamente 2,806,933 parejas infértiles.

En cuanto a la estructura de la población (Figura 2), puede observarse que la pirámide de población del Censo 2010 se ensancha en el centro y se reduce en la base: la proporción de niños ha disminuido y la de adultos se ha incrementado. En el año 2010 la población menor de 15 años representó 29.3% del total, mientras que la que se encontraba en edad laboral (15 a 64 años) constituyó 64.4%, y la población en edad avanzada representaba 6.3% de los habitantes del país. En contraste, en el año 2000 la participación de estos grandes grupos de edad era de 34.1, 60.9 y 5%, respectivamente. Esta transforma-ción en la estructura por edad es muy importante, porque muestra que el país transita por una etapa en la que el volumen de la población en edades laborales alcanza su mayor peso relativo en relación con la población en edades dependientes.

La población mexicana sigue siendo predominan-temente joven; sin embargo, la disminución de la mortalidad y el descenso de la fecundidad han propiciado su envejecimiento paulatino. Ello explica que la edad

Figura 2. Estructura de la población en 1990, 2000 y 2010.

mediana, es decir, la que divide a la población en dos par-tes iguales, en el año 2010 haya sido de 26 años, cuando en 2000 este indicador era de 22 y en 1990, de 19 años.

Algunos de los indicadores que se generan con la in-formación del Censo 2010 muestran las transformaciones que acompañan al proceso de transición demográfica de la sociedad mexicana. Éste es el caso del promedio de hijos nacidos vivos, indicador de la fecundidad, que muestra un descenso hasta llegar ahora a 1.7 hijos para el total de mujeres de 15 a 49 años, cifra que en 1990 y 2000 fue de 2.4 y 2.0, respectivamente. La disminución es perceptible en cada grupo de edad y es más acentuada entre las mujeres que se encuentran en la etapa final de su periodo reproductivo, es decir, las que tienen entre 45 y 49 años. Las mujeres de este grupo de edad tenían 2.2 hijos menos en 2010 de los que tenían en 1990; es decir, hubo una reducción de 40% en la fecundidad medida por el número promedio de hijos nacidos vivos.

La educación es un concepto clave en relación con la fecundidad de la población femenina, pues les permite tener mayor autonomía en la toma de decisiones concer-nientes a su comportamiento reproductivo. Las diferencias de la fecundidad según el nivel de escolaridad son claras. Así, las mujeres más escolarizadas tienen menos hijos que las de menor escolaridad; es decir, mientras las mujeres sin estudios tienen 3.5 hijos, las de instrucción media superior tan sólo tienen 1.1, lo que significa una diferencia de más de dos hijos entre estos dos grupos.

En todos los grupos de edad de los municipios de menor índice de desarrollo humano la fecundidad es sistemáticamente mayor y la diferencia crece, conforme


Editorial

Figura 3. Tasa específica por grupo de edad en 1999 y 2009.Nota: las tasas se presentan para 1999 y 2009 debido a que para su cálculo se utilizan los nacimientos ocurridos en el año anterior al levantamiento de la información.Fuente: INEGI. XII Censo General de Población y Vivienda 2000; Censo de Población y Vivienda 2010.

aumenta la edad de las mujeres, hasta llegar a 3.1 hijos entre las mujeres del grupo de 45 a 49 años (5.9 contra 2.8). Es decir, la fecundidad en los municipios con me-nores niveles de condiciones de vida es más del doble de la que se observa en los municipios de mayor nivel de índice de desarrollo humano.

Las tasas específicas de fecundidad por grupo de edad y la tasa global de fecundidad para los años 1999 (2.9) y 2009 (2.4) permiten hacer las comparaciones corres-pondientes (Figura 3). Los datos confirman la tendencia a la baja, ya observada en años anteriores. En las edades de 20 a 34 años la disminución es de alrededor de 18%. Se destacan los significativos descensos relativos en las mujeres mayores de 39 años, lo que refleja la limitación definitiva de la fecundidad. La fecundidad de las mujeres de 15 a 19 años muestra una de las menores disminucio-nes, que representa 11.7% en este periodo.

En cuanto a la educación, la información censal muestra que 94.7% de la población de 6 a 14 años asiste a la escuela. Hace 20 años 85.8% de los niños en estas edades asistían a centros educativos, lo que implica

que se ha incrementado en alrededor de nueve puntos porcentuales la asistencia total. La población de 15 a 24 años que asiste a la escuela se incrementó en los últimos 20 años en 10 puntos porcentuales. En 1990, 30.2% de las personas en esas edades asistía a la escuela; en 2010, 40.4% asistía a algún centro educativo. Al mismo tiempo, se redujo la brecha entre hombres y mujeres. Hoy, 40.1% de las mujeres y 40.8% de los hombres de ese grupo de edad van a la escuela.

La tasa de analfabetismo es un indicador básico relacionado con el nivel de bienestar de la población y se refiere a la población de 15 años y más que no sabe leer ni escribir. Debido al incremento de la cobertura de la educación básica, la tasa de analfabetismo de la población de 15 años y más disminuyó 5.5 puntos porcentuales entre 1990 y 2010. En 1990, 12.4% de las personas de 15 años y más no sabían leer ni escribir y en 2010 esta cifra se redujo a 6.9%. Desde una óptica generacional, la tasa de analfabetismo disminuye con-forme menor es la edad de las personas, lo que da cuenta de la diferencia en las oportunidades educativas y de los avances entre las generaciones. Para los hombres y las mujeres jóvenes (15-29 años) esta tasa es de 1.9%, lo que sugiere que la población joven es prácticamente alfabeta. Sin embargo, conforme aumenta la edad, la tasa de analfabetismo se incrementa y tiene un com-ponente mayor de mujeres. La diferencia entre sexos en la generación de 75 años y más es de casi nueve puntos porcentuales.

Todos los datos anteriores permiten comprobar no sólo los cambios en la estructura de la población mexi-cana, sino también la mejoría que los mexicanos, y en particular las mexicanas, han experimentado en diversos aspectos, como fecundidad, educación y equidad, entre otros aspectos. Esta importantísima información nos permite extrapolar la forma en que diversos trastornos reproductivos afectan a la mujer mexicana.

Dr. Gerardo Velázquez Cornejo

15 a 19

25 a 29

30 a 34

35 a 39

40 a 44

45 a 50

20 a 24 0 20 40 60 80

100 120 140 160 180

1999 2009

Edad


Los manuscritos deben elaborarse siguiendo las recomendaciones del Comité Internacional de Editores de Revistas Médicas (N Engl J Med 1997;336:309-15) y se ajustan a las siguientes normas:1. El texto deberá entregarse impreso, por cuadruplicado, en hojas tama-

ño carta (21 × 27 cm), a doble espacio, acompañado del disquete con la captura correspondiente e indicando en la etiqueta el título del artículo, el nombre del autor principal y el programa de cómputo con el número de versión. (Ejemplo: Estrógenos en el climaterio. Guillermo Martínez. Word 6.0).

2. Las secciones se ordenan de la siguiente manera: página del título, resumen estructurado, abstract, introducción, material y método, re-sultados, discusión, referencias, cuadros, pies de figuras.

3. La extensión máxima de los originales será de 15 hojas, de los casos clínicos 8 hojas y cuatro figuras o cuadros. Las revisiones no excede-rán de 15 hojas.

En la primera página figurará el título completo del trabajo, sin superar los 85 caracteres, los nombres de los autores, servicios o departamentos e institución (es) a que pertenece (n) y la dirección del primer autor. Si todos los autores pertenecen a servicios diferentes pero a una misma institución el nombre de ésta se pondrá una sola vez y al final. La identificación de los autores deberá hacerse con uno hasta cuatro asteriscos (*,**,***,****); si son más autores utilice números en super índice.

4. Para fines de identificación cada hoja del manuscrito deberá llevar, en el ángulo superior izquierdo, la inicial del nombre y el apellido paterno del primer autor y en el ángulo derecho el número progresivo de hojas.

5. Todo material gráfico deberá enviarse en diapositivas, en color o blan-co y negro, nítidas y bien definidas. En el marco de cada diapositiva se anotará, con tinta, la palabra clave que identifique el trabajo, el número de la ilustración, apellido del primer autor y con una flecha se indicará cuál es la parte superior de la figura. Si la diapositiva incluyera ma-terial previamente publicado, deberá acompañarse de la autorización escrita del titular de los derechos de autor.

6. Las gráficas, dibujos y otras ilustraciones deben dibujarse profe-sionalmente o elaborarse con un programa de cómputo y adjuntarlas al mismo disquete del texto señalando en la etiqueta el programa utilizado.

7. Los cuadros (y no tablas) deberán numerarse con caracteres arábigos. Cada uno deberá tener un título breve; al pie del mismo se incluirán las notas explicativas que aclaren las abreviaturas poco conocidas. No se usarán líneas horizontales o verticales internas. Todos los cuadros deberán citarse en el texto.

8. Tipo de artículos: la revista publica artículos originales en el área de investigación clínica o de laboratorio, editoriales, artículos de revisión, biotecnología, comunicación de casos y cartas al editor. Se reciben artículos en los idiomas español e inglés.

9. Resumen. La segunda hoja incluirá el resumen, de no más de 250 pala-bras y deberá estar estructurado en antecedentes, material y método, resul-tados y conclusiones. Con esta estructura se deberán enunciar claramente los propósitos, procedimientos básicos, metodología, principales hallaz-gos (datos concretos y su relevancia estadística), así como las conclusio-nes más relevantes. Al final del resumen proporcionará de 3 a 10 palabras o frases clave. Enseguida se incluirá un resumen (abstract) en inglés.

10. Abstract. Es una traducción correcta del resumen al inglés.11. Texto. Deberá contener introducción, material y métodos, resultados

y discusión, si se tratara de un artículo experimental o de observación. Otro tipo de artículos, como comunicación de casos, artículos de revi-sión y editoriales no utilizarán este formato.a) Introducción. Exprese brevemente el propósito del artículo. Re-

suma el fundamento lógico del estudio u observación. Mencione las referencias estrictamente pertinentes, sin hacer una revisión extensa del tema. No incluya datos ni conclusiones del trabajo que está dando a conocer.

b) Material y método. Describa claramente la forma de selección de los sujetos observados o que participaron en los experimen-tos (pacientes o animales de laboratorio, incluidos los testigos).

Normas para autores

Identifique los métodos, aparatos (nombre y dirección del fabri-cante entre paréntesis) y procedimientos con detalles suficientes para que otros investigadores puedan reproducir los resultados. Explique brevemente los métodos ya publicados pero que no son bien conocidos, describa los métodos nuevos o sustancialmente modificados, manifestando las razones por las cuales se usaron y evaluando sus limitaciones. Identifique exactamente todos los medicamentos y productos químicos utilizados, con nombres ge-néricos, dosis y vías de administración.

c) Resultados. Preséntelos siguiendo una secuencia lógica. No re-pita en el texto los datos de los cuadros o figuras; sólo destaque o resuma las observaciones importantes.

d) Discusión. Insista en los aspectos nuevos e importantes del es-tudio. No repita pormenores de los datos u otra información ya presentados en las secciones previas. Explique el significado de los resultados y sus limitaciones, incluidas sus consecuen-cias para la investigación futura. Establezca el nexo de las con-clusiones con los objetivos del estudio y absténgase de hacer afirmaciones generales y extraer conclusiones que carezcan de respaldo. Proponga nueva hipótesis cuando haya justificación para ello.

e) Referencias. Numere las referencias consecutivamente siguien-do el orden de aparición en el texto (identifique las referencias en el texto colocando los números en superíndice y sin paréntesis). Cuando la redacción del texto requiera puntuación, la referencia será anotada después de los signos pertinentes. Para referir el nom-bre de la revista utilizará las abreviaturas que aparecen enlistadas en el número de enero de cada año del Index Medicus. No debe utilizarse el término “comunicación personal”. Sí se permite, en cambio, la expresión “en prensa” cuando se trata de un texto ya aceptado por alguna revista, pero cuando la información provenga de textos enviados a una revista que no los haya aceptado aún, citar-se como “observaciones no publicadas”. Se mencionarán todos los autores cuando éstos sean seis o menos, cuando sean más se añadi-rán las palabras y col. (en caso de autores nacionales) o et al.(si son extranjeros). Si el artículo referido se encuentra en un suplemento, agregará Suppl X entre el volumen y la página inicial.

La cita bibliográfica se ordenará de la siguiente forma en caso de revista:

Torres BG, García RE, Robles DG y col. Complicaciones tardías de la diabetes mellitus de origen pancreático. Rev Gastroenterol Mex 1992;57:226-9.

Si se trata de libros o monografías se referirá de la siguiente for-ma:

Hernández RF. Manual de anatomía. 2ª ed. México: Méndez Cer-vantes, 1991;pp:120-9.

Si se tratara del capítulo de un libro se indicarán el o los autores del capítulo, nombre del mismo, ciudad de la casa editorial, editor del libro, año y páginas.

12. Trasmisión de los derechos de autor. Se incluirá con el manuscrito una carta firmada por todos los autores, conteniendo el siguiente pá-rrafo: “El/los abajo firmante/s transfiere/n todos los derechos de autor a la revista, que será propietaria de todo el material remitido para pu-blicación”. Esta cesión tendrá validez sólo en el caso de que el trabajo sea publicado por la revista. No se podrá reproducir ningún material publicado en la revista sin autorización.

Revista Mexicana de Medicina de la Reproducción se reserva el derecho de realizar cambios o introducir modificaciones en el estudio en aras de una mejor comprensión del mismo, sin que ello derive en un cambio de su contenido. Los artículos y toda correspondencia relacionada con esta publi-cación pueden dirigirse a la siguiente dirección: WTC Montecito 38, piso 15, oficina 29, colonia Nápoles, CP 03810, México, DF. Tel.: 9000-2863. Correo electrónico: [email protected]


* Instituto Mexicano de Infertilidad, Guadalajara, Jalisco.

Correspondencia: Dra. Martha Isolina García Amador. Instituto Mexicano de Infertilidad. Blvd. Puerta de Hierro 5150-503C, co-lonia Plaza Corporativa Zapopan, CP 45116, Zapopan, Jalisco. Correo electrónico: [email protected]: febrero, 2011. Aceptado: abril, 2011.

Este artículo debe citarse como: García-Amador MI, Martínez-Armas R, Ruvalcaba-Castellón LA. Vitrificación de ovocitos y embriones. Rev Mex Reprod 2011;3(4):143-149.

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En 1983 Trounson y col.1 fueron los primeros en sumergir un ovocito directamente en nitrógeno líquido con aceptables tasas de supervivencia y fertilización, pero bajas de

segmentación. En 1984, Zeilmarker y col. comunicaron el primer nacimiento luego de transferir embriones descongelados.2

El primer nacido de un ovocito criopreservado fue reportado por Chen en 1986, quien utilizó la congela-ción lenta y dimetilsulfóxido (DMSO).3 Esta técnica fue mejorando a través de los años como resultado de cambios en los componentes de los medios de cultivo utilizados: medios basados en colina,4 reducidos en so-

Artículo de revisión


Vitrificación de ovocitos y embrionesMartha Isolina García Amador,* Rocío Martínez Armas,* Luis Arturo Ruvalcaba Castellón*

RESUMEN

En 1983, Trounson y colaboradores fueron los primeros en sumergir un ovocito directamente en nitrógeno líquido con tasas acep-tables de supervivencia y fertilización, pero bajas de segmentación. En 1984, Zeilmarker y su grupo reportaron el primer nacimiento luego de transferir embriones descongelados. En este artículo se revisan los aspectos generales de esta técnica y los resultados de la vitrificación de ovocitos, cigotos y embriones.Palabras clave: vitrificación, criopreservación, vitrificación de ovocitos, vitrificación de embriones.

ABSTRACT

In 1983, Trounson et al sumerged an oocyte directly on liquid nitrogen with acceptable rates of survival and fertilization, but low rates of cleavage. In 1984, Zeilmarker et al reported the first birth after transfering defrozen embryos. This paper reviews the general aspects of vitrification technique, as well as the results of the oocytes, cygotes and embryos vitrification.Key words: vitrification, cryopreservation, oocyte vitrification, embryo vitrification.

dio,5,6 optimización de crioprotectores7,8 y, por supuesto, de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI),9 que generó nuevas promesas en factor masculino severo y marcó un punto de inflexión en la fertilización hasta entonces limitada por el endurecimiento de la zona pelúcida ovocitaria secundario a las bajas temperaturas durante el proceso de congelación.10,11

Rall y Fahy12 establecieron que la vitrificación consis-tía en solidificar una solución por enfriamiento rápido. Al inducir un estado vidrioso por elevación extrema de su viscosidad, demostraron su aplicación práctica en la criopreservación de embriones mamíferos y la conside-raron una alternativa potencial a la congelación lenta.

Kuleshova y col.,13 en 1999, reportaron el primer naci-do vivo derivado de la vitrificación de ovocitos humanos, luego de vitrificar 17 ovocitos con etilenglicol (40%) y 0.6 M/L de sucrosa en open pulled straws (OPS). Desde su descripción, importantes modificaciones han nutrido la técnica potenciando resultados que demuestran su eficacia y seguridad clínica.

ASPECTOS TERMINOLÓGICOS RELACIONADOS

Una revisión a la terminología empleada para los pro-cesos criobiológicos implicados en la vitrificación ha


García Amador MI y col.

sido realizada recientemente. Shaw y Jones, en 2003, establecieron claramente el significado en criobiología de los términos congelación (freezing) y descongelación (thawing), y afirmaron que sólo podían usarse para pro-cedimientos donde se formaran o derritieran cristales de hielo (como sinónimo de deshielo o derretimiento).14 Cooling y warming, cuyo significado en inglés es en-friamiento y calentamiento, sólo se refieren a cambios de temperatura y pueden utilizarse indistintamente para la congelación tradicional y para la vitrificación. El con-senso actual entre los criobiólogos es usar los términos congelación-descongelación para la congelación lenta y procesos relacionados, y calentamiento-enfriamiento para la vitrificación, es decir, términos vinculados con los cambios de temperatura y no de formación y derre-timiento de cristales de hielo.

Con base en estos argumentos, se ha propuesto, como primer paso en la dirección correcta, reemplazar de manera adecuada los términos en las etiquetas de los medios de vitrificación, como soluciones de calen-tamiento (warming solutions) en lugar de soluciones de descongelación (thawing solutions).15

VITRIFICACIÓN

Es la solidificación de una solución a bajas temperaturas, no por cristalización, sino por elevación de su viscosidad (Rall y Fahy, 1985), y supone el uso de crioprotectores en mínimo volumen y elevadas concentraciones a velocidad ultra-rápida de enfriamiento.

Aspectos generales de la técnicaEn la vitrificación, la célula y su entorno se solidifican en una forma similar al vidrio sin que se formen cristales de hielo. Es una técnica en la que se utilizan altas con-centraciones de crioprotectores en mínimo volumen y elevadas velocidades de enfriamiento (15,000-30,000ºC/min),16 lo que genera como consecuencia la ausencia de cristales de hielo durante los procesos de congela-ción-descongelación,17 una mejor conservación de la ultraestructura y menor daño a la fisiología ovocitaria.18 Borini y col. señalaron que los protocolos subóptimos para criopreservación de ovocitos pueden causar daño subletal vinculado con capacidad limitada para la fer-tilización.19

La alta osmolaridad de la solución de vitrificación rápidamente deshidrata la célula. Sumergirla brusca-mente en nitrógeno líquido la solidifica, de manera que el agua intracelular no tiene tiempo para formar cristales y provocar daño a los organelos intracelulares, lo que incrementa su potencial de supervivencia.20

Algunos autores siguen mostrando preocupación por las altas concentraciones de crioprotectores utilizadas, por su potencial citotoxicidad y por la posibilidad de con-taminación relacionada con el uso de sistemas abiertos.21

Contaminación cruzadaSe ha mencionado el riesgo de contaminación cruzada por patógenos bacterianos o virales secundario al uso de sistemas abiertos que permiten el contacto directo con el nitrógeno líquido, e incluso con el vapor de éste, en los tanques de almacenamiento.22,23

Al respecto se ha sugerido filtrar el nitrógeno con un filtro de 0.2 µm, el cual puede eliminar bacterias y hon-gos, para luego almacenarlo en el tanque de nitrógeno líquido en fase de vapor, o exponerlo a luz ultravioleta. Se destaca la incapacidad que tienen algunos gérmenes para penetrar una zona pelúcida intacta e infectar la célula.24 También contribuyen a disminuir la posibilidad de contaminación los lavados a los que se someten los ovocitos y los embriones luego de ser descongelados, y los sistemas secos de almacenamiento.

Se ha propuesto la colocación de las muestras y las herramientas (cryotop, open pulled straws, OPS, etcé-tera) después del enfriamiento en el interior de pajillas preenfriadas, preferiblemente de alta seguridad (CBS Strauss), selladas al calor y almacenadas en contenedores comunes sin peligro de contaminación cruzada. Para el enfriamiento, puede cortarse uno de los extremos de la pajilla, removerse la herramienta con la muestra y sumergirse directamente en el medio de calentamiento. Este abordaje fue usado por Vajta, en 1998, y Bielanski y Animan lo probaron recientemente.25

Isachenko y col. compararon los resultados obteni-dos al vitrificar 376 embriones pronucleares a los que previamente se les había realizado biopsia, asignados al azar a uno de dos grupos (cada grupo de 183 embriones).En el grupo 1 la vitrificación se hizo en pajillas abiertas y estiradas (open pulled straw, OPS) que se colocaron directamente en nitrógeno líquido (vitrificación directa);


Vitrificación de ovocitos y embriones

con la pipeta Pasteur en dos ocasiones cada tres minutos hasta completar 10 minutos.

Luego, se trasladan a la solución de vitrificación, compuesta por etilenglicol a 15%, dimetilsulfóxido a 15% y sucrosa (0.5 M,VS). En ésta son aspirados y devueltos tres o cuatro veces antes de ser depositados sobre la superficie del cryotop (Kitazato Supply Co., Fujinomiya, Japón).

Finalmente, el cryotop se sumerge en nitrógeno lí-quido para la colocación de su cubierta protectora y ser almacenado en el tanque de nitrógeno.

Calentamiento o descongelación1. Los ovocitos se depositan en solución descongelante (TS) a 37ºC durante un minuto. Seguidamente en so-lución diluyente (DS) por tres minutos, y después se trasladan a la solución de lavado (WS1) durante cinco minutos y (WS2) por cinco minutos más.

2. Los ovocitos supervivientes se dejan en medio de cultivo dos a cuatro horas y posteriormente se microin-yectan mediante la técnica convencional de inyección intracitoplasmática de espermatozoides.

Se han hecho algunas modificaciones a la técnica ori-ginal, principalmente en cuanto a tiempos y volúmenes, en diferentes pasos. Se incorporará un nuevo suplemento en la solución de vitrificación de manera específica (comunicación vía telefónica con el Dr. Masashige Kuwayama), la hidroxipropilcelulosa con la finalidad de mejorar las ya excelentes tasas de supervivencia, fertilización y segmentación.

Resultados de la vitrificación de ovocitosKuwayama reportó el primer embarazo a partir de ovocitos vitrificados utilizando cryotop en el año 2002, en Japón. Los resultados publicados en 2005 fueron: supervivencia de 91% (58/64), segmentación de 81%, embriones en estadio de blastocisto en 50%, implan-tación de 11.2% (12/107), y 41% de embarazos por embrión transferido.28 En la actualidad, muchos centros de reproducción en todo el mundo han implantado su técnica con excelentes resultados y reproducibilidad.

Katayama29 reportó, luego de la descongelación de ovocitos vitrificados, índices de supervivencia de 94%; de fertilización por inyección intracitoplasmática de espermatozoides de 91% y división celular de 90%. Kim

en el otro grupo, se hizo en una pajuela estéril de inseminación de 90 mm cerrada (sistema aséptico; OPS, straw in straw). Las tasas de desarrollo a blastocisto expandido después de cultivo in vitro fueron de 25% en el grupo con vi-trificación directa, y de 23% en el grupo con straw in straw, y se concluyó que la vitrificación de embriones pronucleares, sometidos previamente a biopsia, coloca-dos en pajillas estiradas abiertas (OPS) y en un recipiente herméticamente cerrado, antes de sumergirla en el ni-trógeno líquido, permite un aislamiento confiable, evita la contaminación por microorganismos patógenos y no afecta la supervivencia si hay descongelación rápida con remoción simultánea de los crioprotectores.26

La realización de un estudio serológico, cervical o seminal para Mycoplasma, ureaplasma, virus de la he-patitis B o C, VIH, herpes tipo II, entre otros, en todas las parejas contempladas para ciclo de reproducción asistida, ovodonadoras y donantes de semen permitirá un doble mecanismo de protección ante el riesgo de contaminación cruzada.

En el Instituto Mexicano de Infertilidad (IMI), de Guadalajara, Jalisco, los ovocitos de metafase II identificados por la extrusión del primer cuerpo polar, excedentes o destinados por alguna otra indicación, son vitrificados en cryotop según la técnica descrita por Kuwayama.27 Existen otros dispositivos para vitrificar ovocitos, embriones, o ambos (Cuadro 1).

TécnicaInicialmente, los ovocitos se depositan en la solución de equilibrio que contiene etilenglicol a 7.5% y dimetil-sulfóxido a 7.5% (ES), haciendo puentes entre las gotas

Cuadro 1. Algunas herramientas o dispositivos utilizados para la vitrificación de ovocitos o embriones

Autores Dispositivo

Kuleshova (1999), Chen (2000), Cuello (2008) Open pull straw (OPS)

Park (1999), Yoon (2000), Son (2003) Cooper GridsPapis (2000) MicrodropsLieberman (2002), Vanderzwalmen (2003) HemistrawKatayama (2003), Kuwayama (2005) CryotopLane (2001), Mukaida (2001) CroloopKuwayama (2005) CryotipLin, Chen Chiang (2008) Cryoleaf



(2006) encontró un índice de supervivencia de 81%, y de fertilización y división celular de 63.8 y 95.9%, respec-tivamente;30 Lucena y col. (2006), de 8.2% (13/159);31 Antinori y su grupo (2007), de 11.8% (39/330);32 Cobo (2008) obtuvo cifras de supervivencia de 96.9% y de fertilización de 76.3%;33 mientras que Schoolcraft y col. (2009) registraron tasas de implantación por ovocito “desvitrificado” de 8.8% (14/160).34

En un estudio multicéntrico se publicaron resultados obstétricos y perinatales de 165 embarazos (200 lactan-tes) derivados de la vitrificación de ovocitos en cryotop o cryoleaf. La proporción de embarazo múltiple fue de 17% (26 fueron gemelares y dos, triples). Se realizó cesárea en 37% de los embarazos únicos (n = 51). El peso promedio de los nacidos únicos fue de 2,920 ± 37 g y de 2,231 ± 55 g para los múltiples. La incidencia de anomalías congénitas en esa cohorte de nacidos vivos fue de 2.5% (dos defectos septales ventriculares, una atresia biliar, una anomalía ósea en el miembro inferior y un hemangioma de piel, comparable con las concepciones espontáneas en mujeres fértiles, o de mujeres fértiles en ciclos de fertilización in vitro).35

Vitrificación y alteraciones en el huso meióticoEl aparato microtubular del huso meiótico es una estructura dinámica que facilita la segregación de los cromosomas en células hijas durante la mitosis y en el primer y segundo cuerpos polares durante la meiosis. Algunos autores han señalado alteraciones en la segrega-ción de los cromosomas durante la meiosis II, derivadas de la exposición a bajas temperaturas.36-39 Otros sugieren que el huso meiótico puede sobrevivir a procesos de congelación-descongelación sin consecuencias, o al menos sin incremento en el número de aneuploidías en los embriones resultantes, dado que se pierde durante la congelación y se recupera después de la descongelación y cultivo.40-43 De Santis considera que éste no debe ser un indicador de la función ovocitaria.44

La criopreservación de ovocitos se ha analizado también mediante microscopio de luz polarizada, el cual ofrece la oportunidad de visualizar el huso meiótico de manera no invasora. La estructura ordenada de los micro-túbulos del huso genera el fenómeno de birrefringencia que crea una diferencia en contraste entre el huso y el resto de la célula. Esto puede detectarse por medio de

algún método de imágenes, como el poloscopio, que am-plifica las señales de birrefringencia y hace cuantificable el grado de orientación de los microtúbulos.45

Notola y col. (2009) evaluaron, mediante microscopia electrónica y de manera comparativa, los posibles efec-tos que los protocolos de vitrificación pueden tener en las características ultraestructurales de ovocitos vitrificados en cryoleaf y cryoloop. Específicamente, se valoró la presencia y extensión de vacuolas citoplasmáticas, la calidad de los organelos, la textura de la zona pelúcida, la integridad del citoplasma, la apariencia del espacio perivitelino y el arreglo del huso meiótico. Se analizó el comportamiento de 35 ovocitos, 10 vitrificados en cryoleaf, 10 en cryoloop y 15 en el grupo control (fres-co). Estos ovocitos mostraron características similares a los ovocitos en fresco en cuanto a forma y textura del citoplasma. En los tres grupos (los dos de vitrificación y el fresco) se observaron vacuolas esporádicas. El número de gránulos corticales estuvo anormalmente reducido en los ovocitos criopreservados, y en algunas ocasiones estuvo vinculado con una compactación incrementada del aspecto interno de la zona pelúcida.46

También se han descrito características atípicas, como una tendencia a la elongación del huso, protrusión de los cromosomas fuera del mismo y aumento en la distancia polo-polo de la mano de una disminución en lo ancho (en la porción ecuatorial) del huso meiótico (14.9 ± 2.3 µm) en comparación con el control en fresco (12.4 ± 2.6 µm) [p = 0.001].47

La repercusión de algunas manifestaciones continúa siendo incierta, y para algunos autores es razonable sos-pechar que podrían indicar un incremento en el riesgo de errores meióticos.48

Vitrificación de cigotosDe manera teórica, puede hacerse la vitrificación a los embriones en todos los estados de preimplantación. No hay suficiente sustento científico para aseverar cuál de los estados embrionarios en particular tolera mejor los cambios que implica la técnica, además de que las di-ferencias estructurales limitan la comparación. Aunque para algunos la congelación en pronúcleos pareciera ser el estado ideal para la criopreservación embrionaria,49 no es en realidad el estadio más común de criopreservación del excedente en fresco en un ciclo de fertilización in



vitro. Uno de los inconvenientes descritos del embrión en otras etapas de desarrollo es que la apariencia mor-fológica no aporta suficientes elementos que permitan intuir su calidad y potencial implantatorio.

En un estudio realizado en el Instituto Mexicano de Infertilidad (IMI) de julio de 2006 a enero de 2008 se evaluó la supervivencia, segmentación y proporción de embarazos tras la vitrificación y descongelación de 104 cigotos y 314 embriones en cuatro células. La edad promedio fue de 34.6 ± 4.9 años (n = 26) para el grupo I, y de 33.8 ± 4.5 años para el grupo II (n = 85). La supervivencia fue de 86 y 89%, respectivamente. En el grupo I, la proporción de embarazos fue de 50% (13/26) y no hubo pérdida gestacional. En el grupo II, fue de 28% (24/85), y hubo tres pérdidas gestacionales. No se encontraron diferencias significativas al comparar edad, porcentajes de supervivencia ni promedio de embriones transferidos; sí las hubo en la proporción de embarazo (χ2 = 5.22; gl 1; p < 0.05).50

Vitrificación de embrionesEn 2007 Ali y col. observaron que una disminución en la velocidad de congelación reducía las tasas de super-vivencia embrionaria y debía ser compensada por altas concentraciones intracelulares de crioprotectores.51 La exposición a los crioprotectores también puede ser da-ñina, aun cuando no haya congelación, si no se realiza en la forma correcta.52

En un metanálisis reciente se compararon los resultados obtenidos en la criopreservación de em-briones por congelación lenta y vitrificación. Sólo se eligieron cuatro de 873 estudios, tres de los cuales eran ensayos controlados con asignación al azar. Se compa-raron 8,824 blastocistos congelados por vitrificación (n = 7,482) vs congelación lenta (n = 1,342). Las tasas de supervivencia y de segmentación embrionaria fueron significativamente mayores después de la vitrificación, en comparación con la congelación lenta (razón de momios: 15.57, intervalo de confianza de 95%: 3.68 a 65.82; al azar modelo de efectos). La revisión concluyó que la vitrificación está vinculada con tasas de supervivencia significativamente mayores que la congelación lenta.53 Debido a que sólo un pequeño número de blastocistos está disponible para la criopreservación, es necesaria una forma simple, rápida y confiable para optimizar el

resultado de la transferencia. Mukaida, en 2001, reportó el primer nacimiento exitoso después de la transferencia de blastocistos humanos vitrificados utilizando el cryloop,54 y subsecuentemente encontró altas tasas de supervivencia (87.5%), implantación (29%) y embarazo (44%) después de 223 ciclos usando cryoloop.55

Zhang y col., en 2009, criopreservaron embriones en los días 3, 4 o 5 después de la biopsia, y compararon los resultados luego de vitrificarlos (tres horas después de la biopsia) con los de un grupo control. La vitrificación la realizaron con cryoleaf (Medicult). Obtuvieron tasas similares de supervivencia para los embriones vitrifica-dos en estado de mórula (tras biopsia y sin biopsia): 87.5 vs 92%, p = 0.037. La supervivencia en los blastocistos fue mayor para el grupo de biopsia (95.7%) que para el de control (81.4%), p = 0.035.56

Revitrificación de embrionesEn estudios previos se ha evaluado la seguridad de los ciclos de congelación y recongelación usando embriones de ratón, y se ha demostrado que éstos podían sobre-vivir a tres ciclos de congelación-descongelación y ser capaces de desarrollarse in vitro57-59 tras la recongelación (congelación lenta).

Hace poco, Takahashi y Araki (2004) reportaron el nacimiento de un bebé saludable derivado de un embrión revitrificado en estado de blastocisto.60 Yoko y col.61 hicieron un estudio comparativo con pacientes en ciclo de in vitro a las que se les transfirieron embrio-nes vitrificados inicialmente en estado de pronúcleos, que fueron descongelados y revitrificados en estado de mórula o blastocisto por tener todavía embriones supernumerarios, y un grupo control en el que se trans-firieron embriones tras un solo ciclo de vitrificación. La tasa de cancelación que encontraron fue de 28% para el grupo de estudio vs 17.4% para el grupo control, diferencia estadísticamente no significativa, con tasas de supervivencia similares: 84 vs 88.9%. Las tasas de embarazo por ciclo de transferencia fueron de 27.8 vs 25.9%. La proporción de aborto espontáneo fue de 32 vs 20% (diferencia no significativa).

En 2009, Ruvalcaba y col.62 reportaron un embarazo exitoso a partir de ovocitos vitrificados donados, revi-trificación en estadio de cuatro células con posterior “descongelación” y transferencia en el mismo estadio.



De momento, ésta es una herramienta que puede utilizarse en casos estrictamente necesarios; deberán realizarse más estudios para avalar su seguridad clínica. Es fundamental que se informe a la pareja de los bene-ficios y riesgos de continuar el tratamiento. Conviene, para prevenir embriones excedentes después de una primera vitrificación, que al momento de la aspiración sólo se insemine una parte razonable de los ovocitos que genere un justo número de embriones; en el caso de vitrificación de embriones, no deben pasar de tres o cuatro por herramienta (cryotop, cryoleaf, cryoleaf, etcétera).

CONCLUSIÓN

La vitrificación es un método simple que ha revolucio-nado la criobiología y es de gran utilidad clínica en los centros de reproducción asistida. Al margen del dispo-sitivo utilizado (cryotop, cryoleaf, cryoloop, etcétera), los resultados alcanzados en el orden de supervivencia y preservación de la función han demostrado que es una técnica segura, reproducible y de alto rendimiento.

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El papel de la proteómica en la definición del secretoma embrionario humano*MG Katz Jaffe, S McReynolds, DK Gardner, WB Schoolcraft

RESUMEN

La evaluación no invasiva de gametos y embriones se considera un aspecto importante en la tecnología de reproducción asistida. Actualmente, la selección de embriones para transferencia se basa en índices morfológicos. Aunque exitoso, el campo de la tecnología de reproducción asistida se beneficiaría de un método cuantitativo no invasivo para la determinación de la viabilidad. Las técnicas ómicas, incluidas la transcriptómica, proteómica y metabolómica, han empezado a proporcionar evidencia de que los gametos y embriones viables poseen perfiles moleculares únicos con biomarcadores potenciales que pueden utilizarse para la selección del desarrollo, de la viabilidad, o de ambas. A diferencia del genoma humano que es relativamente fijo y estable en todo el cuerpo hu-mano, el proteoma humano, estimado en más de un millón de proteínas, es más complejo, diverso y dinámico. Las proteínas en sí mismas contribuyen a la homeostasia fisiológica de cualquier célula o tejido. De interés particular en la tecnología de reproducción asistida es el secretoma, las proteínas producidas dentro del embrión y secretadas en el ambiente circundante. La definición del secretoma embrionario humano tiene el potencial de expandir nuestro conocimiento de los procesos celulares embrionarios, incluido el complejo diálogo entre el embrión en desarrollo y su ambiente materno, y también puede ayudar en la identificación de los embrio-nes con mayor potencial de implantación. Los avances en las técnicas proteómicas han permitido la caracterización no invasiva del secretoma embrionario humano con la investigación en curso enfocada en la correlación con el resultado. Desde una perspectiva clínica, la selección de embriones basada en la evaluación morfológica y el análisis no invasivo del secretoma embrionario humano puede aumentar el éxito de la FIV y resultar en la transferencia rutinaria de embriones individuales. Palabras clave: proteómica, embrión, secretoma, evaluación no invasiva.

ABSTRACT

Non-invasive gamete and embryo assessment is considered an important focus in assisted reproductive technologies (ART). Currently, the selection of embryos for transfer is based on morphological indices. Though successful, the field of ART would benefit from a non-invasive quantitative method of viability determination. Omics technologies, including transcriptomics, proteomics and metabolomics, have already begun providing evidence that viable gametes and embryos possess unique molecular profiles with potential biomarkers that can be utilized for developmental and/or viability selection. Unlike the human genome that is relatively fixed and steady throughout the human body, the human proteome, estimated at over a million proteins, is more complex, diverse and dynamic. It is the proteins themselves that contribute to the physiological homeostasis in any cell or tissue. Of particular interest in ART is the secretome, those proteins that are produced within the embryo and secreted into the surrounding environment. Defining the human embryonic secretome has the potential to expand our knowledge of embryonic cellular processes, including the complex dialogue between the developing embryo and its maternal environment, and may also assist in identifying those embryos with the highest implantation potential. Advances in proteomic technologies have allowed the non-invasive profiling of the human embryonic secretome with ongoing research focused on correlation with outcome. From a clinical perspective, embryo selection based on morphological assessment and non-invasive analysis of the human embryonic secretome may improve IVF success and lead to routine single embryo transfers.Key words: proteomics, embryo, secretome, non-invasive assessment.

Actualmente se ha insistido en la necesidad de la selección embrionaria, no sólo para transferir embriones con mejores posibilidades de implantación. Los llamados “omics” –entre los cuales se cuentan los “proteomics”– nos permiten lograr una mejor selección embrionaria no invasiva, además de conocer más sobre los procesos celulares del embirón. Esta tecnología aún está en desarrollo, y aunque son alentadoras las posibilidades, es importante tomar en cuenta que son muchas las proteínas implicadas. Además de conocer sus productos, es importante establecer sus correlaciones e interacciones para poder establecer un modelo que nos lleve a un factor de predicción adecuado.


El papel de la proteómica en la definición del secretoma embrionario humano

* Traducido de: Katz Jaffe MG, McReynolds S, Gardner DK, Schoolcraft WB. The role of proteomics in defining the human embryonic secretome. Reprod Hum Mol 2009;15(5):271-277.


Durante la década pasada, ha habido un gran enfoque en la caracterización molecular de diversos sistemas biológicos y estados de enfermedad. El genoma humano consta de

∼25,000 genes y el transcriptoma humano proporciona a los investigadores datos valiosos sobre la expresión genética. Sin embargo, el proteoma humano –definido como el complemento PROteico del genOMA humano– dicta en realidad la función celular y determina en última instancia el fenotipo (Figura 1). Por sí mismo el proteo-ma es dinámico, cambia constantemente mediante sus propias interacciones, afectado por estímulos internos y externos. Los avances en las técnicas proteómicas han empezado a arrojar luz sobre la diversidad y complejidad del proteoma humano, estimado en más de un millón de proteínas. Una variedad de muestras biológicas está bajo investigación, con insistencia en la identificación de proteínas implicadas en estados de enfermedad espe-cíficos, a fin de desarrollar nuevas pruebas diagnósticas y pronósticas.1 De particular interés para los investi-gadores es el secretoma, las proteínas producidas por células y secretadas en cualquier momento o bajo cier-tas condiciones fisiológicas.2 Diversos tipos de fluidos biológicos, incluido el suero y un medio acondicionado, se han analizado en busca de proteínas secretadas que puedan definir un estado particular de enfermedad o progresión.3,4 A partir del análisis de proteomas séricos de una variedad de pacientes con cáncer se descubrió una serie de biomarcadores sustitutos del cáncer. Aun-que muy prometedores, algunos de los biomarcadores aptos son relativamente abundantes, compartidos entre diferentes cánceres humanos y sobreexpresados en otras enfermedades humanas, como las autoinmunitarias.3 Es fundamental la validación futura de los biomarcadores oncológicos aptos en grandes cohortes independientes de pacientes. Con el desarrollo de nuevas técnicas proteómicas sensibles, los investigadores se están concentrando en el descubrimiento de proteínas séricas

poco abundantes que son más sensibles y específicas del cáncer. En esta revisión se discute el papel de la proteómica en el estudio del secretoma embrionario de mamíferos. La definición y caracterización del secretoma embrionario de mamífero ampliará nuestro conocimiento de la embriogénesis temprana, promoverá nuestra comprensión del papel embrionario durante la implantación y contribuirá potencialmente al desarrollo de una evaluación no invasiva de viabilidad.

EVALUACIÓN EMBRIONARIA

Actualmente, la selección de embriones para transfe-rencia se basa en criterios morfológicos detallados.5 Aunque relativamente exitoso, el campo de la tecnología de reproducción asistida se beneficiaría de más métodos cuantitativos de determinación de la viabilidad para aumentar el éxito de la FIV y disminuir la incidencia de embarazos múltiples.6 Durante la década pasada, una disminución en la cantidad de embriones para transferencia se ha correlacionado con una reducción sig-nificativa de embarazos de orden superior.7 Sin embargo, los embarazos gemelares continúan reflejando un alto porcentaje de embarazos por FIV con elevados riesgos para la salud de la madre y los fetos, que incluyen parto prematuro, bajo peso al nacimiento, mortalidad perinatal y otras complicaciones relacionadas con el embarazo.8 Por consiguiente, la promesa de mejorar las tasas de embarazo por FIV con más métodos cuantitativos de selección embrionaria tiene la capacidad de optimizar la transferencia exitosa de embriones individuales.

PROTEÓMICA Y EL EMBRIÓN MAMÍFERO

Las proteínas traducidas a partir de transcripciones de ARN son directamente responsables de la función celular como se ilustra en la Figura 1. Aunque valiosos, se ha demostrado que los estudios de expresión genética de estas transcripciones de ARN a menudo no predicen la abundancia de las proteínas o su función. Por ejemplo, en un estudio en células madre embrionarias –en el que se investigaron comparaciones pares de cambios en el ARNm y los niveles de expresión de proteína– se observaron bajos niveles de correlación.9 Además, al examinar la relación entre las proteínas y la abundancia


Katz Jaffe MG y col.

de ARNm en levaduras, se encontró que el análisis de transcripciones de ARNm era insuficiente para predecir la expresión proteica.10 Varios mecanismos, incluida la degradación dirigida de ARNm y de proteína, pueden ser utilizados por la célula durante la regulación de la transcripción-traducción, lo que resulta en falta de aso-ciación entre la expresión genética, las transcripciones de ARN y la expresión proteica. En consecuencia, es vital una investigación a fondo del proteoma humano para entender la función celular y comprender los procesos biológicos y los estados de enfermedad.

A pesar de los nuevos avances en las técnicas pro-teómicas, el conocimiento del proteoma de embriones mamíferos de preimplantación sigue siendo limitado. El efecto combinado de una plantilla limitada, baja expre-sión proteica y la falta de sensibilidad de las plataformas proteómicas han contribuido como los obstáculos prin-cipales. A pesar de estos obstáculos, ha habido algunas excelentes publicaciones, de las cuales se describe una selección en el Cuadro 1. Los estudios proteómicos tempranos utilizaron electroforesis bidimensional (2D) en gel en combinación con el análisis computarizado de imágenes en gel para construir y analizar las bases de datos de proteínas de embriones de ratón en fase de preimplantación.11,12 La técnica de Western blot también se ha utilizado para identificar la expresión de proteínas conocidas,13 o para detectar modificaciones postrans-lacionales, como la fosforilación, relacionadas con el

desarrollo del embrión.14 Recientemente, los avances en las técnicas proteómicas, con el desarrollo de la espectrometría de masa, han hecho posible identificar grupos de proteínas dentro de cantidades limitadas de fluidos biológicos y tejidos complejos.15,16

ESPECTROMETRÍA DE MASA: UNA HERRAMIENTA PODEROSA EN LA PROTEÓMICA GLOBAL

La espectrometría de masa se ha convertido rápidamente en una tecnología importante en la caracterización pro-teómica. La búsqueda de una alteración consistente y significativa en el perfil de expresión proteica entre gru-pos específicos de muestras ha revelado características importantes de un estado de enfermedad o de un proceso fisiológico. La espectrometría de masa supone una fuente de iones para la producción de especies cargadas en la fase gaseosa, y un analizador, que pueda separar iones de acuerdo con su proporción masa-carga (m/z). Algunos métodos de ionización utilizados comúnmente incluyen la ionización por electrospray y la ionización-desorción láser de superficie (SELDI, por sus siglas en inglés), las cuales están acopladas a analizadores de “tiempo de vuelo” (TOF, por sus siglas en inglés), trampa de iones o cuadrupole. La espectrometría de masa SELDI-TOF, con chips de captura específica de afinidad a proteínas, permite el análisis rápido, costo-efectivo y de alto ren-dimiento de volúmenes pequeños de muestras (rango de microlitros) y permite que la sensibilidad esté en el rango de picomoles a femtomoles. Las proteínas ligadas son activadas con láser liberando de este modo iones gaseosos mediante desorción-ionización. El tubo TOF está bajo un vacío el cual causa que los iones más pe-queños viajen más rápido hacia el detector permitiendo de este modo la separación de estos iones de acuerdo con la proporción m/z representada como un perfil de proteína.17 La tecnología se ha aplicado a una serie de tejidos y fluidos biológicos con un especial enfoque en oncoproteómica, incluida la detección temprana, capacidad metastásica y resultado terapéutico de una variedad de diferentes cánceres.18 La identificación de proteínas siguiendo el perfil de espectrometría de masa típicamente se realiza mediante digestión con proteasas generando diferentes productos de escisión identificables

Figura 1. Diagrama esquemático que esboza la complejidad de la función celular incluidas las técnicas ómicas asociadas: genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica que contribuyen al estudio y comprensión de los sistemas biológicos.



con el análisis de espectrometría de masa en tándem y la búsqueda en la base de datos de proteínas.19

Ha comenzado a utilizarse la tecnología de espectro-metría de masa como una plataforma proteómica en el estudio del desarrollo del embrión de preimplantación (Cuadro 1). La proteína vault mayor (MVP, por sus siglas en inglés) se identificó como una proteína expresada en embriones de preimplantación porcinos utilizando espec-trometría de masa de desorción/ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF, por sus siglas en inglés) y Western blot. Se demostró que la MVP se acumulaba en embriones porcinos de baja calidad que no se desarrollaron normalmente in vitro.20 Además, recientemente la espectrometría de masa SELDI-TOF

Cuadro 1. Publicaciones seleccionadas que destacan el uso de la proteómica en la evaluación y desarrollo embrionario

Modelo Caracterización Hallazgos clave Referencia

Ratón Electroforesis 2D en gel Se construyó una base de datos de proteínas en gel 2D para embrión de ratón. Se caracterizaron los cambios en los patrones de síntesis proteica durante el desarrollo normal de preimplantación desde la fertilización hasta el estadio de blastocisto

Latham y col. (1992)11

Ratón Electroforesis 2D en gel Se construyeron bases de datos de proteínas para embriones de ratón compactados de ocho células y en estadio de blastocisto. Se documentaron los cambios cuantitativos generales en las concentra-ciones de proteínas

Shi y col. (1994)12

Conejo Western blot En blastocistos de conejo se expresaron isoformas de proteína transportadora de glucosa sensible a insulina (GLUT4 y GLUT8) y proteína receptora de insulina

Navarrete Santos y col. (2004)13

Ratón Western blot El aumento en la fosforilación de SAPK/JNK y p38MAPK se correlacionó negativamente con el desarrollo del embrión de ratón

Wang y col. (2005)14

Porcino EM MALDI-TOF Western blot La proteína vault mayor (MVP) se acumuló en embriones que no se desarrollaron normalmente in vitro

Sutovsky y col. (2005)20

Ratón EM SELDI-TOF Los embriones que generaron por debajo de 5% (bajo) de oxígeno fueron más parecidos a embrio-nes de ratón derivados in vivo. Las condiciones con oxígeno alto (20%) se asociaron con la regulación a la baja de 10 proteínas-biomarcadores

Katz-Jaffe y col. (2005)21

Humano EM SELDI-TOF Se identificaron diferentes perfiles proteicos entre los blastocistos tempranos y expandidos, y entre blastocistos en desarrollo y embriones en dege-neración

Katz-Jaffe y col. (2006a)22

SAPK/JNK: proteína cinasa activada por estrés-cinasa Jun; p38 MAPK: proteína cinasa mitógeno-activada 38; EM MALDI-TOF: espectrometría de masa de desorción-ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo; EM SELDI-TOF: espectrometría de masa de ionización-desorción láser de superficie-tiempo de vuelo.

se ha utilizado para generar perfiles proteicos en todos los estadios del desarrollo embrionario de mamíferos.21,22 Se observaron diferencias en los perfiles proteicos entre blastocistos tempranos y expandidos, así como entre blastocistos en desarrollo y embriones degenerados. La búsqueda preliminar en la base de datos identificó algunos de los candidatos proteicos que podrían estar directamente vinculados con la embriogénesis.22

Necesita considerarse la naturaleza dinámica y sen-sible del proteoma a variables durante la recolección, almacenamiento, manejo y procesamiento de la muestra, y un protocolo consistente necesita estar acompañado de datos proteómicos reproducibles.23 El prejuicio de los datos causado por la calibración de la espectrometría



de masa y la corriente del instrumento a lo largo del tiempo y entre laboratorios también puede introducir artefactos. Esto puede controlarse corriendo muestras en repeticiones, realizando habitualmente calibraciones internas y externas e incluyendo muestras adecuadas de control con cada serie.

EL SECRETOMA EMBRIONARIO

Se propone que los embriones viables poseen un pro-teoma único con algunas de estas proteínas secretadas en el medio de cultivo circundante contribuyendo po-tencialmente al secretoma. En consecuencia, un análisis proteómico no invasivo del secretoma de embriones mamíferos a lo largo del desarrollo antes de la implan-tación puede ayudar a revelar los factores secretados que reflejan competencia y viabilidad de desarrollo.

Uno de los estudios más tempranos del secretoma embrionario humano reveló la liberación de 1-o-alquil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina (paf), un factor soluble que es producido y secretado por embriones mamíferos de preimplantación. paf funciona de manera autocrina como un factor de supervivencia durante el desarrollo embrionario. También crea un espectro de alteraciones de la fisiología materna que incluyen activación pla-quetaria.24 La leptina, un pequeño péptido pleiotrópico, también se ha observado en el medio acondicionado de blastocistos en un modelo humano in vitro para estudiar las interacciones entre el embrión y las células epiteliales endometriales.25 Se demostró que los blastocistos huma-nos competentes secretaron concentraciones de leptina en el medio circundante más altas que los embriones detenidos. Se ha planteado la hipótesis de que la lepti-na secretada por el blastocisto inicia un efecto ligando mediado por receptor con receptores de leptina en el endometrio materno estableciendo un diálogo molecular durante la ventana de implantación.26

Se ha demostrado que la acrogranina, una proteína que regula el crecimiento celular epitelial, es secretada en el medio circundante por embriones de ratón en pre-implantación.27 Una vez que se agregó acrogranina al medio de cultivo, se promovió la formación del blasto-cisto. Se cree que la acrogranina actúa directamente en las células trofoectodérmicas de forma autocrina. Ade-más, este estudio reveló que la adición de anticuerpos

antiacrogranina al medio circundante retrasó el inicio de la formación del blastocisto. Se ha sugerido que la acrogranina es expresada por el útero e influye en el desarrollo embrionario de forma similar a la de la acro-granina agregada exógena que promueve la formación del blastocisto en cultivo.27

Recientemente, Sakkas y col.28 caracterizaron una molécula soluble secretada por los blastocistos humanos que modula la regulación de la expresión de HOXA10 en una línea celular del epitelio endometrial. Esta forma de interacción recíproca embrio-endometrial podría trans-formar el ambiente uterino local afectando el desarrollo embrionario y el proceso de implantación. Además, la detección de antígeno G leucocitario humano soluble (sHLA-G, por sus siglas en inglés) en el medio de FIV de embriones en el día 3 ha indicado mayores tasas de embarazo en embriones positivos a sHLA-G.29,30 Sin embargo, estos resultados no han sido absolutos con embarazos establecidos a partir de embriones negativos a sHLA-G. Asimismo, se han registrado diferencias téc-nicas que incluyen la incapacidad de medir la producción de sHLA-G en algunos sobrenadantes.31 En general, cada uno de estos estudios individuales del secretoma se ha enfocado sólo en la variable individual. Al considerar la naturaleza multifactorial del desarrollo embrionario mamífero, sería razonable asumir que se requeriría más de un factor individual para predecir la competencia de desarrollo o el potencial de implantación (o ambos).

ESPECTROMETRÍA DE MASA Y EL SECRETOMA EMBRIONARIO

Con la espectrometría de masa SELDI-TOF, se observaron las firmas distintivas del secretoma cada 24 horas del de-sarrollo embrionario desde el momento de la fertilización hasta el estadio de blastocisto. Estas firmas del secretoma podrían identificar de forma única los estadios del desa-rrollo embrionario, independiente de la morfología. Se observaron algunas proteínas a lo largo de varios estadios embrionarios, mientras que otras fueron más estadio-específicas.32 De manera interesante, la comparación de especies entre el secretoma de ratón y el humano reveló una diversidad limitada; similar a la de la proteína paf, la cual se ha observado en el secretoma de todas las especies de mamíferos estudiadas hasta la fecha.24



La transición desde transcripciones y proteínas maternas heredadas hasta la activación del genoma embrionario y la expresión de proteínas embrionarias clave debe ocurrir para el desarrollo embrionario con-tinuo.33 En particular, se observaron proteínas únicas en el secretoma embrionario después de la activación del genoma embrionario.32 Así, los embriones con un geno-ma activado correctamente, y por tanto, un proteoma y secretoma embrionario completamente funcional pueden tener un mayor potencial de competencia de desarrollo. La correlación de las firmas del secretoma con el desa-rrollo en curso del blastocisto reveló una proteína de 8.5 kDa. La expresión limitada de esta proteína de 8.5 kDa a partir del secretoma de embriones en degeneración, en conjunto con su significativamente alta expresión a partir del secretoma de blastocistos en desarrollo, indica potencialmente una asociación entre esta proteína y la competencia de desarrollo (p < 0.05). La espectrometría de masa en tándem y la base de datos de identificación de secuencias peptídicas indicaron que el mejor candi-dato para esta proteína de 8.5 kDa era la ubiquitina.32 La ubiquitina es un componente del sistema proteosómico dependiente de ubiquitina, que identifica proteínas para degradación. El sistema está implicado en una serie de procesos fisiológicos que incluyen la proliferación y la apoptosis. Se ha demostrado que la ubiquitina secre-tada es estimulada en los fluidos corporales en ciertos estados de enfermedad y esta acumulación proporciona evidencia de un aumento en el recambio proteico.34,35 La ubiquitina también se ha implicado en el desempeño de una papel decisivo durante la implantación en mamíferos mediante el control de las actividades y el recambio de moléculas clave en la señalización.36 La investigación en curso está enfocada en la identificación de las proteí-nas restantes secretadas, así como la correlación con la competencia de desarrollo y la implantación.

Otro aspecto de las técnicas de reproducción asisti-da que podría beneficiarse del análisis no invasivo es la detección genética preimplantación (PGS, por sus siglas en inglés). La PGS implica la biopsia de cuerpos polares o células embrionarias y se ha convertido en un procedimiento clínico rutinario en muchas clínicas de FIV para la detección de anormalidades cromosómicas específicas en embriones humanos. Los procedimientos de biopsia son invasivos para el embrión en crecimiento

y podrían afectar potencialmente el desarrollo posterior. Una investigación inicial sobre si los embriones con anormalidades cromosómicas podrían distinguirse de embriones euploides mediante su respectivo secretoma identificó que blastocistos en incubación euploides para 10 cromosomas exhibieron perfiles de secretoma notablemente diferentes a los de blastocistos en incu-bación aneuploides para 10 cromosomas. Además, los embriones aneuploides en degeneración exhibieron un perfil de secretoma significativamente diferente al de blastocistos aneuploides en incubación.37

Con avances en las técnicas genómicas que permiten un análisis cromosómico exhaustivo de los 23 pares de cromosomas en una célula individual,38 ha llegado a ser realista un abordaje “ómico” integrado, que discrimina las firmas de secretoma entre blastocistos euploides y aneuploides individuales. Se procesaron microgotas de medio de cultivo de FIV consumada de blastocistos indi-viduales de calidad transferible (n = 33) y se analizaron mediante espectrometría de masa SELDI-TOF determi-nando una huella digital del secretoma del blastocisto. Cada blastocisto individual se sometió a hibridación genómica comparativa para un análisis cromosómico exhaustivo de los 23 pares de cromosomas; con 19 identificados como euploides y 14 como aneuploides.38 De los 14 blastocistos aneuploides, 9 tuvieron aneu-ploidía cromosómica única y 5 eran caóticos con más de dos cromosomas implicados. Las huellas digitales del secretoma de blastocistos individuales identificaron firmas proteicas que permitieron la discriminación entre constituciones cromosómicas euploides y aneuploides.39 Después de un análisis estadístico, se identificó una nue-va serie de nueve biomarcadores expresados de manera diferencial (p < 0.05). Cada uno de los nueve biomarca-dores fue reproducible en las 33 muestras de secretoma clasificando un secretoma-blastocisto euploide de un secretoma-blastocisto aneuploide.39 La Figura 2 mues-tra cuadros de tres ejemplos de esta serie, incluido un biomarcador que mostró una expresión disminuida en el secretoma de blastocistos aneuploides (p < 0.05, Figura 2A), y dos biomarcadores que se demostró que tienen expresión aumentada en el secretoma de blastocistos aneuploides (p < 0.05, Figura 2B y C). La investigación en curso está enfocada en el aumento del tamaño de la muestra para confirmar la reproducibilidad, incluido



un análisis prospectivo para validar la discriminación de blastocistos euploides y aneuploides. La capacidad de analizar no invasivamente la combinación de la competencia de desarrollo y la constitución cromosó-mica podría representar una poderosa herramienta de selección de viabilidad en las técnicas de reproducción asistida.

MICROARREGLO PROTEICO

Además de la tecnología de espectrometría de masa, existen otras plataformas proteómicas en investiga-ción que parecen prometedoras para la definición del secretoma embrionario humano. En particular, los

Figura 2. Ejemplos de biomarcadores que se expresaron diferencialmente en las firmas del secretoma de blastocistos euploides (n = 19) comparados con el secretoma de blastocistos aneuploides (n = 14) (p < 0.05).(A) Cuadro que revela disminución significativa en la expresión de un biomarcador de 3.1 kDa en el secretoma de blastocistos aneuploides comparados con el secretoma de blastocistos eu-ploides (p < 0.0001). (B y C) Dos cuadros que muestran aumento significativo en la expresión de biomarcadores de 2.9 y 5.2 kDa en el secretoma de blastocistos aneuploides comparados con el secretoma de blastocistos euploides (p < 0.002 y p < 0.0009, respectivamente). El eje superior del cuadro indica el percentil 75, y el inferior, el percentil 25. La línea interna representa la mediana.

microarreglos proteicos tienen la ventaja agregada de ofrecer información complementaria a los estudios del transcriptoma, así como eliminar la necesidad de iden-tificación proteica de seguimiento. Recientemente, un estudio que utilizó microarreglos proteicos comparó el medio acondicionado de blastocistos agrupados con un medio de control y reveló el aumento en la expresión del receptor 1 de factor de necrosis tumoral soluble (TNF) e interleucina (IL) 10, y la disminución en la expresión de proteína estimulante de macrófagos (MSP) alfa, factor de células madre (SCF), quimiocina (C-X-C motif) ligando 13 (CXCL13), receptor 3 a ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAILR3) y proteína inflamato-ria de macrófagos (MIP) 1beta.40 El análisis adicional que investigó las diferencias potenciales entre el medio acondicionado agrupado de blastocistos que se implan-taron versus el medio agrupado que resultó en falla en la implantación reveló disminución significativa de dos proteínas, CSCL13 y GM-CSF, en el medio de blasto-cistos implantados. Se ha identificado que GM-CSF es una proteína que en medios de cultivo de blastocistos humanos y de ratón promueve el desarrollo embrionario y la implantación.41 La disminución de la expresión de GM-CSF observada por Dominguez y col.40 puede in-dicar un mecanismo autocrino en el mantenimiento del desarrollo del blastocisto y la implantación potencial. No se observó aumento significativo de ninguna de las 120 proteínas incluidas en este microarreglo proteico en el medio acondicionado de blastocistos implantados.40 Las grandes cantidades de muestra requeridas y otras limitantes de sensibilidad de la plataforma restringieron el estudio a la investigación de muestras agrupadas en contraste con muestras de medios individuales. Otros asuntos relacionados con la plataforma incluyen el alto costo de los microarreglos proteicos, el bajo número de blancos en comparación con la espectrometría de masa u otras técnicas, y la dependencia de la existencia de anticuerpos e interacciones potenciales no específicas.42

METABOLITOS EN EL SECRETOMA EMBRIONARIO HUMANO

Los metabolitos, productos funcionales finales de pro-cesos biológicos, también están bajo investigación en el secretoma mediante métodos basados en espectroscopia



junto con bioinformática dirigida.43 Se ha demostrado que estos metabolitos de bajo peso molecular cambian radicalmente para reflejar un estado metabólico y am-biental particular. La espectroscopia infrarroja cercana y la espectroscopia Raman son dos métodos que se han utilizado para detectar biomarcadores específicos del estrés oxidativo en un medio de cultivo agotado con diferencias destacadas en los algoritmos generados para resultados de FIV positivos versus negativos. Se obser-vó que los índices de viabilidad generados a partir del análisis de medios de cultivo agotados fueron mayores para embriones humanos que avanzaron para producir embarazos y nacidos vivos, en comparación con los que no se implantaron.44 Además, un estudio ciego piloto de datos recolectados retrospectivamente, que utilizaron la plataforma Raman de espectroscopia, reveló una precisión diagnóstica general de 80.5% para predecir el potencial reproductivo embrionario, el parto o la falla en la implantación.45

La proteómica y metabolómica son dos plataformas ómicas complementarias en la investigación del secre-toma embrionario humano que son prometedoras para el desarrollo de métodos no invasivos de selección de embriones en el campo de las técnicas de reproducción

asistida. Con la capacidad de analizar proteínas y me-tabolitos en medios de cultivo agotados, lo que genera perfiles moleculares complementarios pero distintos, es factible proponer que la evaluación de viabilidad embrionaria puede incluir una combinación de ambas plataformas.

DISCUSIÓN

Los avances en el campo de la proteómica, particular-mente las mejoras en la detección de los instrumentos de espectrometría de masa, han hecho posible el análisis de fluidos biológicos complejos limitados, incluidos los medios de cultivo agotados, y han facilitado el análisis rápido, sensible y de alto rendimiento del secretoma. La investigación en curso del secretoma que utiliza una variedad de plataformas proteómicas continuará proporcionando datos valiosos que aumentarán nuestra comprensión de los procesos biológicos implicados en el desarrollo embrionario de mamíferos (Cuadro 2). Este co-nocimiento puede contribuir con la evaluación no invasiva de la viabilidad embrionaria para su uso en las técnicas de reproducción asistida. Junto con la morfología, un método cuantitativo no invasivo de selección embrionaria

Cuadro 2. Publicaciones seleccionadas que destacan el uso de la proteómica en la definición del secretoma embrionario

Modelo Caracterización Hallazgos clave Referencia

Ratón Western blot e inmunopre-cipitación

La proteína acrogranina fue secretada por embriones en el medio circundante.La adición de acrogranina al medio de cultivo estimuló la formación del blastocisto.La adición de anticuerpos anti-acrogranina al medio de cultivo retrasó la formación del blastocisto

Díaz-Cueto y col. (2000)27

Humano ELISA Los blastocistos competentes secretaron concentracio-nes más altas de leptina que los embriones detenidos

González y col. (2000)25

Humano ELISA La detección del antígeno leucocitario humano soluble G (sHLA-G) en el medio agotado de FIV tuvo una corre-lación positiva con el resultado de embarazo

Noci y col. (2005)29 y Sher y col. (2005)30

Humano-ratón EM SELDI-TOF Se identificaron diferentes perfiles de secretoma para cada estadio del desarrollo embrionario.La ubiquitina, una proteína de 8.5 kDa, fue estimulada en el secretoma de blastocistos en el día 5 de desarrollo

Katz-Jaffe y col. (2006b)32

Humano Microarreglo proteico Expresión aumentada de receptor 1 de TNF soluble e IL-10, y expresión disminuida de MSP-alfa, SCF, CXCL13, TRAILR3 y MIP-1beta en medio de cultivo de blastocistos. El medio de blastocistos implantados mos-tró una expresión disminuida de CSCL13 y GM-CSF

Domínguez y col. (2008)40

ELISA: ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas; TNF: factor de necrosis tumoral.



puede optimizar las transferencias exitosas de embriones individuales, reducir las pérdidas tempranas del embarazo y aumentar la cantidad de nacidos vivos. La definición del secretoma embrionario también proporcionará a los investigadores una visión de las secuencias únicas de eventos que son fundamentales para la implantación exitosa, incluidos los requerimientos más críticos del blastocisto. Si se toma en cuenta la complejidad y diver-sidad del embrión humano, parece razonable prever una contribución “ómica” combinada con la caracterización del secretoma embrionario humano.

FinanciamientoEl financiamiento para pagar los gastos de publicación de Acceso Abierto para este artículo fue proporcionado por BioSymposia Inc.

Traducción: Adriana Jardón A

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Fragmentación del ADN espermático: mecanismos de origen, repercusión en los resultados reproductivos y análisis*Denny Sakkas, Juan G Álvarez

RESUMEN

Objetivo: revisar los mecanismos responsables de la fragmentación del ADN en los espermatozoides humanos, incluidos los que ocurren durante la espermatogénesis y el transporte a través del aparato reproductivo. Los mecanismos examinados incluyen: apop-tosis en el epitelio de los túbulos seminíferos, defectos en la remodelación de la cromatina durante el proceso de espermiogénesis, daño al ADN inducido por radicales de oxígeno durante la migración de los espermatozoides desde los túbulos seminíferos hacia el epidídimo, activación de las caspasas y endonucleasas espermáticas, daño inducido por quimio y radioterapia y el efecto de los tóxicos ambientales. También se discuten las diferentes pruebas utilizadas actualmente para el análisis de fragmentación de ADN espermático y los factores que determinan el valor predictivo de la prueba de fragmentación de ADN espermático y sus implicaciones en el diagnóstico y tratamiento de la infertilidad. Finalmente, también se escudriña cómo las roturas de las cadenas de ADN en el genoma embrionario o las modificaciones de nucleótidos del ADN heredados del genoma paterno podrían afectar al embrión y la descendencia. En particular se discute cómo los espermatozoides anormales pueden ser tratados por el ovocito y cómo las anorma-lidades en el ADN espermático –que no hayan sido reparadas satisfactoriamente por el ovocito después de la fertilización– pueden interferir con el desarrollo embrionario y fetal normal.Conclusiones: el ADN espermático puede modificarse a través de varios mecanismos. La integridad del genoma paterno es, por tanto, de suma importancia en el inicio y mantenimiento de un embarazo viable en la concepción natural y en un procedimiento asistido de reproducción. La necesidad de diagnosticar los espermatozoides a nivel nuclear es un área que requiere mayor conocimiento para mejorar el tratamiento de la pareja infértil.Palabras clave: fragmentación de ADN, fertilización in vitro, radicales de oxígeno, estrés oxidativo, caspasas, endonucleasas, qui-mioterapia, radiación ionizante.

ABSTRACT

Objective: To review the mechanisms responsible for DNA fragmentation in human sperm, including those occurring during sper-matogenesis and transport through the reproductive tract. The mechanisms examined include: apoptosis in the seminiferous tubule epithelium, defects in chromatin remodeling during the process of spermiogenesis, oxygen radical-induced DNA damage during sperm migration from the seminiferous tubules to the epididymis, the activation of sperm caspases and endonucleases, damage induced by chemotherapy and radiotherapy, and the effect of environmental toxicants. The different tests currently used for sperm DNA frag-mentation analysis and the factors that determine the predictive value of sperm DNA fragmentation testing and their implications in the diagnosis and treatment of infertility are also discussed. Finally, we also scrutinize how the presence in the embryonic genome of DNA strand breaks or modifications of DNA nucleotides inherited from the paternal genome could impact the embryo and offspring. In particular we discuss how abnormal sperm could be dealt with by the oocyte and how sperm DNA abnormalities, which have not been satisfactorily repaired by the oocyte after fertilization, may interfere with normal embryo and fetal development.Conclusion(s): Sperm DNA can be modified through various mechanisms. The integrity of the paternal genome is therefore of para-mount importance in the initiation and maintenance of a viable pregnancy both in a natural conception and in assisted reproduction. The need to diagnose sperm at a nuclear level is an area that needs further understanding so that we can improve treatment of the infertile couple. Key words: DNA fragmentation, in vitro fertilization, oxygen radicals, oxidative stress, caspases, endonucleases, chemotherapy, ionizing radiation.

Actualmente, la fragmentación del ADN en el espermatozoide se ha convertido en un punto focal para el diagnóstico y tratamiento de la infertilidad. Conocer los mecanismos que inducen el daño puede ayudarnos a lograr mejores tratamientos y a analizar las posibilidades de embarazo.Hoy día, además de existir varias pruebas diagnósticas, también se han desarrollo y aplicado algunas técnicas para seleccionar espermatozoides, las cuales deben ser del conocimiento general.


Fragmentación del ADN espermático

* Traducido de: Sakkas D, Alvarez JG. Sperm DNA fragmenta-tion: mechanisms of origin impact on reproductive outcome, and analysis. Fertil Steril 2010;93(4):1027-1036.


Los espermatozoides con daño en el ADN son capaces de fertilizar de manera eficiente un óvulo.1-3 Sin embargo, la pregunta sigue siendo cuáles son los efectos más probables

en el desarrollo embrionario y fetal normal cuando el genoma paterno introduce nucleótidos o ADN con da-ños que no han sido reparados por el ovocito después de la fertilización.4-7 Una cantidad relativamente alta de mujeres no logra tener un embarazo a pesar de la ausencia aparente de un factor masculino o femenino de infertilidad. Es probable que muchas de estas parejas tengan un factor masculino de infertilidad de tipo genó-mico, el cual puede incluir daño en el ADN espermático, alteraciones meióticas o aneuploidía espermática. Sin embargo, la capacidad del ovocito y del embrión humano de reparar el daño al ADN es poco conocida y nuestro conocimiento actualmente se limita a un cierto número de estudios de expresión genética que muestran que el embrión y el ovocito están equipados con mecanismos para hacer frente a algunas anomalías en el ADN pa-terno.8,9 Primero, la capacidad del ovocito de iniciar la reparación depende, en gran medida, de la calidad cito-plásmica y genómica del ovocito, la cual es afectada de manera importante por el aumento de la edad. Segundo, la calidad del ADN espermático presente en un esper-matozoide está cada vez más ligada a la edad paterna10 y esto puede agravar aún más la disminución de la tasa de embarazo observada en mujeres de edad avanzada.11

Se ha postulado que, en embriones generados in vivo e in vitro, la presencia por encima de un umbral crítico de daño sin reparar en el ADN explica el bloqueo en el desarrollo embrionario observado después de la implan-tación en embriones con un cariotipo normal. Estudios recientes sugieren que este tipo de daño se expresa du-rante y después de la implantación y se ha caracterizado como efecto paterno tardío.12,13 También hay indicios de altos niveles de daño en el ADN en una muestra de esperma con incapacidad para obtener blastocistos14 y se cree que, entre la activación posembrionaria del genoma

y el estadio de blastocisto, se produce cierta pérdida de embriones de preimplantación.15,16

El daño en el ADN encontrado en el embrión no siempre se relaciona con el daño en el ADN en el esper-matozoide que fertilizó el ovocito. Un nivel significativo de anormalidades del ADN surge del ovocito. Si se toman como ejemplo estudios de aneuploidía, los problemas en el ovocito siguen siendo el factor que más contribuye.17,18 Las técnicas analíticas futuras pueden concentrarse en el uso combinado de sondas cromosómicas y pruebas de fragmentación de ADN en biopsias de embriones, lo que permitiría un análisis más robusto, que incluya no sólo el diagnóstico de enfermedades monogénicas y aneuploidía, sino también el grado de daño del ADN en el embrión, lo que permitiría seleccionar embriones de la más alta calidad genómica. Otra estrategia potencial para examinar si el daño al ADN ha sido o no reparado por el ovocito o el embrión sería mediante el análisis de fragmentación de ADN en células trofoblásticas obtenidas mediante biopsia del blastocisto.

MECANISMOS DE FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO

¿Cómo ocurre el daño al ADN espermático? El daño al ADN en los espermatozoides puede afectar al ADN mitocondrial y al ADN nuclear y puede ser inducido mediante seis mecanismos principales. Éstos pueden ocurrir durante la producción o el transporte de las cé-lulas espermáticas e incluyen (Figura 1): 1) apoptosis durante el proceso de espermatogénesis; 2) roturas en las cadenas de ADN producidas durante la remodela-ción de la cromatina espermática durante el proceso de espermiogénesis; 3) fragmentación postesticular del ADN inducida principalmente por radicales de oxígeno (incluidos el radical hidroxil y óxido nítrico) durante el transporte espermático a través de los túbulos seminífe-ros y el epidídimo; 4) fragmentación del ADN inducida por caspasas endógenas y endonucleasas, y 6) daño al ADN inducido por tóxicos ambientales.

De estos seis mecanismos, el daño postesticular du-rante el transporte de los espermatozoides a través del epidídimo puede tener una participación importante en el origen de la fragmentación del ADN espermático. Esto está apoyado por informes previos que demuestran


Sakkas D y Álvarez JG

Figura 1. Mecanismos principales de inducción de daño al ADN en espermatozoides durante la producción o el transporte de las células espermáticas: (i) apoptosis durante el proceso de espermatogénesis; (ii) roturas en las cadenas de ADN producidas durante la remodelación de la cromatina espermática durante el proceso de espermiogénesis; (iii) fragmentación postesticular del ADN in-ducida principalmente por radicales de oxígeno durante el transporte espermático a través de los túbulos seminíferos y el epidídimo (el aumento del daño en el ADN está indicado por el tamaño de los destellos rojos y el oscurecimiento gradual en el tracto); (iv) fragmentación del ADN inducida por caspasas endógenas y endonucleasas; (v) daño en el ADN inducido por radio y quimioterapia; y (vi) daño en el ADN inducido por tóxicos ambientales.Sakkas. Sperm DNA fragmentation. Fertil Steril 2010.

que la fragmentación del ADN es mayor en el esperma epididimal caudal y eyaculado19,20 en comparación con los espermatozoides testiculares. Informes recientes confirmaron esta hipótesis.21 Sin embargo, la pregunta sigue siendo si las fallas durante la espermatogénesis han hecho al esperma más susceptible al daño postesticular.

Inducción de la apoptosis durante el proceso de espermatogénesisDurante el proceso de espermatogénesis el mecanismo de selección de células germinales gobernado por la célula de Sertoli es responsable de la inducción de la apoptosis en 50 a 60% de todas las células germinales

que entran en la meiosis I. Estas células están asignadas con marcadores apoptóticos de tipo Fas y deben ser fagocitadas y eliminadas por la célula de Sertoli con la que estas células germinales están asociadas.22-24 Sin embargo, este mecanismo no siempre puede operar eficazmente y un porcentaje variable de estas células ger-minales defectuosas entra en el proceso de remodelación espermática durante la espermiogénesis y posteriormente aparecen en la eyaculación. En relación con la falla de este mecanismo de selección, los resultados de un estudio reciente de Burrello y coautores25 sugieren que existe una disociación entre la calidad genómica en la célula germi-nal y la remodelación espermática que ocurre durante el



proceso de espermiogénesis. Es decir, una célula germinal puede tener su núcleo “desorganizado” por la apoptosis o ser aneuploide y, aún así, los espermatozoides tendrán una morfología normal. Por tanto, cuando un esper-matozoide con morfología normal es microinyectado no necesariamente significa que la calidad genómica también es normal. De manera interesante, reciente-mente se propuso que el mecanismo de apoptosis en la espermiogénesis puede estar menos relacionado con el de muerte celular, pero ser más responsable del proceso de “desprendimiento” del citoplasma en los estadios finales de la maduración espermática.26

Se ha demostrado que en hombres con oligospermia, la probabilidad de que un espermatozoide con morfolo-gía normal sea aneuploide es mucho mayor que cuando el hombre es normospérmico.25 Probablemente esto está relacionado con la detención parcial de la maduración asociada con alteraciones meióticas. El hecho de que un porcentaje variable de espermatozoides en la eya-culación exprese marcadores apoptóticos, por ejemplo, Fas, fosfatidilserina, Bcl-XL, p53,

27-30 indica que este fenómeno podría ser utilizado para seleccionar esperma-tozoides no apoptóticos a partir de muestras de semen.31 Un método introducido recientemente con este propósito es el uso de microesferas anexina-V-conjugadas (ANMB Microbead Kit; Miltenyl Biotec, Alemania). El principio en el que se basan estas columnas es que los esperma-tozoides apoptóticos expresan fosfatidilserina en la hoja externa de la membrana espermática y se fijan a la anexina-V. Cuando se aplica un campo magnético a las columnas, los espermatozoides unidos a anexina-V se conjugan con las microesferas magnéticas y son reteni-dos en la columna, mientras que los espermatozoides no apoptóticos pasan a través de la columna.32

Roturas de ADN durante el proceso de espermiogénesisLas alteraciones en la reestructuración de la cromatina durante el proceso de espermiogénesis puede resultar en la fragmentación del ADN. McPherson y Longo33-35 postularon que la existencia de cortes de ADN en los espermatozoides eyaculados puede ser un indicador de una maduración incompleta durante la espermiogénesis. Postularon que el empaquetado de cromatina puede re-querir la actividad de nucleasas endógenas para crear y

ligar cortes que facilitan la protaminación. Se cree que estos cortes proporcionan alivio a la tensión torsional para ayudar al arreglo de la cromatina durante el reem-plazo de las histonas por protaminas y se cree que ocurre el mismo procedimiento en humanos.36 Las alteraciones en el control de este proceso pueden resultar en ano-malías en el empaquetamiento de la cromatina o cortes no reparados de ADN. Estas roturas de ADN ocurrirían antes de la espermiación y es probable que los hagan más susceptibles al ataque postesticular.

Fragmentación postesticular de ADN espermáticoEstudios recientes muestran que los espermatozoides inmaduros, los cuales producen altos niveles de ROS, pueden inducir daño en el ADN de espermatozoides maduros. Este daño se produciría después de la esper-miación durante la comigración de espermatozoides maduros e inmaduros desde los túbulos seminíferos hacia la cola del epidídimo.20 Aunque la vida media de ROS es del orden de nanosegundos a microsegundos, debido a que los espermatozoides están altamente comprimidos en el epidídimo, esto facilitaría el daño al ADN inducido por ROS. El ROS puede dañar el ADN espermático directa o indirectamente a través de la activación de caspasas y endonucleasas esper-máticas. Esto es consistente con el hecho de que la cocentrifugación de espermatozoides inmaduros (que producen altas concentraciones de ROS) con espermatozoides maduros resulta en la inducción de fragmentación de ADN espermático en espermato-zoides maduros, debido a que bajo estas condiciones, los espermatozoides maduros e inmaduros están en contacto estrecho.37 Esto también es consistente con el hecho de que la exposición in vitro de los esperma-tozoides maduros a ROS resulta en daño significativo al ADN.3,38 Asimismo, las células epiteliales del epi-dídimo también podrían desempeñar un papel activo en el daño al ADN inducido por ROS, 1) a través de ROS, como el radical hidroxil o el óxido nítrico39 o 2) a través de la activación de caspasas y endonucleasas espermáticas mediante factores fisicoquímicos, como temperatura alta40 y factores ambientales.41 En el pri-mer caso, este daño teóricamente podría prevenirse con el consumo de antioxidantes, mientras que en el segundo caso este tratamiento no sería efectivo.



Esto está apoyado por el estudio de Greco y cola-boradores19 en el que el consumo de antioxidantes resultó en reducción significativa de los niveles de fragmentación del ADN espermático. Sin embargo, debe tenerse cuidado cuando se utiliza terapia antioxi-dante. Se informó que algunos antioxidantes, como la vitamina C, pueden aumentar la compactación de cromatina reduciendo el entrecruzamiento disulfuro en las protaminas espermáticas.42

Lo más probable es que los espermatozoides con niveles mayores de daño al ADN serían los que ad-quieren niveles menores de entrecruzamiento disulfuro en su cromatina espermática durante el proceso de maduración espermática en el epidídimo. Una caracte-rística interesante que ha surgido de estudios recientes es que, en general, el grado de fragmentación del ADN espermático en espermatozoides eyaculados es más alto que en los espermatozoides testiculares19,43 y en los espermatozoides del cuerpo y la cola del epidídimo –que son precisamente donde se lleva a cabo el proceso de entrecruzamiento disulfuro– y que la inducción de la fragmentación del ADN espermático en el epidídimo podría estar relacionada con su calidad genómica. Es decir, además del mecanismo de selección ejercido por la célula de Sertoli durante el proceso de espermatogéne-sis, habría otro mecanismo de selección en el epidídimo dirigido a eliminar los espermatozoides defectuosos genómicamente.21

El daño potencial que los espermatozoides pueden experimentar durante el paso a través del epidídimo podría limitarse eliminándolos antes de ese paso. Esto tiene mayor importancia clínica en los casos de nive-les altos de fragmentación del ADN en el semen y de fracaso repetido de la FIV, donde podría recurrirse al uso de espermatozoides testiculares obtenidos por la extracción de esperma testicular (TESA o TESE, por sus siglas en inglés); preferentemente TESA, ya que es menos invasivo y tendría mayor aceptación por el ginecólogo y la paciente. Esto está apoyado por los re-sultados informados por Greco y colaboradores,19 en los que la microinyección de espermatozoides testiculares en pacientes que previamente mostraron falla con su esperma eyaculado, con niveles de fragmentación de ADN en semen >15%, medido por etiquetado terminal Tdt-dUTP-mediado (TUNEL, por sus siglas en inglés),

resultó en una tasa de embarazo clínica de 44.4% com-parada con una tasa de embarazo clínica de 0% con espermatozoides eyaculados.

La fragmentación de ADN espermático inducida por el radical hidroxil y la radiación ionizante causa la formación de 8-OH-guanina y 8-OH-2’-desoxiguano-sina (8-OHdG) en un primer estadio y posteriormente, fragmentación monocatenaria del ADN.44 Además, la formación del radical hidroxil puede resultar en la induc-ción de daño bicatenario al ADN espermático mediante la activación de caspasas y endonucleasas espermáticas. Aunque el daño del primer tipo puede ser reparado por el ovocito o el embrión, la fertilización de un ovocito por un espermatozoide con fragmentación bicatenaria extensa del ADN es prácticamente no reparable e incompatible con el desarrollo embrionario y fetal normal.

Activación de caspasas y endonucleasasLa activación de caspasas y endonucleasas espermáti-cas por radicales de oxígeno y factores fisicoquímicos también puede inducir fragmentación del ADN. Estudios previos indican que la exposición del esperma de ratón a una temperatura de 40°C aumenta significativamente la fragmentación del ADN espermático.45 Recientemente, Banks y colaboradores40 demostraron la inducción de fragmentación del ADN espermático después de la ex-posición in vivo de testículos de ratón a una temperatura de 42°C. Debido a que el aumento en la fragmentación del ADN espermático observada en estos ratones ocurrió dentro de una hora después de la exposición al calor, los investigadores concluyeron que el daño observado debe haber ocurrido en el epidídimo y podría haber sido causado por ROS o por la activación de caspasas y endonucleasas espermáticas. Si se considera que los núcleos del esperma de ratón están empaquetados más homogéneamente, la probabilidad de que el esperma humano sea susceptible al calor es mucho mayor, debi-do a las menores concentraciones de protaminas en los núcleos y a la mayor heterogeneidad del empaquetado nuclear.46

Fragmentación del ADN inducida por quimioterapia y radioterapiaSe reportó que la exposición a quimioterapia y radiotera-pia puede resultar en la inducción de fragmentación del



ADN espermático. Se cree que los tratamientos contra el cáncer afectan negativamente la fertilidad masculina y que la reducción en la producción de espermatozoides surge de los efectos citotóxicos de la quimio o radio-terapia en el epitelio espermatogénico.47 Aunque en pacientes con cáncer el examen del ADN espermático ha sido limitado, un estudio reciente de O’Flaherty y co-laboradores48 encontró que la integridad y compactación del ADN espermático estaban afectadas en pacientes con cáncer testicular y linfoma de Hodgkin antes de la quimioterapia. Al examinar las diferentes técnicas de evaluación del daño al ADN los investigadores conclu-yeron que aunque el ensayo de estructura de cromatina espermática (SCSA, por sus siglas en inglés), el TUNEL y el ensayo cometa detectaron daño en el ADN, este último era óptimo para ser utilizado en pacientes con cáncer. Se cree que una combinación del ensayo come-ta con pruebas que evalúan la compactación del ADN espermático, tal como ensayos mBBr y CMA3 basados en citometría de flujo, es una estrategia confiable para caracterizar la calidad de la cromatina espermática en pacientes con cáncer al momento del almacenamiento de esperma.

Daño al ADN inducido por tóxicos ambientalesEstudios previos proporcionaron evidencia de una asociación entre la exposición a niveles altos de con-taminación del aire y aumento en el daño al ADN en espermatozoides humanos. En un estudio reciente, Rubes y colaboradores41 ampliaron estas observaciones y abordaron la hipótesis de que los hombres que son homocigotos nulos para la glutatión-S-transferasa M1 son menos capaces de detoxificar metabolitos reactivos de hidrocarburos aromáticos policíclicos carcinógenos encontrados en la contaminación del aire. Por con-siguiente, estos hombres son más susceptibles a los efectos de la contaminación del aire en la cromatina espermática. Con un diseño de estudio longitudinal en el cual los hombres proporcionaron muestras de semen durante periodos de contaminación de aire baja (basal) y episódicamente alta, los investigadores encontraron una asociación estadísticamente significativa entre el geno-tipo nulo para glutatión-S-transferasa M1 y el aumento de la fragmentación del ADN espermático. Además, los hombres con genotipo nulo para glutatión-S-transferasa

M1 también mostraron niveles más altos de fragmenta-ción del ADN espermático en respuesta a la exposición a contaminación intermitente del aire.41

PRUEBAS DE FRAGMENTACIÓN DEL ADN

Durante las pasadas dos décadas se introdujo una serie de pruebas para el análisis de la fragmentación del ADN espermático. Estas pruebas incluyen TUNEL,49 cometa,50 CMA3,51 traducción de cortes in situ,46,52, DBD-FISH (hibridación in situ de fluorescencia para detección de roturas de ADN),53 prueba de dispersión de cromatina espermática (SCD, por sus siglas en inglés)54 y SCSA.55-58Un aspecto importante en el análisis de la fragmenta-ción del ADN espermático es la pregunta relacionada con el tipo de roturas producidas en las cadenas de ADN, por ejemplo, si las roturas son mono o bicatena-rias y si requieren un paso inicial de desnaturalización para detectar roturas en el ADN, como el SCSA, SCD,54 o el cometa, con un pH ácido o alcalino.59 De hecho, cuando el daño al ADN se observa bajo condiciones ácidas o alcalinas –y no bajo condiciones de pH neutro– deberíamos estar hablando de sitios de ADN ácido-alcalino lábiles.10 Asimismo, las pruebas TUNEL,49 de traducción de cortes in situ (ISNT, por sus siglas en inglés)46 y el ensayo cometa a pH neutro60 no requieren un paso inicial de desnaturalización y, por tanto, miden las roturas monocatenarias (ISNT, TUNEL y cometa) o bicatenarias (TUNEL y cometa) directa-mente. Debido a que el pH intracelular en el ovocito es de alrededor de 7.0,61,62 las roturas monocatenarias de ADN o los sitios ácido-alcalino lábiles no deben ser de consecuencias significativas en la formación del pronúcleo masculino, ya que a un pH neutro las cadenas de ADN no se disociarían y, por tanto, este tipo de daño sería más fácil de reparar que el daño bicatenario en el ADN.

Por tanto, como un primer examen, podríamos considerar dos tipos de pruebas: 1) pruebas que mi-den el daño al ADN directamente, como TUNEL, ISNT, o cometa a pH neutro, y 2) pruebas que miden el daño al ADN después de la desnaturalización, como SCSA, SCD y cometa a pH ácido o alcalino.59 Un estudio reciente reportado por Borini y colabora-dores13 mostró que los valores de fragmentación del



ADN espermático en alícuotas de los mismos esper-matozoides utilizados para FIV, valorados mediante TUNEL, se correlacionaron significativamente con el resultado del embarazo. Esto tiene un marcado contraste con los resultados reportados por Bungum y colaboradores,63 quienes no encontraron correlación entre los valores de fragmentación del ADN esper-mático en las muestras utilizadas para FIV, medidos por la prueba SCSA, y el resultado del embarazo. Es importante observar que aunque la prueba TUNEL se utiliza frecuentemente para la determinación de la apoptosis celular, la positividad del TUNEL no es si-nónimo de apoptosis, ya que el daño al ADN inducido por el radical hidroxil o la radiación ionizante también causa fragmentación del ADN que puede ser detectada como un resultado positivo por la prueba TUNEL.64 El concepto reportado en muchos artículos de evaluación del ADN espermático que establece que la prueba TUNEL se asocia con la apoptosis es una gran sobre-estimación de la capacidad de esta prueba.

Hasta la fecha, la prueba estudiada más extensamen-te desde el punto de vista clínico es la prueba SCSA, desarrollada por Evenson y colaboradores.55,58,65-68 La prueba SCSA, según Evenson, mide la susceptibilidad del ADN a la desnaturalización después de la expo-sición a un ácido débil. El ADN de espermatozoides con una estructura de cromatina normal no se desna-turaliza, mientras que si el ADN está algo dañado y contiene roturas en las cadenas de ADN, éste puede alcanzar diferentes grados de desnaturalización. Para determinar el grado de desnaturalización del ADN espermático, después del tratamiento con un ácido débil, las células espermáticas son teñidas con naranja de acridina. Debido a que el naranja de acridina es un fluorocromo metacromático, muestra fluores-cencia verde cuando está intercalado entre ADN bicatenario intacto y muestra fluorescencia roja en ADN monocatenario. El grado de daño al ADN es medido por citometría de flujo y se expresa como índice de fragmentación del ADN o IFA. Estudios previos indican que un valor IFA > 27% se asocia con falla de embarazo en tecnología de reproducción asistida.57,69 Sin embargo, como se indicó, informes recientes de-safían el valor predictivo de la prueba SCSA.2,70,71 Sin embargo, debe advertirse que la prueba SCSA se ha

sometido a mayor escrutinio que otras pruebas y que otros estudio clínicos pueden revelar limitaciones en otras pruebas, como las pruebas TUNEL y SCD/Halo.

VALOR PREDICTIVO DE LAS PRUEBAS DE FRAGMENTACIÓN DE ADN ESPERMÁTICO

El valor predictivo de las pruebas de fragmentación del ADN espermático depende de una serie de factores. Éstos incluyen:1. Tipo de daño al ADN: daño monocatenario versus

bicatenario al ADN. Como aproximación general, el daño monocatenario al ADN es de mejor pro-nóstico y más fácil de reparar que el daño bicate-nario al ADN. Como se comentó, la fragmentación monocatenaria del ADN puede ser causada por cortes en el ADN no reparados durante el proceso de remodelación de la cromatina. También podría estar causada por daño inducido por radicales de oxígeno. El daño bicatenario al ADN habitualmente es causado por apoptosis, hidrólisis por caspasas y endonucleasas, y por daño inducido por radicales de oxígeno mediante la activación de caspasas y endonucleasas. La extensión del daño bicatenario al ADN inducido por radicales de oxígeno durante el paso de los espermatozoides a través del epidídimo puede estar determinada no sólo por los niveles de radicales de oxígeno producidos por espermatozoi-des inmaduros, células epiteliales de epidídimo o leucocitos activados, sino también por los niveles de enzimas antioxidantes presentes en la luz del epidídimo.39

2. Porcentaje de espermatozoides con daño en el ADN. A la fecha la mayor parte de los estudios han analizado este aspecto de la relación entre la fertili-dad y el daño al ADN espermático. En general, los resultados apuntan a mayor utilidad de las pruebas de ADN espermático en relación con la concepción natural e inseminación intrauterina antes que los tratamientos de tecnología de reproducción asistida, como FVI normal e inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI, por sus siglas en in-glés).72 Es importante tener en cuenta que la cali-dad del ADN espermático en los espermatozoides utilizados en la fertilización es el único factor im-



portante. En las técnicas, como FIV o ICSI, aunque un alto porcentaje de espermatozoides de la muestra puede tener ADN dañado, todavía puede selec-cionarse un espermatozoide “sin daño al ADN”. Se requiere comprender mejor la extensión del daño al ADN en espermatozoides individuales y la forma en que diferentes técnicas de procesamiento espermático pueden eliminar espermatozoides con daño al ADN.

3. Extensión del daño al ADN por espermatozoide. Las principales cuestiones que no se han probado en humanos son: 1) ¿Cuál es el grado de daño al ADN en un espermatozoide individual? y 2) ¿A cuánto daño al ADN espermático puede hacer frente un ovocito? En estudios con ratones se demostró una correlación entre cantidades cada vez mayores de inductores de daño al ADN (calor y radiación) y el resultado reproductivo.73-75 Por ejemplo, los estudios de Ahmadi y Ng74,75 mostraron que se alcanzaban tasas de fertilización de alrededor de 60% cuando los espermatozoides fueron sometidos a 0, 5, 10, 50 y 100 GY. Sin embargo, el desarrollo del blastocisto disminuyó de 49.8% en el grupo control a 2.3% con espermatozoides expuestos a dosis de 5-100 GY. De los blastocistos transferidos en el grupo control, 33.9% se convirtieron en fetos vivos, mientras que estas tasas fueron de 20 y 0% cuando los espermatozoides se expusierona dosis de 5 y 10 GY. Los investigadores concluyeron que el desarrollo embrionario y fetal está mucho más relacionado con el grado de daño al ADN y que el ovocito tiene la capacidad de reparar el daño al ADN espermático cuando está dañado en menos de 8%.

4. Si existe daño combinado de nucleótidos y fragmen-tación del ADN. El daño postesticular al ADN es-permático inducido por el radical hidroxil o después de la exposición a radiación ionizante está asociado con el daño a nucleótidos del tipo 8-OHdG. Como se indicó previamente, con este tipo de daño, en un primer estadio el daño producido es de tipo 8-OHdG, seguido de la fragmentación bicatenaria del ADN que puede estar mediada por caspasas y endonucleasas. Las implicaciones del daño combinado de nucleóti-dos y la fragmentación de cadenas de ADN es que, además de su valor diagnóstico (el daño inducido

por radicales de oxígeno es sensible al tratamiento antioxidante), puede tener un peor pronóstico, ya que la mayor parte de las células espermáticas será afectada por uno u otro tipo de daño.

5. Si el daño al ADN afecta intrones o exones. Más de 90% del ADN está compuesto de intrones. Por consiguiente, la probabilidad de que el daño al ADN afecte los exones, que son las secuencias que codifican proteínas, es relativamente baja. Por tanto, la pregunta es si la mayor parte del daño al ADN es de naturaleza arquitectónica y si esto puede tener implicaciones a largo plazo.

6. Capacidad del ovocito de reparar el daño al ADN espermático en el espermatozoide que lleva a cabo la fertilización. De los diferentes factores que tienen repercusión en el valor predictivo de las pruebas de fragmentación de ADN espermático, la capa-cidad de reparación del ADN que tiene el ovocito posiblemente es el más importante. El ovocito de ratón tiene la capacidad de reparar el daño al ADN espermático,76 aunque esta capacidad es limitada y puede variar de ovocito en ovocito e, incluso, entre diferentes cohortes de ovocitos del mismo paciente o de diferentes pacientes. También puede depender de la edad de la mujer. Asimismo, la capacidad del ovocito de reparar el daño al ADN espermático en el espermatozoide encargado de la fertilización también depende del tipo de daño al ADN. Como se indicó, el daño al ADN espermático puede cla-sificarse como mono y bicatenario. En general, el daño monocatenario al ADN es más fácil de reparar que el daño bicatenario, aunque existe evidencia de que las polimerasas también pueden reparar el daño bicatenario al ADN.77 Por consiguiente, aun si el espermatozoide encargado de la fertilización tuviera daño al ADN en su genoma, el ovocito po-dría reparar este daño y, por tanto, sería irrelevante para el desarrollo embrionario y fetal. Sin embargo, no es posible determinar si el ovocito sería capaz de reparar este daño. Además, las pruebas de fragmen-tación de ADN disponibles actualmente no pueden proporcionar información sobre la “reparabilidad” del daño al ADN. Por consiguiente, hay dos niveles de incertidumbre que no pueden resolverse con las pruebas diagnósticas actualmente disponibles. Sin



embargo, si postulamos que el daño irreparable al ADN espermático no es compatible con el desa-rrollo embrionario y fetal normal, en las parejas en las que el hombre tiene fragmentación del ADN espermático de tipo irreparable, no debe lograrse un embarazo y la pareja acudiría a clínicas de in-fertilidad con infertilidad de largo tiempo de evo-lución o falla repetida del embarazo en tecnología de reproducción asistida sin causa aparente. Si la fragmentación del ADN espermático es el factor limitante, las estrategias dirigidas a disminuir los niveles de fragmentación de ADN deben mejorar el resultado de embarazo en parejas sin causa aparente de su problema de infertilidad.

Como se expuso, los reportes demostraron que el daño al ADN espermático es significativamente menor en los túbulos seminíferos en comparación con la cola del epidídimo21,78 o el esperma eyaculado,19 y que el uso de espermatozoides testiculares en parejas con falla repetida para lograr un embarazo en tecnología de reproducción asistida y alta fragmentación del ADN espermático en semen resultó en aumento significativo de las tasas de embarazo en estas parejas.19,79 Además, un informe reciente muestra que las tasas de embarazo en los primeros ciclos de TESA-ICSI son relativamente altas (Cuadro 1). Estos resultados son consistentes con el concepto de que en parejas con infertilidad de larga evolución o falla repetida para lograr un embarazo con tecnología de reproducción asistida sin causa aparente, la fragmentación del ADN espermático podría ser el factor limitante responsable de su falla de embarazo, y que el uso de espermatozoides testiculares con nive-les muy bajos de fragmentación del ADN elimina del ovocito la carga de reparación de ADN del esperma-tozoide encargado de la fertilización. Sin embargo, el uso de esperma testicular puede no siempre solucio-nar el problema, ya que el daño al ADN espermático también puede ocurrir en el epitelio de los túbulos seminíferos mediante apoptosis o deberse a defectos en la remodelación de la cromatina durante el proceso de espermiogénesis. No obstante, en la mayoría de los casos, el daño al ADN espemático ocurre o aumenta en el epidídimo y, por consiguiente, los niveles de frag-mentación de ADN en los espermatozoides testiculares deben ser menores.19

Un asunto que debe considerarse cuando se utili-zan espermatozoides testiculares es la posibilidad de microinyectar espermatozoides testiculares con una probabilidad alta de tener anormalidades cromosómi-cas. Es bien sabido que la tasa de aneuploidía en los espermatozoides testiculares es mayor que en el esperma eyaculado. Esto podría deberse a la eliminación selectiva de los espermatozoides aneouploides durante el paso a través del epidídimo.80 Sin embargo, la conclusión de que la tasa de aneuploidía en el esperma testicular es significativamente mayor que en el esperma eyaculado proviene, en la mayor parte, de estudios que utilizaron espermatozoides de hombres gravemente oligospérmi-cos o azoospérmicos. En contraste, en la mayoría de los pacientes con altos niveles de fragmentación de ADN en espermatozoides eyaculados en los cuales está indicado el uso de espermatozoides testiculares, la concentra-ción de espermatozoides en el semen es normal y, por consiguiente, no nos estamos enfrentando con hombres gravemente oligospérmicos o azoospérmicos donde el riesgo de aneuploidía espermática es mayor. En un in-forme reciente se demostró que las tasas de embarazo, utilizando espermatozoides testiculares en parejas con niveles altos de fragmentación de ADN, fueron signi-ficativamente mayores que al utilizar espermatozoides

Cuadro 1. Resultados de TESA-ICSI en parejas con falla repetida a FIV y niveles altos de fragmentación del ADN espermático en semen

Características Valores

Parámetros de semen y casos Casos evaluados 68 Casos de TESA-ICSI realizada 31 IFA promedio en semen 39.4% Concentración espermática promedio (millones/mL)

44.7

Edad masculina promedio 41.9Resultados Tasa de fertilización 58% (20-100%) Número de embriones transferidos 2.3 Tasa de embarazo clínico 40% Tasa de embarazo en el primer ciclo TESA-ICSI

93%

IFA: índice de fragmentación del ADN; TESA-ICSI: extracción de espermatozoides testiculares-inyección espermática intra-citoplasmática.Sakkas. Sperm DNA fragmentation. Fertil Steril 2010.



eyaculados y que las tasas de aborto espontáneo fueron significativamente menores (Cuadro 2). Si el uso de espermatozoides testiculares en parejas con niveles altos de fragmentación de ADN espermático fuera un riesgo significativo, las tasas de embarazo deberían ser menores y las tasas de aborto espontáneo, mayores. Sin embargo, los resultados indican lo contrario y que ésta es una técnica relativamente segura cuando se aplica a estas parejas.137. Tipo de prueba de fragmentación de ADN utilizado.

Como se indicó, deben recomendarse de preferen-cia las pruebas que miden directamente el daño al ADN sin un paso previo de desnaturalización, como TUNEL; especialmente cuando se combinan con citometría de flujo. Esto aumenta la capacidad de reproducir el resultado de la prueba, así como su confiabilidad.

8. Procesamiento de los espermatozoides en tecnología de reproducción asistida. El daño al ADN puede ocu-rrir durante el procesamiento de los espermatozoides. Estudios previos demostraron que la incubación de semen a temperatura ambiente81 o a 37°C82 después de su aislamiento mediante centrifugación por gradiente de densidad puede resultar en aumento de los niveles de fragmentación de ADN espermático. También, la criopreservación de los espermatozoides puede causar aumento en la fragmentación del ADN.83 Además, la centrifugación de semen bruto puede aumentar la fragmentación de ADN. Por tanto, el procesamiento de los espermatozoides en tecnología de reproducción asistida debe regirse por el principio primum non nocere. Es decir, 1) debe evitarse la

incubación innecesaria de semen y suspensiones de espermatozoides; 2) la centrifugación por gradiente de densidad parece ser la mejor manera de procesa-miento de semen,84-89 y 3) deben utilizarse métodos de criopreservación que minimicen la fragmentación de ADN espermático. Un valor IFA puede ser normal en el semen licuado y anormal en los espermatozoides utilizados para la tecnología de reproducción asisti-da. Esto dará resultados falsos-negativos y alterará el valor predictivo de las pruebas de fragmentación de ADN espermático. Una manera de minimizar el efecto de la incubación del semen en la fragmentación del ADN sería mediante la disminución del tiempo entre el procesamiento del semen y la inseminación. Además, en el caso de la criopreservación de esper-matozoides, debe recomendarse el uso de medios complementados con antioxidantes. Un aspecto importante que debe tomarse en cuenta acerca de la relación entre el procesamiento de espermatozoides y la fragmentación de ADN es que, en caso de que una cantidad crítica de espermatozoides en la muestra de semen tenga cromatina intacta, el procesamiento de espermatozoides puede resultar en el enriquecimiento de estos espermatozoides y, por tanto, aumentar las oportunidades de lograr un embarazo viable.

9. Número de ovocitos. En parejas en quienes el nivel de fragmentación del ADN es relativamente alto, la pro-babilidad de que se produzcan embriones normales o embarazos viables dependerá, al menos parcialmente, de la cantidad de ovocitos obtenidos en metafase II y de su capacidad de reparar el daño al ADN en los es-permatozoides fertilizantes. Por ejemplo, si se obtienen

Cuadro 2. Resultado de embarazo en pacientes con niveles altos de fragmentación de ADN espermático al ser tratados con esper-matozoides eyaculados en comparación con espermatozoides testiculares

Tasa de embarazo bioquímico

Tasa de embarazo clínico

Tasa de implantación Tasa de aborto espontáneo

Espermatozoides eyaculados (n = 42)

6.9% 13.79% 6.56% 75%

Espermatozoides testiculares (n = 30)

2.5% 40% 28.09% 6.25%

Valor p NS .035 .0021 .017

Nota: todos los pacientes incluidos en el estudio tuvieron un valor del índice de fragmentación de ADN >20% mediante TUNEL; análisis estadístico mediante prueba de ji al cuadrado. Sakkas. Sperm DNA fragmentation. Fertil Steril 2010.



10 ovocitos en metafase II, la probabilidad de tener un embarazo será mayor que si sólo se obtiene un ovoci-to. En el segundo caso (un solo ovocito obtenido), la probabilidad de obtener al menos un embrión derivado de un espermatozoide con ADN intacto que fertilizó un ovocito normal o de un espermatozoide con ADN dañado que fertilizó un ovocito con alta capacidad de reparación de ADN será mucho más baja que en el primer caso (10 ovocitos obtenidos). En el primer caso, la selección de embriones y la transferencia de dos embriones aumenta significativamente la proba-bilidad de obtener al menos un embrión con ADN intacto a partir del cual se puede derivar un embarazo viable. Sin embargo, esto no invalida el valor de las pruebas de fragmentación de ADN en estas parejas. Por consiguiente, el número de ovocitos disponibles en metafase II es un factor importante que afecta el valor predictivo de las pruebas de fragmentación de ADN. Lo mismo aplicaría a ciclos naturales o de in-seminación intrauterina (IIU) en los cuales la cantidad de ovocitos obtenidos es usualmente uno. En este escenario, las tasas de embarazo dependerían más del valor de la prueba de fragmentación de ADN, ya que la probabilidad de obtener un embrión con ADN intacto es más baja y, además, no se tiene la ventaja de trans-ferir dos o tres embriones como en el caso de la FIV. Por tanto, el valor predictivo negativo de las pruebas de fragmentación de ADN debe ser mayor en ciclos naturales o de IIU. Esta hipótesis es consistente con los resultados del estudio de Duran y colaboradores,90 en el que encontraron que los valores de fragmentación de ADN, estimados mediante la prueba TUNEL, se correlacionaron estrechamente con las tasas de em-barazo en ciclos de IIU.

Para concluir, se propone que el valor predictivo de las pruebas de fragmentación de ADN, πtest, es la suma de varios factores: πtest= π(1) + π(2)+ π(3) ... +π(n), donde π(n)representa muchos de los factores discutidos previa-mente, y a cada factor se le puede dar un peso diferente.

APLICACIONES AL DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE LA INFERTILIDAD ¿Cuáles son las implicaciones de las pruebas de ADN espermático en el diagnóstico y tratamiento de la in-

fertilidad? La fertilización de ovocitos en metafase II por espermatozoides con daño al ADN podría resultar en defectos en el desarrollo embrionario, falla en la implantación, o en aumento en la tasa de aborto espon-táneo.13,14,91-95 Los ovocitos maduros con mecanismos funcionales de reparación de ADN tienen la capacidad de reparar el daño moderado al ADN espermático.96,97 Sin embargo, los ovocitos cuyos mecanismos de reparación de ADN no son funcionales o que han sido dañados por factores endógenos (radicales libres) o exógenos (radiación, tóxicos ambientales) no serían capaces de reparar este daño.

Un aspecto importante que está surgiendo actual-mente relacionado con las pruebas de fragmentación de ADN espermático es la existencia de subgrupos de parejas infértiles que acuden a clínicas de infertilidad con infertilidad de larga evolución o falla repetida a FIV sin una causa aparente en las cuales el daño “irrepara-ble” al ADN espermático puede ser el factor limitante responsable de su problema de infertilidad. Esto puede ayudar a explicar, al menos en parte, por qué las tasas de embarazo en los primeros ciclos de TESA-ICSI son relativamente altas en estas parejas.79 Estos datos sugie-ren que si el embarazo no tiene lugar en el primer ciclo TESA-ICSI, la causa de infertilidad en estas parejas puede estar en cualquier otra parte. Actualmente, existe cierta controversia respecto del valor predictivo de las pruebas de fragmentación de ADN espermático en tecno-logía de reproducción asistida. Incluso al utilizar pruebas con un alto valor predictivo, como TUNEL mediante citometría de flujo, dada su baja especificidad, debida principalmente a la capacidad del ovocito de reparar el ADN espermático, los valores de fragmentación de ADN espermático no siempre se correlacionan con el resultado de embarazo. Algunos investigadores reportan tal correlación y otros no. En un informe reciente, Collins y colaboradores98 concluyen que “la pequeña pero esta-dísticamente significativa asociación entre los resultados de las pruebas de integridad de ADN espermático y el embarazo en ciclos FIV e ICSI, no es suficientemente fuerte para proporcionar una indicación clínica para el uso rutinario de estas pruebas en la evaluación de la infertilidad masculina. Es posible que subgrupos aún por determinar de parejas infértiles puedan beneficiarse de las pruebas de integridad de ADN espermático.” Esta



evaluación implica que las pruebas de fragmentación de ADN espermático pueden ser aplicadas selectivamente a parejas con mal pronóstico en tecnología de reproduc-ción asistida. Como se indicó, hay una serie de factores que afectan el valor predictivo de las pruebas de frag-mentación de ADN, lo cual puede ayudar a responder esta pregunta. Sin embargo, tal vez la explicación más probable a esta aparente paradoja está relacionada con el tipo de daño al ADN: reparable versus irreparable. Por ejemplo, dos pacientes pueden tener el mismo valor de la prueba de fragmentación de ADN mediante TUNEL (por ejemplo, 50%); sin embargo, el pronóstico puede ser completamente diferente, ya que en un caso el daño al ADN puede ser reparable y en el otro no. Sin embargo, esto en sí mismo no explica por qué las tasas de emba-razo serían tan bajas en el segundo caso. Para que esto aplique, todos los espermatozoides deben tener algún tipo de daño al ADN y este daño no puede ser reparado por el ovocito o el embrión. Debe aplicar un escenario de tipo “efecto iceberg”. Dado el hecho de que uno de los mecanismos más importantes de fragmentación del ADN espermático es el daño oxidativo durante el paso a través del epidídimo y, como se mencionó, de una com-binación de daño a nucleótidos (por ejemplo, 8-OHdG y daño bicatenario al ADN), es posible que, en estas parejas, el daño al ADN afectaría la mayor parte de las células espermáticas, a pesar de que las pruebas actuales permiten medir sólo una fracción de este daño al ADN. Por consiguiente, el valor de 50% sería engañoso. Vale la pena considerar el concepto de que algunos pacientes con un tipo más grave de daño al ADN (por ejemplo, daño al ADN que no es reparable por el ovocito o el embrión) pueden beneficiarse de las pruebas de fragmen-tación de ADN y el uso de espermatozoides con valores bajos de fragmentación de ADN. Desafortunadamente, al menos en el escenario clínico, actualmente no están disponibles pruebas que permitan la diferenciación de estos tipos de daño al ADN. Sin embargo, recientemente el 2D-COMET se introdujo como una prueba nueva que puede distinguir entre estos dos tipos de daño.99 Esta prueba puede ayudar a evaluar el efecto del daño bica-tenario al ADN espermático en el resultado de embarazo de tecnología de reproducción asistida y aumentar la especificidad de las pruebas de fragmentación de ADN. Además del daño al ADN calculado mediante pruebas

como TUNEL, cometa, SCD o SCSA, con excepción de la prueba 8-OHdG, actualmente no están disponibles pruebas que midan otros tipos de daño al ADN (oxidativo y no oxidativo) que puedan estar presentes en el ADN espermático. Hasta que se desarrollen estas pruebas, la especificidad de las pruebas de fragmentación de ADN espermático continuará siendo baja.

Por tanto, con base en los factores que determinan el valor predictivo de las pruebas de fragmentación de ADN espermático, el valor clínico de las pruebas de fragmentación de ADN en la predicción del resultado de embarazo en tecnología de reproducción asistida debe basarse necesariamente en dos supuestos principales: 1) el daño al ADN debe afectar toda la población de esper-matozoides en la muestra, y 2) el daño al ADN presente en estos espermatozoides no puede ser reparado por el ovocito. Si alguno de estos supuestos no se aplica, no podría esperarse correlación significativa entre un índice de fragmentación de ADN anormal y el resultado de embarazo en tecnología de reproducción asistida.

Como se indicó, otro aspecto importante de las aplica-ciones clínicas de las pruebas de fragmentación de ADN es el uso de espermatozoides testiculares en pacientes con niveles altos de fragmentación de ADN espermático en el semen. En estos casos, debe recomendarse el uso de espermatozoides testiculares obtenidos mediante TESE o TESA.

Además del uso de espermatozoides testiculares, otra estrategia que puede utilizarse en pacientes con niveles altos de fragmentación del ADN espermático es la selección de espermatozoides con niveles bajos de daño al ADN. Aunque esta estrategia se aplicaría principalmente a espermatozoides eyaculados, también podría aplicarse a espermatozoides testiculares, ya que, como se mencionó, no todo el daño al ADN espermá-tico es postesticular. Actualmente se ha propuesto una serie de técnicas para seleccionar espermatozoides con niveles bajos de fragmentación de ADN. Éstas inclu-yen el uso de columnas anexina-V,100,101 las cuales han demostrado reducir significativamente el porcentaje de espermatozoides con fragmentación de ADN, según lo determinado por la prueba TUNEL y un método de selección de espermatozoides basado en la fijación de ácido hialurónico espermático.102 Otras técnicas incluyen la selección de espermatozoides desprovistos



de vacuolas superficiales mediante ICSI de alta mag-nificación103 y la recientemente introducida tecnología de absorción confocal de la luz y espectroscopia de dispersión (CLASS, por sus siglas en inglés), la cual permite la visualización no invasiva de estructuras subcelulares.103 Estas estructuras pueden identificarse mediante dos modos principales: visualización direc-ta mediante la microscopia confocal o mediante su espectro específico. En relación con las aplicaciones del modo espectral en tecnología de reproducción asistida, se uniría un espectroscopio al microscopio invertido y el espectro de estructuras subcelulares, como la cromatina espermática, puede recogerse en menos de un segundo. Por consiguiente, la tecnología CLASS puede hacer posible, en un futuro cercano, seleccionar espermatozoides con cromatina intacta para ser microinyectados a través de ICSI. Sin embargo, debe tenerse cuidado en relación con los potenciales efectos perjudiciales del uso de estas técnicas no in-vasivas, ya que en algunas condiciones imprevistas puede inducirse daño. Debido a que en el caso de la tecnología CLASS el tiempo de selección espermática y de exposición a luz visible estaría limitado a alrededor de un segundo, esto es más probable que se aplique a la tecnología IMSI (inyección intracitoplasmática de espermatozoides morfológicamente seleccionados), en la que el tiempo de selección espermática es significa-tivamente mayor. Con respecto a la utilidad de IMSI en ART, un estudio reciente indica que los niveles de fragmentación de ADN, según lo evaluado mediante la prueba de dispersión de cromatina espermática, en espermatozoides individuales seleccionados median-te IMSI, son insignificantes en espermatozoides sin vacuolas (Gosalvez y col., resultados no publicados).

En conclusión, la fragmentación de ADN en el núcleo espermático generó una plétora de artículos durante la década pasada. La distinción entre todos los esperma-tozoides afectados versus sólo los espermatozoides con “ADN dañado” es sumamente relevante para el manejo clínico de estos pacientes. En relación con la tecnología de reproducción asistida, la responsabilidad debe ahora cambiarse a la identificación de los espermatozoides con ADN dañado y cómo seleccionar poblaciones de espermatozoides o espermatozoide individuales “norma-les”. Finalmente, la presencia de espermatozoides con

ADN fragmentado es irrefutable cualesquiera que sean los mecanismos de su origen, el efecto en el embrión y la descendencia, y la necesidad de diagnosticarlo es un área crítica que requiere un conocimiento más profundo.

Agradecimientos: Los autores agradecen a la Dra. Esther Velilla y a la Dra. Estefanía Toro por la asistencia técnica en la realización de la prueba TUNEL y al Dr. Ferrán García por la recuperación de espermatozoides testiculares en los estudios TESA-ICSI. También agrade-cen a la Dra. López-Teijón por sus valiosos comentarios y su apoyo incondicional en esta investigación.

Traducción: Adriana Jardón A

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Artículo original


Características que optimizan la selección de donantes de óvulosLaura Fabiola Guadarrama García,* Heidi Trejo Castañeda,* Zarela Lizbeth Chinolla Arellano,* Jeimy Pedraza Cepeda,* Felipe Caldiño Soto,* Sandra Cubillos García,* Silvio Cuneo Pareto*

RESUMEN

Antecedentes: la donación de ovocitos es una técnica de reproducción asistida en la que el gameto femenino es aportado por una mujer distinta a la que recibirá el gameto o el embrión resultante.Objetivo: identificar las variables que definan un perfil de buena respuesta de donantes de ovocitos.Material y métodos: se realizó –de noviembre de 2004 a marzo de 2010– un estudio retrospectivo, longitudinal y descriptivo del primer ciclo de hiperestimulación ovárica controlada, ciclo que se llevó a cabo en 53 donadoras de ovocitos para fecundación in vitro con transferencia de embriones; se analizaron únicamente las características de las donantes que en su primer ciclo realizado lograron un embarazo (n = 19).Resultados: en relación con las donantes nuligestas o con embarazo previo, se observó una diferencia significativa en las concen-traciones de estradiol –secundarias a la aplicación de la gonadotrofina coriónica humana–, en el número de folículos maduros y en el total de ovocitos capturados y ovocitos en metafase II de las donantes con al menos un embarazo a término; no hubo diferencia en la dosis total de gonadotrofinas ni en el perfil hormonal basal.Conclusiones: las características que optimizan la selección de donantes de ovocitos son: edad menor de 25 años, índice de masa corporal (IMC) menor de 24.9 y fertilidad probada; por tanto, las posibles mujeres aptas para ovodonación se tendrían que seleccio-nar con base en dichas condiciones –para obtener buenas tasas de embarazo, para utilizar menores dosis de gonadotrofinas y para originar menos complicaciones en la donante.Palabras clave: donantes de óvulos, selección.

ABSTRACT

Background: Oocyte donation is an assisted reproduction technique in which female gamete is aported by a different woman to that will receive this or the resulting embryo.Objective: To identify the variables defining the profile of good reponse in oocyte donors.Material and methods: A retrospective, longitudinal, descriptive study was done of the first cycle of controlled ovarian hyperstimula-tion of 53 donors for IVF-TE from November 2004 to March 2010. The characteristics of donors who achieved pregnancy in their first cycle were analyzed (n = 19).Results: According to the group of nuligest or with previous pregnancy a significant difference was observed favoring donors with at least one term-pregnancy in the value of estradiol with hCG, number of mature follicles, total of captured and in metaphse II oocytes, without observing difference in the total dose of gonadotrophins nor in the basal hormonal profile.Conclusions: Characteristics optimizing oocytes donations in a donor are a younger age than 25 years, a BMI lesser than 24.9 and tested fertility, thus, at the moment of selection of possible candidates for ovodonation these conditions should be looked for in order to obtain good rates of pregnancy and to use lower doses of gonadotrophin with the lesser probability of complications for the donor.Key words: oocyte-donor, selection.

* Laboratorio de Reproducción Asistida CONCIBE, México, DF.

Correspondencia: Dr. Silvio Cuneo Pareto; [email protected]: febrero, 2011. Aceptado: marzo, 2011.

Este artículo debe citarse como: Guadarrama-García LF, Trejo-Castañeda H, Chinolla-Arellano ZL, Pedraza-Cepeda J y col. Características que optimizan la selección de donantes de óvulos. Rev Mex Reprod 2011;3(4):176-181.


La donación de ovocitos es una técnica de reproducción asistida en la que el gameto femenino es aportado por una mujer distin-ta a la que recibirá el gameto o el embrión

resultante.1 La utilización de ovocitos de donantes ha sido posible gracias a las técnicas de fertilización in vitro. Estos procedimientos requieren que se lleve a cabo una hiperestimulación ovárica vigilada y una captura de ovocitos que pueden significar incomodidades y riesgos para las donantes. Las indicaciones principales


Características que optimizan la selección de donantes de óvulos

para considerar la donación de ovocitos son: pacientes con hipogonadismo hipergonadotrófico, en edad repro-ductiva avanzada, con reserva ovárica disminuida (por intervención quirúrgica, menopausia temprana, agenesia gonadal, etc.), portadoras de algún defecto genético, con mala calidad ovocitaria o embrionaria o con múltiples intentos fallidos para concebir mediante alguna técnica de reproducción asistida.2,3

Según las guías internacionales para ser donante de ovocitos, la donante debe someterse a una evaluación física completa, a exámenes serológicos –de hepatitis B, hepatitis C, sífilis y virus de la inmunodeficiencia humana 1 y 2– y a una evaluación psicológica completa. La do-nante debe ser anónima y mayor de edad; preferentemente debe tener entre 21 y 34 años de edad; la fertilidad probada es deseable pero no obligatoria; se excluye a las mujeres que integran grupos de riesgo, como usuarias de drogas intravenosas, practicantes de conductas sexuales de riesgo –como prostitución, promiscuidad o contacto sexual con personas de este grupo– o presidiarias; también se excluye a las mujeres que tengan tejidos u órganos trasplantados o que en el último año se hayan realizado acupuntura, perforaciones o tatuajes, porque no es claro que estos procedimientos se hayan realizado con esterilidad.2

El éxito de la donación de ovocitos es influido por múltiples factores, como la edad de la donante de ovocitos y de la receptora, la calidad del embrión, el estado reproductivo y la receptividad endometrial. Recientemente, la edad de la donadora es uno de los factores más importantes para obtener un buen resultado en la fertilización in vitro.4 Aun cuando se han utilizado diferentes biomarcadores indirectos para evaluar la reserva ovárica (concentraciones de hormona folículo estimulante en el día 3 del ciclo, concentraciones de estradiol en el día 3 y concentraciones de inhibina B y de hormona antimülleriana), ninguno ha sido más exacto que los demás.5,6 Sin embargo, en mujeres jóve-nes fértiles los marcadores hormonales raramente son anormales, de ahí que sean utilizados como factores de predicción de respuesta ovárica.7 Otro factor que se ha asociado con la disminución de la fertilidad, con el incremento de requerimientos de gonadotrofinas, con un desarrollo folicular insuficiente y con menor número de ovocitos y porcentaje de embarazos es el índice de masa corporal (IMC). Las donadoras jóvenes con IMC

elevado requieren una dosis total mayor de gonado-trofina debido a que producen menos ovocitos totales maduros. Por tanto, el sobrepeso y la obesidad pueden reducir el porcentaje de éxito e incrementan el costo de los programas de ovodonación.8 Se ha observado que el porcentaje de embarazos es mayor en donantes jóvenes delgadas cuyo IMC es menor de 27.9

JUSTIFICACIÓN

La donación de ovocitos es un tratamiento contra la infer-tilidad de las mujeres con insuficiencia ovárica prematura, menopausia natural o quirúrgica, falla de fertilización in vitro y enfermedades cromosómicas, entre otras afec-ciones; por eso, en este estudio se busca identificar las variables clínicas, bioquímicas y ultrasonográficas que definan un perfil de buena respuesta en donantes de ovo-citos para de esta forma lograr mejores tasas de embarazo en las receptoras y menores riesgos y costos.

OBJETIVOS

Identificar las variables que definan un perfil de buena respuesta en donantes de ovocitos.

Identificar si la edad, el IMC y la maternidad previa de la donante de ovocitos son factores de predicción de dosis totales de gonadotrofinas utilizadas, ovocitos totales, ovocitos maduros capturados y porcentaje de embarazo.

PACIENTES Y MéTODO

Se realizó –de noviembre de 2004 a marzo de 2010– un estudio retrospectivo, longitudinal y descriptivo del pri-mer ciclo de hiperestimulación ovárica controlada, ciclo que se llevó a cabo en 53 donadoras de ovocitos para fecundación in vitro con transferencia de embriones; se analizaron únicamente las características de las donantes que en su primer ciclo realizado lograron un embarazo (n = 19). Se inició la estimulación ovárica controlada con hormona folículo estimulante recombinante, menotropi-nas urinarias con protocolo de reducción (o ambas) en el día 2, 3 o 4 del ciclo, se dio seguimiento ultrasonográfico y se estableció la determinación hormonal sérica; una vez que los folículos midieron 18 mm de diámetro, se aplicaron por vía subcutánea 10,000 UI de gonadotrofina


Guadarrama García LF y col.

coriónica humana y se realizó la aspiración folicular a las 36 horas, estando bajo sedación la donante.

Se analizaron los siguiente factores: la edad, el antece-dente de embarazo y el IMC y su repercusión en la dosis total de gonadotrofinas, en los ovocitos capturados y en los ovocitos en metafase II. Para comparar el antecedente de embarazo y el IMC y su repercusión en la dosis total de gonadotrofinas, en los ovocitos capturados y en los ovocitos en metafase II se utilizó la prueba no pareada de la t de Student. Para comparar los grupos de edad y su repercusión en las variables estudiadas se utilizó ANOVA y la prueba de comparación múltiple de Tukey-Kramer.

RESULTADOS

En el Laboratorio de Reproducción Asistida CONCIBE se revisaron, de noviembre de 2004 a marzo de 2010, 53 ciclos de estimulación ovárica en 53 pacientes do-nantes. Se incluyó a las donantes que cumplieron con los requisitos para pertenecer al programa; a saber, tener entre 18 y 34 años de edad, con maternidad comprobada preferentemente, con serologías negativas para hepatitis B y C, sífilis y virus de la inmunodeficiencia humana 1 y 2, con estudio toxicológico negativo, con perfil hormonal basal normal en el día 2, 3 o 4 del ciclo, con ultrasonido transvaginal basal sin evidencia de daño y con logro de embarazo (19 donantes) en su primera donación.

Respecto al IMC, los resultados de las donantes se dividieron en dos grupos: grupo 1: IMC de 18.5 a 24.9, grupo 2: IMC mayor de 25 (Cuadro 1).

En relación con el IMC, no se observaron diferencias significativas en las concentraciones hormonales basales, en las concentraciones de estradiol –secundarias a la aplicación de la gonadotrofina coriónica humana–, en el número de folículos maduros, en los ovocitos captu-rados y en metafase II (Figura 1) y en la dosis total de gonadotrofinas utilizadas entre las donantes con IMC de 18.5 a 24.9 y con IMC mayor de 25.

Respecto al antecedente de embarazo, los resultados de las donantes se dividieron en dos grupos: grupo 1: donantes nuligestas, grupo 2: donantes con embarazo previo (Cuadro 2).

En relación con las donantes nuligestas o con em-barazo previo, se observó una diferencia significativa a favor de las donantes con al menos un embarazo a término en las concentraciones de estradiol –secundarias a la aplicación de la gonadotrofina coriónica humana–, en el número de folículos maduros y en el total de ovo-citos capturados y en metafase II (Figura 2); no hubo diferencia en la dosis total de gonadotrofinas ni en el perfil hormonal basal.

Respecto a la edad, los resultados de las donantes se dividieron en tres grupos: grupo 1: menores de 25 años, grupo 2: entre 25 y 29 años, grupo 3: mayores de 30 años (Cuadro 3).

En los diferentes grupos de edad no hubo diferencias significativas en el perfil hormonal basal, en el número de folículos maduros, en el total de ovocitos capturados y en metafase II y en la dosis total de gonadotrofinas utilizadas (Figura 3).

Cuadro 1. Resultados de los grupos de donantes en relación con el IMC

Índice de masa corporal Grupo 1: IMC 18.5-24.9 (n = 14) Grupo 2: IMC > 25 (n = 5) p

Edad 26.86 ± 3.44 25 ± 1.22 NSFSH basal 6.95 ± 2.70 5.48 ± 0.947 NSLH basal 3.93 ± 1.82 4.66 ± 0.61 NSEstradiol basal 35.79 ± 21.21 36 ± 12.79 NSEstradiol disparo 6,040 ± 3,050 6,871 ± 5,235 NSFolículos maduros 10.71 ± 3.55 17 ± 8.09 NSOvocitos capturados 21 ± 13.62 26 ± 15.13 NSOvocitos en metafase II 10.07 ± 7.06 9.60 ± 6.1) NSDosis total de gonadotrofinas 2,753 ± 561 2,594 ± 308 NS

FSH: hormona folículo estimulante; LH: hormona luteinizante.Prueba no pareada de la t de Student (p = < 0.05).



Figura 1. Ovocitos capturados y en metafase II en relación con el índice de masa corporal de la donante.

Cuadro 2. Resultados de los grupos de donantes en relación con el antecedente de embarazo

Antecedente de embarazo Grupo 1: donantes nuligestas (n = 12) Grupo 2: donantes con embarazo previo (n = 7) p

Edad 26.66 ± 3.14 25.86 ± 2.67 NSIMC 21.62 ± 2.20 22.70 ± 4.47 NSFSH basal 7.09 ± 2.42 5.48 ± 2.51 NSLH basal 4.32 ± 1.48 3.78 ± 1.78 NSEstradiol basal 30.58 ± 21.32 44.9 ± 27.9 NSEstradiol disparo 4,727 ± 3,066 8,886 ± 3,834* < 0.05Folículos maduros 10.42 ± 3.75 15.71 ± 6.92* < 0.05Ovocitos capturados 17.25 ± 9.14 31.28 ± 14.73* < 0.05Ovocitos en metafase II 6.33 ± 4.29 16.14 ± 9.8* < 0.05Dosis total de gonadotrofinas 2,749 ± 504 2,645 ± 546 NS

IMC: índice de masa corporal; FSH: hormona folículo estimulante; LH: hormona luteinizante.Prueba no pareada de la t de Student (*p = < 0.05).

Figura 2. Ovocitos capturados y en metafase II en relación con el antecedente de embarazo de la donante.

Cuadro 3. Análisis de variancia ANOVA y prueba de comparación múltiple de Tukey-Kramer (p < 0.05)

Edad Grupo 1: < 25 años (n = 5) Grupo 2: 25-29 años (n = 12) Grupo 3: > 30 años (n = 2) p

IMC 21.72 ± 2.14 22.24 ± 3.80 21.6 ± 0.13 NSFSH basal 6.4 ± 4.52 7.29 ± 2.35 7.21 ± 0.007 NSLH basal 3.01 ± 2.65 4.52 ± 0.83 4.47 ± 0.69 NSEstradiol basal 33 ± 11.9 33.5 ± 28.56 57 ± 4.24 NSEstradiol disparo 7,573 ± 3,674 5,972 ± 4,252 4,695 ± 1,269 NSFolículos maduros 11.2 ± 3.96 13.92 ± 5.91 6 ± 1.41 NSOvocitos capturados 26.60 ± 13.57 21.58 ± 14.09 17 ± 4.24 NSOvocitos en metafase II 8.8 ± 3.42 9.83 ± 9.73 13.50 ± 9.19 NSDosis total de gonadotrofinas 2,564 ± 625 2,799 ± 392 2,550 ± 1,060 NS

IMC: índice de masa corporal; FSH: hormona folículo estimulante; LH: hormona luteinizante.

21

26

10

9.6

0 5 10 15 20 25 30

18.5

-24.

9Ín

dice

de

mas

a co

rpor

al>

25

Ovocitos capturados

Núm. de ovocitos

Ovocitos en metafase II

31.28

17.25

16.14

6.33

0 5 10 15 20 25 30 35

Con

em

bara

zo

prev

ioN

ulig

esta

Ovocitos capturados Ovocitos en metafase IINúm. de ovocitos


Guadarrama García LF y col.

24.9 no difirieron significativamente de los de nuestras donantes con sobrepeso. También observamos que las donantes con un IMC igual o mayor de 25 donaron un mayor número de ovocitos totales capturados; sin em-bargo, las donantes con un IMC menor de 24.9 donaron un mayor número de ovocitos en metafase II, aunque el número de ovocitos no fue significativo. Las dosis totales de gonadotrofinas para las donantes con un IMC menor de 24.9 o mayor de 25 no difirieron significati-vamente, lo cual contrasta con lo descrito por Obeso y col.; sin embargo, estos autores analizaron donantes con un IMC mayor de 30.8

En su estudio Faber y col. encontraron que la falta de fertilidad comprobada de las donantes de ovocitos no parece tener un efecto negativo en el potencial de embarazo.11 En su serie Fiszbajn y col. observaron que en las donantes sin embarazo previo hubo un mayor número de embarazos;13 esto probablemente ocurrió porque las donantes eran más jóvenes. En nuestro estu-dio observamos que las donantes con embarazo previo donaron muchos más ovocitos capturados y ovocitos en metafase II que las donantes sin embarazo previo; sin embargo, la dosis total de gonadotrofinas utilizadas no difirió significativamente.

CONCLUSIONES

Estudiamos exclusivamente a las donantes de ovocitos que en el primer ciclo de donación lograron un embara-zo (no analizamos el factor masculino); el objetivo fue identificar las características que optimizan la selección de las donantes que tienen más probabilidades de lograr un embarazo. Se observó que en las donantes menores de 25 años se lograban capturar más ovocitos que en las donantes de mayor edad, pero la diferencia no fue significativa; esto también se observó en las donantes con un IMC menor de 24.9. Además, las donantes que lograron más embarazos eran nuligestas; sin embargo, en las donantes con embarazo previo se utilizaron menos dosis de gonadotrofinas –aunque las dosis no fueron significativas– y se capturó un mayor número de ovocitos totales y en metafase II. En conclusión, las características que optimizan la selección de donantes de ovocitos son: edad menor de 25 años, IMC menor de 24.9 y fertilidad probada; por tanto, las posibles mujeres

Figura 3. Ovocitos capturados y en metafase II en relación con la edad de la donante.

DISCUSIÓN

Bush y col. analizaron 266 donaciones de óvulos sin observar algún parámetro, como edad, tipo y días de estimulación u ovocitos capturados, que influya en el porcentaje de embarazos logrados.10 Al analizar la edad –como factor que optimice la selección de donantes– diversos autores, como Faber y col., excluyeron de los programas de ovodonación a las mujeres con una edad igual o mayor a 33 años por observar que en dicho grupo de edad había disminuido el porcentaje de embarazos clínicos y de nacidos vivos; no observaron diferencias en las donantes entre 22 y 32 años de edad.11 Flisser y col. observaron que la edad de las donantes entre 21 y 32 años no afectaba el porcentaje de embarazos.12 Fisz-bajn y col. concluyeron que la edad igual o menor de 25 años es el mejor factor de predicción para embarazo.13 Respecto a la edad, en nuestro estudio observamos que el mayor número de ovocitos capturados lo obtuvimos de las mujeres menores de 29 años, sobre todo, de las donantes con edad igual o menor de 25 años, aun cuando el número de ovocitos en metafase II que obtuvimos de ellas sea menor –pero no significativo– al que obtuvi-mos de las donantes entre 25 y 30 años. Otro parámetro que se ha estudiado es el IMC. Según Obeso y col., cuando el IMC es igual o mayor de 25 se necesita una dosis total de gonadotrofinas significativamente mayor y el número de ovocitos en metafase II es menor que en donantes con un IMC menor de 24.9.8 Respecto a la dosis total de gonadotrofinas, observamos que los resultados de nuestras donantes con un IMC menor de

17

21.589.83

26.6

13.5

8.8

0 5 10 15 20 25 30

> 30

25

-29

< 25

Ovocitos capturados Ovocitos en metafase II

Eda

d (a

ños)

Núm. de ovocitos



aptas para ovodonación tendrían que seleccionarse con base en dichas condiciones para obtener buenas tasas de embarazo, utilizar menos dosis de gonadotrofinas y originar menos complicaciones en la donante.

REFERENCIAS

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stimulating hormone for oocytes recruitment. Fertil Steril 1988;50:917-921.

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9. Mack CK, Pascal C, Gupta N, Cekleniak NA, et al. In search of the perfect donor: age and BMI influences in egg donors. Fertil Steril 2006;86(3 Suppl 1):S410.

10. Bush CJ, Beltsos AN, Sasada KL, Martin-Johnston MK, et al. Clinical response of successful donor oocyte cycles. Fertil Steril 2007;88:S141-S142.

11. Faber BM, Mercan R, Hamacher P, Muasher SJ, Taner JP. The impact of an egg donor’s age and her prior fertility on recipient pregnancy outcome. Fertil Steril 1997;68:370-372.

12. Flisser E, Kump LM, Krey LC, Licciardi F. Donor age does not impact the success of oocyte donation cycles. Fertil Steril 2006;86:S211

13. Fiszbajn K, Maero R, Lipowicz S, et al, Searching for the ideal donor in an oocyte donation program. Fertil Steril 2004;82(Suppl 2):S144.


* ProfesoradjuntodelaSubespecialidadenBiologíadelaReproducción,UnidadMédicadeAltaEspecialidadnúm.23,IMSS,Monterrey,NL.

** Codirector.*** CoordinadordeEnseñanzaeInvestigación.*** CoordinadoradeQuirófano. CentrodeFertilidadIECH,Monterrey,NL.1 BiólogodelaReproducción.

Correspondencia:Dr.IsraelCarmonaR.Av.Constitución1881Pte., 1er piso, consultorio 108, coloniaObispado,CP64060,

Artículo original

RevistaMexicanadeMedicinadelaReproducción2011;3(4):182-187

El valor de la suplementación de la fase lútea con valerianato de estradiol y progesterona en un programa de reproducción asistidaIsraelObedCarmonaRuiz,*RobertoSantosHaliscak,**PedroGalacheVega,**SamuelHernándezAyup,**VíctorAlfonsoBatizaReséndiz,1PabloDíazSpíndola,***MaríaLidiaArenasMontezco****

RESUMEN

Objetivo:investigarsilaadicióndeestradiolalesquemadeprogesteronacomosoportedelafaselúteadeciclosdereproducciónasistidaenfrescomejoralosresultadosenunprogramadeestanaturaleza.Pacientes y método:estapruebase realizóenel InstitutoparaelEstudiode laConcepciónHumana (IECH),en laciudaddeMonterrey,NuevoLeón.Seincluyeronciclosdelprogramadefertilizaciónin vitro-inyecciónintracitoplasmáticadeespermatozoidescontransferenciadeembriones(FIV-ICSIconTE)entreeneroydiciembrede2009.Laspacientessedividieronendosgruposdeacuerdoconlasuplementacióndelafaselútea:grupoI(n=24),adicióndevalerianatodeestradiolyprogesterona;grupoII(n=92),suplementaciónúnicaconprogesterona.Seanalizaronlosporcentajesdeembarazoydeimplantaciónmedianteunacomparacióndemediasconelfindeestablecerunadiferenciasignificativaenlosdistintosgruposformados,ylasvariablescategóricasconlapruebadejialcuadrado;enlasvariablescontinuasseaplicólapruebatdeStudentparalacomparacióndemedias.Resultados:elíndicedeembarazoenelgrupoIfuede41.6%yenelgrupoII,de40.2%(pnosignificativa),entantoqueelíndicedeimplantaciónfuede14.2%paraelgrupoIyde16.9%paraelgrupoII(pnosignificativa).Conclusiones:conbaseenlosresultadospreliminaresdeestetrabajo,seconcluyequeelsoportedelafaselúteaconprogesteronayvalerianatodeestradiolcomocoadyuvantenoofrecemejoresresultadosenunprogramadeFIV-ICSIconTEquelaadministracióndeprogesteronasola.Palabras clave:suplementacióndelafaselútea,valerianatodeestradiol,progesterona,programadereproducciónasistida.

ABSTRACT

Objective:Toinvestigateiftheadditionofestradioltoprogesteroneschemeduringlutealphaseinfreshcyclesofassistedreproductionimprovesoutcomesofaprogramofassistedreproduction.Patients and method:ThisstudywasconductedattheInstitutefortheStudyofHumanConception,inMonterrey,NuevoLeon,Mexico.Cycles of in vitro fertilizationand intracytoplasmic sperm injectionwith embryo transferwere included fromJanuary toDecember2009.Patientsweredividedintotwogroupsaccordingtosupplementationofthelutealphase:groupI(n=24),withestradiolvalerianateandprogesterone,groupII(n=92),onlywithprogesteronesupplementation.Weanalyzedthepregnancyandimplantationratesbycomparisonofmeanstoestablishasignificantdifferenceinthedifferentgroups,andthecategoricalvariableswithc2test;continuousvariableswereanalyzedwithStudent’st-testcomparisonofmeans.Results:ThepregnancyrateingroupIwas41.6%andingroupwas40.2%(pnonsignificant),andtheimplantationratewas14.2%forgroupIand16.9%forgroupII(pnonsignificant).Conclusions:Preliminaryresultsofthisstudyindicatedthatsupplementalprogesteroneandestradiolduringlutealphasedonotprovidebetterresultsthanprogesteronealoneinaprogramofin vitrofertilizationandintracytoplasmicsperminjectionwithembryotransfer.Key words:supplementationofthelutealphase,valerianateofestradiol,progesterone,assistedreproductionprogram.

Monterrey,NuevoLeón.Recibido:marzo,2011.Aceptado:abril,2011.

Este artículo debe citarse como:Carmona-Ruiz IO,Santos-HaliscakR,Galache-VegaP,Hernández-AyupSycol.Elvalordelasuplementacióndelafaselúteaconvalerianatodeestradiolyprogesteronaenunprogramadereproducciónasistida.RevMexReprod2011;3(4):182-187.



El valor de la suplementación de la fase lútea con valerianato de estradiol y progesterona

Para la implantación del blastocisto y el mantenimiento del embarazo se requiere un endometrio receptor.1 El desarrollo del endo-metrio receptor se alcanza cuando el útero se

expone a los esteroides ováricos en tiempo y cantidad suficientes y adecuados. El papel del estrógeno durante la fase folicular del ciclo menstrual en el desarrollo del endometrio está bien establecido; sin embargo, su fun-ción en la implantación y mantenimiento del embarazo en la fase lútea sigue siendo motivo de controversia.2,3

Es común que en la práctica clínica, en casos en los que la función ovárica está ausente (como en las pacien-tes receptoras de los programas de donación ovular), el soporte de la fase lútea se lleve a cabo con progesterona y estradiol, con lo que se obtienen altos porcentajes de implantación y de nacidos vivos.4

Si se lleva a cabo la suplementación de la fase lútea con estradiol y progesterona, aun con función ovárica, es posible que mejore la receptibilidad endometrial. En un estudio piloto, conducido por el Dr. Galache y colaboradores (comunicación oral) en el Instituto para el Estudio de la Concepción Humana de Monterrey, se llevó a cabo la suplementación de la fase lútea con valerianato de estradiol y progesterona en pacientes que buscaban técnicas de reproducción asistida de baja complejidad; el resultado fue un porcentaje de embarazo superior (con significado estadístico) que el alcanzado en las que únicamente recibieron progesterona (datos no publicados). Con esta justificación, se diseñó un estudio con la hipótesis de que las pacientes infértiles que requieren entrar a un programa de reproducción asistida de alta complejidad tienen menor exposición del endometrio al estradiol durante la fase lútea y, por tanto, menor receptibilidad. La suplementación de la fase lútea con estradiol y progesterona debe aumentar los porcentajes de implantación y embarazo clínico en dichos casos.

JUSTIFICACIÓN

El propósito del estudio fue evaluar el efecto del vale-rianato de estradiol como coadyuvante en el soporte de la fase lútea de ciclos de un protocolo de fertilización in vitro-inyección intracitoplasmática de espermatozoides (FIV-ICSI) con transferencia de embriones.

El beneficio esperado es el de ofrecer una mayor pro-babilidad de éxito mediante un método seguro, sencillo y económico.

OBJETIVO

Investigar si la adición de valerianato de estradiol al esquema de progesterona como soporte de la fase lútea de ciclos de FIV-ICSI con transferencia de embriones mejora los resultados.

Objetivos específicosInvestigar si la administración de estradiol como suple-mento de la fase lútea aumenta el índice de embarazo bioquímico.

Investigar si la administración de estradiol como suplemento de la fase lútea incrementa el índice de implantación.

HIPÓTESIS

La adición del valerianato de estradiol al soporte de fase lútea con progesterona vaginal en ciclos de FIV-ICSI con transferencia de embriones incrementa los índices de embarazo bioquímico e implantación, en comparación con los regímenes con progesterona sola.

PACIENTES Y MéTODO

Se hizo un estudio experimental, prospectivo, compa-rativo, no aleatorio, probabilístico, en el Instituto para el Estudio de la Concepción Humana, en la ciudad de Monterrey, Nuevo León. Se incluyeron ciclos del pro-grama de FIV-ICSI con transferencia de embriones entre enero y diciembre de 2009, que reunieron los criterios de inclusión y exclusión enumerados en los Cuadros 1 y 2.

En el Cuadro 3 se enlistan los criterios de cancelación.Se formaron dos grupos, el de casos (ciclos en los

que se administraron estrógeno y progesterona en la fase lútea) y el de controles (ciclos con administración exclusiva de progesterona), y se compararon los índi-ces de embarazo y de implantación. Los resultados se analizaron mediante una comparación de medias con el fin de establecer una diferencia significativa en los distintos grupos de ciclos.


Carmona Ruiz IO y col.

Fórmula para calcular el tamaño de la muestra:

N = 2* (Zα+Zβ)2* s2 418.2025

__________ _____________________

d2

N: número de sujetos necesarios en cada uno de los grupos.

Zα: valor de Z correspondiente al riesgo α fijado.Zβ: valor de Z correspondiente al riesgo β fijado.s2: variancia de la distribución de la variable cuantita-

tiva que se supone que existe en el grupo de referencia.d2: valor mínimo de la diferencia que se desea de-

tectar.Si se fija un riesgo α de 5% y un riesgo β de 20%, el

número necesario de sujetos por cada grupo sería de 328.La metodología para cada grupo fue la siguiente:Grupo I (casos, n = 24): se suplementó la fase lútea

con valerianato de estradiol y progesterona. El estra-diol se administró en tabletas de 2 mg (Primogyn®) por vía oral tres veces al día; es decir, una dosis de 6 mg diarios iniciando el día de la aspiración ovular. La

progesterona se indicó en dos óvulos de 200 mg por las noches por vía vaginal, comenzando el día de la aspiración folicular.

Grupo II (controles, n = 92): ciclos con adminis-tración exclusiva de progesterona. La progesterona se aplicó en dosis de dos óvulos por las noches por vía vaginal, comenzando el día de la aspiración folicular.

Se analizaron los porcentajes de embarazo y de im-plantación mediante una comparación de medias con el fin de determinar si existe diferencia significativa en los distintos grupos de ciclos. Las variables categóricas se evaluaron con prueba de ji al cuadrado, y en variables continuas se aplicó la prueba t de Student para la com-paración de medias. Se consideró que un valor de p < 0.05 tenía significado estadístico.

La recolección, la presentación y la caracterización de los datos de la población se realizaron mediante estadística descriptiva.

En el Cuadro 4 se definen las variables independientes y dependientes de los grupos de estudio.

Recursos físicos y financierosSólo se utilizaron recursos físicos y financieros del Instituto para el Estudio de la Concepción Humana de Monterrey.

RESULTADOS

Los datos generales de cada ciclo se exponen en el Cuadro 5. El Cuadro 6 muestra las características de la hiperestimulación ovárica: número de ampolletas de gonadotropinas y menotropinas, y la respuesta a dicha estimulación medida el día 10 a través del número de folículos mayores de 15 mm, la cifra de estradiol sérico y el grosor endometrial. Se enumeran, además, la cantidad de ovocitos inyectados-inseminados y fertilizados por ciclo, el índice de fertilización y el número de embriones transferidos por cada ciclo.

En el Cuadro 7 se observan los resultados del pro-cedimiento.

DISCUSIÓN

Aunque no se encontró diferencia estadística en cuanto a edad, tiempo de infertilidad, perfil hormonal basal y

Cuadro 1. Criterios de inclusión

• Pacientes que entraron a un ciclo de FIV-ICSI con transfe-rencia de embriones

• Edad de 18 a 39 años• IMC de 18 a 30• Tener ambos ovarios• Perfil hormonal basal

Estradiol entre 30 y 80 pg/mLFSH entre 2 y 10 UI/LLH entre 2 y 10 UI/L*Prolactina ≤ 25 ng/mL

• Uso de agonista de GnRH en protocolo de fase lútea tardía

* Un 30-70% del valor de la FSH representa el valor de LH.

Cuadro 2. Criterios de exclusión

• Donación de óvulos• Perfil hormonal basal diferente al descrito previamente• No transferencia embrionaria

Cuadro 3. Criterios de cancelación

• Rechazo de la paciente en cualquier etapa del protocolo• Aparición del síndrome de hiperestimulación ovárica severa



Cuadro 4. Definición de variables independientes y dependientes

Definición

Variables independientes

Edad mujer (años) Edad cronológica, variable cuantitativa

Tiempo de infertilidad (años) Tiempo diagnosticado de infertilidad, variable cuantitativa

FSH (d3) UI/L Concentración sérica de FSH en el día 3 del ciclo, variable cuantitativa

LH (d3) UI/L Concentración sérica de LH en el día 3 del ciclo, variable cuantitativa

E2 (d3) pg/mL Concentración sérica de estradiol en el día 3 del ciclo, variable cuantitativa

Prolactina ng/mL Concentración sérica de prolactina, variable cuantitativa

Factor masculino Alteración en parámetros seminales acorde con los valores de la OMS, variable categórica

Factor tubario Alteración en una o dos salpinges diagnosticada por HSG, LPSC (o ambas), variable categórica

Factor ovárico Alteración en el perfil hormonal o sonográficamente (SOP), variable categórica

Factor uterino Alteración en la cavidad uterina diagnosticada por USG, HSG, HSC (o las tres), variable categórica

Número de ampolletas de FSHr Número de ampolletas de FSHr de 75 UI utilizadas en la estimulación ovárica, variable cuantitativa

Número de ampolletas de hMG Número de ampolletas de hMG de 75 UI utilizadas en la estimulación ovárica, variable cuantitativa

Folículos >15 mm (d10) Número de folículos mayores de 15 mm en diámetro mayor en el día 10 del ciclo estimulado medidos por USG TV, variable cuantitativa

E2 (d10) pg/mL Concentración sérica de estradiol en el día 10 del ciclo estimulado, variable cuantitativa

Grosor endometrial (d10) Grosor endometrial en mm en el día 10 del ciclo estimulado medido por USG TV, variable cuantitativa

Inyec/insem Número de ovocitos inyectados o inseminados por ciclo, variable cuantitativa

Ovocitos fertilizados Número de ovocitos fertilizados por cada ciclo, variable cuantitativa

Índice de fertilización Relación entre el número de ovocitos fertilizados y el número de ovocitos inyectados/insemi-nados por ciclo, variable cuantitativa

Número de embriones transferidos Media del número de embriones transferidos por ciclo, por grupo; variable cuantitativa

Variables dependientes

Índice de embarazo bioquímico Relación entre el número de pruebas séricas positivas de embarazo entre el total de pacientes que efectuaron dicha prueba

Índice de implantación Relación entre el número de embriones transferidos y el número de sacos visibles por USG TV a las cuatro semanas de la transferencia, variable cuantitativa

Cuadro 5. Características generales de los pacientes por grupo de estudio

Factor Grupo 1 Grupo 2 p

Edad mujer (años) 34.9 33.5 NSTiempo de infertilidad (años) 5.5 4.3 NSFSH (d3) UI/L 6.7 6.2 NSLH (d3) UI/L 4.8 3.9 NSE2 (d3) pg/mL 39.3 42.4 NSProlactina 21.5 18.5 NSFactor masculino (%) 41 61.9 NSFactor tubario (%) 29.1 32.6 NSFactor ovárico (%) 25 9.7 NSFactor uterino (%) 16.6 21.7 NSFactor inexplicable (%) 4.1 0 NS

Cuadro 6. Características de cada ciclo por grupo de estudio


Número de ampolletas de FSHr 24.5 32.9 SNúmero de ampolletas de hMG 14.2 9.5 SFolículos >15 mm (d10) 6.4 7.7 NSE2 (d10) pg/mL 1724.5 1875 NSGrosor endometrial (d10) 8.7 9.3 NSInyec/insem 7.9 8.4 NSOvocitos fertilizados 4.5 4.4 NSÍndice de fertilización 58.9 52.5 NSNúmero de embriones transferidos 2.5 2.3 NS


Carmona Ruiz IO y col.

causa más frecuente de infertilidad de las pacientes, se puede apreciar que las del grupo 1 eran mayores que las del grupo 2 (34.9 vs 33.5 años), lo cual concuerda con el perfil hormonal promedio (Cuadro 5), en el que la FSH y la LH fueron superiores en el grupo 1, con estradiol sérico basal menor para el grupo 1 que para el grupo 2 y mayor tiempo de infertilidad para el primer grupo. La explicación de la falta de diferencia estadística puede recaer en el número de casos por cada grupo.

En cuanto a la estimulación ovárica, se encontró di-ferencia estadística en el número de ámpulas utilizadas de FSHr y de hMG (Cuadro 6). Esto tiene dos compo-nentes: primero, los diferentes esquemas de estimulación ovárica de cada médico que participó en el trabajo, y segundo, las variables edad y perfil hormonal basal, las cuales, al individualizar cada caso, afectan el esquema de estimulación en cuanto al número de ámpulas utilizadas para cada medicamento en particular. La respuesta a la estimulación ovárica dada por el número de folículos mayor de 15 mm, la concentración de estradiol sérico y el grosor endometrial, estimados el día 10 del ciclo, no mostraron diferencias significativas al comparar los grupos (Cuadro 6). A su vez, el número de ovocitos inyectados/inseminados, el índice de fertilización y el número de embriones transferidos por grupo fue similar; aunque esto puede ser un punto a favor de la homogenei-dad de ambos grupos de estudio, se aprecian diferencias que pueden estar relacionadas con la edad y el perfil hormonal basal, como concentraciones de estradiol más bajas en el grupo 1 que en el grupo 2 (1,724.5 vs 1,875 pg/mL, respectivamente), grosor endometrial de 8.7 mm del grupo 1 comparado con 9.3 mm del grupo 2, y menor número de ovocitos en ciclos del grupo 1 que en los del grupo 2 (7.9 vs 8.4, respectivamente). Si bien el factor masculino es el más frecuente para ambos grupos, la diferencia con la que se presenta en cada uno de ellos (41 vs 61.9% para el 1 y el 2, respectivamente) puede afectar el índice de fertilización de los grupos (58.9 vs 52.5% para el 1 y el 2, respectivamente).

No hubo diferencia significativa en el porcentaje de embarazo bioquímico de cada grupo de estudio (41.6 vs 40.2% para el grupo 1 y el 2, respectivamente). Esto coincide con los resultados obtenidos por Fatemi y colaboradores, quienes reportaron porcentajes de emba-razo de 29.7% para el grupo de soporte de la fase lútea con estradiol y progesterona, contra 26% del grupo de progesterona solamente.5 La diferencia más importante entre este trabajo y el mencionado es el protocolo de supresión; en éste se eligió la supresión con agonista de la GnRH en fase lútea tardía, y en el de Fatemi y co-laboradores, la supresión con antagonista de la GnRH.5 En la revisión sistemática y metanálisis publicados por Gelbaya y colaboradores en 2008, se registraron porcentajes de embarazo de 38.9% para pacientes con soporte de fase lútea con estradiol y progesterona, y de 32% para mujeres con progesterona únicamente. No hay diferencia significativa entre dichos esquemas de tratamiento, lo cual es similar a los resultados que se obtuvieron en este estudio.6 De acuerdo con Fatemi, la heterogeneidad en los estudios es una de las principales limitantes para llegar a conclusiones definitivas, algo en lo que los autores de este estudio están de acuerdo y que se considera que afecta y limita este trabajo.

El índice de implantación obtenido fue similar en ambos grupos, de 14.2% para el grupo 1 y de 16.9% para el grupo 2, sin diferencias estadísticas. Esto difiere del metanálisis de Pritts y Atwood, quienes destacaron que la variable que refleja las ventajas de añadir estradiol al soporte de fase lútea con progesterona es el porcentaje de implantación; esto, en ciclos con supresión hipofisa-ria mediante agonista de la GnRH en fase lútea tardía, como en este estudio;7 sin embargo, en el metanálisis más reciente de Gelbaya y colaboradores se comunicaron índices de implantación de 23.7 y 22.1% para los grupos de estradiol+progesterona y progesterona, respectiva-mente, sin diferencias significativas. Nuevamente, la heterogeneidad de los estudios incluidos en este último metanálisis no permite establecer una conclusión final.6

Entre los aspectos que limitan los resultados de este trabajo se encuentran: el hecho de ser un estudio de cohorte; no hay distribución al azar de los ciclos; el número de casos incluidos por cada grupo de estudio, lo cual a su vez podría revelar diferencias estadísticas en las características generales de las pacientes, para lo

Cuadro 7. Resultados del procedimiento


Índice de embarazo bioquímico 41.6 40.2 NSÍndice de implantación 14.2 16.9 NS



cual tendrían que ajustarse los grupos; y las diferencias en los esquemas de estimulación, que son el producto de la participación de varios médicos y de la individua-lización del manejo de cada paciente.

Es posible que sólo sea un subgrupo de pacientes en los programas de reproducción asistida el que desarro-lle un defecto en la impregnación con estradiol o que requiera estradiol adicional. Tales grupos podrían estar constituidos por mujeres con concentraciones bajas ba-sales de estradiol, de LH, o de ambas. Sólo ellas serían las beneficiadas con la adición de valerianato de estra-diol durante la fase lútea. Dadas las características del programa de reproducción asistida del Instituto para el Estudio de la Concepción Humana y el tiempo con que se contaba para llevar a cabo este estudio, fue necesario limitar la investigación a un grupo de pacientes con perfil hormonal basal normal.

Este trabajo muestra resultados preliminares, por tanto, es necesario reunir muestras mayores para poder definir mejor grupos y subgrupos y dar, así, conclusiones definitivas.

CONCLUSIONES

Con base en los resultados preliminares de este tra-bajo, se determina que el soporte de la fase lútea con

progesterona y valerianato de estradiol como coadyu-vante no ofrece mejores resultados en un programa de fertilización in vitro-inyección intracitoplasmática de espermatozoides con transferencia de embriones en comparación con la progesterona sola.

REFERENCIAS

1. Maslar IA. The progestational endometrium. Semin Reprod Endocrinol 1988;6:115-128.

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6. Gelbaya T, Kyrgiou M, Tsoumpou I, Nardo L. The use of estradiol for luteal phase support in in vitro fertilization/intra-cytoplasmic sperm injection cycles: A systematic review and meta-analysis. Fertil Steril 2008;90(6):2116-2125.

7. Pritts EA, Atwood AK. Luteal phase support in infertility treatment: a meta-analysis of the randomized trials. Hum Reprod 2002;17:2287-2299.

FE DE ERRATAS

En la fotografía de la portada del número 3, volumen 3 (enero-marzo, 2011) debieron aparecer los siguientes nombres: Dr. Robert Geoffrey Edwards, Bióloga Kay Elder, Louise Brown (niña) y Dr. Patrick Steptoe.

Asimismo, el último párrafo del editorial (volumen 3, número 3, página 100) debió decir así:

Ojalá nos pudiéramos sentir culpables de que nos convirtamos en un personaje como Nobel cuando esta innovación reproductiva en casos que no cumplamos con el objetivo para el cual fue creada: solucionar la infertilidad de parejas infértiles de acuerdo a los límites de nuestra sociedad.


Artículo original


Incidencia de embarazo múltiple en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con las técnicas de reproducción asistidaAlberto Kably Ambe,* Jorge Alberto Campos Cañas,* Heidy Ortiz Reyes,* Jaime Ignacio Cevallos Bustillos,* Diana Elena Monzalbo Núñez**

RESUMEN

Antecedentes: el embarazo de alto orden fetal, como producto del uso de técnicas de reproducción asistida, supone un mayor riesgo en comparación con los embarazos únicos. Por el frecuente uso de estas técnicas se observó a partir de 1980 un notable aumento en la incidencia de este tipo de embarazos. Los embarazos de alto orden fetal constituyen solamente 3% del total de nacimientos y son responsables de morbilidad y mortalidad materno-fetales altas.Objetivo: exponer el resultado y desenlace perinatales de los embarazos de alto orden fetal atendidos en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con las técnicas de reproducción asistida.Material y métodos: estudio retrospectivo en el que se analizaron todos los embarazos múltiples que en el Hospital Ángeles Lomas fueron atendidos de enero de 2005 a mayo de 2010. Como variables de salida se consideraron el diagnóstico y tiempo de infertilidad, la edad y la técnica de reproducción utilizada. Se realizó el examen de Apgar al minuto y a los cinco minutos y se analizaron la edad gestacional al nacimiento, el peso, el desenlace del recién nacido y las complicaciones obstétricas. Resultados: se encontraron 35 embarazos múltiples (un embarazo cuádruple y 34 embarazos triples) atendidos en el periodo indi-cado. Los embarazos fueron obtenidos así: 22.8% (n = 8) por inducción de la ovulación, 5.7% (n = 2) por hiperestimulación ovárica controlada, 8.5% (n = 3) por inseminación artificial homóloga, 28.5% (n = 10) por fertilización in vitro con transferencia de embriones (FIV-TE) e inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI por sus siglas en inglés) y 2.8% (n = 1) de manera espontánea. La edad promedio fue de 30.6 años (DE 4.27). En FIV-TE se observó un promedio de 3.75 embriones transferidos, con calidad promedio de 1.05 (escala de 1 a 6 según la cantidad de blastómeros y el grado de fragmentación). Respecto a la resolución, todos los recién nacidos fueron obtenidos por cesárea; la edad gestacional promedio fue de 31.6 (DE 2.76); la calificación de Apgar fue: al minuto de 7.9 (DE 1.15) y a los cinco minutos de 8.7 (DE 0.57); el peso promedio fue de 1,422 g (DE 422.65). Se observaron tres defunciones (8.5%). Las principales complicaciones obstétricas fueron: preeclampsia (11.4%, n = 4), restricción del crecimiento intrauterino (8.5%, n = 3) y diabetes gestacional/rotura prematura de membranas (5.7%, n = 2).Conclusiones: en los procedimientos de baja complejidad (inseminación artificial homóloga) [1.9%] y en los de alta complejidad (3.7%) se observó una tasa baja de embarazos múltiples. En nuestro estudio la tasa de complicaciones no fue mayor a la reportada en la bibliografía y el desenlace de los recién nacidos fue bueno en general, con una mortalidad de 8.5%. Palabras clave: embarazo múltiple, alto orden fetal, nacimientos múltiples, reproducción asistida.

ABSTRACT

Background: High order pregnancies are more probable than singleton pregnancies in the use of assisted reproductive techniques. Since the 1980s there have been a higher number of multiple pregnancies. High order pregnancies are about 3% of all births, and are responsible for a high mortality rates in the mother and the fetuses.Objective: To explain the outcome and perinatal outcome of pregnancies of high fetal order treated at the Angeles Lomas Hospital and its relationship with assisted reproductive techniques.Material and methods: This is a retrospective study, analyzing all multiple pregnancies that took place in Angeles Lomas Hospital in Mexico throughout January 2005 to January 2010. Variables were diagnosis and time of infertility, age and the reproductive technique that was used. We analyzed gestational age at the moment of birth, Apgar scores in the first minute and five minutes, weight, newborns outcome and the obstetrical complications.Results: We found a total of 35 multiple pregnancies that took place in the period of time studied. 22.8% were obtained by ovulation induction (n = 8), 5.7% by controlled ovarian hyperstimulation (n = 2), 8.57% by homologous artificial insemination (n = 3), 28.5% by IVF-ET/ICSI (n = 10), and 2.85% (n = 1) by a spontaneous pregnancy. The age range was 30.6 years (SD 4.27). In patients with IVF we observed an average of 3.75 transferred embryos, with a quality of 1.05. 100% of the newborns where delivered by cesarean section, the gestational age average was 31.6 weeks (SD 2.76), Apgar scores 7.9 (SD 1.15)/8.79 (SD 0.57), and average weight was 1,442 g (SD 422.65). We observed 3 deaths (8.57%). The main obstetrical complications were preeclampsia (11.42%, n = 4), fetal growth restriction (8.57%, n = 3), and gestational diabetes/premature rupture of membranes (5.71%, n = 2).


Incidencia de embarazo múltiple en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con las técnicas de reproducción asistida

Los embarazos de alto orden fetal se han con-vertido actualmente en uno de los mayores retos que enfrentan los centros de repro-ducción asistida.1 Es bien sabido que estos

nacimientos representan 2 a 3% del total de los mismos y 11 a 14% de las muertes fetales.1,2

Entre 1980 y 1999 la tasa de embarazos múltiples aumentó en más de 59%.3 En el año 2000 se reportó en Estados Unidos que 0.9% de todos los nacimientos fue resultado de alguna técnica de reproducción asistida.1,3

En el año 2000 se reportó en Europa una tasa total de embarazos triples de 2%, tasa que fue menor a la tasa (3.7%) reportada en 19974,5 y que contrastaba con la tasa de embarazos triples (4.3%) reportada ese mismo año en Estados Unidos.3 La razón principal de las tasas bajas que se han reportado en Europa, en comparación con las de Estados Unidos, es la reducción de embrio-nes transferidos por ciclo; en los países europeos la tendencia es transferir un solo embrión. En ese año en Europa sólo 6.7% de las transferencias fue de más de tres embriones;4,5 en contraste, en Estados Unidos una tercera parte de las transferencias fue de más de tres em-briones. Sin embargo, el número promedio de embriones transferidos a mujeres menores de 35 años disminuyó de 3.8 por transferencia en 1996 a 2.9 en 2000, con la correspondiente disminución (de 6.5 a 4.3%) de la tasa de nacimientos triples.1,3,6

En México, en comparación con otros países, no se cuenta con datos estadísticos completos referentes a embarazos múltiples por año y a la relación de éstos con técnicas de reproducción asistida. Sin embargo, un estudio realizado en el norte de México reportó que en los últimos 35 años ha habido 208 nacimientos de alto orden fetal, que corresponden a una tasa de 0.72 por cada 1,000 nacimientos; sin embargo, el estudio no especifica cuántos de los nacimientos fueron logrados por métodos de reproducción asistida.7

El embarazo de alto orden fetal conlleva muchas complicaciones bien conocidas, como mayor morbi-lidad –incluido en ésta el riesgo de sufrir hipertensión (RM 2.0-3.0)–, hemorragia posparto (RM 4.0), muerte materna (RM 2.0-3.0), polihidramnios y amenaza de parto pretérmino, así como un aumento en la tasa de cesárea.1,2 Hay mayor riesgo de diabetes gestacional (RM 1.6) y de placenta de inserción baja (RM 2.0).1,2 Respec-to a las complicaciones para los neonatos, el riesgo de prematurez es significativamente más elevado en los nacidos de embarazos de alto orden fetal; al nacer los recién nacidos triples pesan –en promedio– entre 1,700 y 1,800 gramos, según los reportes de Estados Unidos y del Reino Unido, respectivamente, y la resolución del embarazo en Estados Unidos y en el Reino Unido ocurre a las 32.5 y 34 semanas, respectivamente.1,2,4,5 La tasa de parálisis cerebral en nacimientos triples es de 26.7 por cada 1,000 nacidos vivos, tasa que contrasta con la de 1.6 por cada 1,000 nacidos vivos de embarazos únicos. Aproximadamente 90% de los nacimientos triples son pretérmino; por eso, el riesgo de morir de cada recién nacido es 20 veces mayor en el primer mes de vida.4

Respecto a las consecuencias económicas, en Estados Unidos el costo promedio de un nacimiento de embarazo único se estima en 9,845 dólares; en contraste, el costo de un nacimiento triple es de 109,765 dólares. Esto sin considerar el costo del tratamiento durante los ciclos de FIV-TE.8

También debe ponerse especial atención al aspecto psicosocial relacionado con el embarazo múltiple que

* Centro Especializado para la Atención de la Mujer.** Residente de cuarto año de Ginecología y Obstetricia Hospital Ángeles Lomas.

Correspondencia: Dr. Jorge Alberto Campos Cañas; [email protected]: diciembre, 2010. Aceptado: febrero, 2011.

Este artículo debe citarse como: Kably-Ambe A, Campos-Cañas JA, Ortiz-Reyes H, Cevallos-Bustillos JI, Monzalbo-Núñez DE. Incidencia de embarazo múltiple en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con las técnicas de reproducción asistida. Rev Mex Reprod 2011;3(4):188-192.


Conclusions: We observed a low rate of multiple birth in low complexity procedures (1.94%, homologous artificial insemination), and in high complexity procedures (3.75%). In our study the complication rate was not higher than what is reported in the literature, the new born outcome was generally good, with an 8.5% of mortality rate.Key words: multiple pregnancy, high order pregnancy, multiple births, assisted reproduction.


Kably Ambe A y col.

resulta de técnicas de reproducción asistida. Al respecto, Ellison y col. realizaron un estudio en 2005 para conocer la calidad de vida de las familias sometidas a técnicas de reproducción asistida y con embarazos múltiples; en dicho estudio ellos encontraron baja calidad de vida, ma-yor riesgo de estigmatización social, depresión materna e insatisfacción marital.9

El propósito de nuestro estudio es exponer el resul-tado y desenlace perinatales de los embarazos de alto orden fetal atendidos en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con las técnicas de reproducción asistida.

MATERIAL Y MéTODO

Se realizó un estudio retrospectivo, transversal, descrip-tivo y observacional. Se revisaron todos los expedientes clínicos de las mujeres que entre enero de 2005 y mayo de 2010 cursaron con embarazo de alto orden fetal en el servicio de Ginecología y Obstetricia del Hospital Ángeles Lomas; el propósito de la revisión fue evaluar la incidencia y prevalencia de los embarazos múltiples relacionados con las técnicas de reproducción asistida –como inducción de la ovulación, hiperestimulación ovárica controlada + coito programado, inseminación artificial homóloga, FIV-TE e ICSI–, las complicaciones durante el embarazo y el desenlace perinatal. El emba-razo con tres o más fetos se definió como embarazo de alto orden fetal. Se excluyeron los embarazos gemelares.

RESULTADOS

Se evaluaron 35 expedientes de pacientes con embarazo de alto orden fetal atendidas de enero de 2005 a mayo de 2010. Se encontró que 97.1% de los embarazos fueron secundarios a técnicas de reproducción asistida (n = 34) y que 2.8% (n = 1) ocurrió de manera espontánea.

En 97.1% (n = 34) de las pacientes se estableció diagnóstico de infertilidad primaria, y en 2.8% (n = 1), diagnóstico de infertilidad secundaria. El tiempo de in-fertilidad de las pacientes fue de 1.4 años (DE 0.72 años).

Las causas de infertilidad fueron: en 62.8% (n = 22) un factor no especificado, en 14.2% (n = 5) un factor masculino, en 14.2% (n = 5) un factor endocrino, en 5.7% (n = 2) un factor tuboperitoneal y en 2.8% (n = 1) un factor uterino (Figura 1).

Respecto a las técnicas de reproducción asistida utilizadas para lograr el embarazo, se encontró que en 62.8% (n = 22) de los casos no se especificaba si hubo alguna técnica de reproducción implicada; en 22.8% (n = 8) el embarazo se logró únicamente con inducción de la ovulación; en 20% (n = 7), por FIV-TE; en 8.5% (n = 3), por inseminación artificial homóloga; en 8.5% (n = 3), por ICSI, y en 5.7% (n = 2), por hiperestimulación ovárica controlada + coito programado (Figura 2).

Respecto a los resultados perinatales, la edad ges-tacional promedio a la resolución del embarazo fue de 31.6 semanas de gestación (SDG) [DE 2.76 semanas]. La calificación de Apgar que se obtuvo al minuto fue

Figura 1. Causas de infertilidad.

Figura 2. Técnicas de reproducción utilizadas. IO: inducción de la ovulación; HOC + CP: hiperestimulación ovárica controlada + coito programado; IAH: inseminación artificial homóloga; FIV-TE: fertilización in vitro con transferencia de embriones; ICSI: inyección intracitoplasmática de espermatozoides.

0

10

20

30

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60

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Por

cent

aje

No especificado

Masculino

Uterino

Endocrino

Tuboperitoneal

IO

HOC + CP 0

10

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30

40

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60

70

Por

cent

aje

IAHFIV-TE

ICSI No

especificado


Incidencia de embarazo múltiple en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con las técnicas de reproducción asistida

Figura 3. Complicaciones obstétricas encontradas. RCIU: res-tricción del crecimiento intrauterino; RPMP: rotura prematura de membranas pretérmino.

de 7.9 (DE 1.15) y la que se obtuvo a los cinco minutos fue de 8.7 (DE 0.57). El peso promedio al nacimiento fue de 1,422 g (DE 422.65).

La complicación obstétrica que se encontró con más frecuencia fue restricción del crecimiento intrauterino (8.5%, n = 3); otras complicaciones encontradas fueron: preeclampsia leve, diabetes gestacional, rotura prema-tura de membranas pretérmino (RPMP), luxación por cerclaje (5.7%, n = 2), preeclampsia severa y síndrome HELLP (2.8%, n = 1) [Figura 3].

DISCUSIÓN

En un periodo de cinco años se atendieron en el Hospital Ángeles Lomas 35 embarazos múltiples; de éstos, 97.1% se logró por técnicas de reproducción asistida; dicho porcentaje fue similar al reportado en la bibliografía.

El promedio de edad de las pacientes fue de 30.6 años y el periodo de infertilidad fue de 1.4 años, por lo que se acotan estas dos características como factores de riesgo de un embarazo múltiple, ya que no son las característi-cas típicas que en una clínica de reproducción se hallan en las pacientes con infertilidad. Es importante resaltar que la edad de las pacientes y el tiempo de infertilidad que cursaron son menores que los que se han reportado en la bibliografía.

La edad gestacional a la resolución del embarazo fue de 31.6 semanas de gestación (DE 2.76), edad muy similar a la reportada (32.2) en la bibliografía. De la misma manera, el peso promedio de los neonatos (1,422

g [DE 422.65 g])fue muy semejante al peso reportado (1,687 g) por algunos autores.

Respecto a las complicaciones obstétricas, el por-centaje de preeclampsia (8.5%) fue muy similar al porcentaje mencionado en la bibliografía. Respecto a los porcentajes de las demás complicaciones que se encon-traron en el estudio –como restricción del crecimiento intrauterino, diabetes gestacional, rotura prematura de membranas pretérmino y luxación por cerclaje (cada una de las tres últimas con porcentaje de 5.7%)–, tales porcentajes fueron más bajos que los reportados en la bibliografía, lo cual posiblemente se debe a un control de embarazo más riguroso.

CONCLUSIONES

En los procedimientos de baja complejidad (insemi-nación artificial homóloga) [1.9%] y en los de alta complejidad (3.7%) se observó una tasa baja de emba-razos múltiples. Llama la atención que una proporción importante de embarazos múltiples se obtuvo por induc-ción de la ovulación; esto probablemente fue secundario a la falta de un control estricto en este tipo de ciclos, por lo que se sugiere realizar un control ultrasonográfico más riguroso de los mismos. Como hallazgos asociados con la posibilidad de tener un embarazo múltiple, podemos señalar la edad de la paciente (30.6 años en promedio) y el tiempo de infertilidad (1.4 años en promedio). En nuestro estudio la tasa de complicaciones no fue mayor a la reportada en la bibliografía y el desenlace de los recién nacidos fue bueno en general, con mortalidad de 8.5%.

No hay duda de que los nacimientos de alto orden fetal implican mayores complicaciones y costos para los neonatos, madres, familias y sociedad y de que la meta de cualquier técnica de reproducción asistida es un embarazo único sin desenlaces adversos. En cualquier país la tasa de nacimientos de alto orden fetal es vista como un problema serio; actualmente se intentan desa-rrollar soluciones sistemáticas y basadas en evidencias. Es imposible eliminar por completo los embarazos y nacimientos múltiples, aun con la transferencia de un solo embrión; mientras alguna técnica de reproducción asistida esté implicada, existirá el riesgo de embarazos gemelares o, incluso, triples. Ciertamente, tampoco es razonable argumentar que las técnicas de reproducción

0123456789

Preeclampsia

Porcentaje

Diabetesgestacional

RCIU Cerclajeluxado

RPMP SíndromeHELLP


Kably Ambe A y col.

asistida deban dejar de usarse para evitar un embarazo de alto orden fetal. Por tanto, los daños que conlleva un embarazo múltiple deben ser sopesados con los benefi-cios de lograr, finalmente, un embarazo.

REFERENCIAS

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9. Ellison MA, Hotamisligil S, Lee H, Rich-Edwards JW, et al. Psychosocial risks associated with multiple births resulting from assisted reproduction. Fertil Steril 2005;83:1422-1428.


Artículo original


Determinantes en el resultado de inseminación intrauterina: análisis de 1,040 ciclos consecutivosJulio González Cofrades,* Carlos Linder Efter,* Gustavo Aguirre Ramos,*,** Pablo Vilchis Nava,* José Smeke Befeler,*** Carlos Navarro Martínez,*,**** José Antonio Rodríguez Martínez1

RESUMEN

Antecedentes: existe una gran variedad de tratamientos contra la infertilidad; sin embargo, la inseminación intrauterina sigue siendo útil al compararla con técnicas más complejas.Objetivo: determinar los factores que favorecen que las pacientes con diagnóstico de infertilidad tengan éxito reproductivo –valorado con el porcentaje de embarazos con frecuencia cardiaca fetal positiva– después de ser sometidas a inducción de la ovulación e inseminación intrauterina.Material y método: estudio retrospectivo de 1,040 ciclos consecutivos de inseminación intrauterina realizados entre enero de 1998 y diciembre de 2004. Se incluyeron pacientes sometidas a inducción de la ovulación e inseminación intrauterina y se excluyeron pacientes con registros incompletos o que abandonaron el tratamiento.Resultados: de 1,040 ciclos, en 97 pacientes se logró el embarazo. Se obtuvo un menor éxito reproductivo con el uso de monoterapia como protocolo de inducción de la ovulación. Se obtuvo una proporción significativamente mayor de embarazos con cuatro folículos; otros hallazgos fueron que las cifras totales de espermatozoides móviles poslavados eran mayores en pacientes con éxito reproductivo y que la tasa de embarazo era menor (31.3 vs 68.6%; p < 0.001) en pacientes con endometriosis. Conclusiones: la inseminación intrauterina es un método útil, con éxito aceptable y accesible. Los factores que favorecen el éxito reproductivo son: inducción con tratamiento combinado, uso de cuatro folículos, un total elevado de espermatozoides móviles e infertilidad no causada por endometriosis.Palabras clave: técnicas de reproducción asistida, inseminación intrauterina, éxito reproductivo.

ABSTRACT

Background: There are a variety of infertility treatments, however, intrauterine insemination (IUI) is still useful, when compared with more complex techniques.Objective: To determine factors favoring the reproductive success in patients with diagnosis of infertility who underwent ovulation induction and intrauterine insemination, valuing the success with the percentage of pregnancies with fetal heart rate (+). Material and method: A retrospective study of 1,040 consecutive cycles of IUI, from January 1998 to December 2004. We included patients undergoing ovulation induction and IUI. We excluded those with incomplete records or who discontinued treatment. Results: Of 1,040 cycles, pregnancy was achieved in 97 patients. The use of monotherapy for ovulation induction had lower reproduc-tive success. With 4 follicles we obtained a significantly higher proportion of pregnancy, another finding was that patients with higher reproductive success had a higher total numbers of motile sperm post-washing, and we found that the patients with endometriosis had a lower pregnancy rate (31.3% vs 68.6%, p < 0.001). Conclusions: Intrauterine insemination is a useful, acceptable and accessible technique. The factors favoring the reproductive suc-cess are: the use of combined therapy for ovulation induction, the use of 4 follicles, a high number of motile sperm and a etiology of the infertility different from endometriosis. Key words: assisted reproductive techniques, intrauterine insemination, reproductive success.

* Médico adscrito al servicio de Ginecología y Obstetricia.** Biólogo de la Reproducción.*** Médico residente de cuarto año de Ginecología y Obstetricia.**** Director de la Clínica de Reproducción Asistida.1 Médico cirujano y monitor de Estudios Clínicos de la Facul- tad de Medicina, UNAM. Centro Médico ABC, Santa Fe, México, DF.

Correspondencia: Dr. Julio González Cofrades. Centro Médico ABC, Campus Santa Fe, Torre de consultorios (consultorio 332).

Av. Carlos Graef Fernández 154, colonia Tlaxala Santa Fe, CP 05300, México, DF. Correo electrónico: [email protected]: febrero, 2011. Aceptado: marzo, 2011.

Este artículo debe citarse como: González-Cofrades J, Linder-Efter C, Aguirre-Ramos G, Vilchis-Nava P y col. Determinantes en el resultado de inseminación intrauterina: análisis de 1,040 ciclos consecutivos. Rev Mex Reprod 2011;3(4):193-198.



González Cofrades J y col.

Actualmente, en parejas con diferentes diag-nósticos de infertilidad –por alteraciones masculinas, factores cervicales (incluidos los anticuerpos antiespermatozoides y las

infecciones), anovulación u oligoovulación, endometrio-sis e infertilidad idiopática– se usa una gran variedad de tratamientos.1 Sin embargo, la inseminación intrauterina, asociada con estimulación ovárica controlada, sigue siendo uno de los tratamientos más útiles, ya que es poco costosa, es menos invasiva y sus tasas de embarazo son aceptables,2 comparada con técnicas de reproducción asistida de mayor complejidad.3 En el éxito o fracaso del tratamiento con inseminación intrauterina influyen mu-chas variables, como la selección de pacientes, el origen, duración y severidad de la infertilidad, la capacitación de la muestra por inseminar, la inducción de la ovulación y el estado de las trompas de falopio, entre otros.4,5

El objetivo de este estudio retrospectivo de 1,040 ciclos consecutivos de inseminación intrauterina es identificar cuáles de estos factores imposibilitan una tasa de embarazo favorable y cuál de ellos puede manipularse con el propósito de maximizar la tasa de éxito reproduc-tivo en pacientes tratadas con inseminación intrauterina. Así como determinar los factores que favorecen que las pacientes con diagnóstico de infertilidad tengan éxito reproductivo –valorado con el porcentaje de embarazos con frecuencia cardiaca fetal positiva– después de ser sometidas a inducción de la ovulación e inseminación intrauterina.

MATERIAL Y MéTODO

En el Centro de Ginecología y Reproducción Humana, Ciudad de México, se realizó un estudio retrospectivo en el que se analizaron 1,040 ciclos consecutivos de inseminación intrauterina de enero de 1998 a diciembre de 2004; se incluyó a las pacientes que fueron sometidas a inducción de la ovulación e inseminación intrauteri-na por tener diagnóstico de infertilidad y que tenían expediente completo, consentimiento informado y apro-bación del Comité de Ética e Investigación de nuestro hospital; se excluyó a las pacientes que no contaban con las hojas de registro completas y a las pacientes que por cualquier motivo abandonaron el tratamiento. Las pacientes con endometriosis se sometieron a un

protocolo de diagnóstico, que consistió en sospecha clínica, exploración física, uso de métodos paraclínicos de diagnóstico y laparoscopia para visualizar en forma directa la lesión.

Estimulación ovárica controladaLos protocolos usados en la inducción de la ovulación se estandarizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en la bibliografía (Cuadro 1). Se administró citrato de clomifeno a dosis de 50 a 100 mg/día (Omifin®, Aventis Pharma, o Serophene®, Serono), gonadotrofi-na menopáusica humana o la combinación de dichos regímenes; la dosis, que se ajustó a cada paciente, se determinó por seguimiento ecográfico endovaginal, por concentraciones de estradiol en sangre o por ambos métodos.

Control serológico de las muestras de espermatozoides y preparaciónIndependientemente de si la muestra espermática –para la capacitación espermática– se obtuvo del esposo, compañero o donante, en todos los casos se examinó el perfil de enfermedades infecciosas (virus de la in-munodeficiencia humana 1 y 2, hepatitis A, B y C, y espermocultivo). La preparación de las muestras de espermatozoides, para la inseminación intrauterina, se realizó por medio de gradientes de concentración.

Determinación de la ovulación e inseminaciónEn 664 ciclos (63.8%) se indujo la ovulación mediante la administración intramuscular de gonadotrofina coriónica humana a dosis de 5,000 a 10,000 UI (Profasi®, Serono); 36 a 38 horas después de la aplicación se programó a las pacientes para la inseminación intrauterina. Además, se instruyó a 200 de las pacientes para que determinaran, en orina, la concentración de LH (mediante OvuQUICK®, Corporación NanoRepro).

InseminaciónLa muestra de espermatozoides, una vez capacitados, fue cargada en una sonda intrauterina para posteriormente inseminarla. A la paciente, en posición de litotomía, se le colocó un espéculo en la vagina para localizar el cuello uterino, mismo que se limpió con dispositivos de algodón. Después se introdujo la sonda intrauterina en


Determinantes en el resultado de inseminación intrauterina

el canal cervical, hasta aproximadamente 1 a 2 cm del fondo uterino, y lentamente se insufló la muestra de es-permatozoides capacitados. Posteriormente, el catéter se retiró pausadamente y la paciente fue colocada en posi-ción supina durante 10 minutos, tiempo después del cual continuó con sus actividades cotidianas. Catorce días después de la inseminación intrauterina se determinó, en sangre, la concentración de gonadotrofina coriónica humana, y a las 48 horas volvió a determinarse la con-centración, y en caso de que el resultado fuera positivo, seis semanas después de la inseminación intrauterina se realizaba un ultrasonido endovaginal para determinar la existencia de frecuencia cardiaca fetal.

Análisis estadísticoCon los datos obtenidos se construyó una base de datos en el programa estadístico SPSS (versión 15.0), con lo cual se obtuvo la estadística descriptiva. Se usó la prueba de la t de Student para comparar las medias y se calcularon los valores z para comparar las proporciones.

Cuadro 1. Comparación de protocolos de inducción de la ovulación (n = 1,040)

CC (protocolo 1)

CC + FSH (protocolo 2)

CC + HMG (protocolo 3)

CC + HMG + FSH (protocolo 4)

aGnRH + FSH + HMG (protocolo 5)

Valor de p

Ciclos 10 (0.96%) 214 (20.5%) 622 (59.8%) 168 (16.1%) 26 (2.5%) 1 vs 2,3,4,5*2 vs 3,4,5*3 vs 4,5*4 vs 5*

Edad 32 ± 4.2 33.7 ± 3.8 32.4 ± 4.2 33.5 ± 3.9 31.4 ± 4.4 p > 0.05 (todas las

combinaciones)Número de folículos

1 ± 1 2.1 ± 1.4 2.3 ± 1.7 2.3 ± 1.5 3.3 ± 3.3 1 vs 2,3,4,5*

Número de embarazos (frecuencia cardiaca fetal positiva)

0 20 59 16 2

Porcentaje de embara-zos (frecuencia car-diaca fetal positiva)

0% 9.3% 9.4% 9.5% 15.3% 1 vs 2,3,4,5

Los valores z de las variables ciclo y porcentaje de embarazos se calcularon para comparar las proporciones, que fueron significa-tivas cuando el valor de p fue menor de 0.05*; en las variables edad y número de folículos se usó la prueba de la t de Student para calcular el significado estadístico.CC: citrato de clomifeno; FSH: hormona foliculoestimulante; HMG: gonadotrofina menopáusica humana; aGnRH: antagonista de la hormona estimulante de gonadotrofinas.

RESULTADOS

Durante el periodo de estudio el protocolo de inducción de la ovulación más administrado fue el de citrato de clo-mifeno + gonadotrofina menopáusica humana –en 622 ciclos (58.8%) con tasa de embarazo de 9.4%–, seguido de los protocolos de citrato de clomifeno + FSH –en 214 ciclos (20.5%) con tasa de embarazo de 9.3%– y de ci-trato de clomifeno + FSH + gonadotrofina menopáusica humana, en 168 ciclos (16.1%) con tasa de embarazo de 9.5%. Sin embargo, el mayor porcentaje de embarazos se logró con el protocolo de antagonistas de la hormona estimulante de gonadotrofinas + FSH + gonadotrofina menopáusica humana, con tasa de embarazo de 15.3%. De 1,040 ciclos realizados, en 97 pacientes (9.3%) se logró el embarazo. En los diferentes protocolos de inducción de la ovulación no difirió significativamente la edad materna; en contraste, sí existió una diferencia significativa en la proporción de protocolos administra-dos, ya que el de citrato de clomifeno + gonadotrofina menopáusica humana fue el más administrado, mientras



que el protocolo menos administrado fue el de citrato de clomifeno en monoterapia; respecto al número de folículos, éste fue significativamente menor –comparado con el de los otros protocolos– cuando se administró el protocolo de citrato de clomifeno, y respecto al éxito reproductivo, el porcentaje de embarazo fue significati-vamente menor en el protocolo de citrato de clomifeno, mientras que al comparar los otros cuatro esquemas, no se obtuvo una diferencia significativa en el éxito reproductivo (Cuadro 1).

Durante los años de estudio los resultados observados variaron, pues la tasa de embarazo en el año 2000 fue de 5.9% y la tasa en 2003 fue de 13.5%; sin embargo, año tras año no existió una variación significativa en la proporción de embarazos (Cuadro 2).

La edad promedio de nuestras pacientes fue de 32 ± 3.7 años, sin diferencia entre el grupo de pacientes que lograron embarazo (31.2 ± 3.3 años) y el grupo de las que no lo lograron (32.9 ± 4.1 años); igualmente, la cantidad de folículos de ambos grupos fue similar (2.3 ± 1.8 vs 2.8 ± 1.6). Sí se encontró significado estadístico

en la tasa de embarazo de las pacientes cuyo total de espermatozoides móviles fue menor, ya sean prelavados (40.4 millones vs 123.9 millones) o poslavados (17.2 millones vs 38.9 millones), con valor de p menor de 0.001 en ambas modalidades. La tasa de embarazo de las pacientes con endometriosis fue menor que la de las pacientes sin endometriosis (31.3 vs 68.6%, p < 0.001) [Cuadro 3]. Un hallazgo importante fue que 9% de los embarazos fueron embarazos gemelares.

Al cotejar la tasa de embarazo con el número de folí-culos (> 16 mm), medidos por ultrasonido endovaginal al momento de administrar la gonadotrofina coriónica humana, se observó que las tasas mayores de embara-zos (10.5, 14.8 y 16.6%) se obtuvieron con tres, cuatro y cinco folículos, respectivamente. En dos pacientes (5%) en que no se visualizó ningún folículo mayor de 16 mm se obtuvo una prueba de embarazo positiva, y al ver que la proporción de éxito reproductivo de las pacientes con tres, cuatro o cinco folículos era signifi-cativamente mayor que la de las pacientes sin ningún folículo, se observó que la tasa de embarazo aumentó

Cuadro 2. Porcentaje de embarazos por año de estudio

Año Número de ciclos Embarazos totales (frecuencia cardiaca fetal positiva)

Porcentaje de embarazos (frecuencia cardiaca fetal positiva)

Valor de p

1998 170 15 8.8%1999 160 12 7.5% 1999 vs 1998 (p = 0.66)2000 220 13 5.9% 2000 vs 1999 (p = 0.54)2001 120 14 11.6% 2001 vs 2000 (p = 0.08)2002 70 6 8.5% 2002 vs 2001 (p = 0.48)2003 148 20 13.5% 2003 vs 2002 (p = 0.63)2004 152 17 11.1% 2004 vs 2003 (p = 0.76)Total 1,040 97 9.5%

Los valores z se calcularon para determinar el significado estadístico del año en curso vs el año anterior.

Cuadro 3. Comparación entre las pacientes con embarazo vs las pacientes sin embarazo

Sin embarazo Con embarazo Valor de p

Edad 32.9 ± 4.1 31.2 ± 3.3 > 0.05Número de folículos 2.3 ± 1.8 2.8 ± 1.6 > 0.05Total de espermatozoides móviles prelavados 40.4 millones 123.9 millones < 0.001Total de espermatozoides móviles poslavados 17.2 millones 38.9 millones < 0.001Pacientes con endometriosis 55.5% 31.5% < 0.001Pacientes sin endometriosis 44.6% 68.6% < 0.001

Se usó la prueba de la t de Student para comparar las variables edad y número de folículos. También se calcularon los valores z de las demás variables para comparar sus proporciones.


Determinantes en el resultado de inseminación intrauterina

significativamente sólo en el caso de las pacientes con cuatro folículos (Cuadro 4).

DISCUSIÓN

Los protocolos de estimulación ovárica deben indivi-dualizarse de acuerdo con la edad, el diagnóstico y la respuesta al tratamiento. Afortunadamente, los medica-mentos efectivos y seguros cada vez son más.6 En este campo se ha evolucionado porque se ha administrado desde citrato de clomifeno y gonadotrofinas urinarias y recombinantes hasta antagonistas de la hormona estimu-lante de gonadotrofinas. En este estudio retrospectivo, 59.8% de las pacientes fue estimulada con citrato de clomifeno + gonadotrofina menopáusica humana y la tasa de embarazo fue de 9.4%; 20.5% de las pacientes fue estimulada con citrato de clomifeno + FSH recom-binante y 16.1% fue estimulada con citrato de clomifeno + FSH recombinante + gonadotrofina menopáusica humana y las tasas de embarazo fueron de 9.3 y 9.5%, respectivamente; en ninguno de los protocolos en que se administró un tratamiento combinado se obtuvo una diferencia significativa; además, el éxito reproductivo disminuye significativamente cuando únicamente se administra un medicamento.7 Pensamos que la admi-nistración de estos costosos medicamentos sigue siendo motivo de controvertsia debido a que las tasas de em-barazo no difieren significativamente; quizá, la única ventaja que nos ofrecen estos medicamentos costosos

es una menor respuesta antigénica. La edad de la mujer está relacionada directamente con la calidad ovular; sin embargo, en este estudio no observamos una diferencia significativa relacionada con la edad de las pacientes de los diferentes protocolos.

Las características de la muestra espermática desem-peñan una función decisiva en el éxito de la inseminación intrauterina;8 sin embargo, nosotros le conferimos un valor primordial al total de espermatozoides móviles, ya sean prelavados o poslavados, debido a que la dife-rencia estadística fue significativa en las pacientes que no lograron embarazarse.

Independientemente del grado de endometriosis, sabemos que el grado de afección en la fertilidad fe-menina es muy importante;9 por eso, hay que recordar que en este tipo de pacientes es necesario realizar un diagnóstico temprano y adecuado para poder mejorar las tasas de embarazo, ya sea mediante inseminación intrau-terina u otras técnicas. Sólo la tercera parte del grupo de pacientes con endometriosis logró embarazarse; las restantes requirieron técnicas de reproducción asistida más complejas y más costosas.

Acorde con el número de folículos mayores de 16 mm, las tasas de embarazo más altas se lograron con cuatro y cinco folículos (14.8 y 16.6%, respectivamente), y de estas tasas, sólo fue significativa la tasa de embarazo de las pacientes con cuatro folículos; por tanto, podemos determinar que cuatro folículos es la cantidad ideal para la obtención de éxito reproductivo.

Cuadro 4. Resultados de pacientes con éxito reproductivo basado en el número de folículos (> 16 mm) medidos por ultrasonido endovaginal al momento del disparo

Número de folículos Prueba de embarazo negativa

Prueba de embarazo positiva

Número de pacientes

Porcentaje de embarazos

Valor de p(0 vs 1,2,3,4,5,6,7,8,9)

0 38 2 40 5%1 314 25 339 7.3% p = 0.532 225 18 243 7.4% p = 0.533 194 23 217 10.5% p = 0.174 92 16 108 14.8% p = 0.04*5 40 8 48 16.6% p = 0.066 12 1 12 8.3% p = 0.337 4 0 4 0% p = 0.148 2 0 2 0% p = 0.149 1 0 1 0% p = 0.14

Se calcularon los valores z para obtener significado estadístico (p < 0.05*).



En nuestra población estudiada la tasa global de embarazo fue de 9.5%, muy similar a la tasa (8 a 13%) reportada en la bibliografía internacional. La gran can-tidad de variables que influyen el resultado exitoso de la inseminación intrauterina10 limita el análisis estadís-tico. Recomendamos que las pacientes sometidas a este tratamiento se estudien cuidadosamente para descartar padecimientos –como endometriosis–, que limitarían el resultado de la inseminación intrauterina; también recomendamos realizar un seguimiento sonográfico es-trecho, así como revisar las concentraciones sanguíneas de estradiol para mejorar las probabilidades de éxito. El número de ciclos es limitado cuando se usa la técnica de inseminación intrauterina; por eso, después de ese número la probabilidad de embarazo es prácticamente nula; es permisible realizar –como máximo– un total de tres a cuatro ciclos de inseminación intrauterina, antes de pensar en la necesidad de aplicar técnicas de repro-ducción asistida de mayor complejidad.

La inseminación intrauterina sigue siendo uno de los métodos de tratamiento más útil, su éxito depende de la selección estricta de los pacientes y de determinar el ori-gen de la infertilidad, lo que nos da la pauta para someter a una pareja a este tipo de tratamiento. Es importante reconocer cuándo las pacientes requieren técnicas de reproducción asistida de mayor complejidad, como FIV o ICSI, para lograr un embarazo. Con base en nuestros resultados, podemos concluir que la administración de monoterapia –como terapia de inducción– disminuye significativamente el éxito reproductivo, por lo que se recomienda administrar un tratamiento combinado; no se obtuvo algún resultado que favoreciera a un protocolo en particular, pues los porcentajes de éxito reproductivo de los cuatro protocolos combinados no fueron signi-ficativamente diferentes. Durante los años de estudio analizados no varió significativamente la tasa de éxito reproductivo en nuestro centro médico. Otra de las conclusiones fundamentales es que para obtener éxito reproductivo la cantidad ideal de folículos es cuatro y que la tasa de fracaso reproductivo de las pacientes con endometriosis es significativamente mayor que la de las

pacientes sin esta afección. Otro aspecto fundamental fue el total de espermatozoides móviles poslavados, pues el total fue significativamente mayor en las pacientes con éxito reproductivo. Si tomamos en cuenta los factores mencionados, podremos lograr que las mujeres con infertilidad eleven su tasa de éxito reproductivo.

REFERENCIAS

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10. Kably A, Meza E, Di Castro P, Villanueva C, et al. Multifacto-rial analysis of patients with endometriosis in an institutional program of assisted reproduction. Ginecol Obstet Mex 1991;59:151-157.



Índice de materias del volumen 3

47 Reunión anual 1057,481,307 mujeres mexicanas 139Gerardo Velázquez CornejoAnálisis endocrino y metabólico de los fenotipos del

síndrome de ovarios poliquísticos 118 Rene Jaime Toro Calzada, María de Lourdes Estrada

Soria, Mara Guadalupe Cárdenas NavidadAsociación entre el resultado de la prueba de Sims-

Huhner y el logro de embarazo de pacientes infértiles atendidas en un hospital urbano de alta especialidad 69

Maytreli López Negrete, Araceli Vázquez Flores, Rosa Alicia Ramos García, Juan Carlos Hinojosa Cruz, Víctor Saúl Vital Reyes

Características que optimizan la selección de donan-tes de óvulos 176

Laura Fabiola Guadarrama García, Heidi Trejo Cas-tañeda, Zarela Lizbeth Chinolla Arellano, Jeimy Pedraza Cepeda, Felipe Caldiño Soto, Sandra Cu-billos García, Silvio Cuneo Pareto

Determinantes en el resultado de inseminación intrau-terina: análisis de 1,040 ciclos consecutivos 193


Efectividad diagnóstica de la histerosalpingografía y la histerosonografía en la evaluación de la cavidad uterina en pacientes con problemas re-productivos 78

Gerardo Velázquez Cornejo, Marlene Lizbeth Zamora Ramírez, José Luis Castro López, Héctor Luis Mon-dragón Alcocer, Carlos Salazar López Ortiz, Sergio Téllez Velazco

Efecto de la quimioterapia y el cáncer testicular avan-zado o el linfoma de Hodgkin en la integridad del ácido desoxirribonucleico del esperma 123

Cristian O’Flaherty, Barbara F Hales, Peter Chan, Bernard Robaire

El papel de la proteómica en la definición del secre-toma embrionario humano 150

MG Katz Jaffe, S McReynolds, DK Gardner, WB School-craft

El Premio Nobel, el Dr. Robert Geoffrey Edwards y la reproducción 99

Guillermo Santibáñez MorenoEl valor de la suplementación de la fase lútea con

valerianato de estradiol y progesterona en un programa de reproducción asistida 182

Israel Obed Carmona Ruiz, Roberto Santos Haliscak, Pedro Galache Vega, Samuel Hernández Ayup, Víc-tor Alfonso Batiza Reséndiz, Pablo Díaz Spíndola, María Lidia Arenas Montezco

Embarazo ectópico abdominal primario 133 Héctor Luis Mondragón Alcocér, Gerardo Velázquez

Cornejo, Marlene Lizbeth Zamora RamírezEstimulación ovárica controlada. Tiempo de reeva-

luar 1Efraín Pérez Peña, Antonio Gutiérrez Gutiérrez, Ernesto

Pérez Luna, Francisco Rojas RomeroFragmentación del ADN del espermatozoide y su

influencia en la fertilidad de la pareja 105 Alfredo Góngora Rodríguez, Sergio Sánchez González,

Sandra Cubillos García, Silvio Cuneo ParetoFragmentación del ADN espermático: mecanismos

de origen, repercusión en los resultados repro-ductivos y análisis 160

Denny Sakkas, Juan G ÁlvarezFrecuencia de endometriosis en mujeres infértiles:

características clínicas y laparoscópicas 112 Raymundo Preciado Ruiz, José Alfredo Zúñiga Montiel,

María Nayeli Salas Quiroz, Antonio Manuel García Luna González Rubio, Jorge Arturo Torres Calleja, Gerardo Velázquez Cornejo


Índice de materias

Hallazgos histeroscópicos en 70 procedimientos realizados en un curso de histeroscopia de con-sultorio 73

Carlos Gerardo Salazar López Ortiz, Alfredo Saad Ganem, José Alanís Fuentes, Jorge Gálvez Muñoz

Incidencia de embarazo múltiple en el Hospital Ángeles Lomas y su relación con técnicas de re-producción asistida 188


Inhibidores de la aromatasa. Aplicaciones potenciales en medicina de la reproducción 63

Juan Carlos Hinojosa Cruz, Rosa Alicia Ramos García, Víctor Saúl Vital Reyes

Mecanismos patogénicos de la infertilidad asociada con endometriosis 83

Sajal Gupta, Jeffrey M Goldberg, Nabil Aziz, Eric Gol-dberg, Natalie Krajcir, Ashok Agarwal

Tendencias de la reproducción femenina y riesgos asociados con el embarazo 101

Marcelino Hernández ValenciaVitrificación de ovocitos y embriones 143 Martha Isolina García Amador, Rocío Martínez Armas,

Luis Arturo Ruvalcaba Castellón



Índice onomástico del volumen 3

Acosta Rodríguez Ernesto 55, 56Agarwal Ashok 83Aguilar Acosta Loida Ruth 51Aguilar Melgar Ashanti 25Aguinaga Ríos Mónica 61Aguirre Ramos Gustavo 35, 37, 40, 45, 193Alanís Fuentes José 73Alba Jasso Gerardo Andrés 50Almanza Blix Claudia 47Alvarado Gay Francisco Javier 18Álvarez Juan G 160Anaya Torres Francisco Javier 61Angulo Torres Lizbeth Citlalli 26Anuar Tamez Garza David 11 Aparicio González Hipólito 28, 41Arenas Montezco María Lidia 25, 35, 182Arroyo Méndez Francisco Alfredo 38, 47, 61Ávila Lombardo Rosaura 58Aziz Nabil 83

Báez Reyes Rocío 61Bagnarello González Fiorella 14Balcázar Vázquez Ricardo 50Barros Delgadillo Juan Carlos 13, 14Barroso Villa Gerardo 48, 58Basulto Montalvo Erika María 31Batiza Reséndiz Víctor Alfonso 20, 182Bedia Sánchez Luis Miguel 50Benavides Salazar María del Socorro 27, 55Bermúdez Rodríguez Alexandra 42Bracho Ugarte Marco Antonio 53Briones Vega Carlos G 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31

Caldiño Soto Felipe 17, 20, 21, 28, 29, 34, 38, 39, 41, 43, 44, 45, 47, 49, 57, 176Camargo Díaz Felipe A 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31Campos Cañas Jorge Alberto 188

Canavati Ramos Rocío 17Cancino Villareal Patricia 38, 46, 47Cárdenas Navidad Mara Guadalupe 118Carmona Maldonado Marcia 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31Carmona Ruiz Israel Obed 20, 182Caro Gómez Tannia Paulina 30Carrasco Hernández Thamara 51, 59Castillo Baso J 43Castillo Montes Karen 19Castrillo Morales Adriana Lucía 14Castro Hernández Wendy Belén 22, 53, 54Castro López José Luis 78Cedillo Díaz Francisco Javier 36, 40Cerbón Cervantes Marco Antonio 16, 46Cerrillo Hinojosa Mabel 27, 55Cevallos Bustillos Jaime Ignacio 188Chan Peter 123Charría Realpe Gilberto 28, 41Chávez Hernández Álvaro 36Chiang Esteban José Antonio 41Chinolla Arellano Zarela Lizbeth 17, 20, 21, 29, 38, 39, 42, 43, 44, 47, 176Colín Licea Omar 13Colin Valenzuela Alin 13, 58Cortés Algara Alfredo 32, 33Cruz Gutiérrez María de Jesús 60Cubillos García Sandra 17, 20, 21, 28, 29, 34, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 49, 57, 105, 176Cuneo Pareto Silvio 17, 20, 21, 28, 29, 34, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 49, 57, 105, 176

Dabbah Mussally Jacobo 42Dávila Garza Alberto 11De Alba Cervantes María Guadalupe 22, 53, 54Díaz P 39, 43Díaz Spíndola Pablo 11, 17, 19, 20, 25, 34, 35, 182Dupre Aramburu Guillermina 60


Índice onomástico

Echavarría S Mirna Guadalupe 15, 61, 62Enríquez Flores Ana Silvia 46, 47Enríquez Pérez María Magdalena 22Estrada Soria María de Lourdes 118

Fiszman Amora Rachel 26, 27Flores E Xochitl 15, 61, 62Fornelli López Aldo 26

Galache Vega Pedro 11, 19, 25, 34, 39, 182Galindo López Paulina 32, 33Gálvez Muñoz Jorge 73Gamboa Domínguez Armando 16García Amador Martha Isolina 22, 23, 36, 37, 53, 54, 57, 143García Genaro 25, 43García Luna González Rubio Antonio Manuel 112García Suástegui Wendy 34García Villafaña Genaro 19, 34, 35Gardner DK 150Garza Ríos Loyzaga Corcuera Pablo 26Gaviño Gaviño Fernando 13, 14, 26, 27Gaytán Melicoff José 42Godoy Barahona Paola 17Goldberg Eric 83Goldberg Jeffrey M 83Gómez Calsin Magali 42Gómez López Nardhy 58Gómez Piquer Vanessa 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31Góngora Rodríguez Alfredo 32, 33, 105González Becerra Juan Enrique 10, 36, 40González Cervantes Marino Miguel 19González Cofrades Julio 35, 37, 40, 45, 193González Cortés Carolina 32, 33González Garza Socorro 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31González González Patricia Elizabeth 54González O 43González Ortega Claudia 38, 46, 47, 61González Sergio Sánchez 17, 20González Vega Oswaldo Daniel 35Guadarrama García Laura Fabiola 17, 20, 21, 29, 34, 38, 39, 43, 44, 47, 49, 176Gupta Sajal 83Gutiérrez Gutiérrez Antonio Martín 1, 38, 46, 47, 61Gutiérrez Nájar Alfonso Javier 27, 55

Gutiérrez Rueda María Cristina 38, 61Gutiezzez Antonio 41 Guzmán Rodríguez Raymundo 26

Hales Barbara F 123Hernández Ayup Samuel 11, 19, 182Hernández Marín Imelda 18, 49, 50, 51, 52, 59, 60Hernández S 39Hernández Valencia Marcelino 101Hernández Vivar Luis Edmundo 50Hinojosa Cruz Juan Carlos 16, 49, 50, 63, 69Huetle Figueroa David Alejandro 19

Iga Canavati Gerardo 17Isaías Preciado Abril del Carmen 10, 40Islas Cruz Gaudencio 18

Jacobo Nájera Sara 55, 56Jiménez Arboleda Janet 42, 45Juárez Bengoa Armando 13, 14, 31, 54, 58

Kably Ambe Alberto 188Katz Jaffe MG 150Kohls Graciela Cristina 61Krajcir Natalie 83Krasnova Olga 35, 37, 40, 45

Lara Kferman Oliver 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31Lara Rangel Edali Lizzete 35Lazcano Flores Otilia 11Lemus Huerta Ángel 26Linder Efter Carlos 193Lira Plascencia Josefina 26, 27López Duarte Pablo 30, 42López Negrete Maytreli 69López Villaseñor Berenice 22Luna Gallardo Ada Belinda 40

Macedo Torres Esther 55, 56Madrid Zavala Renata Melina 18, 51, 52, 60Maldonado Rosas Israel 30, 42Martínez Armas María del Rocío 22Martínez Armas Rocío 22, 23, 36, 37, 57, 143Martínez Juárez Oscar Eugenio 50Martínez Silvia 15, 61, 62


Índice onomástico

Mateo Sanez Henry 23, 36, 37, 57McReynolds S 150Medina Flores José 23, 36, 37, 57Mejía Medina Cecilia Berenice 48Mendoza Baranda Karelia 18Mendoza Rodríguez Carmen Adriana 46Meneses Núñez Cizani 27, 55Mojica Martínez Karlo Alberto 19, 20Mondragón Alcocer Héctor Luis 78, 133Monroy Moreno Luis Gabriel 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31Montoya Sarmiento Jorge Eduardo 23, 36, 37, 57Monzalbo Núñez Diana Elena 188Morales Sánchez Elizabeth 46Moreno García Jesus Daniel 10, 36, 40, 48Munguía Olvera Patricia 35, 37, 40, 45Muñoz Padilla Susana Daniela 30

Nava Pablo 35Navarro Martínez Carlos 35, 37, 40, 45, 193

O’Flaherty Cristian 123Obeso I 39Ocampo Torres Aide Beatriz 18, 51, 52, 59, 60Ochoa Flores Juan Gerardo 51, 52, 60Orizaba Chávez Bernardett 50Ortiz Reyes Heidy 188

Pascual Rodríguez Antonio Vidal 41Pashkova Olga 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31 Pedraza Cepeda Jeimy 17, 21, 28, 29, 34, 38, 41, 44, 45, 49, 57, 176Pérez Luna Ernesto 1Pérez Peña Efraín 1, 41, 46, 47Pérez Torres Alicia 38, 46Preciado Ruiz Raymundo 112Puente Enríquez Silvia Irene 32, 33

Quintana Mónica 61Quiroz Torres Edgar 22, 23, 36, 37, 57

Ramírez Eugenio Brenda Yareli 22Ramírez García Patricia 11Ramírez Rodiles Adriana 13, 58Ramírez Silva Beatriz Ofelia 49Ramos García Rosa Alicia 49, 50, 63, 69

Ramos Gordillo Guillermo Martín 18, 52, 60Regalado Hernández Miguel Ángel 10, 36, 40, 48Reyes Olivans Juan Pablo 34Reyes Ramírez Ana Nayeli 42Reyna Arias María del Pilar 35, 37, 40, 45Rivera Montes Alfredo Martín 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31Robaire Bernard 123Robles Murillo Karina 41Rodríguez Martínez José Antonio 193Rodríguez Perdomo David Francisco 14Rodríguez Solís Hafid Rodolfo 49Rodríguez Villasana Enrique 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31Rojas Romero Francisco 1Rosales J 39Ruiz Muñoz Saúl 30, 42Ruiz O Francisco 15Ruvalcaba Castellón Luis Arturo 22, 23, 36, 37, 53, 54, 57, 143

Saad Ganem Alfredo 73Sakkas Denny 160Salas Quiroz María Nayeli 55, 56, 112Salazar López Ortiz Carlos Gerardo 73, 78Sam Soto Selene 26, 27Sánchez González Sergio 28, 29, 34, 38, 39, 41, 43, 45, 49, 57, 105Sánchez M Maribel 15, 61, 62Sánchez Serrano Ana Paola 48Sánchez Solís Víctor 13, 14Santibáñez Morales Álvaro 13, 14, 60Santibáñez Moreno Guillermo 99Santillana Espinosa Estrella 52, 60Santos Haliscak Roberto 25, 34, 39, 43, 182Sauceda González Luciano 36Schoolcraft WB 150Sepúlveda González José 11, 19, 20, 25, 35, 43Serrano Heidi 15, 61, 62Sierra Jiménez Hugo 12, 13, 15, 16, 23, 24, 29, 31Silvestri Tomassoni José Roberto 60Smeke Befeler José 193Sondon García Zoe Gloria 36Soriano Cruz José Guadalupe 13Sosa Reyes Francisco Javier 36, 40Stern Colin y Nunés Jorge Jaroslav 55, 56


Índice onomástico

Téllez Velazco Sergio 78Toro Calzada Rene Jaime 118Torres Calleja Jorge Arturo 112Torres Ramírez Jorge Enrique 18, 52Torres Zapata Roxana J 34Trejo Castañeda Heidi 17, 20, 21, 38, 39, 43, 44, 47, 49, 57, 176

Valdez Morales Francisco Javier 16Valdovinos Ramírez Irene Alejandra 42, 45, 57Vargas Maciel Marcos 38, 46, 47, 61Vázquez Aguilar Paola 51, 52, 59

Vázquez de Lara Luis Guillermo 19Vázquez Flores Araceli 69Vega Hernández Eva 13Velázquez Cornejo Gerardo 78, 112, 133, 139Vilchis Nava Pablo 37, 40, 45, 193Vital Reyes Victor Saúl 16, 46, 49, 50, 63, 69

Zamora Ramírez Marlene Lizbeth 78, 133Zavala Ortega Isabel 50Zúñiga Jiménez Daniel 26Zúñiga Montiel José Alfredo 112

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