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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA

Amanda Alencar Cabral

EFICÁCIA DA LASERTERAPIA NA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS

PRÉ-OSTEOBLÁSTICAS CULTIVADAS SOBRE BIOFILME DE PLA.

NATAL – RIO GRANDE DO NORTE

2016

Amanda Alencar Cabral

EFICÁCIA DA LASERTERAPIA NA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS

PRÉ-OSTEOBLÁSTICAS CULTIVADAS SOBRE BIOFILME DE PLA.

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado a

Coordenação do Curso de Ciências Biológicas da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

como requisito parcial para obtenção do título de

Bacharel em Ciências Biológicas.

Orientador: Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza

NATAL - RIO GRANDE DO NORTE

2016

DEDICATÓRIA

A Deus que me sustentou nos momentos de

dificuldades, ao meu pai Álvaro e minha mãe

Susani por todo o apoio e incentivo que tornaram

isso possível.

AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus pais (Álvaro Pereira Cabral e Susani Alencar Cabral) que conviveram

comigo todos os dias desta jornada me apoiando, aconselhando e incentivando os meus sonhos

acadêmicos. Agradeço por sempre falarem que, com Deus e esforço, tudo é possível.

Ao Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza pela orientação, por toda a experiência acadêmica

proporcionada e por acreditar neste trabalho. Obrigada por me ajudar a crescer academicamente.

A todos os componentes do Laboratório de Biologia Crânio-Facial, em especial Fernanda Ginani

por toda a ajuda com as análises e Haroldo Gurgel (futuro Cirurgião-Dentista) que, além de ter

sido um companheiro de pesquisa inestimável, se tornou um grande amigo que levarei para a

vida.

Ao Prof. Dr. Hugo Alexandre Rocha, responsável pelo Laboratório de Cultivo Celular do

Departamento de Bioquímica (DBQ) da UFRN, por ter cedido todo o espaço, sem o qual este

trabalho não seria possível.

A todas as pessoas que conheci neste percurso e que se dispuseram a me ajudar, em especial

Jailma Almeida (Lab. BIOPOL, DBQ, UFRN) por toda a paciência, ensinamentos e por ter

cedido seu sábado para que eu pudesse finalizar as análises, sem você eu não teria conseguido; e

Melina (Laboratório de Técnicas Histológicas, DMOR, UFRN) por toda a ajuda com a parte

histológica.

Ao Prof. Dr. Paulo Henrique de Souza Picciani do Instituto de Macromoléculas da UFRJ,

responsável pelo Laboratório de Dispositivos Poliméricos (LADISPO), por ter cedido o PLA

para este estudo e por toda a colaboração com esta pesquisa. E a Talita Nascimento da Silva

(LADISPO, UFRJ) por toda a colaboração e disponibilidade.

A Marjorie Freire pela ajuda na para fabricação do filme de PLA e pelo conhecimento

compartilhado.

Ao meu amigo e namorado Athayde por todo o apoio e conselhos que nesta etapa final foram

essenciais.

A todos os professores que compõe o corpo docente que tive o privilégio de conhecer. Agradeço

por todo o conhecimento repassado durante a minha graduação, sem vocês não seria possível.

E a todos os amigos e colegas da turma de Ciências Biológicas, principalmente aos de 2010.2 e a

Ramayana Brito pela amizade e conhecimentos compartilhados.

“Vocês serão enriquecidos de todas as formas, para

que possam ser generosos em qualquer ocasião e,

por nosso intermédio, a sua generosidade resulte em

ação de graças a Deus.”

(2 Coríntios 9:11)

“No entanto, ninguém é digno de contribuir para a

ciência se não usar suas dores e insônias nesse

processo. Não há céu sem tempestade. Risos e

lágrimas, sucessos e fracassos, aplausos e vaias

fazem parte do currículo de cada ser humano, em

especial daqueles que são apaixonados por produzir

novas ideias.”

(Augusto Cury)

RESUMO

O ácido poliláctico (PLA) é um biomaterial utilizado para diversas aplicações biomédicas,

incluindo a interface no processo de cicatrização de tecidos, representando um promissor

arcabouço na engenharia tecidual por seu baixo custo e biocompatibilidade. O laser de baixa

intensidade (LBI) tem sido apontado como uma ferramenta para promover a bioestimulação de

diversos tipos celulares in vitro. Este trabalho teve como objetivo verificar a eficácia do LBI na

proliferação de células pré-osteblásticas (MC3T3-E1) cultivadas sobre filme de PLA. Foram

avaliados três grupos: I (controle) – células cultivadas sobre a superfície plástica; II (PLA) –

células cultivadas sobre o filme de PLA; e III (PLA + Laser) – células cultivadas sobre o filme

de PLA e submetidas à irradiação com laser diodo (InGaAIP) com comprimento de onda de 830

nm, potência de 30 mW, e uma única dose de 4 J/cm2, sendo a radiação emitida de forma

contínua. O experimento foi conduzido em quadruplicata, em quatro intervalos de tempo: 6, 24,

48 e 72 horas. A adesão celular foi analisada 6 horas após o cultivo celular, através da contagem

das células coradas por azul de toluidina. A viabilidade e proliferação celular foram avaliadas

pela contagem das células através do método de exclusão por azul de tripan (24, 48 e 72 horas) e

fotomicrografias da interface do biomaterial/plástico (6, 24, 48 e 72 horas). Os resultados

mostraram uma maior proliferação dos grupos III em comparação com o grupo I e II. Estes

dados sugerem que o LBI nos parâmetros utilizados aumenta a proliferação de células MC3T3-

E1 cultivadas sobre filme de PLA, tendo assim um uso potencial para aplicações futuras no ramo

da engenharia tecidual.

Palavras-chaves: Biomateriais. PLA. Laser de Baixa Intensidade. Proliferação Celular.

ABSTRACT

Poly (lactic acid) (PLA) is a biomaterial used for biomedical applications, such as for interfacing

the tissue healing process, representing a promising scaffold in tissue engineering due to its low

cost and biocompatibility. Low level laser therapy (LLLT) has been suggested as a tool to

promote bio-stimulation of various cell types in vitro. This study aimed to verify the efficacy of

LLLT in the proliferation of preosteoblast cells (MC3T3-E1) cultured on PLA film. We

evaluated three groups: I (control) – cells cultured on plastic surface; II (PLA) – cells cultured

on PLA film; and III (PLA + Laser) – cells cultured on PLA film and submitted to irradiation

with diode laser (InGaAIP) by using a wavelength of 830 nm, output power 30 mW, and a single

dose of 4 J/cm2, with the radiation emitting continuous radiation. The experiment was conducted

in quadruplicate at four time intervals: 6, 24, 48, and 72 h. Cell adhesion was analyzed 6 h after

the cell culture by counting cells stained by toluidine blue. Cell viability and proliferation were

evaluated by counting the cells in all three groups using trypan blue exclusion assay (24, 48, and

72 h) and photomicrographs of the biomaterial/plastic interface (6, 24, 48, and 72 h). The results

showed that group III exhibited a higher proliferation compared to the groups I and II. These

data suggest that LLLT on the parameters used in this study increases the proliferation of

MC3T3-E1 cells on PLA surface, thus having a potential use for future applications in the field

of tissue engineering.

Keywords: Biomaterials. PLA. Low Level Laser Therapy. Cell proliferation.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Desenho experimental da distribuição dos grupos na placa de cultura........................16

Figura 2- Células MC3T3-E1 cultivadas em garrafa de cultivo celular de 75 cm2.......................17

Figura 3 – Processo de esterilização dos filmes de PLA...............................................................18

Figura 4 – Aparelho de Laser diodo utilizado no trabalho............................................................19

Figura 5 – Processo de coloração com azul de toluidina...............................................................20

Figura 6 – Modelo da fotomicrografia da interface filme de PLA/placa de cultura......................20

Figura 7 – Análise da adesão celular ao filme de PLA no intervalo de tempo de 6 horas após o

plaqueamento e/ou irradiação com LBI.........................................................................................22

Figura 8 - Fotomicrografias das células aderidas à superfície do filme de PLA após 72 horas de

plaqueamento.................................................................................................................................23

Figura 9 – Fotomicrografias da interface filme de PLA (P) com a placa de cultura (C) em

diferentes intervalos de tempo.......................................................................................................24

Figura 10 – Proliferação de células MC3T3-E1 em diferentes períodos de tempo.......................26

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Parâmetros utilizados do Laser de Baixa Intensidade..................................................19

Tabela 2 – Proliferação de células MC3T3-E1 cultivadas sobre filme de PLA submetidas à

irradiação com laser de baixa intensidade em diferentes intervalos de tempo..............................25

ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS

% Porcento

µL Microlitro

°C Grau Celsius

ALP Fosfatase Alcalina

ATP Adenosina Trifosfato

cAMP Adenosina 3',5'-monofosfato cíclico

CAMs Moléculas de Adesão Celular (do inglês Cell Adhesion Molecules)

cm2 Centímetro quadrado

CO2

Dióxido de carbono

DP Desvio Padrão

g Gramas

J/cm² Joules por centímetro quadrado

LBI Laser de Baixa Intensidade

mL Mililitro

mW Milliwatts

nm Nanometros

PBS Tampão fosfato-salino (do inglês Phosphate Buffered Saline)

PLA Poli (ácido láctico)

ROS Espécies Reativas de Oxigênio

SFB Soro Fetal Bovino

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO......................................................................................................................11

2. OBJETIVOS...........................................................................................................................15

2.1. Objetivo Geral.................................................................................................................15

2.2. Objetivos Específicos......................................................................................................15

3. METODOLOGIA..................................................................................................................16

3.1. Delineamento do Estudo.................................................................................................16

3.2. Fabricação do Filme de PLA.........................................................................................17

3.3. Cultivo Celular................................................................................................................17

3.4. Cultivo Celular nos Filmes de PLA...............................................................................18

3.5. Irradiação Laser de Baixa Intensidade.........................................................................19

3.6. Adesão Celular................................................................................................................19

3.6.1. Azul de Toluidina.................................................................................................19

3.7. Análise de Viabilidade....................................................................................................20

3.7.1. Teste de Contato Direto.......................................................................................20

3.8. Análise de Proliferação...............................................................................................21

3.8.1. Método de Exclusão por Azul de Tripan...........................................................21

3.9. Análise Estatística...........................................................................................................21

4. RESULTADOS......................................................................................................................22

5. DISCUSSÃO...........................................................................................................................27

6. CONCLUSÕES......................................................................................................................30

REFERÊNCIAS.....................................................................................................................31

11

Cabral, A. A. Trabalho de Conclusão de Curso

REFERÊNCIAS....

1. INTRODUÇÃO

A engenharia tecidual é uma ciência que envolve uma tríade entre o uso de materiais

biocompatíveis (scaffolds), uma linhagem celular adequada e fatores de crescimento (IKADA et

al., 2006; MURPHY et al., 2013). Esta área do conhecimento visa elaborar substitutos biológicos

como alternativas para o reparo ou substituição de tecidos/órgãos lesionados (ZANG et al.,

2009), e vem promovendo um crescimento constante de pesquisas.

Segundo MENDONÇA et al. (2009), os estudos abordando substitutos ósseos vêm

avançando para aprimoramento das técnicas de implementação de materiais biomiméticos no

local lesionado, através da combinação de arcabouços biocompatíveis com células vivas e/ou

moléculas bioativas (BONASSAR & VACANTI, 1998; KUBINOVÁ & SYKOVÁ, 2010;

MURPHY et al., 2013). Os materiais utilizados como arcabouços devem ser biocompatíveis e

apresentarem a capacidade de induzir respostas celulares especificas, permitindo assim, a

formação de um novo tecido (KIM & MOONEY, 1998; ALVES, 2012). Além disso, em

algumas situações o biomaterial deve ser metabolizado pelo corpo e não deixar vestígios após a

regeneração tecidual ser atingida, sendo assim considerado biodegradável (LIPINSKY &

SINCLAIR, 1986).

Dependendo das propriedades físicas e químicas destes biomateriais, os mesmos podem

gerar respostas positivas ou negativas nos processos de adesão, proliferação, migração e

diferenciação celular (HUTMACHER, 2000; PONSONNET et al., 2003; LORCAN et al., 2006;

MENDONÇA et al., 2009). O Poli (ácido láctico) (PLA) é um biomaterial conhecido como um

"biopolímero verde" que pertence aos hidroxiácidos e tem o ácido láctico (α-ácido 2-

hidroxipropianóico) como matéria prima. Este biomaterial é amplamente aceito para aplicações

biomédicas devido à suas propriedades positivas no que se refere à biodegradabilidade,

biocompatibilidade e sua fácil disponibilidade devido ao baixo custo (LIPINSKY & SINCLAIR,

1986; GOSWAMI et al., 2013).

O uso do PLA, seja puro ou em blendas/modificações, vem sendo amplamente

investigado com diversos focos (XIAO et al., 2012), seja para sistema de liberação de fármacos

(TOBÍO et al., 1998; OLIVIER, 2005; LI et al., 2013; MU et al., 2013; CASA et al., 2015; LUO

et al., 2015; MHLANGA & RAY, 2015); analisar a eficácia em fazer a interface no processo de

cicatrização de tecidos (JAMSHIDI et al., 1988; WELCH et al., 2002); ou investigar a interação

12


REFERÊNCIAS....

com diversos tipos celulares, como condrócitos humanos e fibroblastos NIH/3T3 (LEE et al.,

2002; FUKUHIRA et al., 2006; PRIME et al., 2007), células percursoras osteogênicas

(HAMAJIMA et al., 2003; HU et al., 2003; ABDAL-HAY et al., 2013), células do sistema

imune (STANKEVICH et al., 2015), células do ligamento periodontal (LI et al., 2013) e

linhagens de células neuronais (ÁLVAREZ et al., 2013; XIE et al., 2013; MEI et al., 2014;

MOBASSERI et al., 2014).

Dentre os eventos celulares essenciais para a efetividade de um implante, a adesão celular

é considerada um processo primordial (MARGARON et al., 1997; OLIVEIRA et al., 2010). O

termo “adesão” ao biomaterial engloba diferentes fenômenos: a fase de adsorção, a qual ocorre

rapidamente e envolve pequenas ligações físico-químicas entre as células e o material, tais como

ligações iônicas, força de Van der Walls, etc.; e a fase de adesão propriamente dita, que ocorre

lentamente envolvendo diversas moléculas biológicas, tais como proteínas da matriz celular,

proteínas de membrana celular e proteínas do citoesqueleto, as quais interagem juntas para

induzir sinal de transdução, promovendo a ação dos fatores de transcrição e consequentemente

regulando a expressão gênica. Além disso, essas moléculas induzem a proliferação, migração e

diferenciação celular, permitindo, consequentemente, a formação de um novo tecido sobre o

biomaterial (ANSELME, 2000; MEIGA & THIRÉ, 2012).

As moléculas biológicas envolvidas no processo de adesão celular são conhecidas como

CAMs (do inglês Cell Adhesion Molecules) e classificadas em: caderinas, superfamília das

imunoglobulinas, integrinas e selectinas (ALBERTS et al., 2008). Estas glicoproteínas expressas

na superfície das células mediam o contato célula-célula ou célula-matriz extracelular, sendo,

portanto de fundamental importância para a adesão (ANSELME, 2000; GOMES et al., 2009).

Para que a adesão das CAMs ao biomaterial ocorra é necessária também a interação com alguns

componentes da matriz extracelular, como proteoglicanas, colágeno e proteínas (MEYER et al.,

2005).

Diversos estudos têm avaliado a interação entre células e biomateriais através da

expressão de CAMs e componentes da matriz extracelular, como: (i) as integrinas (COMISAR et

al.,2007; OLIVEIRA et al., 2007; RAVICHANDRAN et al., 2012; POLINI et al., 2011; WANG

et al., 2011), consideradas uma molécula fundamental (MARTHIENS et al., 2010), pois está

envolvida em diversos processos de comunicação célula-matriz (GIANCOTTI & RUOSLAHTI,

1999; HYNES, 2002), como o mecanismo de adesão focal (BIGGS et al., 2008a; BIGGS et al.,

13


REFERÊNCIAS....

2008b; BIGGS et al., 2009); e (ii) o colágeno (MARLETTA et al., 2007; PRABHAKARAN et

al., 2009; ABD EL- FATTAH et al., 2011), que é o componente principal da matriz extracelular

e vai interagir com outros componente da matriz, como fibronectina/vitronectina/laminina

(OLIVEIRA et al., 2007; ZHOU et al., 2009), para aumentar a capacidade de adesão celular

(RODRIGUES-ANJOS et al., 2004; CARVALHO et al.; 2009).

Outros mecanismos importantes na adesão celular envolvem: (i) a participação da

fosfatase alcalina (ALP) (MARLETTA et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2007; HEO et al., 2009;

FRANCIS et al., 2010; DUAN et al., 2010; POLINI et al., 2011), que atua na formação dos

cristais de hidroxiapatita de cálcio (ANDERSON et al., 2004), ou seja, sua expressão fornece o

grau de diferenciação osteoblástica (HEO et al., 2009); e (ii) a formação de

filopódios/lamelipódios (LIUYUN et al., 2009; DUAN et al., 2010), que auxiliam na união e

alongamento das células, e por isso são fundamentais para a ancoragem e a proliferação celular.

O conhecimento detalhado desses mecanismos de integração é essencial para a eficiência

dos enxertos, no sentido de se estabelecer um implante com completa união entre o biomaterial e

o tecido (ANSELME, 2000). Segundo YANG et al. (2003) e MEIGA (2010), a escolha do

biomaterial vai influenciar no comportamento celular, por esta razão, é importante conhecer os

mecanismo celulares envolvidos nos processos de adesão, crescimento e diferenciação

(PONSONNET et al., 2003).

Visando acelerar o crescimento celular e melhorar a resposta ao implante, os efeitos do

laser de baixa intensidade (LBI) sobre diversos tipos celulares têm sido amplamente estudados

nos últimos anos e tem mostrado efeitos bioestimulatórios positivos (STEIN et al., 2005;

EDUARDO et al., 2008; KIYOSAKI et al., 2010; RENNO et al., 2010; BARBOZA et al., 2014;

MIGLIARIO et al., 2014; ZACCARA et al., 2015).

Pesquisas sugerem que o laser estimula a proliferação celular através do aumento do

potencial de membrana mitocondrial e ATP, dos níveis de cAMP, o que aumenta a secreção de

fatores de crescimento (KARU et al., 1995; HU et al., 2007). Com o passar dos anos, a literatura

tem mostrado que os efeitos do laser sobre as células dependem dos parâmetros utilizados, ou

seja, os resultados obtidos são dose-dependentes (LAAKSO et al., 1993; AZEVEDO et al., 2006;

HOU et al., 2008; AMID et al., 2014; De OLIVEIRA et al., 2015). ALGHAMDI et al. (2012)

sugerem que o uso de doses entre 0.5 e 4.0 J/cm² tem um efeito positivo na proliferação de vários

tipos celulares.

14


REFERÊNCIAS....

Na literatura alguns estudos foram publicados analisando o efeito do LBI na

adesão/proliferação de células cultivadas sobre biomateriais, incluindo-se o policarbonato

uretano (HSU et al., 2010), o biosilicato (RENNO et al., 2010; PINTO et al., 2013), a matriz

dérmica acelular (CHOI et al., 2013), o arcabouço poroso de hidroxiapatita (PARENTI et al.,

2013) e o arcabouço de titânio (DE VASCONCELLOS et al., 2016). Porém, não há estudos

investigando os efeitos do LBI em células cultivadas sobre filme de PLA.

15


REFERÊNCIAS....

OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Verificar a eficácia do LBI na proliferação de células pré-osteblásticas (MC3T3-E1)

cultivadas sobre filme de PLA.

2.2. Objetivos Específicos

Analisar a adesão celular ao biofilme de PLA.

Verificar a viabilidade celular após a irradiação com o LBI.

Registrar a proliferação celular nos intervalos de 24, 48 e 72 horas após a

irradiação com o LBI.

16


REFERÊNCIAS....

METODOLOGIA

2.3. Delineamento do Estudo

O experimento foi conduzido em quadruplicata, com três grupos experimentais (Figura 1)

e em quatro intervalos de tempo (6, 24, 48 e 72 horas após irradiação), sendo os grupos

estabelecidos:

Grupo I (controle de crescimento): células MC3T3-E1 cultivadas sobre a superfície

do plástico.

Grupo II (controle negativo): células MC3T3-E1 cultivadas sobre o filme de PLA.

Grupo III: células MC3T3-E1 cultivadas sobre o filme de PLA e submetidas a

irradiação com laser de baixa intensidade na dose de 4 J/cm2.

Figura 1 – Desenho experimental da distribuição dos grupos na placa de cultura. Azul -

Grupo I; Amarelo - Grupo II; Vermelho - Grupo III. Observe-se que no Grupo III há intervalo

entre os poços para evitar a dispersão não intencional da luz.

17


REFERÊNCIAS....

2.4. Fabricação do Filme de PLA

Os filmes foram fabricados no Departamento de Farmácia da UFRN, seguindo o

protocolo descrito por Lian et al. (2008). Resumidamente, 2 g de PLA foi dissolvido em 100 mL

de clorofórmio a 60ºC durante 90 minutos, sob agitação vigorosa. Em seguida, a solução foi

transportada para uma placa de Petri e deixada numa câmara de ventilação até o clorofórmio

residual evaporar e uma película fina de matéria-prima ser formada. Os filmes foram cortados

em pedaços circulares com 1 cm de diâmetro, tendo como molde lamínulas usadas para

imunohistoquímica na placa de 24 poços.

2.5. Cultivo Celular

Foi utilizada uma linhagem de células pré-osteobásticas (MC3T3-E1), gentilmente

cedidas pelo Departamento de Bioquímica da UFRN, que foram cultivadas em meio de cultura

α-MEM (Cultilab, Brasil) suplementado com 1% de antibiótico (100 UI/ml de penicilina, 100

microgramas/ml de estreptomicina e 0,25 microgramas/ml de anfotericina B) e 10% de soro fetal

bovino (FBS – Gibco, USA), em garrafas de cultivo celular de 75 cm2. As células foram

mantidas a 37ºC em 5% de CO2 até atingirem 80 a 90% de confluência, com troca de meio a

cada três dias. (Figura 2).

Figura 2- Células MC3T3-E1 cultivadas em garrafa de cultivo celular de 75 cm2.

Aumento: 10x - Eclipse Ti-U da Nikon; Imagem: Autora.

18


REFERÊNCIAS....

2.6. Cultivo Celular nos Filmes de PLA

Após a obtenção dos filmes nas dimensões adequadas, estes foram submetidos ao

processo de esterilização em fases, seguindo o protocolo de Mansourizadeh et al. (2013): (1)

etanol a 70% durante 10 minutos; (2) submetidos à luz ultravioleta durante 2 horas na câmara de

fluxo laminar; (3) nova lavagem com etanol 70% durante 30 minutos; (4) enxaguados três vezes

com solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 15 minutos.

Em seguida, os filmes de PLA foram dispostos em placas de 24 poços e imersos em meio

completo (α-MEM + 10% de SFB + 1% antibióticos) overnight a 37ºC em 5% de CO2 (Figura 3),

com o objetivo de aumentar a hidrofilia do biomaterial. Após esse período, as células MC3T3-E1

foram cultivadas sobre os arcabouços na densidade de 2x104 células/poço.

Figura 3 – Processo de esterilização dos filmes de PLA. (a) Fase 1 – Etanol 70%; (b) Fase 2 –

Luz ultravioleta; (c) Fases 3 e 4 – Etanol 70% e PBS; (d) Distribuição dos filmes na placa de 24

poços. Imagens: Autora.

19


REFERÊNCIAS....

2.7. Irradiação Laser de Baixa Intensidade

Após o plaqueamento, os grupos foram submetidos a uma única irradiação com laser de

baixa intensidade no momento do plaqueamento. O aparelho utilizado para as irradiações foi um

Laser diodo InGaAIP (Kondortech – BioWave LLLT Dual, Brasil) (Figura 4), com os

parâmetros apresentados na Tabela 1.

Tabela 1 – Parâmetros utilizados do Laser de Baixa Intensidade.

Figura 4 – Aparelho de Laser diodo utilizado no trabalho. Imagem: Autora.

2.8. Adesão Celular

2.8.1. Azul de Toluidina

A análise de adesão celular ao biomaterial foi feita pela coloração com azul de toluidina a

1%. Nesta etapa foram analisados somente os grupos II e III em quadruplicata, já que o grupo I

foi o controle positivo do crescimento celular nas placas de cultivo. Decorridas 6 horas após

Potência 30mW

Comprimento de onda 660nm

Dose 4,0J/cm²

Diâmetro da ponta 0,01cm2

Modo de ação Contínuo

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REFERÊNCIAS....

irradiação, os espécimes foram fixados em paraformaldeído a 4%, processados e corados de

acordo com o protocolo descrito na Figura 5 e as lâminas foram montadas para visualização das

células aderidas ao biomaterial, no Laboratório de Técnicas Histológicas do Departamento de

Morfologia da UFRN.

Figura 5 – Processo de coloração com azul de toluidina.

3.7. Análise de Viabilidade

3.7.1. Teste de Contato Direto

Foram obtidas fotomicrografias da interface filme de PLA/placa de cultura (Figura 6) e

da superfície do PLA de cada grupo experimental em diferentes intervalos de tempo (6, 24, 48 e

72 horas), após a irradiação com LBI, onde foi utilizado o Microscópio Invertido (Eclipse Ti-U –

Nikon) do Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL/ DBQ/ UFRN).

Figura 6 – Modelo da fotomicrografia da interface filme de PLA/placa de cultura.

21


REFERÊNCIAS....

Em seguida, as fotos obtidas foram comparadas entre os diferentes períodos de

observação para avaliação da proliferação celular na placa de cultura e/ou sobre o filme de PLA.

3.8. Análise de Proliferação

3.8.1. Método de Exclusão por Azul de Tripan

Após os intervalos de tempo de 24, 48 e 72 horas, as células de cada poço foram soltas,

seguindo o protocolo abaixo:

I. Lavagem com PBS.

II. Adição de 300µl de tripsina (5 minutos).

III. Adição de 300µl de meio α-MEM para inativar a tripsina.

IV. Passagem da amostra de cada poço para um tubo Falcon correspondente.

V. Completar com 400µl de meio α-MEM cada tubo Falcon (total de 1ml).

VI. Separadamente, colher 10µl da amostra e misturar com 10µl de Azul de Tripan.

VII. Coletar 10µl e colocar no hemocitômetro.

Em seguida foram feitas duas contagens por poço no sistema duplo-cego, onde as células

coradas (mortas) e não coradas (viáveis) foram contadas.

O cálculo final obedeceu a seguinte equação matemática:

Para o cálculo de viabilidade celular:

3.9. Análise Estatística

Os dados foram plotados em planilha do Excel e a diferença, entre os grupos para cada

um dos intervalos de tempos estudados (24, 48, 72 horas), foi analisada utilizando o software

GraphPad Prism (versão 5.00 para Windows) através do teste estatístico não paramétrico de

Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn‟s, em seguida o valor de p foi calculado pelo teste

complementar de Mann Whitney, sempre considerando um intervalo de confiança de 95%.

22


REFERÊNCIAS....

4. RESULTADOS

4.3. Adesão Celular

4.3.1. Azul de Toluidina

A Figura 7 apresenta a análise de adesão celular ao filme de PLA 6 horas após o

plaqueamento e/ou irradiação com LBI. Como pode ser observado, as células aderiram

adequadamente ao material no período analisado, mostrando que ele se mostra satisfatório para a

adesão inicial deste tipo celular. O uso da laserterapia parece não influenciar na adesão celular no

período de tempo avaliado.

Figura 7 – Análise da adesão celular ao filme de PLA 6 horas após o plaqueamento

e/ou irradiação com LBI. (a) Grupo II – PLA; (b) Grupo III – PLA + Laser. Aumento:

10x. Imagens: Autora.

23


REFERÊNCIAS....

4.4. Análise de Viabilidade

4.4.1. Teste de Contato Direto

As Figuras 8 e 9 apresentam as imagens obtidas com microscópio óptico invertido

(Eclipse Ti-U – Nikon) nos intervalos de tempo estudados após o plaqueamento e/ou irradiação.

As imagens mostram que as células proliferaram adequadamente nos poços, podendo-se observar

que houve grande aumento no número de células na placa, inclusive sobre a superfície do filme

de PLA.

Figura 8 - Fotomicrografias das células aderidas à superfície do filme de PLA após 72 horas de

plaqueamento. (a) Grupo II – PLA; (b) Grupo III – PLA + Laser. Aumento: 40x. Imagens: Autora.

24


REFERÊNCIAS....

Figura 9 - Fotomicrografias da interface filme de PLA (P) com a placa de cultura (C) em

diferentes intervalos de tempo. Grupo I – controle; Grupo II – células cultivadas sobre o filme de PLA;

Grupo III – células cultivadas sobre o filme de PLA e irradiadas com LBI. Aumento: 10x. Imagens: Autora.

25


REFERÊNCIAS....

Mesmo o filme de PLA não sendo completamente translúcido, podemos visualizar bem

as células em algumas partes mais translúcidas no centro do biofilme. A crescente proliferação

celular na placa de cultura e na interface com o filme de PLA durante o período da analise indica

que, provavelmente, também há um significativo número de células em sua superfície. Sendo

assim, ao longo das 72 horas de experimento, podemos ver uma crescente proliferação celular na

interface do biomaterial com a placa de cultura e também na superfície do filme de PLA, onde as

células apresentaram uma morfologia adequada ao seu tipo celular.

O grupo III mostrou visivelmente um maior crescimento celular em comparação com o

grupo I e II, demonstrando que o laser de baixa intensidade na dose de 4 J/cm² estimula

positivamente o crescimento das células e melhora a resposta de células cultivadas sobre o filme

de PLA.

4.5. Análise de Proliferação

4.5.1. Método de Exclusão por Azul de Tripan

Os resultados obtidos pelo método de exclusão por Azul de Tripan confirmam o

observado nas outras etapas deste estudo, visto que as células do grupo III apresentaram uma

maior taxa proliferativa, quando comparadas com os grupos I e II em todos os períodos de tempo

analisados (Tabela 2; Figura 10).

Tabela 2 – Proliferação de células MC3T3-E1 cultivadas sobre filme de PLA submetidas à

irradiação com laser de baixa intensidade em diferentes intervalos de tempo

p valor#

Controle PLA Laser Controle x PLA Controle x Laser PLA x Laser

24h 2,19±1,05 2±0,92 6,59±1,08 0,87 0,0009*** 0,0009***

48h 3,16±0,86 3,53±0,57 7,38±1,53 0,43 0,0009*** 0,0009***

72h 4,41±1,28 5,19±1,51 8,75±1,99 0,22 0,0009*** 0,0009***

Controle: Grupo I; PLA: Grupo II; Laser: Grupo III. Os valores são apresentados conforme a média e ± desvio padrão

(×104 células/ml). Sendo, # - Teste de Mann Whitney; ***p<0,001.

26


REFERÊNCIAS....

Figura 10 – Proliferação de células MC3T3-E1 em diferentes períodos de tempo

Controle: Grupo I; PLA: Grupo II; Laser: Grupo III. (***p<0,001).

O uso deste biomaterial sozinho não apresenta diferença estatística quando comparado ao

grupo controle, mas quando combinado com o laser de baixa intensidade há um aumento

estatisticamente significativo na taxa proliferativa e uma viabilidade celular.

27


REFERÊNCIAS....

5. DISCUSSÃO

De acordo com MURPHY et al. (2013), a engenharia tecidual procura combinar fatores,

como o uso de biomateriais (scaffolds), uma fonte celular e estímulos biofísicos, para permitir a

melhor resposta regenerativa possível.

A literatura tem mostrado efeitos positivos no uso do polímero Poli (ácido láctico) (PLA)

sobre diversos tipos celulares (JAMSHIDI et al., 1988; WELCH et al., 2002; FUKUHIRA et al.,

2006; PRIME et al., 2007; ABDAL-HAY et al., 2013; MEI et al., 2014; MOBASSERI et al.,

2014; STANKEVICH et al., 2015) e no uso do LBI como bioestimulador de diversas linhagens

celulares (STEIN et al., 2005; NÍCOLI et al., 2006; EDUARDO et al., 2008; KIYOSAKI et al.,

2010; RENNO et al., 2010; BARBOZA et al., 2014; MIGLIARIO et al., 2014; ZACCARA et al.,

2015), porém não foi encontrado na literatura nenhum trabalho que combine esses dois fatores

„bioestimulantes‟ e analise a proliferação celular frente a esses parâmetros. Diante disso, este

trabalho procurou analisar o efeito do LBI na proliferação de células MC3T3-E1 cultivadas sobre

o filme de PLA.

Em seus estudos, RICOTTI et al. (2010) analisaram a eficácia no uso de filmes ultrafinos

de PLA na adesão e proliferação de células do músculo esquelético (C2C12). Estes autores viram

que esses filmes são uma boa matriz para adesão, espraiamento, proliferação e diferenciação

inicial destas células. Os resultados do presente estudo corroboram com o encontrado por esses

autores, pois o filme de PLA utilizado se mostrou eficaz para uma boa adesão e proliferação

celular, semelhante à atividade proliferativa das células cultivadas somente sobre os poços da

placa de cultivo.

Ao combinar o uso do LBI com o biopolímero, a proliferação celular observada mostrou-

se crescente nos intervalos de tempo analisados. Estes resultados corroboram com o apresentado

por diversos autores (OZAWA et al., 1998; HAMAJIMA et al., 2003; UEDA & SHIMIZU,

2003; STEIN et al., 2008), onde células de linhagens osteoblásticas, após irradiadas com LBI,

apresentaram um aumento da proliferação e diferenciação celular.

Os efeitos bioquímicos da irradiação com LBI têm sido relacionados ao aumento do

potencial de membrana mitocondrial e, consequentemente, a produção de ATP (KARU et al.,

1995; HU et al., 2007) e geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) (GROSSMAN et al.,

1998; MIGLIARIO et al., 2014). A literatura tem sugerido que esses fatores seriam responsáveis

28


REFERÊNCIAS....

por controlar a proliferação celular, viabilidade, diferenciação e apoptose (ARAKAKI et al.,

2008; MIGLIARIO et al., 2014; CERDEIRA et al., 2016).

Após a irradiação com LBI, OZAWA et al. (1998) demonstraram um aumento na

proliferação celular, formação de nódulo ósseo, aumento da atividade de ALP e expressão de

gene de osteoglicina, conhecido como sendo um fator osteoindutor. Os estudos subsequentes

confirmaram estes resultados, como no trabalho de HAMAJIMA et al. (2003) que analisou que o

LBI estaria aumentando a expressão do gene de osteoglicina; e no estudo feito por UEDA

&SHIMIZU (2003), onde os autores viram que houve um aumento na proliferação celular, na

formação de nódulo ósseo, na atividade da ALP e na expressão do gene de ALP, confirmando a

ação bioestimulatória do LBI. Os resultados apresentados neste trabalho abrem caminho para que

sejam feitos estudos futuros para avaliar se há um aumento na expressão desses fatores mediante

a combinação do PLA com a irradiação com LBI.

Na literatura, há apenas poucos estudos investigando o efeito do LBI na

adesão/proliferação de células cultivadas sobre diferentes biomateriais. Entre os trabalhos

disponíveis, podemos citar o estudo de HSU et al. (2010), onde os autores verificaram que o

efeito do laser (1,18 J/cm²) sobre as células endoteliais cultivadas sobre uma arcabouço poroso

de poliuretano foi positivo. Como o substrato utilizado era poroso, os autores irradiaram as

células antes de cultivá-las sobre o arcabouço. Estes resultados corroboram com o encontrado no

presente estudo, sendo o filme de PLA mais fácil para a aplicação do laser (in vitro), visto que o

laser foi aplicado com as células já sobre o substrato.

Em seu trabalho, RENNO et al. (2010) utilizaram uma dose de 10 J/cm² para avaliar a

proliferação de células pré-osteoblásticas (MC3T3-E1) cultivadas sobre biosilicato, os resultados

mostraram uma diminuição na proliferação celular quando comparado com o grupo não-

irradiado. Os autores sugerem que podem estar havendo uma interferência do biomaterial na

ação do laser, como a refração ou absorção da luz. Corroborando com os autores mencionados

anteriormente, PINTO et al. (2013) também utilizaram um arcabouço de biosilicato e uma dose

de 120 J/cm² para reparar defeitos ósseos em ratos, os resultados mostraram não haver nenhum

efeito extra do laser sobre o processo de regeneração. A possível refração ou absorção da luz

pelo biomaterial utilizado, sugerida por esses autores, parece não acontecer no caso do filme de

PLA, pois obtivemos uma proliferação celular bem maior do que os grupos não irradiados nos

dois primeiros dias de cultivo.

29


REFERÊNCIAS....

Em seu estudo, CHOI et al. (2013) analisaram o efeito do LBI (1 J/cm²) na proliferação

de células-tronco mesequimais cultivadas sobre uma matriz dérmica acelular e verificaram que o

LBI aumentou a sobrevivência e proliferação destas células sobre o biomaterial utilizado, o que

sugere o uso do LBI como uma abordagem clinica interessante na engenharia tecidual.

PARENTI et al. (2013) utilizaram uma dose de 2 J/cm² sobre uma linhagem de células

osteoblásticas (MG63) cultivadas sobre um arcabouço poroso de hidroxiapatita. Os autores não

observaram diferença significativa na proliferação das células irradiadas e não-irradiadas. Esse

resultado pode estar ligado ao fato mencionado por RENNO et al. (2010), onde a luz do laser

pode estar sofrendo refração ou absorção pelo biomaterial, ou pode ter uma relação com o fato

do arcabouço ser poroso e as células não estarem recebendo a irradiação de forma efetiva (HSU

et al., 2010).

Um dos estudos mais recentes envolvendo este tema foi feito por DE VASCONCELLOS

et al. (2016), que investigaram o efeito do LBI, sendo sete aplicações da dose de 4 J/cm² em

quatro pontos diferentes, sobre o processo de cicatrização de defeitos ósseos em ratos que

receberam um implante poroso de titânio. Os resultados se mostraram satisfatórios, pois o LBI

melhorou e acelerou a reparação óssea. Assim, corroborando com o presente estudo, os autores

confirmaram que a utilização da laserterapia se mostra uma ferramenta importante para um

melhor e mais rápido resultado de implantes utilizados na engenharia tecidual.

Estudos futuros envolvendo este tema são necessários para um maior entendimento dos

processos envolvidos. Incentiva-se que as pesquisas futuras explorem a aplicação desta

metodologia in vivo e uso do PLA de diversas formas, seja em blendas ou com modificações

estruturais, de forma a obter a melhor resposta celular para aplicação no ramo da engenharia

tecidual.

30


REFERÊNCIAS....

6. CONCLUSÕES

O biofilme de PLA mostrou-se satisfatório, pois permitiu a adesão das células

MC3T3-E1 a sua superfície, não mostrou efeitos citotóxicos e permitiu a proliferação

celular sobre a sua superfície nos diferentes períodos de tempo avaliados.

Através das fotomicrografias, observamos que as células apresentaram uma atividade

proliferativa satisfatória e crescente, quando irradiadas com o laser.

Após a irradiação com o LBI, as células se mostraram viáveis e com uma crescente

taxa proliferativa nos intervalos de tempo estudados.

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