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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Cromatografia de papel, Cromatografia de camada delgada, Cromatografia de coluna, Cromatografia gasosa, Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE (HPLC)

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  • 1. Universidade Federal do Par Instituto de Cincias da Sade Faculdade de Farmcia Qumica Farmacutica Experimental IIAmanda de Almeida Cntia Quaresma Eunice Oliveira Juliana Hernandez Tammy Reymo Thiago Paixo

2. Introduo Cromatografia: um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura, realizada atravs da distribuio desses componentes em duas fases. Uma das fases permanece estacionria, enquanto outra se move atravs dela.Durante a passagem da fase mvel sobre a estacionria, os componentes da mistura so distribudos pelas duas fase de tal forma que cada um deles seletivamente retido pela fase estacionria, resultando em migraes diferenciais desses compostos.Thiago 3. Introduo Cromatografia: Chrom = cor + graphe = escreverO processo no totalmente dependente da cor, mas em alguns casos pode basear a identificao dos constituintes separados.SeparaoIdentificaoQuantificao Thiago 4. Introduo Cromatografia Breve Histrico O botnico russo Mikhael Tswett em 1906 utilizou o termo cromatografia pela primeira vez, para descrever a separao de um extrato vegetal, utilizando colunas de vidro recheadas com partculas slidas, arrastando os componentes com ter de petrleo.A poca moderna da cromatografia iniciou em 1930, quando Kuhn e Lederer, aperfeioaram as experincias do botnico russo, separando e identificando as xantfitas da gema do ovo, usando coluna preenchida com carbonato de clcio pulverizado com fase estacionria e ter de petrleo com fase mvel. Thiago 5. Introduo Cromatografia Breve Histrico1938 Izmailov e Schraiber reintroduziram a CCD em anlises de produtos farmacuticos, contudo permaneceu subutilizada, at o desenvolvimento do mtodo de aderir slido ao suporte, atribuido a Kirchner, e do mtodo de preparar placas, descrito por Stahl. 1941 - Martin e Synge desenvolveram a cromatografia por partio (lquido-lquido), que fundamentou o surgimento da CLAE e CG. Eles receberam em 1962 prmio Nobel de qumica pelo mtodo desenvolvido.1941 Hesse e colaboradores desenvolveram a cromatografia gsslido, a partir da separao de dois cidos graxos sob valor de 100 C, arrastando sobre a slica com dixido de carbono. Thiago 6. Introduo Cromatografia Breve Histrico1952- Martin e James descreveram a cromatografia gs lquido;1954 Ray desenvolve o detector por condutividade trmica;1958 Pretorius e colaborares, juntamente com McWilliams e Dewar, desenvolveram o detector de ionizao em chama;1958 Golay introdiziu as colunas capilares em anlises por cromatografia de alta eficincia; Estes avanos ampliaram o poder analtico da cromatografia, tornando-a o mtodo analtico de separao e determinao mais usado do mundo Thiago 7. Introduo Classificaes da Cromatografia: 1. Quanto a forma fsica:1.1. Fase estacionria depositada em uma superfcie planar 1.2.1 Cromatografia planar1.2. Fase estacionria depositada em um tubo cilndrico 1.1.1. Cromatografia em coluna TiposTamanhoPreparativa6-50 mmAnalticas2-6 mmMicrodimetro1-2 mmCapilares< 1 mmThiago 8. Introduo Classificaes da Cromatografia: 2. Quanto a fase mvel: 2.1. Gs inerte: cromatografia gasosa 2.2. Lquido: cromatografia lquida 2.3. Vapor pressurizado: cromatografia supercrtica2.2.1. Cromatogrfica lquida em coluna Clssica: em colunas de vidro, onde a fase mvel e deslocada sobre a fase estacionaria pela fora da gravidade;Alta eficincia: em colunas metlicas, onde a fase mvel deslocada por presses elevadas, obtidas com auxilio de uma bomba de alta presso. Thiago 9. Introduo Classificaes da Cromatografia:3. Quanto a polaridade das fases: 3.1. Cromatografia gasosa: fase mvel inerte, separao ocorre devido s interaes das molcula da amostra com a fase estacionria;3.2. Cromatografia lquida (planar e coluna); 3.2.1. Cromatografia de fase normal: fase estacionria mais polar do que a fase mvel3.2.2. Cromatografia de fase reversa: fase mvel mais polar do que a fase estacionria.Thiago 10. Introduo Mecanismo de interao: Adsoro: CDD, CGS, CLS, CSSInterao entre o slido e fase mvel, devido a presena de grupos ativos em sua superfcie. A dessoro do soluto ocorre por volatilidade (CG) ou solubilidade na fase mvel (CL ou CSS)Thiago 11. Introduo Mecanismo de interao: Absoro: CP, CGL, CLLFase estacionria um lquido ocorre por absoro ou partio e baseia-se nas diferentes solubilidades dos componente da amostra na fase estacionria. A volta dos componentes a fase mvel depende de sua volatilidade (fase mvel gasosa) ou de sua solubilidade (fase mvel lquida) Thiago 12. Introduo Mecanismo de interao: Troca inica:A fase estacionria constituda por um suporte onde so adicionados grupos ionizveis: Grupos carregados positivamente, retendo nions e grupos carregados negativamente retendo ction. A fase mvel uma soluo inica com propriedades tamponantes compatvel.Thiago 13. Introduo Mecanismo de interao: Bioafinidade: Grupos com especificidade biolgica, quimicamente ligados ao suporte. Podem ser antgenos, substratos ou lectinas, que retiram da fase mvel somente os componente complementares, os anticorpos, enzimas ou acares, respectivamente.Thiago 14. Introduo Mecanismo de interao: Excluso:Thiago 15. Cintia 16. Cromatografia de Papel Tcnicasimples; Pequena Boaquantidade de amostra;capacidade de resoluo, Separaoe identificao de compostos polares, como antibiticos hidrossolveis, cidos orgnicos e ons metlicos.Cintia 17. Cromatografia de Papel classificada como de partio lquido-lquido;Separaoe distribuio depende da solubilidade;Geralmentegua utilizada como fase mvel e papel (celulose) como fase estacionria.Cintia 18. Cromatografia de Papel A forma mais simples de CP a cromatografia ascendente (por capilaridade).Cintia 19. Cromatografia de PapelCintia 20. Cromatografia de Papel Misturade componentes coloridos;Misturasincolores.Cintia 21. Cromatografia de Papel ProcedimentoCintia 22. Cromatografia de Papel A anlise qualitativa de uma substncia realizase atravs da cor da mancha e de seu fator de retardamento, Rf, determinado atravs da expresso: Rf = da/dsRf= fator de reteno; da= distncia (cm, mm) percorrida pela substncia;ds= distncia (cm, mm) percorrida pela fase mvel. Cintia 23. Tammy 24. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Histrico 1889, Beyerinck - slidos em camada delgada sobrevidro;1938, Izmailov e Schraiber - anlise de produtos farmacuticos; 1956, Stahl preparao de placas comreprodutibilidade.Definio: Mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura atravs da distribuio destes entre duas fases(mvel e estacionria). Tammy 25. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Fase estacionria slida e fase mvel lquida; A fase estacionria constituda de slica G (fase normal) ou slica C18 (fase reversa); Fase Normal: polaridade da FE > FM Fase Reversa: polaridade da FE< FMTammyA fase mvel constituda de solventes polares, apolares ou mistura de ambos (ex: gua, etanol, metanol, clorofrmio, diclorometano, hexano, etc.) 26. Cromatografia em Camada Delgada -CCD As placas utilizadas podem ser de folha de alumnio (manufaturadas na indstria) ou de vidro (preparadas no prprio laboratrio);Vantagens: Uniformes e homogneas; Promovem melhor separao dos componentes. Vantagens: Baixo custo; Fcil preparo. necessrio ativ-las em estufa antes da aplicao, afim de remover gua e interferentes. Tammy 27. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Como ocorre: Durante a corrida, os componentes da mistura so distribudos entre a FM e a FE e cada um deles retido seletivamente pela FE, conforme a velocidade com que passam pela mesma. Isso resulta em alturas diferentes para cada componente.A cuba deve estar saturada com vapores da fase mvel, para que ocorra boa migrao dos componentes da mistura. Tammy 28. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Fator de reteno (Rf): Partindo do princpio de que um composto percorre sempre a mesma distncia em relao a frente do solvente, o fator de reteno a razo entre estes deslocamentos. utilizado para auxiliar a identificao de substncias, comparando o Rf obtido com o Rf padro.Tammy 29. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Revelao do cromatograma: necessrio proceder esta etapa quando os componentes migrados so incolores. Para tal, utiliza-se alguns reagentes para torn-los visveis.Podem ser biolgicos.Fsicos: Luz UVutilizadosreveladoresQumicos: Dragendorff (alcalides) NP-PEG (flavonides) FeCL3 (comp fenlicos) Rev. Universal (vapor de iodo)fsicos,qumicosouBiolgicos: Enzimas, Antibiticos e Substratos.Tammy 30. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Exemplos:Tammy 31. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Aplicaes: Estudospreliminares orgnico;doscomponentesdeumextrato Investigaode casos de envenenamento e ingesto de estimulantes por atletas; Estudosde reaes qumicas intermedirios estveis; Anlise Anlisequanto presenadeda pureza de compostos;da eficincia cristalizao.deprocessosdedestilaoeTammy 32. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Vantagens: Fcil execuo;Rapidez;Menor trajeto da fase mvel ;Baixo custo;Versatilidade.Desvantagens: Difcil reprodutibilidade;Difcil determinao precisa do Rf. Tammy 33. Eunice 34. Cromatografia em coluna Citada como o mais antigo procedimento cromatogrficoUtilizada para Isolamento de produtos naturaisPurificao de produtos de reaes qumicasFundamenta-se basicamente na polaridade relativa das molculas envolvidas. 35. Cromatografia lquida clssica Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plstico, de dimetros variados;possuem uma torneira em sua extremidade inferior.Esses cilindros so preenchidos por um adsorventecolocado na coluna diretamente ou suspendido em um solvente adequado. 36. Adsorventes mais utilizados Slica e aluminaSuporte para fase estacionria lquida Lquida: separao por adsoro Slida: separao por partio 37. Cromatografia em Coluna A fase estacionria mantida em um tubo estreito e a fase mvel, forada atravs do tubo sob presso ou por gravidade.A substncia a ser separada ou analisada colocada na coluna parte superior e o eluente vertido aps.A adio de slica deve ser feita com a torneira semiaberta.O adsorvente

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