alimentos · alimentos sistemas complejos ... por semejanza con un proceso de extracción con...
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ALIMENTOS
Sistemas complejos de varios componentes intrínsecos, aditivos y sustancias formadas durante el procesamiento/almacenamiento
moléculas orgánicas, inorgánicas, biomoléculas
Identificación y/o cuantificación de uno o más componentes
Métodos de separación
EXTRACCIÓN CON SOLVENTES
Transferencia de un soluto (analito) de una fase líquida a otra, separándolo de manera diferencial de otros que pueden interferir en su análisis posterior
Se puede obtener una solución del analito de concentración adecuada para su detección (evaporación de la fase líquida de extracción, resolubilización en volumen conveniente)
Los líquidos deben ser inmiscibles (fase acuosa – fase orgánica)
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AMPOLLA O EMBUDO DE DECANTACIÓN/SEPARACIÓN
Tapón cierre hermético
Robinete
Vástago
Cuerpo
(distintos volúmenes)
Sistema bifásico
• (Di)etil éter, éter (di)etílico, éter
• Tolueno
• Hexano
FASE ACUOSA
• Cloruro de metileno, diclorometano
• Cloroformo, triclorometano
• Tetracloruro de carbono, tetraclorometano
menor
mayor
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Baño de agua termostático
Balón con solución de analito
Motor
Condensador
Entrada y salida líquido de
refrigeración
Balón de recuperación de
solvente
A bomba de vacío
EVAPORADOR ROTATORIO
Partición o repartoProceso por el cual un soluto se distribuye entre dos fases no condensadas (líquido- líquido, líquido-gas)
Agregado de un solvente inmiscible
de menor
Agitación
Analito preferencialmente disuelto en el solvente
agregado
Separación de fases
(equilibrio)
Medio acuoso
Analito de interés
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En el equilibrio, a T constante:
S (fase acuosa) S (fase orgánica)
Coeficiente de partición o de reparto:
Si
V1 : volumen de la fase acuosa
V2: volumen de la fase orgánica
m: moles de soluto totales
q: fracción de moles de soluto que permanece en la fase acuosa luego de la extracción
[Sorg]
[Saq] K = (1)
Entonces, la concentración molar del soluto en la fase acuosa es:
[Saq] = m q / V1
Y la concentración molar del soluto en la fase orgánica es:
[Sorg] = m (1-q) / V2
Por lo que (1) resulta:
Despejando q:
(1 – q) / V2
q / V1
K =
V1
V1 + K V2
q =
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Supongamos que, luego de separar la fase orgánica, se agrega un nuevo volumen V 2 de fase orgánica “fresca” y se deja llegar a un nuevo equilibrio.
Puede demostrarse que la fracción de soluto que permanecerá en la fase acuosa será en este caso:
En, general, luego de n extracciones, la fracción de soluto remanente en la fase acuosa será:
V1
V1 + K V2
q2 =
2
V1
V1 + K V2
qn =
n
Efecto del pH en la extracción de solutos ácidos o básicos
HA H+ + A-
:B + H+ BH+ (base de Lewis)
Especies neutras más solubles en solventes orgánicos
Especies iónicas más solubles en medio acuoso
Ej. Un soluto ácido HA se encuentra en medio acuoso y se lo desea extraer con un solvente orgánico inmiscible. ¿Cómo afecta el pH a la extracción?
Definimos[conc. total del ácido en fase orgánica] [HA]org
Coeficiente de distribución: D = =[conc. total del ácido en fase acuosa] [HA]aq + [A-]
[H+] [A-] [HA]orgYa que: Ka = y que K = resulta: K [H+]
[HA]aq [HA]aq D =[H+] + Ka
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CROMATOGRAFÍA
CROMATOGRAFÍA
Comprende una serie de métodos analíticos utilizados para separar analitos a partir de una muestra, los que luego son, en general, identificados y/o cuantificados.
Tswett (1906)
Cromatografía: chroma "color" y graphos “dibujo"
Separación de pigmentos vegetales en columnas rellenas con CaCO3 por las que hacía pasar diferentes solventes.
Métodos basados en la afinidad diferencial de los solutos por dos fases:
Fase fija o fase estacionaria (sólido o líquido fijado a un sólido)
Fase móvil (fluído: líquido, gas, fluído supercrítico)
Clorofilas y
xantófilas
caroteno
caroteno
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Sembrado de la muestra
Elución distintos componentes de
la muestra
Empacado con fase
estacionaria
Columna Equilibrado con fase móvil
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Separación cromatográfica
Elución con fase móvil
Durante el proceso de separación cromatográfica (desarrollo o corrida) se logra separar A de B:
A eluye antes que B; es decir, A tiene un tiempo de retención menor que B (tA < tB)
Por semejanza con un proceso de extracción con solventes, cada soluto tiene una constante de distribución característica a T cte. :
KA = [A]fm / [A]fe y KB = [B]fm / [B]fe
Elución de A
(tA)
Elución de B
(tB)
Dado que tA < tB, puede deducirse que KA > KB, es decir que A tiene mayor afinidad por la fase móvil
que B (o que B pasa más tiempo retenido en la fase estacionaria que A)
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TIPOS DE CROMATOGRAFÍA(Naturaleza fase móvil y estacionaria)
Naturaleza de la fase móvil Naturaleza fase estacionaria
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA Cromatografía Líquido-Sólido (CLS)
Cromatografía Líquido-Líquido (CLL)
CROMATOGRAFÍA GASEOSA Cromatografía Gas-Sólido (CGS)
Cromatografía Gas-Líquido (CGL)
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA(Objetivos y escala)
CROMATOGRAFÍA ANALÍTICA
Separación, identificación y cuantificación de un analito
CROMATOGRAFÍA PREPARATIVA
Separación de un compuesto conocido para obtener cantidades útiles del mismo para un determinado fin
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TIPOS DE CROMATOGRAFÍA(Técnica)
CROMATOGRAFÍA LINEAL (en columna)
Se utiliza un tubo cilíndrico de diversas dimensiones, en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a su través se hace pasar la fase móvil (líquida o gaseosa) que percola ya sea por capilaridad, gravedad o presión.
CROMATOGRAFÍA PLANA (bidimensional)
La fase estacionaria se encuentra como una superficie plana sobre la que la fase móvil (líquida) se desplaza por capilaridad (cromatografía ascendente) o por capilaridad y gravedad (cromatografía descendente).
Cromatografia en papel (CP)Cromatografia en capa fina o delgada (CCF, TLC)
COLUMNAS CONVENCIONALES PARA CROMATOGRAFÍA
(vidrio, plásticos)
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COLUMNAS PARA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA Y GASEOSA
(metales, polímeros)
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA PREPARATIVA
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA SEMIPREPARATIVA
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL (ascendente)
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CROMATOGRAFÍA EN PLACA FINA (ascendente)
Solvente (fase móvil)
Fase estacionaria sobre soporte inerte
Cuba de desarrollo
Ascenso de fase móvil por
capilaridad
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TIPOS DE CROMATOGRAFÍA(Fenómenos de separación)
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
Los solutos se distribuyen entre una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida o gaseosa. La separación resulta de la mayor o menor adsorción de los solutos sobre la fase estacionaria sólida (fuerzas de van del Waals).
CSL (en columna y TLC)CSG
• Fase estacionaria: Sólido adsorbente (sílice o alúmina)
• Adecuada para compuestos no polares (PM < 5 000)
• Aplicaciones:
Separación de compuestos con diferentes grupos funcionales
Diferenciación de compuestos isómeros en mezclas
CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN o REPARTO
Los solutos se distribuyen entre una fase estacionaria líquida y una fase móvil líquida o gaseosa. La separación resulta de la mayor o menor solubilidad de los solutos en la fase estacionaria líquida (interacciones dipolares)
CLL CLG
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA(Fenómenos de separación)
CLL
• Fase estacionaria líquida recubre soporte inerte• Modalidad en columna poco usada por pérdidas de fase estacionaria (“bleading”)• La cromatografía en papel corresponde a este tipo (fase móvil líquida, fase estacionaria: agua ligada a la celulosa)
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CROMATOGRAFÍA DE FASE ORGÁNICA QUÍMICAMENTE UNIDA
Fase estacionaria ligada químicamente a la superficie del soporte (a base de sílice)
Cromatografía de fase inversa: fase estacionaria no polar
Cromatografía de fase normal: fase estacionaria polar
• Cromatografía de fase inversa: ampliamente utilizada (compuestos de mediana a alta polaridad: mayoría de los compuestos orgánicos)
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA(Fenómenos de separación)
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN
De filtración en gel (fase móvil acuosa, apta para biomoléculas)
De permeación en gel (fase móvil no acuosa, apta para polímeros sintéticos)
• La separación se produce por los diferentes tiempos que invierten los solutos en atravesar la columna que contiene una fase estacionaria tipo sólido-gel poroso (tamices moleculares). Dichos tiempos dependen del tamaño molecular.
• Las moléculas que puedan ingresar a los poros eluirán a mayores tiempos que aquellas cuyo tamaño molecular no les permite ingresar a los poros.
• No existe interacción fisico-química entre soluto y fase estacionaria
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA(Fenómenos de separación)
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Las moléculas más pequeñas ingresan y salen de los poros del
gel repetidas veces
Las moléculas de tamaño intermedio ingresan y salen de los
poros, algunas veces
Las moléculas más grandes no pueden ingresar a los poros o lo
hacen muy pocas veces
Ma
yor tiem
po
de elu
ción
MECANISMO DE SEPARACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN
Ve: volumen de elución
Vo: volumen muerto
Aplicaciones
• Útil para separar biomoléculas de sustancias de bajo peso molecular (desalinización)
• Determinación de peso molecular de biomoléculas (se requiere calibración)
Estándares
Muestra
log PM
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN
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TIPOS DE CROMATOGRAFÍA(Fenómenos de separación)
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Los solutos iónicos se distribuyen entre una fase estacionaria que posee cargas (positivas o negativas) fijas y una fase móvil acuosa de acuerdo a su carga (interacciones iónicas)
Cromatografía de intercambio catiónico (fase estacionaria posee cargas negativas fijas)
Cromatografía de intercambio aniónico (fase estacionaria posee cargas positivas fijas)
Las moléculas A, con mayor carga neta, se retienen fuertemente a la resina, viajando por la columna más lentamente y eluyendo a un tiempo mayor
Las moléculas B, con carga neta intermedia, se equilibran entre la resina y la fase móvil más fácilmente, moviéndose más rápidamente que A, pero más lentamente que C
Las moléculas C, con menor carga neta, se retienen débilmente a la resina, viajando por la columna más rápidamente y eluyendo a un tiempo menor
MECANISMO DE SEPARACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
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CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO CATIÓNICO
R- C+ + X- M+ R- M+ + X- C+
R: Resina de intercambio catiónicoC: Catión de intercambioM: Muestra (debe tener carga neta positiva)X: Contraión de la muestra en la fase móvil
• Los aniones eluyen sin retención
• Los cationes eluyen en orden inverso a la magnitud de su carga neta
fase estacionaria fase móvil
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO ANIÓNICO
R+ A- + X+ M- R+ M- + X+ A-
R: Resina de intercambio aniónicoA: anión de intercambioM: Muestra (debe tener carga neta negativa)X: Contraión de la muestra en la fase móvil
• Los cationes eluyen sin retención
• Los aniones eluyen en orden inverso a la magnitud de su carga neta
fase estacionaria fase móvil
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
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CROMATOGRAMA
• Es el resultado gráfico de un análisis cromatográfico
• Permite evaluar a primera vista si la separación lograda bajo las condiciones cromatográficas utilizadas (fase estacionaria, fase móvil, T, flujo fase móvil, etc.) es la adecuada
• En una cromatografía de adsorción en columna, placa fina o papel, con analitos coloreados o que puedan visualizarse mediante algún medio (exposición a luz UV, reacción con reactivo revelador, etc.), el cromatograma se corresponde al patrón de separación logrado
Cromatogramas
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• Conectando un detector por el que pase el eluato de una columna durante un análisis cromatográfico que sea capaz de generar una señal cuando por el mismo pase un analito, se puede obtener un gráfico continuo de dicha señal en función del tiempo, el que recibe el nombre de cromatograma
• Cada señal tendrá una magnitud proporcional a la cantidad del analito que la generaSe
ñal
del
det
ecto
r
Tiempo o volumen
Picos cromatográficos
Línea de base
solvente
Punto de inyección
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
tr tiempo de retención (s, min): Tiempo necesario para la elución del máximo de la señal correspondiente a un analito desde el momento de la inyección de la muestra (t=0)
Vr volumen de retención (mL): Volumen necesario de fase móvil para la elución del máximo de la señal correspondiente a un analito desde el momento de la inyección de la muestra
w ancho de pico en la base (s, min, mL): segmento del eje horizontal delimitado por las rectas tangentes al pico.
tr , Vr
to
Tiempo o volumen
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t0 tiempo muerto: Tiempo que tarda un analito no retenido en atravesar la columna (corresponde al tiempo de elución del frente del solvente de la muestra)
V0 volumen muerto: Volumen de fase móvil correspondiente a la elución de un analito no retenido. Es el volumen de la columna no ocupado por fase estacionaria (volumen de espacios intersticiales + poros + tuberías desde el punto de inyección de la muestra hasta la entrada al detector)
Q o F flujo o caudal (mL/min): Volumen de fase móvil por unidad de tiempo que pasa por la columna
Q = Vr / tr = V0 / t0
t’r tiempo de retención corregido o ajustado: Tiempo necesario para la elución del máximo de la señal correspondiente a un analito desde el momento de elución del máximo del frente del solvente (t0)
V’r volumen de retención corregido o ajustado: Volumen necesario de fase móvil para la elución del máximo de la señal correspondiente a un analito desde el momento de elución del máximo del frente del solvente
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS CORREGIDOS
Señ
al d
el d
etec
tor
Tiempo o volumen
Punto de inyección
Solvente
t0 t’A = tA - t0
t’B = tB - t0
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PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Para cada componente del cromatograma, se define:
k’ → factor de retención o de capacidad
k’ = t’r / t0 = (tr – t0) / t0 = (Vr – V0) / V0
(Q o F: caudal o flujo = Vr/tr)
• A mayor k’, mayor retención del componente en la columna
• Útil para monitorear performance de la columna en el tiempo
Para dos componentes separados en una columna cromatográfica, A y B, donde B es más retenido que A, se define:
→ retención relativa, factor de separación o selectividad
= t’rB / t’
rA = k’B / k’A
• A mayor , mayor separación de los componentes A y B
• No depende del flujo
Relación entre k’ y K
Por su definición, el factor de capacidad para un compuesto dado, puede concebirse como la relación de los tiempos que el mismo invierte dentro de la columna, en la fase estacionaria y móvil, respectivamente:
tiempo que el soluto permanece en la fase estacionaria
tiempo que el soluto permanece en la fase móvil
Así, por ejemplo: Soluto retenido totalmente (no eluye): k’
Soluto no retenido (solvente de la muestra): k’ = 0
Soluto igualmente distribuido en ambas fases: k’ = 1
En término de número de moles:
número de moles del soluto en la fase estacionaria Ce Ve
número de moles del soluto en la fase móvil Cm Vm
Donde:
Ce: concentración del soluto en la fase estacionaria
Ve: volumen de la fase estacionaria
Cm: concentración del soluto en la fase móvil
Vm: volumen de la fase móvil (V0)
K : constante de distribución o de reparto
k’ =
k’ = = Ve
= KVm
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PROCESO
CROMATOGRÁFICO
Migración diferencial
Ensanchamiento de banda
Ancho de banda inicial
Anchos de bandas finales
Aumenta grado de separación
Aumenta ancho de banda
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MIGRACIÓN DIFERENCIAL
• Fenómeno basado en las diferencias de velocidades de desplazamiento de solutos distintos a lo largo de la fase estacionaria, como consecuencia de las afinidades relativas de cada uno de ellos por ambas fases
• Bajo condiciones determinadas (fase estacionaria, fase móvil, caudal y T), la velocidad de desplazamiento de un soluto dado viene dado por K (constante de reparto o distribución)
• Puede suponerse un fenómeno controlado por estados de equilibrio (termodinámico)
Afm < Afe
Bfm > Bfe
B se desplazará más lentamente que A (trB > trA)
PROCESO CROMATOGRÁFICO
Bfe
Bfm
Afe
Afm
ENSANCHAMIENTO DE BANDA
• Fenómeno basado en las diferencias de velocidades de desplazamiento de las moléculas de un mismo soluto como consecuencia de procesos físicos de velocidad (no todas se desplazan a una misma velocidad, sino que se existe una distribución de velocidades)
Factores que contribuyen al ensanchamiento de banda
1) Difusión de Eddy o caminos múltiples
Las moléculas de soluto optan por distintos canales disponibles entre las partículas de fase estacionaria
PROCESO CROMATOGRÁFICO
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2) Transferencia de masa en la fase móvil
La velocidad de la fase móvil en el interior de un canal formado por partículas de fase estacionaria, será mayor en el centro que en la zona adyacente a las partículas
3) Difusión longitudinal
Es el proceso que se manifiesta inmediatamente luego de la inyección como consecuencia del esparcimiento de las moléculas de soluto en el solvente en la dirección de la elución
Partículas de fase
estacionaria Distribución de velocidades de la fase móvil
z
y
x
Punto de inyección
4) Transferencia de masa en la fase móvil estancada
En partículas de fase estacionaria porosas, las moléculas de soluto que ingresen más internamente en los poros se verán retrasadas con respecto a otras que ingresen más superficialmente
5) Transferencia de masa en la fase estacionaria
Factor de ensanchamiento de banda debido a la velocidad finita a la cual un soluto alcanza el equilibrio entre ambas fases
El soluto que permanece en la fase estacionaria se retrasa respecto al que avanza con la fase móvil
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Ecuación de Van Deemter
u: velocidad lineal de flujo
A: Caminos múltiples
B: difusión longitudinal
C: Transferencia de masa en fase estacionaria
H = A + B/u + C u
EFICIENCIA
• Corresponde al número de platos teóricos (N)
• Plato teórico: segmento de la columna en donde se llega a un equilibrio del soluto entre la fase estacionaria y la móvil
• Es una medida de la capacidad de un método cromatográfico para generar picos angostos (menor dispersión posible)
• Se define para cada pico del cromatograma, según:
• También, puede derivarse de la relación:
Donde
L: longitud de la columna
H: Altura equivalente de plato teórico
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RESOLUCIÓN
Medida de la capacidad de un método cromatográfico para separar dos picos adyacentes
W1/2
W1/2
• w1 y w2: ancho de banda, en la base del pico cromatográfico, de los compuestos 1 y 2, respectivamente
• w1 y w2 se obtienen por triangulación: se trazan las rectas tangentes a los puntos de inflexión a ambos lados de cada pico. El ancho del segmento que resulta de la intersección de dichas rectas con el eje horizontal se mide en unidades de tiempo.
• w1/2 se refiere a los anchos de banda a la mitad de su altura para cada compuesto
Distintos valores de resolución para dos picos de relación de áreas 1:1
1:1
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Relación entre Resolución (R) y Eficiencia (N)
Puede demostrarse, para dos solutos con factores de capacidad similares, la siguiente relación:
Baja eficiencia
Buena resolución
Buena eficiencia
Buena resolución
Baja eficiencia
Baja resolución
Buena eficiencia
Baja resolución
Efecto de la fuerza, la
selectividad y la eficiencia
sobre la resolución
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PROBLEMA
Separar mediante cromatografía los siguientes compuestos:
naftaleno fluoreno antraceno pireno
aumenta el carácter no polar
Elección del método cromatográfico en base al peso molecular y polaridad de los solutos a separar (solubilidad)
• Sensibilidad
• Determinaciones cuantitativas exactas
• Separación de especies no volátiles
• Gran aplicabilidad: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, antibióticos, esteroides, plaguicidas especies organometálicas e inorgánicas (fármacos, alimentos, etc.)
• Cromatografía de exclusión por tamaño: solutos con masas moleculares superiores a 10000.
• Cromatografía de intercambio iónico: especies iónicas de masa molecular más pequeña.
• Cromatografía de reparto: especies poco polares no iónicas.
• Cromatografía de adsorción: especies no polares, isómeros estructurales y grupos de compuestos homólogos.
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Optimización de una separación cromatográfica
• Selecciono fase reversa (fe menos polar que fase móvil)
• Supongamos: fe: C18, fm: H2O: modificador orgánico (distintas proporciones) elución isocrática (fase móvil no cambia de composición durante la separación)
• Modificadores orgánicos comunes: metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano (THF)
• H2O: componente polar de la fm
• Modificador orgánico: componente menos polar de la fm
• A medida que aumenta proporción de modificador orgánico, disminuye polaridad fm
• A medida que disminuye polaridad fm, se dice que aumenta su fuerza:
Compite más efectivamente con la feSolutos eluyen a menores tiempos de retención
Tod
os lo
s solven
tes
Solven
tes con
p
rop
iedad
es físicas ad
ecuad
as
Solven
tes con
fu
erza adecu
ada
Solven
tes con
selectivid
ad
adecu
ada
Selección del solvente
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TRIÁNGULO DE SELECTIVIDAD DE SOLVENTES
básico
ácido dipolar
éteres
aminasalcoholes
polares próticos
agua
cloroformo
polares apróticos
ésteres
nitrilos
cetonas
hidrocarburos
clorados
hidrocarburos
aromáticos
aceptores de protones
donoresde protones
Efecto de la naturaleza del
modificador orgánico
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Efecto de la proporción del
modificador orgánico
Elución con gradientes
• Para mezclas complejas de analitos
• Sistema de detección debe ser adecuado
Columna: 1 m x 2.1 mm d.i. de acero inoxidable, relleno 1% Permaphase ODS. Muestra: 5 µL de bencenos clorados en isopropanol. Detector: fotómetro de UV (254 nm). Temperatura 60ºC, Presión 80 kg/cm2. (a) elución con gradiente: metanol 40% / agua 60% e incremento de la proporción de metanol a una velocidad de un 8% / min (b) elución isocrática con metanol 50% / agua 50%.
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Sistema de HPLC básico
Sistema de HPLC con 4 canales para solventes
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Sistema de HPLC cuaternario con inyector automático, colector de fracciones y dectores UV-V y electroquímico
BOMBASRequerimientos
1. Generación de presiones por encima de 6000 psi (~410 atm) 2. Flujo libre de pulsaciones 3. Intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min (con control del 0.5%) 4. Componentes resistentes y compatibles (acero inoxidable o Teflón)
Bombas recíprocas
Desventaja
• Producen un flujo pulsado (se debe amortiguar)
Ventajas
•Pequeño volumen interno (35 a 400 μl)
•Altas presiones (>10000 psi)
•Adaptable a elución con gradiente
•Caudales constantes independientes de la contrapresión de la columna y de la viscosidad del disolvente
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VÁLVULA DE INYECCIÓN
Posición de carga del bucle (loop):
LOAD
Posición de entrada de
muestra a la columna:
INJECT
Entrada fase móvil
A la columna
Inyección de la muestraDesecho
Bucle de volumen calibrado
fase móvil arrastra muestra del bucle hacia
la columna
A la columna
Condiciones de un detector ideal
DETECTORES
Detectores basados en la medida de una propiedad del efluente (índice de refracción, la constante dieléctrica, densidad) o basados en la medida de una propiedad del soluto (absorbancia en el UV, fluorescencia, o corriente límite) que no es inherente a la fase móvil.
• Sensibilidad adecuada • Estabilidad y reproducibilidad buenas• Respuesta lineal extendida a varios órdenes
de magnitud • Tiempo de respuesta corto • Respuesta rápida e independiente del caudal • Manejo sencillo • No destructivo • Respuesta similar a todos los analitos o
respuesta selectiva a algunos analitos
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Detector Características favorables Sensibilidady rango lineal
Limitaciones
UV-V, DAD Ampliamente usado y aceptado, prácticamente universal (UV), compatible con gradientes, cualicuantitativo, no destructivo, facilidad de uso, confiable, bajo costo, DAD proporciona pureza de picos, biblioteca de espectros
Nanogramos
105
Detecta analitos con cromóforos, solventes deben ser transparentes, respuestas muy variables según analito
Fluorescencia Muy selectivo y sensibleAdmite gradientes
Picogramos
103-104
No todos los compuestos fluorescen,normalmente se requiere derivatización, alto costo, “quenching” (atenuación de fluorescencia por asociación del analitofluorescente con componentes de la matriz)
Electroquímico Muy selectivo y sensible, confiables y fáciles de usar.
Femto a nanogramos
105
La fase móvil puede ser conductora, susceptible de ruido de fondo y “fouling” de electrodo, sólo aplicable a compuestos que pueden ser oxidados o reducidos.
Índice de refracción
Detector original para numerosos métodos HPLC, excelente versatilidad, universal, compatibilidad con solventes, no destructivo, bajo costo, confiable y fácil de operar
Microgramos
103
Baja sensibilidad, incompatible con gradientes, señal dependiente de T y flujo.
Conductividad Detector de elección para cromatografía iónicas (iones inorgánicos y ácidos orgánicos), muy selectivo, bajo costo.
Nano a microgramos
104
Requiere la supresión de la conductividad de la fase móvil, no todos los compuestos pueden ser detectados, requiere sistemas de HPLC y columnas especiales.
DETECTOR DE ABSORBANCIA UV-V
• Volumen mínimo de celda (minimiza ensanchamiento de banda): V= 1-10 L, b=2-10 mm
• Pmáx 50 kg/cm2 (49 bar, 4,9 Mpa)
• Hay que tener en cuenta “cut-off” del solvente de la muestra ( a la que su absorbancia es 1 UA)
• Simple o doble haz
• De filtros ( fijas) o con monocromadores (rango de )
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Valores de “cut off” de solventes comunes para HPLC
DETECTOR ESPECTROFOTOMÉTRICO UV-V DE ARREGLO DE DIODOS (DAD)
• Permiten recolectar datos de un espectro de absorción completo en tiempos muy cortos (1 s)
• Datos espectrales de cada pico cromatográfico se recolectan y almacenan a medida que eluyen
de la columna
Espectros de absorción del eluato de una columna de HPLC obtenidos cada 5 s
para una mezcla de esteroides
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DETECTOR DE FLUORESCENCIA
• Específico para analitos fluorescentes o que pueden derivatizarse para hacerlos fluorescentes
• Muy sensible (0,1 a 1 g)
EJEMPLOS DE APLICACIÓN
1) Determinación de Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (PAH)
• Provenientes del petróleo, carbón y alquitrán
• Productos de la utilización de combustibles
• Contaminantes
(carcinógenos, mutágenos y teratógenos)
Máximos de absorción UV y de excitación e emisión fluorescente
de algunos PAH
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2) Determinación de Aminoácidos (derivatización y corrida con gradiente)
DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN
• Universal
• Poco sensible (0,1 a 1 g)
• No aplicable con gradientes de elución
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DETECTOR ELECTROQUÍMICO
• Basados en medidas electroquímicas (amperometría, voltametría, coulombimetría,
conductimetría)
• Eluato de columna pasa por una celda en donde se encuentra un electrodo de trabajo mantenido
a un potencial constante (en relación a un electrodo de referencia) que oxida o reduce
completamente al analito
• Corriente que circula entre electrodo de trabajo y auxiliar sirve de señal analítica
Eluato
Potenciostato Electrodo de
referencia
Electrodo
de trabajo
Electrodo auxiliar
Descarte
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CROMATOGRAFÍA GASEOSA
•Técnica de separación y análisis de amplia utilización•Apta para analitos volátiles (termoestables): PM < 1000 (T < 400 ºC)•Fase estacionaria: Líquida (CGL: reparto) o sólida (CGS: adsorción)•Fase móvil (gas portador): gas inerte, sólo transporta la muestra por la columna (H2, N2,He, etc.). Diferentes velocidades óptimas
Gas portador
Regulador de presión
Caudalímetro Horno
Columna
Inyector
Detector
Sistema de procesamiento y
registro
Componentes de sistema de CG básico
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Sistema de CG con detector FID
INYECTORES
El tipo depende de la columna a utilizar y de la escala del análisisColumnas empaquetadas: volúmenes medibles con jeringasColumnas capilares: vol. Iny. < 0,1 L (split, splitless, inyección directa)
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COLUMNASEmpacadas
Tubos de acero inoxidable, vidrio, cobre o aluminio. Long. de 2 a 6 m, diam. int. 2-4 mm, rellenas con sólidosparticulados de 40 a 350 m de diám.Relleno típico: tierra de diatomeas (cuando se hidratan contienen en su superficie grupos silanoles (-Si-OH)que sirven de sitios activos para adsorber moléculas en CGS. Para CGL, las partículas solidas del relleno serecubren con un líquido
CapilaresTubulares abiertasTubos de sílica fundida cubiertos con un polímero protector de 15-100 m de long. y diám. int de 150-300m. Tres tipos:1) De pared recubierta: una capa de 0,25 m de espesor de fase estacionaria en la pared interna.2) De capa porosa: un sólido poroso (alúmina, sílica gel y tamices moleculares) se adhiere a la pared interna
del tubo capilar.3) De soporte recubierto: con un sólido poroso recubierto de un líquido sobre la pared interna del tubo
capilar.
COLUMNAS de CG
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H2
Aire
Eluyente de la columna
Colector
venteo
DETECTOR DE ÍNDICE DE IONIZACIÓN EN LLAMA (FID)
• Ampliamente utilizado
• Universal (para compuestos con enlaces C-H)
• Destructivo
• Alta sensibilidad
• Rango lineal muy amplio
• Fácil de operar
Principio: Colector recoge los iones generados cuando la muestra que sale de la columna se quema y mide la corriente que será proporcional a la concentración del analito.
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD TÉRMICA
• Ampliamente utilizado
• Universal
• Poco sensible
• Rango lineal: 104-105
• He gas más adecuado
(alta conductividad térmica)
Principio: La resistencia eléctrica del filamento depende de su temperatura, la que a su vez depende de la conductividad térmica de la fase móvil.
Cuando un analito eluye con el gas portador de la columna, la conductividad térmica disminuye, la T del filamento aumenta y por tanto su resistencia. Dicho aumento de resistencia (o voltaje) se detecta y es proporcional a la cantidad de analito presente.
conductores
eléctricos
sello
salida gas
portador
entrada gas
portador filamento
bloque
térmico
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DETECTOR DE CAPTURA ELECTRÓNICA
• Muy utilizado (medio ambiente y toxicología)
• Selectivo (para electrofílos)
• Alta sensibilidad
• Difícil de operar (respuesta dependiente de condiciones experimentales)
Principio: Cuando eluye un compuesto capaz de capturar electrones térmicos, se produce caída en la corriente de fondo, cuya magnitud se relaciona con la cantidad del analito.
Fuente de radiación bombardea gas portador generando plasma de cationes, radicales libres y electrones térmicos. Éstos últimos son captados por un electrodo colector, estableciéndose una corriente de fondo (línea de base)
DETECTOR DE MASAS
Espectro de
masas
Mezcla de
analitos A, B y C
se separa por
cromatografía
Cada analito
(ej. A)
se ioniza y
fragmenta o
reordena
Los iones
resultantes se
separan de
acuerdo a su
relación
masa/carga
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Detector de masas
Alta selectividad y sensibilidad, permite la identificación y cuantificación de picos en matrices complejas , información estructural y de peso molecular de analitos.Su especificidad no está directamente relacionada con la pureza de los picos cromatográficos (resolución).
Sensibilidad: de femto a nanogramos
EJEMPLO DE APLICACIÓN HPLC-EM
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Sistema de CG-MS con inyector automático