pràctica transformació

Download Pràctica transformació

Post on 21-Apr-2015

186 views

Category:

Documents

5 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

PRCTIQUES DE BIOTECNOLOGIA

KIT DE TRANSFORMACI BACTERIANAINTRODUCCI La transformaci gentica sesdev quan un bacteri capta i expressa un fragment nou de DNA procedent del medi on viu. En aquesta prctica es transformaran bacteris amb un gen que codifica per la protena verda fluorescent (GFP) que, a la natura, es troba en la medusa bioluminiscent Aequorea victoria. Desprs de la transformaci els bacteris expressen el nou gen recent adquirit i produeixen la protena fluorescent, per la qual cosa brillen sota una lmpada u.v. El gen de la GFP, en la prctica, es troba dins del plasmidi anomenat pGLO, que cont el gen de la GFP i el gen bla. Aquest ltim confereix als bacteris que el contenen resistncia a lantibitic ampicillina. Per tant, els bacteris que han sigut transformats es podran allar afegint ampicillina al medi de cultiu, ja que noms podran crixer els bacteris que tinguin el gen bla. Per activar la transcripci del gen de la GFP, i per tant per poder-ne sintetitzar, sha dafegir al medi, a part de lampicillina, el glcid arabinosa. Si aquest no s al medi, la protena GFP no es sintetitzar. Consideracions prvies a la prctica 1. Normes de seguretat i higiene al laboratori: En qualsevol tcnica microbiolgica s important no introduir bacteris contaminants a lexperiment. Aquests bacteris es troben a les mans, les superfcies de treball... i per tant, cal evitar-ne el contacte amb el material de laboratori. Per aix, no shan de tocar mai amb els dits ni deixar sobre la taula la part circular de les nanses de sembra, les puntes de les pipetes o la superfcie de lagar. A ms, hem de treballar sempre prop del bec bunsen (no sha de sobrepassar mai un cercle de 20 cm de radi al voltant del bec). 2. Utilitzaci de les pipetes: Abans de comenar la prctica s interessant familiaritzar-se amb les graduacions de les pipetes que sutilitzaran i que sn:

PRCTIQUES DE BIOTECNOLOGIA

3. Els bacteris utilitzats: Per a la prctica susaran soques dEscherichia coli no patogniques; no obstant, conv seguir unes mnimes normes dhigiene com: a) Rentar-se les mans abans i desprs de la sessi prctica. b) Utilitzar, si s possible, guants. c) Netejar b les superfcies de treball abans i desprs de la prctica. d) No pipetejar mai amb la boca. e) No menjar, beure ni aplicar-se cosmtics en lrea de treball. f) Utilitzar ulleres protectores, si s possible. 4. Descontaminaci del material Si no es disposa dautoclau, les nanses de sembra, les pipetes... que han estat en contacte amb els bacteris shan de posar en una soluci de lleixiu al 10% recent preparada. El material shi ha de mantenir com a mnim 1 hora. Desprs, el lquid sobrant es pot llenar per la pica i les plaques es poden llenar a les escombraries dins de dues bosses. 5. Medi de cultiu: El medi de cultiu lquid i slid, anomenats respectivament brou nutritiu LB i agar nutritiu LB (de Luria i Bertani), estan preparats amb un extracte de llevat i subproductes de carn digerits enzimticament que aporten glcids, aminocids, nucletids, sals i vitamines necessaris per al creixement bacteri. Lagar, un derivat de les algues, es fon quan sescalfa i forma una gelatina slida quan es refreda, que s molt til com a suport slid per als cultius bacterians.

PRCTIQUES DE BIOTECNOLOGIA

1. PREPARACI DE LA PRCTICA I 1.1 PREPARACI DE LAGAR NUTRITIU

(3 a 7 dies abans)

Les plaques dagar han de preparar-se com a mnim 3 dies abans de lexperiment. Shan de deixar a temperatura ambient 2 dies i desprs cal refrigerar-les fins que shagin dutilitzar. Els 2 dies que les plaques passen a la taula del laboratori a temperatura ambient permeten que lagar sassequi el suficient perqu accepti el lquid de la soluci transformadora que sutilitzar ms endavant. Per preparar lagar cal que facis les operacions segents: 1 2 3 4 5 Posa 500 mL daigua destillada en un erlenmeyer d1 L de capacitat (com a mnim). Afegeix tot el contingut del paquet dagar nutritiu LB. Fes girar el flasc circularment per a dissoldre lagar. Posa lerlenmeyer al microones fins que bulli el seu contingut. Torna a escalfar i remenar lerlenmeyer unes 3 vegades, fins que tot lagar shagi dissolt i no es vegin grumolls girant. Cal anar en compte de deixar refredar una mica el flasc abans de remenar-lo, per evitar que el medi calent bullint vessi sobre la m de qui lest preparant. Quan tot lagar shagi dissolt, deixal refredar fins que lexterior del flasc es pugui agafar b (aprox. 50C).

6

Mentre lagar es refreda, etiqueta les plaques i prepara larabinosa i lampicillina (fes els passos 1.2 i 1.3). Vs amb compte de no deixar refredar massa lagar perqu pot comenar a solidificar-se (a partir dels 27C ho fa).

PRCTIQUES DE BIOTECNOLOGIA

1.2

PREPARACI DE LARABINOSA I LAMPICILLINA

Larabinosa es transporta liofilitzada en un vial petit. Amb una pipeta estril nova, afegeix 3 mL de soluci transformadora directament al vial per rehidratar el sucre. Sacseja b el vial (si pots, amb lajut dun vrtex). Larabinosa triga com a mnim 10 minuts a dissoldres. Lampicillina tamb es transporta liofilitzada en un vial petit. Amb lajut duna pipeta estril nova, afegeix 3 mL de soluci transformadora directament al vial per a rehidratar lantibitic. En tots dos casos sutilitza la soluci transformadora per a la rehidrataci perqu s una soluci estril. Tamb es podria utilitzar aigua destillada estril.

Aquestes dues substncies shauran de barrejar desprs amb lagar. Una calor excessiva (per sobre dels 50C) destruiria lampicillina i larabinosa, per lagar nutritiu es solidifica a 27C aix que cal controlar b el refredament de lagar i desprs abocar-lo a les plaques des del principi fins al final sense interrupci. Lexcs de bombolles pot ser retirat desprs demplenar totes les plaques flamejant breument la superfcie de cada placa amb el bec Bunsen. Quan totes les plaques estiguin plenes no les toquis fins que lagar shagi solidificat. Lagar sobrant sha de llenar a la BROSSA, no a la pica. Asseca tamb qualsevol gota dagar dels costats de les plaques. 1.3 MARCAR LES PLAQUES

Les 40 plaques shan de marcar amb un retolador permanent a la base, prop de la vora de la manera segent: escriu LB a 16 plaques escriu LB/AMP a 16 plaques escriu LB/AMP/ARA a 8 plaques

PRCTIQUES DE BIOTECNOLOGIA

1.4

ABOCA LAGAR NUTRITIU LB A TOTES LES PLAQUES 1r. Aboca lagar nutritiu LB a les 16 plaques marcades amb LB. Apilona les plaques buides en grups de 4 a 8 i, comenant amb la placa del fons, aixeca la tapa i les plaques de sobre amb una m i aboca lagar amb laltra. Omple la placa aproximadament entre 1/3 i (aprox. 12 mL) amb lagar. Torna-la a tapar i continua omplint les plaques del pil en sentit cap amunt del pil. Deixa refredar les plaques apilonades aix. Afegeix lampicillina rehidratada a lagar LB sobrant. Fes girar breument la mescla. Emplena les 16 plaques marcades amb

2n.

LB/AMP utilitzant la mateixa tcnica.

3r.

Afegeix larabinosa rehidratada a lagar sobrant que ja cont ampicillina. Fes girar breument la mescla i aboca-la a les 8 plaques etiquetades amb LB/AMP/ARA utilitzant la tcnica anterior.

PRCTIQUES DE BIOTECNOLOGIA

1.5

EMMAGATZEMATGE DE LES PLAQUES

Desprs que les plaques shagin assecat aproximadament 2 dies a T ambient, es poden utilitzar directament o b ser apilonades de 20 en 20 i tapades amb una bossa de plstic com si fos una funda. La pila sinverteix, es tanca la bossa i les plaques semmagatzemen en posici invertida a la nevera fins que sn utilitzades.

PRCTIQUES DE BIOTECNOLOGIA

2. PREPARACI DE LA PRCTICA II 2.1 REHIDRATACI DELS BACTERIS

(24-36 hores abans)

Utilitzant una pipeta estril rehidrata lEscherichia coli liofilitzada, afegint 250 microlitres de soluci transformadora directament al vial. Torna a tapar el vial i deixa la suspensi cellular a temperatura ambient durant 5 minuts. Desprs sacseja el vial per barrejar-ho b abans de ratllar les plaques inicials LB. Emmagatzema els bacteris rehidratats sobrants de la sembra a la nevera fins a utilitzar-los (temps ideal: 24 hores, com a mxim 3 dies ms tard)

2.2

SEMBRA DE LES PLAQUES INICIALS PER A OBTENIR COLNIES BACTERIANES INDIVIDUALS A LES PLAQUES DAGAR

Cada grup de treball de laboratori necessita la seva placa inicial (starter plate) com a font de cllules per a la transformaci. Aquest kit cont material suficient per a 8 equips destudiants. Les plaques han de ser sembrades per a obtenir colnies individuals i incubades a 37C entre 24 i 36 hores abans de lactivitat de transformaci. Utilitzant lEscherichia coli rehidratada que sha preparat al darrer pas i 8 de les plaques marcades amb LB, cal sembrar per esgotament una placa inicial per a cada equip de treball. Aquest tipus de sembra es realitza ratllant suaument la placa amb una nansa, i lobjectiu s aconseguir generar colnies individuals de duna suspensi concentrada de bacteris. Una quantitat diminuta de la suspensi bacteriana pot generar moltes colnies. En condicions favorables, una cllula es multiplica i norigina milions de genticament iguals en noms 24 hores. Hi ha milions de bacteris individuals en una colnia d1 mm. El procediment pas a pas est a continuaci:

PRCTIQUES DE BIOTECNOLOGIA

1r

Introdueix la nansa de sembra al cultiu bacteri rehidratat. Fica la nansa directament al vial, sense inclinar-lo. Extreu la nansa i ratlla les plaques segons la illustraci. La ratllada es fa en 4 quadrants, un rere laltre. La primera ratllada noms serveix per a estendre les cllules una mica. Mou la nansa endavant i endarrere unes 12 vegades a cadascuna de les rees mostrada. En els quadrants segents les cllules es dilueixen ms i ms, augmentant la probabilitat de produir colnies individuals.

2n

Lobjectiu de les segents ratllades s utilitzar el mxim possible de la superfcie de la placa. Gira la placa uns 45 (per una major comoditat en la ratllada) i comena la 2 ratlla