Cromatografia

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Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativoQueste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale dei vari componenti fra due fasi, una chiamata fase fissa o fase stazionaria e l’altra chiamata fase mobile o eluente, che fluisce in continuo attraverso la fase fissaLe tecniche sono molto utilizzate in campo ambientale, biologico, farmaceutico, ecc., essendo particolarmente utili nell’analisi di miscele complesse come sono la maggior parte dei campioni di natura organica

La separazione dei componenti di una miscela si ottiene in seguito alle

interazioni chimiche o fisiche che avvengono tra le molecole disciolte nella fase

mobile e la fase stazionaria: queste interazioni possono avvenire con la

superficie adsorbente del supporto solido, o con un liquido che ricopre il

supporto in modo omogeneo o ancora con molecole ad esso legate in maniera

covalente.

Dal momento che i diversi componenti della miscela da separare interagiscono

in maniera differente con la fase stazionaria, si muovono lungo la colonna

cromatografica con velocità diverse: i composti che sono più “affini” alla fase

stazionaria si muovono in media più lentamente di quelli che sono più “affini”

alla fase mobile.

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La Nascita della Cromatografia

Scrive Tswett nel 1906:

“Se una soluzione di clorofilla in etere di petrolio è filtrata attraverso una colonna di adsorbente – io

utilizzo soprattutto carbonato di calcio, accuratamente pressato, all'interno di uno stretto tubo di vetro

– allora i pigmenti, si separano, secondo la sequenza di adsorbimento, dall'alto in basso, in molte zone

colorate […] Proprio come i raggi di luce nello spettro, i diversi componenti della miscela appaiono

separati, sulla colonna di carbonato di calcio, secondo una legge e possono essere misurati sia in modo

qualitativo che quantitativo. Io chiamo questa preparazione cromatogramma ed il metodo

corrispondente lo chiamo metodo cromatografico. Ovviamente i fenomeni di adsorbimento fin qui

descritti non sono ristretti ai soli pigmenti della clorofilla ed è lecito presumere che tutti i composti

chimici, sia colorati che incolori, siano soggetti alle stesse leggi.”

Mikhail S. Tsvett(1872–1919)

La nascita della cromatografia si deve al botanico russo Mikhail Semenovich Tswett,

che per primo la utilizzò nel 1903 per separare i pigmenti naturali contenuti in

estratti vegetali.

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Nell’esperimento di Tswett, la fase stazionaria era carbonato di calcio mentre la fase

mobile o eluente era etere di petrolio, un solvente organico composto da idrocarburi a

basso punto di ebollizione. I composti da separare sono introdotti nella fase mobile e si

ripartiscono lungo la colonna cromatografica in funzione della loro affinità relativa per la

fase mobile e per la fase stazionaria.

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La cromatografia è nata dunque all’inizio del XX secolo come tecnica per la separazione di pigmenti fogliari, ma già il suo inventore era consapevole delle sue potenzialità applicative

Tswett chiamò questa tecnica cromatografia dal greco scrittura del colore o, visto il significato del suo cognome in russo, scrittura di Tswett

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Twsett era uno spirito inquieto e mobile, in quanto rimangono tracce di suoi soggiorni - spesso con collaborazioni scientifiche - in università tedesche, olandesi, belghe e francesi. Nel 1910 era apparsa una sua importante opera di, intitolata "Cromofille dei regni vegetale e animale", in cui erano descritte dettagliatamente sia le tecniche sperimentali , scritto però in russo. Il chimico tedesco Willstätter si era fatto tradurre per uso privato il libro di Twsett e questa traduzione, passata nelle mani del suo allievo Kuhn. Nel1930, ad appena 22 anni, Edgard Lederer era giunto per il suo lavoro di postdottorato sui pigmenti della carota ad Heidelberg, nel laboratorio diretto da Kuhn , messo sulla strada giusta dalla lettura di un libro sui carotenoidi dell'americano L.S. Palmer, edito nel 1922, dove si faceva riferimento al volume di Twsett.

La scienza è spesso influenzata da

avvenimenti casuali: Sorprendentemente, nel 1930

Lederer venne in possesso della 'traduzione privata‘ del libro di Tswett e così riprese il cammino della cromatografia.

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Richard Kuhn (1900-1967) Edgar Lederer (1908-1988)

Archer Martin (1910-2002) Richard Synge (1914-1994

The Nobel Prize in Chemistry 1952 was awarded jointly to Archer John Porter Martin and Richard Laurence Millington Synge

"for their invention of partition chromatography"

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LONGITUDINAL DIFFUSION AND RESISTANCE TO MASSTRANSFER AS CAUSES OF NONIDEALITY IN

CHROMATOGRAPHYJ. J. VAN DEEMTER, F. J. ZUIDERWEG

Koninklijke/Shell-Laboratorium, Amsterdam (N.V. De Bataafsche Petroleum Maatschappij)

andA. KLINKENBERG

N. V. De Bataafsche Petroleum Maatschappij, The Hague(Received 1 February 1956)

Chem. Engng Sci. 5, 271-289, 1956.

1898-1903 D. Trebot Day, geologo americano, separò alcuni idrocarburi utilizzando colonne di farina fossile.

1903-1906 M. Tswett, botanico russo, separò una serie di pigmenti colorati presenti in un estratto di foglie verdi utilizzando CaCO3 ed etere di petrolio; coniò anche il nome cromatografia che significa "scrittura mediante il colore".

1930-1931 R. Kuhn e E. Lederer utilizzarono la cromatografia per la separazione di carotenoidi e xantofille.

1938 N.A. Izmailov e M.S.Shaiber descrissero per la prima volta la cromatografia su strato sottile

1941 A.J.P. Martin e R.L.M. Synge presentarono il primo lavoro sulla cromatografia di ripartizione. Essi introdussero la teoria dei piatti basata su di un'analogia con la teoria della distillazione e dell'estrazione controcorrente.

1952 A.J.P. Martin e R.L.M. Synge ebbero il premio Nobel per la chimica per lo sviluppo della cromatografia di ripartizione. Nello stesso anno, in collaborazione con A.T.James realizza la cromatografia gas-liquido.

1956 J.J.van Deemter sviluppò la teoria della separazione cromatografica.

1958 E.Stahl mise a punto la tecnica della cromatografia su strato sottile.

1966 Inizia lo sviluppo della moderna tecnica della cromatografia in fase liquida ad alta prestazione.

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J. Calvin Giddings (1930-1996)

R.A. Dewar (1908-1981) I.G. McWilliam (1933) V. Pretorius (1928-1989)

Il rivelatore a ionizzazione di fiamma fu inventato indipendentemente da due gruppi di ricercatori in Australia e Sud Africa

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Nel 1957 M:J.E. Golay realizza le colonne capillari di vetro e ne sviluppa la teoria

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-James Lovelock in 2005

Basi del procedimento cromatograficoIl campione è introdotto nella fase mobile, che può essere un gas, un liquido o un fluido supercritico.

La fase mobile viene fatta eluire in continuo attraverso la fase stazionaria, che deve essere immiscibile nell’eluente.

La fase stazionaria (liquida o solida) si trova all’interno di una colonna oppure è supportata su una superficie piana.

La fase mobile e la fase stazionaria sono scelte in modo che i componenti della miscela da separare si distribuiscano tra le due fasi i componenti più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in

questa fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistema i componenti più affini alla fase mobile si sposteranno invece più

velocemente

La separazione dei componenti avviene in quanto ogni sostanza ha una distribuzione caratteristica tra le due fasi (costante di ripartizione Kd=Cs/Cm)

Visualizzazione della separazione

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Ponendo all’uscita della colonna un rivelatore che misuri la concentrazione del soluto nell’eluato (cioè la fase mobile che esce dalla colonna) e riportando il segnale in funzione del tempo si può ottenere un cromatogrammaLa posizione dei picchi sull’asse dei tempi, o tempo di ritenzione, serve per identificare i componenti del campioneL’area sottesa dai picchi è proporzionale alla quantità di ogni singolo componente e può essere utilizzata a scopo quantitativo

Forma generale delle isoterme di adsorbimento

ISOTERME DI RIPARTIZIONE

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Picco gaussiano

ISOTERME NON LINEARI

PRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIA

Esempio: separazione di un campione a tre componenti in una colonna chiusa. La fase stazionaria consiste di particelle solide porose contenute all’interno di un tubo lungo e sottile (colonna). Nel passaggio attraverso la colonna ogni componente X si distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la mobile (m):

Xm Xs

A: il campione viene iniettato all’entrata della colonnaB D: la fase mobile fa spostare il campione attraverso la fase stazionaria

A B C D

Flus

so d

el s

olve

nte

m

sX [X]

[X]K

Il coefficiente di ripartizione (o di distribuzione) del componente X è definito come:

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Tempo di ritenzione

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Il tempo di ritenzione tR è il tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector. Un tipico cromatogramma per una miscela a due componenti ha due situazioni diverse:

• il picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcuna interazione con la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempo morto, tM

• il picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazione con la fase stazionaria ed esce al tempo tR > tM

Un parametro importante che viene usato molto spesso per descrivere la velocità di migrazione dell’analita lungo la colonna è il fattore di capacità, k’.

Due sostanze saranno separabili se presentano valori diversi di k’.

M

SAA V

VK

mobilefasenellaAdimoliditotalen

astazionarifasenellaAdimoliditotalen'k

M

MRA t

tt'k

La selettività quantifica l’entità della separazione fra due specie: riguarda la capacità di un sistema cromatografico di distinguere fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (tR)B> (tR)A.

MAR

MBR

A

B

t)t(

t)t(

'k

'k

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poiché CS / CM = KA .

VS / VM = ψ; k’A = KA × ψ.

Ma k’ è anche uguale al rapporto dei

tempi, per cui

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Se con Q indichiamo la portata della fase mobile (in inglese “flow rate”), Q

= V/t; t =V/Q, ed essendo Q=costante, se indichiamo il volume di ritensione

con VR ed il volume di fase mobile con VM, abbiamo

tR – tM / tM = VR - VM / VM = KA × VS / VM

VR - VM = KA × VS; V’R = KA × VS

RELAZIONI TERMODINAMICHE

La costante di equilibrio tra le fasi può essere messa in relazione con la energia libera del processo

(funzione di Gibbs)

log K = - ΔG0/2,3RTE ricordando la relazione tra K e k’

log k’ = log VS/VM - ΔG0/2,3RT

Log k’ = logψ - ΔH0/2,3RT + ΔS0/2,3R

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log K = - ΔH0/2,3RT + ΔS0/2,3R

log VR’ = - ΔH0/2,3RT + ΔS0/2,3R – log Vs

Ma anche

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EQUILIBRI CHIMICI SECONDARI

Quando più di un processo contribuisce alla ritenzione, trascurando gli effetti di correlazione, possiamo scrivere:

k’ = Σi ψi Ki = Σi k’ i

Se fi e fj sono, rispettivamente, la frazione di soluto in forma i e j si ha:

k’ = fi k’i +fj k’j Es.

AH ↔ A– + H+ ; Ka = [A–] [H+] / [AH] ; f– = [A–] / [AH] + [A–]

f– = 1/{1 + ([H+] / Ka)} ;

k’ = 1/{1 + ([H+] / Ka)} k’ A–+ (1 - f–) k’ AH29

Dispersion Forces• London's dispersion forces arise from charge fluctuations throughout a

molecule resulting from electron/nuclei vibrations.

Ud = 3hν0α2 /4r6

• where (α) is the polarizability of the molecule,• (ν0) is a characteristic frequency of the molecule,• (h) is Plank's constant,• and (r) is the distance between the molecules

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Dipole-Dipole Interactions

• The interaction energy (UP) between two dipolar molecules is given, to a first approximation, by

• Up =2α2µ2 /r6

• where (α) is the polarizability of the molecule,• (µ) is the dipole moment of the molecule,• and (r) is the distance between the molecules.

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Dipole-Induced-Dipole Interactions

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Ionic Forces

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Interazione soluto-fasi

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Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se così non fosse non ci sarebbe trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni:

In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità delle due fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello stesso processo cromatografico

• legami a idrogeno

• interazioni dipolo-dipolo

• interazioni dipolo-dipolo indotto

• forze di Van der Waals

• formazione di composti di interazione

• attrazione coulombiana

• interazioni steriche

Hydrophobic and Hydrophilic Interactions

• n-heptane and water are immiscible, not because water molecules repel n-heptane molecules, they are immiscible because the forces between two

n-heptane molecules and the forces between two water molecules are much greater than the forces between a n-heptane molecule and a

water molecule. Thus, water molecules and n-heptane molecules interact very much more

strongly with themselves than with each other.

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Molecular Forces and Chromatographic Selectivity

• To choose a suitable stationary phase for a particular separation it is necessary to select a substance with which the solutes will interact relatively strongly. If the solutes to be separated are predominantly dispersive, then a hydrocarbon-like stationary phase would be appropriate.

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Chromatogram of the Hydrocarbons Contained in Unleaded Gasoline Using a Dispersive (Non-polar)

Stationary Phase

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Two separations by GC illustrate the different selectivity that can be obtained by using dispersive or polar stationary phases

Polyethylene Glycol (polar) Carbopack (dispersive)

IONIC INTERACTION

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Meccanismi della separazione

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In base ai tipi di interazione prima descritti possiamo suddividere i meccanismi di separazione impiegati in cromatografia in:

Il meccanismo di esclusione dimensionale è dovuto solo all’ingombro sterico è non prevede interazioni con la fase stazionaria .•adsorbimento

•ripartizione

•scambio ionico

•affinità

•esclusione

AdsorbimentoLa fase stazionaria è un solido di granulometria piccola, impaccato in colonna o steso su un supporto; sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi che possono stabilire legami deboli (reversibili!) con le molecole della miscela da separare. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento, che può essere gas-solido o liquido-solido a seconda della natura dellafase mobile

La cromatografia di adsorbimento è utilizzata per separare sostanze neutre polari o non polari, di natura organica o inorganica

RipartizioneLa fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare inerte o è ad esso chimicamente legato; in questo liquido le molecole da separare sono solubili; la fase stazionaria e la fase mobile devono invece essere immiscibili. Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo la diversa solubilità di ognuna. Si parla quindi dicromatografia di ripartizione, che può esseregas-liquido o liquido-liquido a seconda dellanatura della fase mobile

Scambio ionico

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La fase stazionaria è costituita da un polimero o da silice contenente siti attivi ionizzati o ionizzabili, i cui controioni possono essere scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno. Il meccanismo di separazione è basato sulla competizione per i siti di scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel campione. Si parla di cromatografia di scambio ionico (IEC)

La cromatografia a scambio ionico è impiegata per la

separazione di sostanze ioniche o ionizzabili

Affinità

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In questo caso si utilizzano reazioni di tipo chimico o biochimico, reversibili e molto specifiche, in modo che le molecole da separare interagiscano con la fase stazionaria e si ottenga così l’eluizione selettiva di alcuni componenti della miscela. Si parla di cromatografia di affinità (AFC)

La cromatografia di affinità è impiegata nella separazione di molecole di interesse prevalentemente biochimico

Esclusione dimensionale

La fase stazionaria è un solido poroso o un gel. Le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori se le loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un certo tempo; le molecole più grandi sono invece escluse dai pori ed escono dalla colonna in tempi brevi

Si parla di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) con le varianti Gel permeazione per la separazione di sostanze insolubili in acqua e Gel filtrazione per la separazione di sostanze solubili in acqua

La tecnica è impiegata per la separazione di molecole di grandi dimensioni

CLASSIFICAZIONE DEI METODI CROMATOGRAFICI

Non è più usata

Equilibrio tra le fasi

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FASE 1

FASE 2

Equilibrio

prima dopo

Concentrazione 0 C1

Volume V1 V1

Concentrazione C0 C2

Volume V2 V2

Dc = C1/C2, dove C indica la somma della concentrazione delle varie forme in cui può essere presente la sostanza che si ripartisce tra le fasi.