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CROMATOGRAFIA

Cromatografia: insieme di tecniche che consentono di separare composti chimici, componenti in campioni complessi e miscele, ai fini di unanalisi sia qualitativa che quantitativa.

Cenni storici: nasce nel 900, grazie aL botanico di origine russa M. Tswett che coni il termine cromatografia, dal greco kroma: colore, graphein: scrivere. Alla lettera: scrittura del colore. Riusc infatti a separare i pigmenti fogliari mediante una colonna di vetro impaccata con una matrice solida.

campione t1 t2 t3

Sistema di rivelazione

Ripartizione differenziale tra fase mobile e fase stazionaria : K(r) = Cs/Cm

Separazione: principio di ripartizione tra due fasi ,

FASE MOBILE e fase fissa, FASE STAZIONARIA.

Levoluzione di questa tecnologia, basata su uno schema alla base semplicissimo, ha dato origine a metodiche altamente diversificate e versatili per consentire la separazione ottimale di composti specifici o gruppi di composti, con caratteristiche chimiche vicine, contenuti nei campioni da analizzare.

Separare/identificare/quantificare molecole di varia natura e origine in campioni biologici, fluidi corporei o cellule, estratti di plasma, siero

e tissutali - miscele molto complesse

CROMATOGRAFIA E CHIMICA CLINICA

endogene: neurotrasmettitori, ormoni, metaboliti; ex.: catecolamine(noradrenalina, dopamina, etc..); ormoni steroidei (ex. neurosteroidi) ; metaboliti (ex. amino acidi, basi azotate e nucleotidi, colesterolo); peptidi; ex.: neuropeptidi (vasopressina, ossitocina, etc..); glutatione (tripeptidi).. esogene: farmaci, sostanze tossiche, inquinanti organici, nutrienti, ex: antidepressivi, antitumorali monitoraggio terapeutico; pesticidi, ftalati tossicologia; vitamine, luteina monitoraggio stato nutrizionale.

Molecole a basso PM: ~ 1500 Da:

Molecole a moderato PM: ~ 2000 PM 5000 Da

endogene: peptidi antimicrobici difese innate (ex. defensine); peptidi intestinali e dellappetito (NPY, etc..) ; polisaccaridi a medio PM; lipidi esogene: peptidi microbici o di origine infettiva microbiologia ; beta-glucani - nutrizione

Molecole ad alto PM: > 5000 Da

endogene: macromolecole , proteine, acidi nucleici, zuccheri in fluidi corporei e tessuti etc.. - ricerca clinica esogene: macromolecole di origine esogena ricerca clinica

Classificazione della CROMATOGRAFIA: in base alla forma del supporto cromatografico che contiene la

fase stazionaria e in base allo stato fisico della fase mobile

Cromatografia su colonna - stato fisico fase mobile: Cromatografia Liquida (Liquid Chromatography , LC) Gas cromatografia (Gas Chromatography, GC) Cromatografia Supercritica (Supercritical Fluid Chromatography, SFC)

Supporto cromatografico fase stazionaria: Cromatografia planare: su strato sottile, su gel o su carta (Thin-Layer Chromatography, TLC; Paper Chromatography); Cromatografia su colonna: colonna contenente la fase stazionaria, una matrice di varia natura in base al tipo di cromatografia

-Adsorbimento - ripartizione Siti attivi sulla fase stazionaria, trattenimento selettivo delle molecole da separare nel campione o nella miscela. Idrofobicit-polarit delle molecole da separare, della fase mobile e della fase stazionaria. Fase normale fase inversa.

-Scambio ionico Presenza di cariche sulla fase stazionaria e competizione tra molecole ioniche del campione da separare e della fase mobile . Forze elettrostatiche resine a scambio ionico/cationico e anionico.

-Esclusione Gel filtrazione, permeazione. Matrice inerte. Separazione in base al peso molecolare.

-Affinit fase stazionaria inerte coniugata con molecole-ligandi che legano in modo specifico le molecole da separare. Ex.: Reazione Antigene- anticorpo. Separazione e purificazione di macromolecole biologiche.

Cromatografia Liquida su colonna : classificazione

Applicazioni prevalenti in base al PM e polarit o carica degli analiti da separare

Cromatografia preparativa ; cromatografia analitica

Idrofobici Idrofilici

Apolari Ionici

Polari non ionici

adsorbimento

ripartizione

scambio ionico

fase inversa C4-C18

fase normale

esclusione

gel permeazione gel filtrazione

102

103

104

105

106

Polarit

affinit

Distinzione in base al meccanismo di separazione :

Pes

o m

ole

cola

re (

Da)

CROMATOGRAFIA SU COLONNA a pressione atm

Raccolta di frazioni, rivelatore

Lavorando a pressioni molto pi elevate della pressione atmosferica, ex. 1200 psi , ha migliorato la prestazione della cromatografia e la quantificazione di molte sostanze in tempi molto pi brevi.

HPLC

http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=cromatografia+su+colonna&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0CAcQjRxqFQoTCIj0u96-q8gCFQRXFAodVd0LQA&url=http://slideplayer.it/slide/571434/&psig=AFQjCNGf9nbFGwqdpa6F_n9IOWZCPcPfrg&ust=1444139960614151http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=raccoglitore+di+frazioni+cromatografiche+automatico&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0CAcQjRxqFQoTCLfOsOv-qsgCFQdOFAod-KULPg&url=http://it.aliexpress.com/promotion/fashion-beauty_distillation-pressure-promotion.html&psig=AFQjCNEUz3Gd9RLuTbE8dF53zX9VfFYpkA&ust=1444122779989397

Sign

al

Time, min 1 2 3 4 5 6 7 8

3000

2500

2000

1500

1000

500

0

Ap TR

TR

Linea di base

TM

H

WH

Wb Fs

H/2

IL CROMATOGRAMMA E IL PICCO ANALITICO Caratteristiche salienti

del picco analitico

Ap= Apice del picco;

H= Altezza del picco, distanza tra la linea di base e A; H/2: met

altezza del picco; segnale del rivelatore

W1/2: Ampiezza del picco

(min), presa a H/2; Wb: Ampiezza alla base

del picco (min), presa alle tangenti dei punti di

flesso alla base dl picco.

Caratteristiche del cromatogramma: Fs = Fronte del solvente; TM: o t0, definizione: tempo morto o tempo necessario affinch una molecola non trattenuta dalla fase stazionaria attraversi V0= volume morto della colonna; TR: tempo di ritenzione della sostanza (analita): TM + TR = TR, dove TR = distanza tra Fs e punto intersezione della perpendicolare da Ap sulla linea di base.

BASI TEORICHE: equazioni che definiscono le caratteristiche di ELUIZIONE, RISOLUZIONE e SIMMETRIA dei picchi degli analiti.

Efficienza della colonna analitica: Piatto teorico: sezione di colonna che in grado di creare un

equilibrio di ripartizione tra le due fasi degli analiti . Ampiezza del picco Wb e TR : N= 16 (TR/Wb), dove N= numero di piatti teorici , espresso anche come altezza del piatto teorico H =

L/N, con L = lunghezza della colonna (cm); da cui: N= L/H Neff = 16 (TR/Wb)

2 , formula del numero di piatti teorici effettivi. Formula considerando W1/2 Neff = 5.55 (W1/2/ TR)

2

Altezza di un piatto teorico effettivo: H = L/Neff o L/16 (Wb/TR)

2 pi piccola, pi i picchi sono stretti e meglio risolti. Equazione che definisce i piatti teorici in

funzione dei tempi di rit.

CARATTERISTICHE DI ELUIZIONE E RISOLUZIONE

Fattore di capacit: K = (V V0/V0) oppure (t-t0/t0), dato dal grado di ripartizione tra fase stazionaria e fase mobile

Equazione di Van Deemter (LC/HPLC): allargamento del picco

H= A/(1 + Cm/u1/2) + B/u + Csu + Cmu

1/2 H = altezza piatto teorico ed efficienza colonna; pi H un valore

basso tanto pi lefficienza della colonna elevata

A = Diffusione di Eddy o diffusione erratica : delle molecole trasportate nella fase mobile; queste possono seguire percorsi diversi, ex. lineari o tortuosi; B= Diffusione longitudinale; dispersione delle molecole rispetto al flusso della fase mobile; a bassi flussi ha un peso nellequazione: B/u; Cs , Cm = Diffusione data dallaffinit differenziale di una molecola per la fase mobile o per la fase stazionaria; effetto maggiore quanto pi veloce il flusso della fase mobile: Csu e Cmu1/2, specie per Csu. Cs= d2 spessore/Ds; Cm= d2impaccamento/Dm

u= velocit lineare della fase mobile; A, B e C: fattori che concorrono allallargamento del picco e alla diminuzione dei piatti teorici;

B/u

Csu

Risoluzione dei picchi e selettivit:

Fattore di asimmetria - Tailing factor:

Risoluzione =

(tr/Wm) = 0.589 tr/Wm1/2

Fattore di asimmetria

1.5

TF = AB/2AC

fronting

tailing

5%H . . . A B C

Picchi simmetrici

H/2

H

min min

min

1.0

CARATTERISTICHE DI SIMMETRIA

Alta velocit, alta produzione , alta risoluzione analitica

Colonne analitiche e sistemi U(H)PLC e nano-HPLC:

Potenziamento tecnologico del sistema

Colonne analitiche con caratteristiche chimico-fisiche peculiari

Rivelatori ad alte prestazioni

High Performance/Pressure - Liquid Chromatography cromatografia liquida ad alta prestazione/pressione

Principali tipi di rivelatore:

Waste

U(H)PLC Nano-HPLC

colonne

HPLC Column

Colonna analitica per nano-HPLC

Pre-colonna in linea

Pompa

Colonne analitiche:

Cromatografia di ripartizione in fase normale o inversa:

RP-LC: Reversed-phas