microesferasporosas

matriz del gel

Métodos de Separación Cromatografía

CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD: Reparto por tamañoCromatografía de filtración en gel ó Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

moléculasgrandes

moléculaspequeñas

HINCHADO YEQUILIBRADO

eluyente

Volumen de elución

Cant

idad

de

solu

to

membranade diálisis

disolvente

disolucióna desalar

DIÁLISIS

Cromatografía de penetrabilidad: Permite separar a las biomoléculas en función de su tamaño (y forma), conforme eluyen en orden decreciente de tamaño.

Polímeromicroparticulado

Métodos de Separación Cromatografía

CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD

Fabricante Nombre comercialDiámetro partícula

(µm)Matriza

Intervalofraccion.

(kDa)Fabricante Nombre comercial

Diámet.partícula

(µm)Matriza

Intervalofraccion.

(kDa)BIO-RAD BIO-GEL A 0.5m 75-150 AG 10 :500 IBF ULTROGEL AcA 22 60-140 AG/AC 100 : 1200

BIO-GEL A 1.5m 75-150 AG 10 :1500 ULTROGEL AcA 34 60-140 AG/AC 20 :350BIO-GEL A 5m 75-150 AG 10 :5000 ULTROGEL AcA 44 60-140 AG/AC 10 :130BIO-GEL A 15m 75-150 AG 40 :15000 ULTROGEL AcA 54 60-140 AG/AC 5 :70BIO-GEL A 50m 75-150 AG 100 : 50000 PHARMACIA SEPHACRYL S-100 HR 25-75 DX/AC 1 :100BIO-GEL A 150m 75-150 AG 103:150x103 SEPHACRYL S-200 HR 25-75 DX/AC 5 :250BIO-GEL P 2 45-90 AC 0.1:1.8 SEPHACRYL S-300 HR 25-75 DX/AC 10 :1500BIO-GEL P 4 45-90 AC 0.8:4 SEPHACRYL S-400 HR 25-75 DX/AC 20 :8000BIO-GEL P 6 45-90 AC 1 : 6 SEPHACRYL S-500 HR 25-75 DX/AC 40 :20000BIO-GEL P 10 45-90 AC 1.5:20 SEPHACRYL S-1000 SF 40-105 DX/AC 500 : 105

BIO-GEL P 30 45-90 AC 2.5:40 SEPHADEX G-10 55-166 DX - :0.7BIO-GEL P 60 45-90 AC 3 :60 SEPHADEX G-15 60-181 DX - :1.5BIO-GEL P 100 45-90 AC 5 :100 SEPHADEX G-25 34-138 DX 1 : 5BIO-GEL P 200 45-90 AC 30 :200 SEPHADEX G-50 40-160 DX 1.5:30

TOSOHAAS TOYOPEARL HW 40F 30-60 ME 0.1:10 SEPHADEX G-75 23-92 DX 3 :70TOYOPEARL HW 50F 30-60 ME 0.5:80 SEPHADEX G-100 26-103 DX 4 :100TOYOPEARL HW 55F 30-60 ME 1 :700 SEPHADEX G-150 29-116 DX 5 :150TOYOPEARL HW 65F 30-60 ME 40 :5000 SEPHADEX G-200 32-129 DX 5 :250TOYOPEARL HW 75F 30-60 ME 500 : 50000 SEPHAROSE CL-2B 60-200 AG 70 :40000

IBF ULTROGEL A4 60-140 AG 55 :9000 SEPHAROSE CL-4B 45-165 AG 60 :20000ULTROGEL A6 60-140 AG 25 :2400 SEPHAROSE CL-6B 45-165 AG 10 :4000

Soportes Comerciales para Cromatografía de Penetrabilidad Convencional

aAC: poliacrilamida; AG: agarosa; DX: dextrano; ME: metacrilato copolimerizado con etilenglicol.

Métodos de Separación Cromatografía

CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD: Calibrado de la columna

AzulDextrano

(M.W.=2x106)

FerricianuroPotásico

(M.W.=329)

VoVolumen de

exclusión

VtVolumen

total

Coeficiente de reparto, Kav

AzulDextrano

Ferricianuro

Aλ

ml

Métodos de Separación Cromatografía

CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD: Calibrado de la columna

RECTA DE CALIBRADO

0.39

4.5

Mr (x) = 104.5 = 31600

Métodos de Separación Cromatografía

CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD: Separación de biomoléculas por tamañoCriterio de pureza

Preparación enzimáticaHOMOGÉNEA

Criterio de purezaNEGATIVO

Métodos de Separación Cromatografía

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO: Separación por interacción electrostática

Elución mediante Gradientes de Fuerza Iónica

Métodos de Separación Cromatografía

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD: Separación por interacciones biológicas de alta especificidad

Carga Lavado Elución Regeneración

Volumen (ml)

Abs

orba

ncia

Cambio de buffer

pH extremos,agentes caotrópicos

??

ELUCIÓN ESPECÍFICAcon agentes quecompitan por la unión

ELUCIÓN

Métodos de Separación Cromatografía

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN: HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Columnas de HPLC