funtamentos e medotos para analises de aminoacidos

Revista Eletrnica Nutritime, v.4, n 2, p.395-404, Maro/Abril 2007.

Revista Eletrnica Nutritime

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Artigo Nmero 42

FUNDAMENTOS E MTODOS PARA ANLISE DE AMINOCIDOS

Wagner Azis Garcia de Arajo1; Flix Incio de Assis Jr2 ; Gabriel Fonseca Sobreira3

Introduo

Com a utilizao crescente do conceito de protena ideal para a preparao de

raes para no ruminantes, demandou-se o conhecimento do perfil aminoacdico dos alimentos utilizados como fontes proticas. Atravs deste conhecimento tornou-se possvel uma adio mais exata dos aminocidos sintticos comercializados atualmente.

A Qumica Analtica compreende o conjunto de tcnicas e medidas que visam caracterizar a natureza e determinar a composio de amostras de diferentes origens, em termos de elementos, espcies, ou agrupamentos de tomos ou molculas.

A crescente demanda da sociedade por produtos de origem animal, a tipificao e disponibilidade de novos alimentos e tecnologias, e os avanos na informtica e computao tm proporcionado o desenvolvimento de programas para o clculo de raes. Porm, o desenvolvimento e a atualizao dos clculos de rao no tm sido acompanhados de atualizao similar na qualidade dos dados que sustentam os programas (Scapim et al., 2003).

De acordo com Garrido (1996), um ponto crtico da aplicao prtica de conhecimentos cientficos gerados no campo da nutrio animal o controle analtico de alimentos e produtos. Por isso, torna-se necessrio o desenvolvimento de tcnicas rpidas e sensveis que vo alimentar os bancos de dados (Saliba et al., 2003).

Quase todas as propriedades fsico-quimicas caractersticas de um determinado elemento ou substncia podem servir de base para se estabelecer um mtodo analtico instrumental, seja ele qualitativo ou quantitativo. A emisso ou absoro de luz em diferentes regies do espectro eletromagntico, as propriedades trmicas e eltricas, como condutividade de solues ou potenciais redox e outras propriedades tm sido usadas na anlise quantitativa, desde que se possa relacionar a propriedade medida com a concentrao do analito.

Mtodos tradicionais de anlise incluem procedimentos qumicos utilizados para separar os nutrientes em questo e mensurar o montante destes em uma dada quantidade nos alimentos. Os mtodos tradicionais so trabalhosos, demorados e produzem resduos txicos. Assim, este trabalho visa apresentar alguns aspectos bsicos sobre alguns dos mtodos e tcnicas alternativos mais utilizados na determinao de aminocidos. Mtodos utilizados Dentre os mtodos utilizados para a avaliao do contedo aminoacdico das amostras destacam-se:

1. A Cromatografia Inica. 2. A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC) 3. Espectroscopia de Refletncia do Infravermelho Prximo (NIRS)

1 Zootecnista, Professor e Pesquisador da EPAMIG, Mestrando em Nutrio de Monogstricos, UFV. 2 Zootecnista, Mestre em Nutrio de Monogstricos, UFV. 3 Zootecnista, Mestrando em Nutrio de Ruminantes, UFV.



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Introduo Cromatografia

A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura, realizada atravs da distribuio destes componentes entre duas fases, que esto em contato ntimo. o mtodo analtico usado para separar, detectar e quantificar uma grande quantidade de compostos. Ultimamente esta tcnica vem sendo utilizada intensivamente na qualificao e quantificao de aminocidos na anlise de alimentos.

Os termos cromatografia, cromatograma so atribudos ao botnico russo Mikhael Semenovich Tswett, que utilizou estes termos em dois trabalhos descrevendo suas experincias na separao dos componentes de extratos de folhas e gema de ovo em 1906. Porm, apenas na dcada de 30 Kuhn e Lederer redescobriram e aperfeioaram a cromatografia em coluna, repetindo as experincias de Tswett separando e identificando as xantofilas da gema do ovo, usando uma coluna recheada de carbonato de clcio e ter de petrleo como fase mvel. A cromatografia por troca inica tambm teve incio na dcada de 30, com Adams E Holmes, que sintetizaram as primeiras resinas de troca inica, baseadas em fenol e formaldedo. As resinas de poliestireno-divinilbenzeno, atualmente empregadas em anlise bioqumica, foram inicialmente utilizadas por COHN na separao de aminocidos e cidos nuclicos. Esta tcnica de separao de aminocidos foi aperfeioada por Moore e Stein em 1958, utilizando uma bomba peristltica para empurrar a fase mvel e um fotmetro para deteco, aps reao para produzir os derivados com ninhidrina. Esta tcnica ainda foi melhorada por Hamilton e Andrews, com a introduo de uma bomba tipo pisto, similar s utilizadas hoje em Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE ou HPLC).

Princpios da Cromatografia O princpio da separao cromatogrfica de uma mistura baseia-se nas

diferenas de velocidade de transporte das substncias individuais quando dissolvidas em um lquido ou gs (fase mvel) que flui atravs de um determinado meio (fase estacionria). Uma substncia com maior afinidade pela fase estacionria ir fluir mais lentamente que as outras. As caractersticas das fases mvel e estacionria, do analito na fase mvel, do meio que serve como fase estacionria e a dinmica de fluxo determinam a velocidade e preciso com que determinadas substncias sero separadas.

As tcnicas cromatogrficas abrangem vrios mtodos de separao com uma caracterstica comum: os componentes de uma mistura so distribudos em duas fases, sendo uma estacionria (fixa) e uma mvel, que flui sobre a primeira, resultando em migrao diferencial dos componentes da amostra. A fase estacionria pode ser lquida ou slida e a fase mvel pode ser lquida ou gasosa. A cromatografia pode servir para analisar gases e ons inorgnicos; aminocidos, acares, gorduras, vitaminas, drogas, hormnios e macromolculas (protenas, polissacardeos, cidos nuclicos e vrus solveis).

H vrios mtodos de cromatografia e, por conseguinte vrias classificaes, porm, na anlise de aminocidos so utilizadas as tcnicas de cromatografia em coluna. A fase mvel percorre uma coluna oca preenchida com uma resina composta de partculas microscpicas. O material a ser separado atravessa a coluna levado pelo fluxo da fase mvel e devido ao equilbrio diferencial entre as duas fases (estacionria e mvel) h separao de seus componentes. O material sai pela extremidade terminal da coluna e coletado em alquotas para anlise posterior. Na anlise de aminocidos so utilizadas basicamente a Cromatografia de Troca Inica e a mais atual Cromatografia lquida de Alto Desempenho.



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Preparo da Amostra

Os aminocidos na maioria das situaes laboratoriais apresentam-se na forma polipeptdica (protenas e peptdeos). Para haver a individualizao dos monmeros necessrio que haja o preparo da amostra antes de inseri-la na coluna cromatogrfica.

Inicialmente deve-se proceder a moagem (1 mm), e subseqentemente desengorduramento (1 mL de ter etlico, repetido 3 vezes), para ento haver a liberao dos aminocidos das amostras com os seguintes processos: hidrlise cida, hidrlise bsica e oxidao, em funo dos aminocidos a serem quantificados.

O peso da amostra varia em funo do tipo de hidrlise e teor de protena bruta do material a ser analisado, variando de 200 a 500 mg. Hidrlise cida: Este tipo de processo recomendado para a determinao da maioria dos aminocidos excetuando-se o Triptofano que completamente destrudo, sendo recomendado outro tipo de processamento. utilizado para este tipo de hidrlise o HCl (cido clordrico) a uma concentrao de 6 N, colocada (a amostra) em estufa a 110 C, por 24 horas. Hidrlise bsica: Esta a hidrlise ideal para o Triptofano devido sua boa estabilidade durante o processo. Para este processo utiliza-se o LiOH (hidrxido de ltio) a uma concentrao de 4 N, colocada em estufa a 110 C, por 22 horas. Oxidao: Ao determinar a concentrao da cistina e da metionina de peptdeos, normalmente feita a oxidao para cido cistico e metionina sulfnica, respectivamente, por meio de tratamento com cido perfrmico em excesso, que posteriormente ser destrudo ao se adicionar o cido bromdrico. Utiliza-se 9 mL de cido frmico a 88% e 1 mL de perxido de hidrognio (gua oxigenada) a 30%. Aps repouso em temperatura ambiente durante 60 minutos, colocar em banho de gelo e utilizar imediatamente.

Cromatografia por Troca Inica Neste tipo de cromatografia a fase estacionria altamente carregada (positiva ou negativamente), sendo que solutos com cargas e sinais contrrios a esta so seletivamente adsorvidos da fase mvel. Os solutos adsorvidos podem ser subseqentemente eludos (voltam soluo), por deslocamentos de outros ons com maior afinidade pela fase estacionria. Desta forma, os diferentes graus de afinidade eletrosttica entre o trocador (fase estacionria) e os ons da fase mvel regem este tipo de cromatografia. Esta diferena de afinidade entre os ons da fase mvel e a matriz devido s diferenas de cargas, sendo possvel control-la (a afinidade) utilizando fatores como o pH e a fora inica. O pH influencia no estado de ionizao dos aminocidos. De modo que ao se aproximar dos valores pH prximos ao ponto isoeltrico destes, eles se desprendem da fase estacionria e so eludos para a fase mvel da coluna cromatogrfica. A matriz de um trocador constituda de um material poroso, natural ou sinttico, inerte, insolvel em gua e em solventes orgnicos, apresentando ligaes covalentes a grupos trocadores inicos. Quanto ao material so classificadas de orgnicas ou inorgnicas, naturais ou sintticas, e dependendo do grupo trocador ligado covalentemente matriz so classificados em aninicos ou catinicos. Por serem mais eficientes geralmente so empregadas resinas orgnicas sintticas altamente polimerizadas, como as resinas sulfonadas produzidas pela condensao de fenis com formaldedo.



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Resumidamente, o processo de separao realizado pela tcnica pode ser descrito da seguinte forma: inicialmente o trocador inico (fase estacionria) est em equilbrio com o eluente inicial (soluo inicial) contendo determinados ons ligados fracamente a esta fase. Adiciona-se ento a amostra pr-tratada com os aminocidos na forma livre, estes aminocidos tm maior afinidade pelo trocador inico e se ligam a este deslocando ons da soluo eluente inicial. Aps esta etapa so adicionados seqencialmente vrios eluentes (solues), com determinados ons de afinidade um pouco maior pelos grupos trocadores da matriz, desprendendo gradualmente os aminocidos com cargas. Aps a separao, a coluna cromatogrfica regenerada, adicionando a soluo eluente inicial num volume de 5 a 10 vezes superior sua capacidade de reteno do on (presente no eluente), para compensar a baixa afinidade deste em comparao com os que esto adsorvidos ao trocador. Um detalhe neste tipo de cromatografia se refere ao tempo de durao. A fora inica pode ser variada (em funo da concentrao de ons no eluente) para se obter uma eluio mais lenta ou mais rpida dos aminocidos. Aumentando a fora inica aumenta-se a competio e reduz a interao entre o grupo trocador e as substncias-amostra (aminocidos neste caso), que desta forma so eludas.

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia. A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia, CLAE ou HPLC (High Performance Liquid Chromatography) o mais importante membro de uma famlia inteira de tcnicas de separao. A HPLC utiliza instrumentos sofisticados que podem ser totalmente automatizados.

um tipo de cromatografia lquida que emprega pequenas colunas recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase mvel que eluda sob alta presso. Por este motivo tambm chamada de Cromatografia Lquida de Alta Presso. Este tipo de cromatografia tem a capacidade de realizar separaes e anlises quantitativas de uma gama de compostos presentes em vrios tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos com alta resoluo, eficincia e sensibilidade.

Inicialmente a matriz utilizada na HPLC foi a de estireno cruzado com divinilbenzeno, devido a sua multifuncionalidade e eficincia. No entanto, estas resinas tm a desvantagem de possurem baixa resistncia deformao sob alta presso, e por dificultarem a difuso das molculas da substncia-amostra para o interior do trocador. Devido a este fato, a matriz utilizada atualmente rgida revestida por este material de estireno-divinilbenzeno, ou silicone, ou ainda de fluorcarbono e derivatizado (modificado, formando uma espcie de composto misto) com grupos trocadores sulfnicos ou amnio quartenrio.

A diferena desta cromatografia de alta eficincia para as demais cromatografias lquidas (como a inica) devido maior automatizao do processo. Na CLC (Cromatografia Lquida Clssica) o recheio da coluna feito uma vez para cada separao (porque parte da amostra adsorvida de forma irreversvel ao trocador), esta repetio representa um desperdcio enorme de material e de mo de obra. A vazo do eluente na CLC promovida pela ao da gravidade e as fraes individuais da amostra so coletadas manualmente ou atravs de um coletor de fraes. Demandando desta maneira mais tempo e custos. Na HPLC emprega-se uma coluna fechada e reaproveitvel, portanto centenas de separaes individuais podem ser realizadas com a mesma coluna. Outra caracterstica o sistema de alta presso (at 400 bars) que fazem a fase mvel migrar com uma velocidade razovel atravs da coluna. A vazo da fase mvel controlada resultando desta forma em resultados mais reproduzveis, precisas e de maior valor cientfico. A injeo da amostra tambm precisa e rpida utilizando uma



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micro seringa de presso (at 50 bar) ou utilizando uma vlvula de injeo para os equipamentos mais modernos.

A anlise quantitativa pela HPLC pode atingir uma preciso superior a 0,5%. Desta forma a anlise qualitativa e quantitativa levada a um alto nvel de reprodutibilidade, exatido e preciso.

Ps-Coluna Aps a passagem pela coluna, para ser realizada a leitura pelo detector espectrofotomtrico necessrio que haja uma reao com um corante especfico. O corante geralmente mais utilizado a ninhidrina, numa soluo de 1:1 tampo de ninhidrina e citrato de sdio. Em relao aos detectores necessrio que a instrumentao apresente uma srie de caractersticas desejveis. Para um detector ideal poderamos listar: alta sensibilidade e baixo limite de deteco; resposta rpida a todos os solutos; insensibilidade a mudanas de temperatura e na vazo da fase mvel; resposta independente da fase mvel; pequena contribuio ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do detector; resposta que aumente linearmente com a quantidade de soluto; no destruio do soluto; segurana e convenincia para uso; e informao qualitativa do pico desejado. Infelizmente no existem detectores com todas as caractersticas, mas os detectores atuais procuram abranger a maior parte delas. Existe uma srie de detectores no mercado atualmente, os mais utilizados so: espectrometria UV-visvel, fluorescncia, por ndice de refrao, eletroqumico (eletrodo de Hg gotejante), condutibilidade eltrica.

Problemas na determinao de aminocidos A anlise nem sempre se mostra exata e precisa para todos os casos e para todos os aminocidos a serem determinados. Para os aminocidos cistina (cistena), prolina, serina, treonina, metionina, triptofano, asparagina e cido glutmico (glutamato) ocorrem perdas de at 30%. Prolina e serina em meio cido reagem com gua formando hidroxilamina que pode ser confundida com alanina. Cistina (cistena) na presena de oxignio em meio cido formam um complexo cistena-cistina-cido cistico, alm de formarem pontes de enxofre no permanecendo na forma livre necessria para a anlise. Para evitar este tipo de evento necessrio converso para cido cistico e minimizar a presena de oxignio. Outro caso de influncia do oxignio na determinao da metionina, ocorrendo a formao de complexos sulfnicos ou sulfxidos. Para a eliminao do oxignio realizado o tratamento a vcuo com nitrognio gasoso puro, ou protegida (a metionina) com fenol a 1%. NIRS Espectroscopia de Reflectncia do Infravermelho Prximo

A espectroscopia do infravermelho prximo (Near Infrared Reflectance

Spectroscopy - NIRS) um mtodo rpido e no destrutivo de anlise que requer mnima preparao de amostra para anlise. Este mtodo foi utilizado primariamente para predizer o valor nutritivo de forragens em 1976. O mtodo NIRS foi aprovado pelo AOAC (Worldwide Confidence in Analytical Results) como mtodo de mensurao de matria seca, teor de nitrognio total e fibra em detergente cido. Laboratrios de anlise de forragens, nos EUA e Europa, tm utilizado o NIRS para realizar anlises de rotina em fenos, silagens e gros, avaliando os teores de protena bruta, FDN, FDA, Ca, P, K e Mg. A preciso do mtodo NIRS dependente da calibrao realizada a partir de amostras representativas da populao e do mtodo tradicional utilizado para tal calibrao.



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O infravermelho prximo definido como a parte do espectro eletromagntico situado entre 700 e 2500 nm. A tecnologia NIRS se baseia na existncia de relaes entre as caractersticas fsicas, qumicas e sensoriais de um produto e a absorbncia a comprimentos de onda especficos na regio do "infravermelho prximo". Consiste em essncia na emisso de um feixe de luz sobre a amostra, a qual em funo de sua composio, ou melhor, da natureza das ligaes, absorver uma determinada quantidade de energia em cada um dos comprimentos de onda. Posteriormente, estes dados so utilizados para determinar parmetros de qualidade de um produto tais como composio qumica, propriedades fsicas, caractersticas sensoriais, nveis microbiolgicos, etc.

A base do sistema NIRS a determinao da reflectncia em comprimentos de onda especficos dentro da faixa do infravermelho prximo (750 2500 nm) e relacionar o grau de reflectncia a um composto ou elemento especfico. Os comprimentos de onda do infravermelho prximo so absorvidos principalmente por:

Ligaes C-H - comuns em carboidratos; Ligaes N-H - comuns em protenas, amidas, e aminocidos; Ligaes O-H - comuns em molculas de gua.

Se o comprimento de onda da radiao for compatvel com a freqncia de rotao ou vibrao da ligao qumica dentro de um composto em particular, ele absorvido.

Procedimentos estatsticos so utilizados para correlacionar a reflectncia de um ou mais comprimentos de onda ao verdadeiro nvel de um composto ou nutriente mensurado por um mtodo de calibrao. A equao de regresso desenvolvida para estimar a quantidade de um composto ou nutriente baseado no poder de reflectncia destes comprimentos de onda. Esta equao ento inserida em um software utilizado pelo NIRS para futuras anlises, sem que o uso dos mtodos qumicos seja necessrio novamente para aquele mesmo alimento, por exemplo.

Porm, a produo de equaes estatsticas significantes e com alto grau de correlao (R>0,90) no tem sido comum para nutrientes que no o N (nitrognio). Ento, sempre so relacionados, indiretamente, comprimentos de onda refletidos a um nutriente ao invs de se fazer relaes diretas entre estes. Isto resulta em mais baixas correlaes entre os valores dos nutrientes encontrados pelo NIRS (com exceo de N) em comparao aos valores das anlises de compostos orgnicos alcanados por anlises laboratoriais tradicionais, que normalmente exibem coeficientes de correlao de determinao altos (R2 >0.95), porque eles esto diretamente envolvidos s ligaes C-H, N-H e O-H.

A anlise quantitativa implica no desenvolvimento de equaes de calibrao, mediante estabelecimento de relaes matemticas entre os valores espectrais e dados obtidos por um mtodo de referncia. Por exemplo, o uso de uma determinada tecnologia de controle de qualidade instantnea permite ao setor de fabricao das raes a caracterizao (% umidade, % protena, % gorduras, % fibra, etc.) tanto de matrias-primas como do produto final.

A tecnologia NIRS, frente a outros tipos de tcnicas de anlise, apresenta numerosas vantagens destacando fundamentalmente sua rapidez, versatilidade, e sobretudo, por sua economia, j que possibilita importante diminuio nos custos analticos para as empresas.

O sucesso dessa tcnica depende da especificidade e concentraes dos analitos, preciso do mtodo convencional utilizado na calibrao e do grau com o qual as amostras escolhidas para a calibrao representam populao a ser predita. Os aparelhos corretamente calibrados so capazes de realizar rapidamente muitas



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determinaes ao mesmo tempo. Os maiores problemas do mtodo NIRS incluem o alto custo de maquinrio de espectroscopia de alta preciso, dependncia de mtodos laboriosos e muitas vezes inexatos para monitorao dos procedimentos, alm da falta de sensibilidade para constituintes menores. Os avanos no desempenho dos instrumentos aumentaram a preciso espectral e a consistncia entre as informaes entre diferentes aparelhos. Softwares mais avanados aumentaram a produo de dados a partir do espectro, aumentaram o entendimento dos operadores quanto s limitaes das equaes de calibrao e habilidade para monitorar os resultados analticos de instrumentos em locais remotos, atravs da rede NIRS.

O NIRS oferece a melhor forma de reduzir o custo de anlises e de prover resultados mais rpidos e confiveis. Estudos prvios demonstraram que o NIRS pode ser usado para mensurar os teores de aminocidos em gros grosseiramente modos, mas existe uma grande necessidade das indstrias de raes em determinar se isto poderia ser feito com gros inteiros, o que seria de extrema importncia para anlise de recepo de gros nas fbricas de raes.

O NIRS pode predizer o contedo de protena bruta de forma mais confivel do que equaes de regresso. Devido ao baixo custo operacional (por amostra) e rapidez as anlises com o mtodo NIRS possibilitam a anlise de muitas amostras. Isto possibilita melhorar a preciso na formulao de raes e obter melhor qualidade destas e custos de produo mais baixos. Mtodos Alternativos de Determinao Alm dos mtodos supracitados, ainda existem outros tipos de avaliao do contedo aminoacdico das amostras. Estes mtodos exigem um nvel menor de tecnologia e ainda apresentam a vantagem de serem de menor custo, entretanto, ainda carecem de preciso e exatido.

Eletroforese capilar

A eletroforese uma tcnica baseada na diferena de velocidade (e, portanto na mobilidade) ao ser submetido ao de um campo eltrico. Esta tcnica foi introduzida por Tiselius em 1937 com a finalidade de separar protenas, onde se observou que ao se colocar uma mistura de protenas dentro de um tubo cheio de soluo tampo e aplicado um campo eltrico, cada protena migrava de forma distinta. A atual Eletroforese Capilar (CE) possibilita anlises com alta eficincia e resoluo, rpidas e necessidades mnimas de solventes e amostra. A separao por eletroforese obtida pela migrao diferencial de solutos (aminocidos, no caso) num campo eltrico dentro de tubos capilares muito finos (dimetro entre 25 e 75 m) preenchidos com soluo tampo. A migrao dos componentes a serem analisados diferenciada em funo da sua carga, com a velocidade diretamente proporcional carga, e do seu raio (tamanho da molcula) com a velocidade inversamente proporcional ao seu tamanho. A alta resistncia eltrica dos capilares permite a aplicao de campos eltricos muito altos (de 100 a 500 Volts/cm) com uma gerao de calor mnima, em funo da grande razo rea:volume do capilar que dissipa eficientemente o calor gerado. A introduo da amostra (pr-preparada) feita na prpria soluo tampo (uma soluo especfica para cada aminocido que se queira analisar, semelhante cromatografia de troca inica), sendo a leitura realizada dentro dos capilares atravs de detectores semelhantes aos da HPLC como os de espectrometria do UV-visvel e por fluorescncia.



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Mtodos biolgicos de determinao de aminocidos Os mtodos biolgicos de determinao ao contrrio dos mtodos qumico-analticos, apenas podem ser utilizados para a determinao da biodisponibilidade de aminocidos considerados essenciais aos organismos. Tais mtodos ainda podem ser divididos em biolgicos e microbiolgicos, onde nos primeiros so utilizados organismos mais complexos na tcnica (como ratos e camundongos de laboratrio), e no segundo so utilizados organismos unicelulares.

Mtodos microbiolgicos ensaios com microorganismos Trs exigncias bsicas devem ser satisfeitas para a aplicao de mtodos microbiolgicos na quantificao de aminocidos. Deve haver a existncia de um microorganismo para qual o aminocido analisado seja indispensvel, que o crescimento do microorganismo em reposta concentrao do aminocido seja linear, e ainda que haja um mtodo adequado para medir a resposta de crescimento do microorganismo em funo da concentrao do aminocido no meio de cultura. No meio basal de desenvolvimento deve haver excesso de todos os nutrientes exigidos pelo microorganismo, exceto o aminocido que se deseja pesquisar. Em seguida construda uma curva-padro de crescimento em que o aminocido essencial adicionado em quantidades crescentes. Para a confeco da curva de crescimento podem se utilizar os seguintes indicadores como medida do desenvolvimento do microorganismo: volume ou peso das clulas formadas durante o perodo de incubao, contagem do nmero de clulas por unidade de volume da suspenso, medida da turbidez do meio de cultura, ou ainda a concentrao de um metablito qualquer do microorganismo. Tendo-se a curva-padro, pode-se determinar a concentrao do aminocido em questo em uma amostra que se queira analisar. As bactrias mais utilizadas neste mtodo so a Streptococcus zynogenes, que utilizada na determinao de arginina, histidina, leucina, isoleucina, metionina, triptofano e valina; e Streptococcus faecalis, utilizada na determinao de lisina e treonina.

Mtodos biolgicos ensaios com animais Este tipo de procedimento bastante semelhante ao ensaio microbiolgico. Na rao base da tcnica necessrio que haja o fornecimento de alimentos ricos em todos (ou a maioria) dos nutrientes e pobres no aminocido que se deseje estudar. Desta forma construda uma curvapadro adicionando doses crescentes deste aminocido livre (na forma L) dieta base. Para a confeco da curva-padro de lisina biodisponvel em qualquer material pode-se utilizar como fonte de protena na dieta base o glten de milho e glten de trigo. Para triptofano podem-se utilizar misturas de gelatina e zena (protena do milho), ainda para triptofano e metionina pode ser utilizada a casena oxidada com cido perfrmico, destruindo completamente o triptofano e transformando a metionina em sulfonada na forma indisponvel. Em comparao com o ensaio microbiolgico os biolgicos utilizando cobaias (ratos) so mais demorados e exigem maior infra-estrutura e maior quantidade de ingredientes e mo de obra, conseqentemente aumentando o seu custo.



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Consideraes Finais

As anlises instrumentais de aminocidos vieram atender uma demanda antiga de vrios pesquisadores, possibilitando avaliar os valores destes componentes nos alimentos de forma rpida, precisa e exata.

So indiscutveis os avanos que esses mtodos trouxeram anlise de alimentos. No s a rapidez e a economia de mo-de-obra, mas tambm a reduo da poluio ambiental e reduo nos gastos com reagentes. Mas apesar deste fato, alguns pontos devem ser levados em considerao quando da aquisio desse tipo de maquinrio de anlise.

O custo desse tipo de maquinrio (sejam cromatgrafos mais modernos HPLC - ou mesmo a aparelhagem do sistema NIRS). Alm do alto custo de aquisio, esses aparelhos demandam uma mo-de-obra especializada, tanto na operao do equipamento quanto em sua manuteno. Esse fato pode inviabilizar a aquisio desse tipo de maquinrio, visto que as peas internas de um equipamento de HPLC, por exemplo, podem chegar casa de algumas centenas de dlares. Outro problema so as possveis falhas na alimentao desses aparelhos com dados viciados, no caso do NIRS, ou com informaes no mnimo duvidosas, como o caso dos analitos ps-digesto/oxidao, no caso da cromatografia.

Esse tipo de aparelhagem capaz de fornecer respostas satisfatrias, desde que respeitadas suas limitaes, e seriam interessantes no setor de recepo de fbricas de raes, visto que com a calibrao bem feita, com o auxlio desse tipo de aparelhagem possvel que se evite o uso de insumos de qualidade inferior evitando, desta forma, problemas posteriores advindos do consumo de raes problemticas. Referncias Consultadas BARTON II, F. E., Theory and Principles of Near Infrared Spectroscopy. Spectroscopy Europe. V. 14, N 1, p. 12-18, 2002 BLATT, C. Evoluo da Eletroforese Capilar. Anais Seminrio sobre Anlise de Aminocidos em Alimentos e outros Materiais Biolgicos, 1994. CAMPESTRINI, E. Utilizao de Equipamento NIRS (Near Infrared Reflectance Spectroscopy) nos Estudos de Valores Nutricionais (Composio Qumica e Digestibilidade) de Alimentos para No Ruminantes. Revista Eletrnica Nutritime, v.2, n5, p.235-246, setembro/outubro 2005. Retirado de em 18/11/2005. COLINS, C. H. Princpios Bsicos de Cromatografia. Instituto de Qumica da Universidade Estadual de Campinas,1994. CORASSA, A.; MAGALHES, S.; COSTA, L. F.; BRITO, C. O. Procedimentos Prticos para Anlise de Aminocidos. In: Determinao de Protena em Alimentos para Animais. Mtodos Qumicos e Fsicos. Editora UFV. 2005. FONTAINE, J., SCHIRMER, B., HORR, J prediction of essential amino acid contents. 2. Results for wheat, barley, corn, triticale, wheat bran/middlings, rice bran, and sorghum. Retirado de em 19/11/2005. GARRIDO, A. Avances en la utilizacin e la tecnologa nirs. aplicaciones en produccin animal. Xix Curso De Especializacin FEDNA. MADRID, 23 e 24 de Outubro de 1996.



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