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Carrera Profesional de Farmacia y Carrera Profesional de Farmacia y BioquímicaBioquímica

cromatografíacromatografía Método usado principalmente para la Método usado principalmente para la

separación de los componentes de una separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como extendida en una capa, distribuida como una película, etc...una película, etc...

La velocidad de desplazamiento es función del coeficiente de distribución de cada componente entre las dos fases.

][A][A

= DFM

FE

FE

sólido

líquido

gel

FM

gas

líquido

fluido sc

CROMATOGRAFÍA

DeterminaciónSeparación

la naturaleza de las fases móvil y estacionaria y la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases, es decir, el mecanismo de interacción

dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase móvil y la estacionaria

Representación gráfica de la respuesta del detector en función del tiempo, volumen de eluyente o distancia en el lecho cromatográfico

funcionamiento del sistema cromatográfico

Información analítica relativa a la muestra

el tiempo que tarda el máximo de un pico en ser eluido después de la inyección

intervalo de tiempo que transcurre desde que el trazador es insertado al principio del lecho cromatográfico hasta que sale del mismo

t'R = tR - to

t0

tR

t´R

diferencia entre el tiempo de retención del analito y el volumen muerto de la columna, es decir, el tiempo que un analito es retenido en la columna comparado con un compuesto no retenido

k' = ( tR - to ) / to

Es la relación entre el tiempo que las moléculas del analito están en la fase estacionaria y el que están en la fase móvil.

tR = t0 (1 + K')

K'= ß KD

K'= ß Dmm

SS

V C

V C

FM laen pasa soluto el que tiempo

FE laen pasa soluto el que tiempo K´

Pes y Pm, probabilidades que tiene un analito de estar en la FE o FM, respectivamente, coinciden con las fracciones del mismo en cada una de estas fases:Pes = K'/ 1+K'

Pm = 1/ 1+K'

Pm es equivalente al denominado factor de retraso, R,

R = velocidad de desplazamiento del analito/velocidad de FM = 1 / 1+K'

V= tF

K' = V'R/V'0VR = V'R + V0

volumen que ocupa en la columna la FM

V0 = t0F

volumen de FM necesario para que se produzca la elución de un soluto

VR = tRF

V'R = t'RF

VR = V0 (1 + K')

CROMATOGRAFÍA EN SUPERFICIE PLANA

FLUJOpropiciado por CAPILARIDAD

FASE MÓVIL(apolar)

CÁMARACROMATOGRÁFICA

distancia avanzada por la moléculaRf= distancia avanzada por el frente

Rf es característico para cada soluto para una composición dada de fase móvil y un determinado tipo de superficie

F. MÓVIL (LÍQUIDA) Disolvente orgánico

F. ESTACIONARIA (LÍQUIDA) H2O absorbida en la celulosa.

SOPORTE celulosa de papel de filtro

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

CLASE: RepartoPROPIEDAD: SolubilidadNOMBRE: Fase Normal

Molec. Hidrofílica LENTARetenida por f.estacionaria

Molec. Hidrofóbica RÁPIDADisuelta en f. móvil

F. MÓVIL (LÍQUIDA) Disolvente orgánico

SOPORTE plancha de metal o vidrio

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)

F. ESTACIONARIA (SÓLIDA) sólido pulverizado sobre plancha de metal o vidrio. El más usado es el gel de sílica.

CLASE: InteracciónPROPIEDAD: HidrofóbicaNOMBRE: Interacción Hidrofóbica

Molec. Hidrofílica LENTARetenida por f.estacionaria

Molec. Hidrofóbica RÁPIDADisuelta en f. móvil

CLASE: RepartoPROPIEDAD: Tamaño (y forma)NOMBRE: Exclusión

CROMATOGRAFÍA DE GEL FILTRACIÓN

SOPORTE Resina de micropartículas esféricas formadas por polímeros hidrofílicos (dextrano, agarosa poliacrilamida o mezcla de ellos).

Tamaños de poro intérvalo o rango de fraccionamiento.

P.e. Sephadex G25: 1000 – 5000 DaSephadex G200: 5000 – 250000 Da

MICROPARTÍCULAS

F. MÓVIL (LÍQUIDA) solvente acuoso que atraviesa la columna por los espacios intersticiales (entre las micropartículas).

FASE MÓVIL

F. ESTACIONARIA (LÍQUIDA) solvente acuoso (el mismo que el de la fase móvil) que se encuentra dentro de micropartículas.

F. ESTACIONARIA

1 2 4 5 6 7 8 93resp

uesta

del d

ete

cto

r

fracción

PERFIL DE ELUCIÓN

CROMATOGRAFÍA DE GEL FILTRACIÓN

Molec. GRANDES RÁPIDAS

* Avanzan con mayor velocidad a través de los espacios intersticiales (con F. móvil)

grande

Molec. PEQUEÑAS LENTAS

* Son retenidas por las fibras de las micropartículas y avanzan con menos velocidad (con F. estacionaria).

pequeñaAPLICACIÓN

MUESTRA

ELUCIÓN

CLASE: InteracciónPROPIEDAD: Electrostática

NOMBRE: Intercambio iónico (aniónico o catiónico)

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

SOPORTE Resina de micropartículas formadas por polímeros sintéticos (poliestireno entrecruzado con divinilbenceno o DowexR) o matrices de polímeros naturales (dextranos, celulosas, agarosa).

MICROPARTÍCULASF. MOVIL (LÍQUIDA) Solvente que anula la interacción electrostática.

2 posibilidades: Gradientes de pH cambio de carga de las moléculas de la muestra.

Gradientes iónicos competencia por grupos electrófilos.

FASE MÓVIL

F. ESTACIONARIA (SÓLIDA) Grupos con cargas iónicas unidos al soporte.

Carga positiva (+) intercambiadores de aniones (-).Carga negativa (-) intercambiadores de cationes (+).

F. ESTACIONARIA

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

Molec. MENOR CARGA (+) RÁPIDAS

* Son desplazadas más fácilmente por la f.móvil.

Molec. MAYOR CARGA (+) LENTAS

* Son retenidas por los grupos cargados iónicamente de la f. estacionaria.

•Gradiente de pH•Gradiente salino

1 2 4 5 6 7 8 93resp

uesta

del d

ete

cto

r

fracción

PERFIL DE ELUCIÓN

+

-

Na+

q+Q+APLICACIÓN

MUESTRA

ELUCIÓN

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

CLASE: InteracciónPROPIEDAD: Interacciones específicas entre dos moléculasP.e. hormona-receptor

proteína-metal o cofactores como ATPantígeno-anticuerpo

NOMBRE: Afinidad biológica

F. ESTACIONARIA (SÓLIDA) Ligando específico unido a la matriz.

-- Comerciales: Concavalina A une glicoproteínasProteína A une IgG (anticuerpos)

-- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz F. ESTACIONARIA

SOPORTE Matriz de micropartículas hidrofílicas sin carga, con rigidez, inerte y estable (agarosa, acrílica).

MICROPARTÍCULASF. MÓVIL (LÍQUIDA) Solución que anula o disminuye la

afinidad con el ligando de la fase estacionaria.

-- Solución con el propio ligando – Molécula + ligando libre -- Solución con algo que interacciona con el ligando - Molécula

FASE MÓVIL

fracción

Molec. NO INTERACCIÓN RÁPIDAS

* No se unen al ligando de la fase estacionaria.

Molec. INTERACCIÓN LENTAS

* Se unen al ligando de la f. estacionaria. Elución específica.

APLICACIÓN MUESTRA

LAVADOELUCIÓN

ESPECÍFICA1 2 4 5 6 7 8 93re

sp

uesta

del d

ete

cto

r

PERFIL DE ELUCIÓN

LAVADOELUCIÓN

ESPECÍFICA

molécula

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Sistema GST (Glutatión-S-Transferasa)

GST

Proteína X

Purificación de PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Cualquier proteína con etiqueta GST

Glut

GSTGlut

GSTGlut

Glut

APLICACIÓN MUESTRA

ELUCIÓN