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Maracaibo, febrero 2018

Análisis Instrumental

Profa. Cristina Uzcátegui Arrieta

TEMA 10 Y 11

¿QUÉ ES LA CROMATOGRAFÍA?

Agrupa un conjunto importante y diverso de métodos, que permite a los científicos separar componentes estrechamente relacionados en

mezclas complejas

IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)

CROMATOGRAFÍA

Método utilizado inicialmente para la separación de los componentes de una muestra, en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve. La fase estacionaria puede ser un sólido, un líquido sobre un soporte sólido o un gel. La fase estacionaria puede estar contenida en una columna, extendida en forma de capa o dispuesta en forma de película. La fase móvil puede ser gaseosa o líquida.

CROMATOGRAFÍA

Mikhail Tswett, 1906

Separación de los pigmentos vegetales

coloreados

Chroma = Color Graphein = escribir

CROMATOGRAFÍA Martin y Synge (1941) Aplicaron técnicas cromatográficas para estudiar la composición de aminoácidos en lana. Idearon la cromatografía de reparto.

En 1952 recibieron el permio Nóbel en Química. iniciaron los estudios de cromatografía de reparto líquido-gas.

En 1954, Giddings planteó la hipótesis que sería posible aplicar a la cromatografía de líquidos los mismo factores que hacían a la cromatografía de gases una poderosa técnica de separación. Fue el inicio de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

EVOLUCIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA

Cromatografo de gases con espectrofotómetro de masas

Equipos para HPLC

Desde la columna sencilla de Tswett, se ha evolucionado hasta los modernos equipos que hoy se conocen

COLUMNA Eluato Eluyente

Fase móvil

Fase estacionaria

Líquido o gas que transporta los analitos a través de una

fase estacionaria.

Sólido o líquido inmovilizado sobre el cual se reparte la

especie de analito durante el paso de una fase móvil.

Las interacciones química cruciales tienen lugar en la superficie de la fase

estacionaria.

En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se desplaza con una fase móvil que se hace pasar a través de una

fase estacionaria

TÉRMINOS BÁSICOS EN CROMATOGRAFÍA

Cromatografo Instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica.

Cromatograma Representación gráfica de la composición de los solutos que salen de una columna cromatográfica en función del tiempo.

Eluir Proceso en el que la fase móvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria transportando los componentes a separar.

Eluyente Disolvente aplicado al principio de una columna cromatográfica.

Detector Aparato que registra una propiedad físico-química del material eluido.

MÉTODOS INSTRUMENTALES

Entrada de la fase móvil

DETECTOR

Cromatograma

a

b

REPRESENTACIÓN DE UN CROMATOGRAMA

Tiempo de retención (tR): Representa el tiempo transcurrido entre el instante de inyección y el determinado cuando el pico correspondiente en el cromatograma alcanza su máximo.

Res

pu

esta

del

det

ecto

r

La separación de los componentes de la muestra problema se debe a la acción de dos efectos

contrapuestos

Efecto de retención Efecto de

arrastre

Ejercido por la fase móvil que

los empuja a través del camino recorrido.

Ejercido sobre los componentes de la mezcla

por la fase estacionaria que está situada en el soporte.

TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

Según el dispositivo utilizado para poner en contacto la fase

estacionaria y la fase móvil

Según el mecanismo de interacción del soluto

con la fase estacionaria

Según los estados de las fases implicadas

FASE MÓVIL

FASE ESTACIONARIA

SOPORTE

NOMBRE

CROMATOGRAFÍA

GAS LÍQUIDO

Líquido Sólido

Adsorbente

Columna Columna

Reparto Adsorción

C.G.L c.gas-líq

C.G.S c.gas-sól

Líquido Sólido

Columna

Reparto

C.L.L c.líq-líq

Plano

Reparto

C.P c. papel

Adsorbente Resina Gel

Columna

Adsorción

C.C. F. c. capa

fina

C.L.S c. liq-sól

Intercambio

iónico

Tamaño

molecular

C.C.I c. cambio

iónico

C.E.M c. exclusión

molecular

Figura tomada de Hernández, L. Introducción al análisis instrumental. 2002

CLASIFICACIÓN DE LOS SISTEMAS CROMATOGRÁFICOS

Tipos de cromatografía

Según el dispositivo utilizado para conseguir poner en contacto la fase estacionaria y fase móvil:

Cromatografía Plana

Cromatografía en columna


CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Consiste en columnas huecas de longitud y diámetro variable en cuyo interior encontramos la fase estacionaria. La fase móvil se hace pasar por ellas ya sea por gravedad o por aplicación de presión.


Diluyente puro

Banda inicial con los solutos

A y B

Empaquetado de la columna (fase estacionaria) suspendida

en el disolvente (fase móvil)

Disco poroso

Emerge B Emerge A

A

B

Representación esquemática de una separación cromatográfica

Figura tomada de Harris, D. Análisis químico cuantitativo. 2007

CROMATOGRAFÍA PLANA

La fase estacionaria se encuentra sujeta por una placa plana o en papel (cromatografía en capa fina y en papel, respectivamente) y la fase móvil se desplaza por ella mediante capilaridad o influenciada por la gravedad.



CROMATOGRAFÍA PLANA


Cromatografía en Capa Fina (TLC)

Fase estacionaria Fase móvil

Gel de sílice, celulosa, alúmina depositado sobre un soporte plano (lámina de aluminio o plástico)

Ácido acético, agua, éter dietílico, metanol, benceno

Cromatografía en Papel

Fase estacionaria Fase móvil

Hoja de papel de celulosa de elevada pureza recubierta de una capa de agua

Agua, etanol.

Según los estados de las fases implicadas, en especial de la fase móvil

CROMATOGRAFÍA DE GASES

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS

SUPERCRÍTICOS

Líquido-sólido, Líquido-líquido,

Intercambio iónico, Exclusión molecular.

Cualquier sustancia que se encuentre en

condiciones de presión y temperatura superiores a su punto

crítico.

Gas-líquido Gas-sólido


MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA

Adsorción

Reparto

Intercambio iónico

Exclusión molecular

Afinidad


Cromatografía de adsorción El soluto presente en una fase móvil líquida o gaseosa se adsorbe a las partículas sólidas de la fase estacionaria. La separación de los diferentes solutos se debe al equilibrio entre las fases estacionaria y móvil.

Cromatografía de reparto Los componentes de la fase móvil son retenidos por la fase estacionaria liquida en función de su solubilidad en ella. Si las dos son liquidas se tiene un proceso de extracción en continuo.


LO SIMILAR ES SOLUBLE EN LO SIMILAR

Cromatografía de intercambio iónico consiste en hacer pasar una fase móvil líquida sobre una fase estacionaria que presenta grupos iónicos en su superficie de modo que los iones de signo opuesto quedarán retenidos por fuerzas electrostáticas.


Cromatografía de exclusión molecular Las moléculas de cierto tamaño presente en la fase móvil líquida o gaseosa son excluidas por la matriz que presenta poros de un determinado tamaño, impidiendo así su paso por el gel y, por tanto, acortando su tiempo de retención.


Cromatografía de afinidad Se basa en la unión reversible entre el analito de interés y un ligando específico, inmovilizado en un soporte sólido inerte. Ejemplo: Anticuerpo-proteína.

Instrumentación Cromatográfica

CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC)

La cromatografía de gases incluye todos los sistemas cromatográficos en los que la fase móvil es un gas.

La muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte.

La fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportarlo a través de la columna.


CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC)

HORNO


Cromatografo de Gases

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN


Dentro de las cromatografías cuya fase móvil está constituida por un líquido, destaca la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC, High Performance Liquid Chromatography)

Esta técnica de separación y análisis consiste en hacer pasar una muestra líquida, o sólida disuelta, en un disolvente adecuado junto con una fase líquida móvil por una columna cromatográfica.

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) High Performance Liquid Chromatography


Bomba

Detector Reservorio del

solvente

Eluente

Desgasificador

Inyección inyector

Columna

Horno para la columna

Desechos


Cromatografo HPLC

APLICACIONES

Investigación

Bioquímica

Química Control

de calidad

APLICACIONES

Farmacia: antibiótico, sedantes, esteroides y analgésicos. Bioquímica: aminoácidos, proteínas, carbohidratos y lípidos. Alimentos: edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas y aditivos. Compuestos industriales: aromáticos condensados, agentes tensoactivos, agentes propulsores, y colorantes. Contaminantes: plaguicidas, herbicidas, fenoles, bifenilos policlorados. Química forense: drogas, venenos, alcohol en la sangre y narcóticos. Medicina Clínica:. Sales biliares, metabolitos de medicamentos, extractos de orina y estrógenos.

Cromatografía Gas Líquido: análisis cualitativo y cuantitativo de mezclas complejas de compuestos orgánicos Alimentos: para determinar especies volátiles, que en muchas ocasiones son responsables de olores y sabores característicos, para determinación de lípidos y ácidos grasos mediante procesos de derivatización. Análisis de drogas junto con HPLC Para la determinación de alquitranes, pinturas, películas fibras sintéticas mediante pirolisis. Para el seguimiento y el control de contaminantes en el medio ambiente (polutantes del agua, contaminación atmosférica)

APLICACIONES

La electroforesis se basa en la migración de iones presentes en una disolución por la acción de un campo eléctrico.

Modificando convenientemente las condiciones de una electroforesis se pueden separar moléculas neutras e iones, así como isómeros ópticos, y disminuir los límites de detección.

Electroforesis Elektro: Electricidad Phoros: Movimiento

Esta técnica fue introducida por el bioquímico sueco Arne Tiselius. Su interés principal fue la química de las proteínas séricas. Recibió el premio Nobel en el año 1948 por su gran contribución en el desarrollo de la técnica de electroforesis y por la importancia de su hallazgo sobre la naturaleza compleja de las proteínas del suero.

Método de separación de:

Proteínas

Ácidos nucleicos

Otras biomoléculas

Permite determinar: • Peso molecular de una proteína • Punto isoeléctrico • Distinguir moléculas por su carga neta o su forma

Electroforesis Separación de especies cargadas, anión (-) y catión (+)

Movimiento al cátodo (-) o al ánodo (+)

Influencia de campo cargado eléctricamente

Cátodo Ánodo

- +

+

+

-

-

Técnica de separación que consiste en el transporte de iones a través de una disolución por acción de un campo eléctrico.

FUNDAMENTO

La electroforesis separa moléculas según su relación carga:masa

Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una velocidad determinada por su relación carga:masa.

Por ejemplo: si dos moléculas tienen masa y formas iguales, la de mayor carga neta se desplazará más rápido hacia un electrodo

La movilidad electroforética (μe) depende de:

• La carga de la molécula, su tamaño y su forma. * la carga, a su vez, depende del pH de la disolución.

LA VELOCIDAD DE MIGRACIÓN (V) DE LA PARTÍCULA es directamente proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la forma de la molécula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio.

V = q E / f

FUNDAMENTO

El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales: inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone, por otro lado las moléculas poseen energía cinética propia por lo que tienden a moverse en forma aleatoria o movimiento browniano

FUNDAMENTO

PARÁMETROS QUE INFLUYEN EN LA MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA

Parámetros externos

- Campo eléctrico

- Temperatura

Parámetros relacionados con el solvente y con el sistema electroforético

- Viscosidad -Fuerza iónica

-La naturaleza de los iones componentes -El pH

Parámetros relacionados con el soluto

- La carga - La forma y el tamaño de los iones

Carga: cuanto mayor sea la carga, mayor será la movilidad,

además su carácter catiónicos o aniónicos determinará la dirección del desplazamiento.

Tamaño y forma de las partículas: el tamaño del ión es un

factor decisivo; cuanto menor sea un ión mayor será su movilidad.

Fuerza iónica y pH del solvente: la mayoría de las

biomacromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos) poseen determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y catiónicos capaces de disociarse.

La velocidad de migración electroforética depende de los siguientes FACTORES:

Temperatura: el aumento de la temperatura puede traducirse en destrucción, o en la alteración de sus características (estructura, función, entre otros) de las que depende la movilidad electroforética.

Viscosidad del medio: al disminuir la viscosidad aumenta la

movilidad. Voltaje: no se puede incrementar indiscriminadamente porque se

genera un excesivo calor.

FACTORES:

DIFUSIÓN Esta provocado por la existencia de gradientes de concentración

que favorecen el transporte hacia las zonas de menor concentración de cada especie.

Afecta tanto a partículas cargadas como no cargadas. Las moléculas tienen a moverse en forma aleatoria (movimiento

browniano) debido a que poseen energía cinética propia

Fenómenos que pueden originarse en el sistema electroforético

CONVENCIÓN: Se trata de un fenómeno no deseable en electroforesis. Consiste en el transporte de todo tipo de especies, cargadas y no cargadas.


MIGRACIÓN: Es el movimiento de las especies producido por una fuerza externa que es impuesta al medio, en este caso, el campo eléctrico y su intensidad.

FRICCIÓN La fricción con el solvente dificultará el movimiento (es decir, al moverse los solutos chocarán con las moléculas de solvente que están en su camino), lo que genera una fuerza que se opone al movimiento.

FLUJO TÉRMICO Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que origina una resistencia dada, se produce calor. Por tanto, el sistema electroforético no es isotérmico.


Electroforesis libre (en disolución)

Métodos

Electroforesis Zonal (sobre un medio soporte)

Geles (a través de una matriz porosa)

Sílice En Papel

Agarosa Policramida

Electroforesis libre: sin la presencia de soporte

Las moléculas cargadas migran hacia los electrodos, aunque no bien separadas por tratarse de una disolución. Actualmente está en desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se desarrolla, tiene poco poder de resolución.

Tiselius

Electroforesis zonal: presencia de soporte

Es una de las técnicas más utilizadas en bioquímica y biología molecular por su elevada resolución. El campo eléctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante (en vez de a un fluido) y la muestra se deposita en una reducida zona del mismo.

Medios de Soporte

Soportes no restrictivos

• Porosidad del soporte mucho mayor que el tamaño de las moléculas.

• No ofrece restricción al avance de las moléculas.

• Se separan dependiendo de su densidad de carga.

Soportes restrictivos

• Poros de tamaño similar al de las moléculas.

• Efecto de tamizado durante el avance.

• Se separan dependiendo de su tamaño.

Ejemplo: acetato de celulosa (para proteínas), agarosa (para proteínas)

Ejemplo: Agarosa (para ácidos nucleicos), poliacrilamida (para proteínas)

Medios de Soporte

Papel

Método sencillo y rápido

Separación de: • Proteínas • Oligonucleótidos • Carbohidratos • Lípidos

Desventajas

• Se desgarra fácilmente • Distorsiona las bandas • Se produce interacción entre

las proteínas y los grupos hidroxilo de la celulosa

Electroforesis en Papel

Medios de Soporte

Acetato de Celulosa

Se usa en el análisis de fluidos biológicos (proteínas séricas, proteínas urinarias, hemoglobinas).

Tiempo de análisis corto.

Sencillez en la técnica.

Desventaja: débil resolución

Gran parte de los grupos hidroxilo de la celulosa se han esterificado por acetilación, por lo que no hay

interacción con las proteínas

Medios de Soporte

Gel

Almidón

Poliacrilamida • Soporte más usado en

electroforesis. • Alta resolución. • Componentes tóxicos

Agarosa

• Buena resolución • Separación de moléculas

grandes (virus, ácidos nucleicos).

• Técnica económica, fácil y rápida.

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE)

Polimerización de acrilamida

Químicamente inertes

Geles de porosidad controlable

Forma geles transparentes Permiten buena visualización

Electroforesis en Gel de Agarosa

Polisacárido obtenido de algas

Separa moléculas grandes (20 000 nucleótidos)

Actúa en forma restrictiva frente a las fibras de ADN

Presentan mucha carga negativa (migran hacia el ánodo)

TIPOS DE ELECTROFORESIS

Electroforesis en gel

Isoelectroenfoque

Electroforesis capilar

Electroforesis bidimensional

Cubeta vertical u horizontal donde se

coloca el soporte

Buffer

Estándares y muestra

Fuente de poder

2 electrodos

Sistema de revelado y lectura

(Detector)

COMPONENTES DE UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO

Cubeta vertical u horizontal

donde se coloca el soporte

Buffer

Estándares y muestra

Fuente de poder

2 electrodos

Sistema de revelado y lectura

(Detector)


ESQUEMA DE EQUIPO DE ELECTROFORESIS CAPILAR

Muestras y Estándares

Electrolitos

Detección UV

Temperatura constante (20 – 30º C)

Capilares de sílica (75 μm x 60 cm)

Electroforesis capilar

VENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR

Alta resolución.

Requiere pequeño volumen de muestra.

Rápida separación.

Automatización.

Reproducibilidad.

Puede acoplarse a otros equipos, como espectrometría de masa

Proteínas.

Péptidos.

Amino ácidos.

Ácidos nucleicos.

Iones inorgánicos.

Bases orgánicas.

Ácidos orgánicos.

MOLÉCULAS QUE PUEDEN SER SEPARADAS POR ELECTROFORESIS CAPILAR

Es posible separar moléculas biológicas en dependencia

fundamentalmente de su carga bajo la influencia de un campo

eléctrico.

Método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos,

proteínas y otras biomoléculas, donde aportan un potente criterio de

pureza.

Es útil además para determinar otros parámetros como peso

molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de

las proteínas.

APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS

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