MUTACIONES

¿Cómo surgen las variantes genéticasen la naturaleza?

Mutación: Proceso por el que un gen cambia de una forma alélica a otra.

Mutación versus Reversión

Las mutaciones pueden generar:

Pérdida de función

Ganancia de función

Las mutaciones pueden afectar:

Región promotora

Región codificante

En organismos diploides las mutaciones de pérdida de función generalmente son

recesivas

Mutaciones en la región reguladora de un gen pueden provocar pérdida o ganancia de función

A nivel del ADN las mutaciones pueden ser originadas por:

Sustituciones Transiciones : A G (purinas) ; C T (pirimidinas) Transversiones: purina pirimidina

Inserciones

Deleciones

Impedimento físico

A nivel de la proteína las mutaciones pueden ser:A) Mutación silenciosa (AGG -> CGG ambos determinan Arg)

B) Mutación de cambio de sentido - Sinónima (AAA Lys -> AGA Arg ambos aa básicos) - No sinónima (UUU Phe hidrofobico -> UCU Ser polar)

C) Mutación sin sentido (CAG Gln -> UAG Stop)

D) Mutación de cambio del marco de lectura (o de cambio de fase)

E) Reversiones - Exacta (AAA Lys -> GAA Glu -> AAA Lys) - Equivalente (UCC Ser -> UGC Cys -> AGC Ser) (CGG Arg -> CCC Pro -> CAC His)

GCU GCUGCUGCUGCUGCUAla Ala Ala Ala Ala Ala

Silvestre

GCU GCU

Ala Ala Ser Cys Cys Cys

AGC UGC UGC UGC

A

Inserción

GCU GCUGCUGCUAla Ala Ala Ala Leu Leu

CUG CUG

G

Deleción

Mutaciones de cambio en el marco de lectura

Las mutaciones se producen en forma:

Inducida: Agentes mutagénicos

* Biológicos* Físicos* Químicos

Espontánea: Causas: * Errores en la replicación (fidelidad ADN pol, tautomeri- zación de bases)

* Lesiones espontáneas (Deaminación)

Las mutaciones se producen en el ADN y se heredan a las células hijas durante la división celular

Mecanismos que aseguran la fidelidad de la ADN polimerasa

Tautomerización

Emparejamiento normal entre las formas “ceto” (y “amino”) de las bases

Emparejamientos erróneos causados por las formas tautoméricas raras de las bases

Tautomerización de bases

Ejemplo de transición provocada por la aparición de la forma enol de G durante la replicación

Deaminación

Además:Deaminación de G -> xantina, bloquea la replicación (no mutagénica)Deaminación de A -> hipoxantina, empareja con C en lugar de T

Agente Efecto en células vivas

Carcinogénico Causa cáncer (transformación neoplásica de células eucarióticas)

Clastogénico Causa fragmentación de cromosomas

Mutagénico Causa mutaciones (puede producir todos los otros efectos)

Oncogénico Induce a la formación de tumores

Teratogénico Produce anormalidades en el desarrollo

Mutágenos

Físicos

Radiación UV, Rayos X

Químicos

Análogos de bases (5-bromo uracilo, 2-aminopurina)

Agentes intercalantes (naranja de acridina)

Agentes alquilantes (etilmetanosulfonato, nitrosoguanidina)

Biológicos

Transposones, virus

TransposonesSecuencia de inserción

ADN receptor

TC CTCTGCC AGGAGACGG

TC CTCTGCC AGGAGACGG

TC CTCTGCC AGGAGACGG

Transposasa

Secuencia de inserción

Repeticiones terminales invertidas

Mecanismos de acción generales de los mutágenos físicos y químicos:

a) Sustitución de bases

b) Modificación de bases

c) Agentes intercalantes

d) Impedimento físico

Mecanismo de sustitución de bases

5-Br-uracilo

2-aminopurina

(enol)

Mecanismo de modificación de bases

Mutágenos del tipo agentes intercalantes

Fotoproductos generados por la luz UV

Impedimento físico: formación de aductos

Mutación somática versus mutación germinal

Mecanismos de reparación

Reversión del daño

* Fotorreparación * Ligamiento de rupturas simple hebra

Remoción del daño

* Reparación por escisión de bases * Reparación de “mismatch”

Tolerancia al daño

* Reparación por recombinación * Reparación mutagénica

Reparación de fotodímeros de pirimidina por fotoliasa y luz blanca

ADN ligasa sella los enlaces fosfodiester interrumpidos

La glicosilasa remueve la base dañada, el sitio AP es reconocido por una endonucleasa y, ayudada por una exonucleasa escinde un fragmento de ADN que es rellenado por ADNpol I y sellado por la ligasa

¿Cómo identifica la célula la hebra recién sintetizada para saber cuál es, probablemente, la base “mutante” en un mal apareamiento?

Escisión frente a un aducto

Reparación mutagénica

Fenotipos mutantes

A) Mutaciones morfológicas

B) Mutaciones letales

D) Mutaciones condicionales

C) Mutaciones bioquímicas

El fenotipo de un individuo es una consecuencia de la interacción entre sus genes y la secuencia histórica de las condiciones ambientales a las que ha estado expuesto.

Mutaciones

Mutagénesis como herramienta de mejoramiento genético de

microorganismos

Mejoramiento genético

Simple selección

Variabilidadintra-específica

Manipulación genética

Mutagénesisal azar yselección

Mutagénesissitio dirigida

Objetivo de la biotecnología de microorganismos

Cepas altamente productoras:

EJEMPLO: Ruta de biosíntesis del -caroteno

GGPP

Prefitoeno pirofosfato

Fitoeno

Licopeno

-caroteno

Fitoeno sintetasa

Fitoeno desaturasa

Licopeno ciclasa

Genes!!!!!

Ejemplos de mutaciones que pueden inducir a la sobreproducción de un producto (deseable en biotecnología):

Mutación de una secuencia reguladora en cis

Mutación del gen que codifica para un elemento regulador en trans

Represor

Factores de transcripción generales

Elementos reguladores en transo factores de transcripción específicos

Oscuridad por 24 h

Dilución seriada

Plaqueo en medio sólido

Conteo de coloniasDeterminación del tiempo de exposición que provoca 95 a 99% de mortalidad

Estandarización de las condiciones de mutagénesis

Cultivo enfase exponencial

Fuente UV(254 nm)

Oscuridad por 24 h

Dilución seriada

Mutagénesis y selección

Plaqueo en medio sólido

Clones seleccionados

Re-chequeo

CaracterizaciónDeterminar la fijación de la mutación

Control Condición de selección

Clones mutantes de Tetraselmis suecica sometidos a selección en presencia de Cerulenina, un inhibidor de la síntesis de ácidos grasos

Control Cerulenina 2 g/ml

Mutantes potencialmente mejorados en su capacidad de acumular PUFAs