Cromatografia

Fabrizio Papa

Simulazione di una

Cromatografia

Poniamoci alcune domande:

1) Perché da una sostanza verde abbiamo ottenuto due sostanze, una gialla ed una blu?

3) Perché le due sostanze si sono separate?

2) Perché le due sostanze sono scese verso il basso?

4) Perché il volume occupato dalle sostanze è aumentato?

5) Perché la sostanza blu più trattenuta occupa un volume maggiore della sostanza gialla meno trattenuta?

Un esempio

Cerchiamo ora di individuare gli elementi della simulazione cromatografica e dell’esempio dei tipi chiacchierone e riservato ed abbinarli tra loro.

Sostanza gialla

Sostanza blu

Solido

Solvente

Tubo di vetro

Corso

Tipo Violetto riservato

Tipo rosa chiacchierone

Folla

Gambe

Simulazione Esempio

Cerchiamo ora di rispondere ad una domanda più difficile:

Perché le bande si allargano?

Per rispondere a ciò riprendiamo ancora l’esempio dei tipi chiaccherone e riservato.

1

2

3

2

1

Perché si allarga la banda? Un esempio.

Tempo

Intensità

1

2

3

Cromatogramma

Non resta che cercare dei termini più appropriati per identificare gli elementi e gli eventi osservati e avremo definito tutto sulla cromatografia.

Tubo di vetro

Solido

Solvente

Trascinamento del solvente

Colonna cromatografica

Eluente: fase mobile

Fase stazionaria

Eluizione

Sostanze Soluti

Tempi

Intensità

t0

t’ R tempo di ritenzione corretto

t R = tempo di ritenzione

Tempi di ritenzione

K’ = (tR – t0)/t0

Fattore di capacità Kd = Cs/Cm

Coefficiente di distribuzione

K’ = Kd*Vs/Vm

Analizziamo ora l’ampiezza della banda:

t R = tempo di ritenzione

W

W1/2

H1/2

Tempo

Intensità

H

Analizziamo ora in maniera più scientifica perché la banda si allarga:

Percorsi multipli

Diffusione longitudinale

Fase stazionaria

Fase mobile

Trasferimenti di massaIn fase stazionaria

In fase mobile stagnante

Diffusione longitudinale =

Percorsi multipli =

Trasferimento di massa =O raggiungimento dell’equilibrio

A

B

C

Diamo dei valore ai tre contributi che influiscono sull’allargamento della banda

HETP = A + B/v + C*v

Equazione di Van Deemter

v = flusso

HETP = altezza del piatto teorico

n = L / HETP

lunghezza della colonna = L

n = numero dei piatti teorici

Un po’ di statistica

Esempio:

Una fabbrica produce dei prodotti (compresse) con 5 mg di principio attivo (caffeina)

Vi chiedono di verificare se le compresse prodotte contengono effettivamente 5 mg di caffeina ed in caso contrario di valutare la variabilità.

E voi cosa fate?

1) Le analizzate tutte?

2) Ne prelevate un po’ in modo casuale e le analizzate?

Ne preleviamo 5 che danno il peso di 3, 4, 5, 6, 7

Media =3 + 4 + 5 + 6 + 7

5= 5

La media non ci dice nulla sulla variabilità

Proviamo con gli scarti dalla media

3 – 5 = -24 – 5 = -1

5 – 5 = 0

6 – 5 = 1

7 – 5 = 2

somma 0

3 – 5 = -24 – 5 = -1

5 – 5 = 0

6 – 5 = 1

7 – 5 = 2

0

3 – 5 = (-2)2

4 – 5 = (-1)2

5 – 5 = (0)2

6 – 5 = (1)2

7 – 5 = (2)2

somma 10

Eleviamo al quadrato

Quello che abbiamo ottenuto si chiama Devianza

Dividendo per il numero dei campioni o osservazioni o meglio per i gradi di libertà ci avviciniamo alla variabilità del singolo campione

10

5 - 1= 2,5

Abbiamo appena ottenuto la Varianza

Avendo prima elevato al quadrato ora possiamo fare l’operazione inversa con la radice quadrata

2,5 = 1,58

Abbiamo finalmente ottenuto la Deviazione Standard

Riprendiamo i numeri appena analizzati

3, 4, 5, 6, 7

Grafichiamo i dati su un istogramma

Un campionamento di cinque non è molto serio

Facciamo un campionamento di 100 numeri approssimando i pesi a 0,5

Distribuzione dati

0

5

10

15

20

25

Serie1

Poli. (Serie1)

Serie1 1 4 12 21 24 21 12 4 1

3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7

Distribuzione di Gauss

La deviazione standard in una curva di Gauss è cade nel punto di flesso

La somma delle osservazioni tra –s e +s risulta essere il 68,2%

Ancora un piccolo esempio:

Due ditte producono due diversi prodotti:

1) Ha una media di 10 e s 2

2) Ha una media di 100 e s 2

La deviazione standard è uguale

Ci chiediamo qual è la ditta che lavora meglio, ovvero è più precisa, ovvero richiamando un termine cromatografico è più efficiente?

Proviamo a rapportare la deviazione standard alla media

2/10 = 0,2

2/100 = 0,02

Se moltiplichiamo per 100 otterremo 20 e 2 ovvero il Coefficiente di Variazione Percentuale o CV%

Questo ci dice chiaramente che la ditta che lavora meglio è la seconda

/ tR

I valori di questo rapporto sono molto piccoli, prendiamo il reciproco

tR/

O ancora meglio il suo quadrato

(tR/)2

N = (tR/)2

1 deviazione standard equivale ad un’ampiezza di picco misurata a 0,882 di altezza, non facile da prendere e quindi si misura alla base che equivale a 4deviazioni standard o a metà altezza che corrisponde a 2,354

N = 16(tR/Wb)2

N = 5,545(tR/h1/2)2

N =(tR/Wb/4)2

N =(tR/h1/2/2,354)2

Equilibrio?

Kd = Cs/Cm

Kd = [fenolo]s/[fenolo]m

Solvente = etile acetato

Solido = silice

Soluto = fenolo

Kd = Cm/Cs Kd = [fenolo]H2O/[fenolo]CH2Cl2

Estrazione con imbuto separatore, un processo

all’equilibrio

La cromatografia non è un processo all’equilibrio

Proviamo a riportare su grafico i tre contributi che tendono ad allargare una banda cromatografica

A

B

C

v = flusso

HPTE

La cromatografia ci permette di separare due o più sostanze

tR

Abbondanza

Risoluzione

Cattiva risoluzione

Buona risoluzione dovuta all’efficienza della colonna

Buona risoluzione dovuta alla selettività della

colonna

Ancora sulla risoluzione

t r1 t r2t

W1 W2

R = 2 t/(W2 + W1)

Risoluzione

Efficienza

Particelle di silice

Bande lungo la colonna

Cromatogrammi

Selettività

Cambiando la fase stazionaria Cambiando la fase mobile

Kd = Cs / Cm

Soluto A

Soluto B

KdA

KdB

A BFase mobile

Fase stazionaria

K’ = tR – t0 / t0

Cambiano i tempi di ritenzione

Parliamo di tipi diversi di cromatografia

Classificazione in base alla fase mobile

Liquida

Gassosa

A fluido supercritico

Cromatografia su strato sottile in colonna, HPLC

Gascromatografia in colonna

Tra la cromatografia liquida e la gascromatografia, in colonna

Fase stazionaria (solido)

Fase mobile

Cromatografia di assorbimento

Siti attivi

Si O Si O Si O Si O

OHOHOH OH

Si O Si

OH OH

HO OHOHHO

O

O

Un esempio di cromatografia di adsorbimento (fase inversa)

Silice (Solido)

Ortodifenolo

Paradifenolo

Cicloesano Etileacetato

HO OH

O

O

Fase stazionaria (liquida)

Fase mobile

Cromatografia di ripartizione

Supporto solido

Un esempio di cromatografia di ripartizione (fase inversa)

Silice (solido)

Catene C18 (liquido)

Si O Si O Si O Si O Si O Si

H

OO

HHN

Aldeide C7

Fase stazionaria

Fase mobile80%20%40% 60%

Si Si Si Si

NC NC NC NC

Si Si Si Si

N NNN

Si Si Si Si

Si Si Si Si

O2N O2N O2N O2N

Cianoalchil

Amminoalchil

FenilalchilNitroalchil

Altre fasi stazionarie

Cromatografia di esclusione

-

+

++ + ++ ++ + +++

Cromatografia di scambio ionico

- +

-

N

CH3

H3C

CH3

OH -

R

SO3-

H +

R

Gruppo trimetilammonio Gruppo solfonato

Gruppi scambiatori di ioni

Scambiatore di anioni Scambiatore di cationi

Cromatografia di affinità

Perché eseguire un’analisi cromatografica?

Analisi qualitativa Indicazioni per identificare una sostanza

Analisi quantitativa Quantificazione della sostanza

tR

tR

In generale sostanze diverse hanno tempi di ritenzione diversi

Analisi qualitativa

Analisi Quantitativa

h hLinea di base

Linee di base corrette (da valle a valle)

S = Base * Altezza/2

Totale = 1 + 2+ 3+ 2+ 1 = 9

Integrazione

Normalizzazione interna

AB

C

ST = SA+SB+SC

%A = SA/ST*100 %B = SB/ST*100 %C = Sc/ST*100

Il rivelatore risponde allo stesso modo con i vari componenti

Ancora normalizzazione interna

AB

C

SA*fA/CA = SBfB/CB = SC*fC/CC

fB = SA/CA*CB/SB fC = SA/CA*Cc/ScfA = 1

S’A = SA * fAS’B = SB * fB S’C = SC * fC

CA= SA/STot CB= SB/STot CC= Sc/STot

Stot = S’A + S’B + S’C

Il rivelatore non risponde allo stesso modo con i vari componenti

Taratura diretta

A

SS/CS = SC/CC

CC=SC*CS/SS

S = standard

C = campione

B

POSSIBILITÀ DI DETERMINARE LA CONCENTRAZIONE DEL SOLO COMPONENTE CHE INTERESSA

Standardizzazione esterna

S

Peso

%A=PA/PC*100PC = peso del campione iniettato

PA = peso del componente ricavato dal grafico

Risposta

Standardizzazione interna

PA/PI.S.

SA/SI.S.

QA = PA/PI.S.*QI.S.

I st. II st. III st.

2 l 2.000.000

4.000.0001l 1.000.000

2.000.000= 0,5 = 0,5

Standard interno

Sostanza da dosare

Campione incognito

Campioneincognito

Px

Metodo dell’aggiunte multiple

S

Paggiunto

CX=PX/VX