new hplc column options for uhplc · en la cromatografia en capa fina, la fase estacionaria es una...
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Aplicaciones de los siguientes productos:
Productos de Preparación de Muestras:
Chem Elut para Extracción L/L sobre soporte sólido
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
2
3
Fase Orgánica
Matriz Acuosa
Extracción L/L clásica
Como mejorar el área de contacto entre la fase acuosa/fase orgánica?
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
4
Chem Elut
Fase Acuosa Alta área
superficial
x
x
x
x x
x x
x
x
x
x
x
x
x
Extracción L/L sobre soporte sólido
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
Manual de uso de Chem Elut
5
PASO 1: Aplicar la muestra acuosa sobre el cartucho seco de
Chem Elut
Flujo por Gravedad!
No se necesita vacío !
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
Manual de uso de Chem Elut
6
Fase Acuosa
PASO 2:
Esperar 5-15 minutos Que ocurre en la superficie
de Chem Elut?
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
Manual de uso de Chem Elut
7
Fase Orgánica
PASO 3:
Añadir disolvente
orgánico de
extracción
Que ocurre en la superficie
de Chem Elut ?
La Elución se lleva a cabo utilizando disolventes orgánicos que son
inmiscibles con el agua. En general, la extracción con 2-3 veces
volumen de muestra es suficiente.
Flujo por Gravedad
No se necesita vacío
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
Los cartuchos de Chem Elut están
disponibles para la extracción desde 0.3 ml
hasta 300 ml de muestra acuosa
Se ha incorporado un material de
separación de las fases dentro del
cartucho para asegurar que los disolventes
orgánicos de elución no se contaminan con
la matriz acuosa
8
El Producto
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
• General, método simple
• Todos los métosdos L/L pueden ser transferidos
• No emulsiones
• Menos uso de vidrio
• Menor tiempo
• Amplio rango de analitos extraidos
• Automatizable
Chem Elut Resumen
9
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
10
Determinación de Plaguicidas Ácidos
Usando una modificación simple de un método existente
Método para extracción L/L de 17-hydrosteroids en orina
Tomar 10ml de muestra y se pre-hidroliza con b-glucuronidasa
Aplicar la muestra en un cartucho Chem elut de 10 ml. seco
Esperar 3 minutos hasta que se empape bien la columna
Elución con 12 mL de diclorometano
Esperar 3 min
Volover a eluir con 12ml. De diclorometano
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
Chem Elut
Aplicaciones de los siguientes productos:
Productos de Preparación de Muestras:
CAPTIVA paa precipitación de proteínas
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
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CAPTIVA ND (NON-DRIP)
CAPTIVA ND LIPIDS
CAPTIVA
- Técnica de Filtración en vacío para proteínas
- 3 pasos
- Diferentes tamaño de poro (0.2um – 20um)
- Diferentes materiales (polipropileno, PDVF, lana de vidrio)
- Permite el almacenamiento de muestra
- Procesado de hasta 96 muestras a la vez
12
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
Precipitación de proteínas tradicional
1 .- Añadir la muestra de plasma
2 .- Añadir el reactivo precipitante (MeOH o ACN, 3-8 volúmenes)
3 .- Vortex para mezclar
4 .- Centrifugar
5 .- Transferir el sobrenadante al vial de inyección.
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Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
CAPTIVA
1 .- Añadir el reactivo precipitante ACN o Metanol a la muestra y
agitar
2 .- Añadir la muestra de plasma a la placa de filtración
3 .- Aplicar vacío a la placa para recoger el filtrado
14
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
PLACAS CAPTIVA MÁS UNA FASE DE CLEAN UP PARA
ELIMINACIÓN DE LÍPIDOS Y FOSFOLÍPIDOS
15
CAPTIVA LIPIDS
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
Cómo funciona Captiva ND Lipids
16
Optimized for
Protein
Removal
Best General
Method
Optimized for
Lipid Removal
3:1 or more
with pH
modified ACN
3:1 with pH
modified
MeOH
2:1 with pH
modified
MeOH
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
Ventajas
- Permite la automatización
- Elimina la fase de centrifugación
- Sin goteo y flujo uniforme (evita la contaminación cruzada y
mejora la reproducibilidad)
- Fácil utilización
- Elimina el paso de transferencia del sobrenadante (tiempo y
facilidad de manejo)
- En placas de 96 pocillos o en cartuchos
- Retiene proteínas y lípidos sin interacciones específicas de los
analitos
17
Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras
Análisis de Drogas por TLC (Thin Layer Chromatography)
18
Análisis
TLC o Thin Layer Chromatography
19
En la cromatografia en capa fina, la fase estacionaria es una capa
uniforme, de un absorbente (ej Sílica Gel) sobre un soporte plano y la
fase móvil es líquida.
La fase estacionaria será polar y el eluyente será por lo general menos
polar que la fase estacionaria, de forma que por capilaridad los
componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos
polares.
Para la detección se utilizan reactivos reveladores o bien su posición
relativa (Rf, Ratio of front) respecto al frente de elución
The Toxi-Lab AB Procedure
Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB
20
The changing colors of
drug identification
21
The Toxi-Lab AB Procedure consiste en un método simple
utilizando patrones, materiales y reactivos especialmente
modificados para obtener resultados fiables y reproducibles
en el menor tiempo
Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB
22
The Toxi-Lab AB Procedure
Extracción
Tomar la muestra e itroducirla en el tubo de extracción
TOXI-A/TOXI-B. Mezclar y centrifugar
Concentración
Poner un disco blanco cada pocillo para concentración.
Transferir la fase orgánica (la superior) del tubo de
extracción. Evaporar para concentrar la muestra en el disco.
Inoculación
Poner los discos secos en los canales de siembra del
TOXI-GRAM (placa cromatográfica)
Desarrollo
Correr la muestra en el TOXI-GRAM en la solución de Fase Móvil
Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB
23
The Toxi-Lab AB Procedure
Detección
Un gran espectro de analitos pueden ser detectados y diferenciados en
función de su posición (Rf) y elcolor de la reacción a través de los
diferentes pasos (4 etapas)
Las muestras se aplican en los canales centrales y los patrones en los
canales laterales
Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB
24
The Toxi-Lab AB Procedure
Detección
Etapa 1
Se expone el Toxi-Gram a los reactivos TOXI•DIP
(A-1, dip it in TOXI•DIP A-2)
Analitos y metabolitos aparecen en un esprectro de
colores
En este ejemplo la anfetamina está incado en amarillo
con centro marrón junto a su standar y la Codeina
está indicada en azul oscuro a junto patrón azul oscuro
Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB
25
The Toxi-Lab AB Procedure
Detección
Etapa 2
Se sumerge elToxi-Gram en agua
Muchos analitos y metabolitos cambiarán de color o
desaparecerán mientras otros aparecen.
La anfetamina ahora tiene un color verde pálido
y la Codeina ha pasado a una especie de marrón al igual que
sus respectivos patrones
Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB
26
The Toxi-Lab AB Procedure
Detección
Etapa 3
Se somete el Toxi-Gram a luz ultravioletaen agua
Muchos analitos y metabolitos muestran características de
fluorescencia o absorbancia
La anfetamina ahora tiene florescencia azul
y la Codeina absorbe la luz UV
Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB
27
The Toxi-Lab AB Procedure
Detección
Etapa 4
Se somete el Toxi-Gram al reactivo TOXI•DIP A-3
La mayoría analitos y metabolitos se ven marrones incluidos
nuestros ejemplos
Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB
28
The Toxi-Lab AB específicos
LTD Opiate
Desarrollado para reconocer el opiaceo exacto
Cápaz de distinguir los distintos opiaceos en 60 min.
Misma metodología que toxilab
Diferencia entre morfina, normorfina, 6-monoacetilmorfina,
hidromorfona, codeína, norcodeína, hidrocodona,
dihidrocodeína y oxycodona
Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB
29
The Toxi-Lab AB específicos
THC II
Desarrollado para reconocer THC en orina
Resultados en 20 min.
Específico, no reconoce nada más
Sensibilidad de 15ppm
Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB
30
The Toxi-Lab AB específicos
SMA (amina simpatomimética)
Desarrollado para reconocer y diferenciar derivados de
anfetaminas
Resultados en 45 min.
Diferencia MDMA, MDA, MDEA, anfetamina, metaanfetamina
PMA, MBDB, DBD, Ephedrina/pseudofedrina, fentermina,
phenylpropanolamina y fenilamina
Sensibilidad de 250 ppm
Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB
31
Toxi-Tubes A y B
Método de extracción L/L en un paso
TOXI-TUBE A (drogas Básicas y neutras)
TOXITUBE B (Drogas ácidas)
Válido paramuestras biológicas y no biológicas
Mejora la eficiencia de GC/MS yLC/MS
Incrementa la rapidez en la preparación de muestras
Muestras muy limpias
Extracción de Drogas de Abuso TOXI-TUBES
32
Toxi-Tubes A y B
Método de extracción L/L en un paso
-Tomar 1 ml de sangre y centrifugar
- Tranferir sobrenadante a TOXI A yTOXI B agitar y
centrifugar 4000rpm. 10 min.
- Transferir fase orgánica a 1 vial y dejar secar a temp.
ambiente.
- Reconstituir en metanol o diclorometano
Extracción de Drogas de Abuso TOXI-TUBES
33
Toxi-Lab AB Procedure reconoce más de 700 sustancias
ilegales y productos OTC con solo un análisis
Toxi-Lab AB detection system provee de todo el material
necesario para otener resultado fiables y reproducibles en 1
hora
Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB
35
Columnas Rapid Resolution HT (RRHT 600 bares) o RRHD 1200 bares
para UHPLC y Columnas Poroshell
Las columnas ‘Rapid Resolution HT’ y ‘Rapid Resolution HD’ tienen tamaño
de particulas de1.8um
Esta reducción en el tamaño de partícula permite incluso el uso de columnas
más cortas con la misma resolución.
Las columnas Poroshell 120 también generan más eficacia a presiones de
HPLC convencional
Columnas más cortas implica menores tiempos de análisis y ahorro
substancial de disolventes.
Aplicaciones Productos análisis
Page 36
Productividad de columnas RRHD con el 1290 Infinity LC
1. Análisis Rápidos y con bajo consumo de disolventes
2. Más resolución en menor tiempo
1. Elección de diferentes longitudes de columna para obtener la
resolución deseada
2. Maximizar la capacidad de picos en separaciones de gradientes de
muestras complejas
Aplicaciones Productos análisis
Month ##, 200X Page 37
Análisis Rápidos en ZORBAX Rapid Resolution High Definition Eclipse Plus
min0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
mAU
0
100
200
300
400
500
600
DAD1 D, DAD1C, DAD: Signal C, 280 nm/Bw:10 nm Ref 400 nm/Bw:50 nm (G:\1290\AOX JASMIN\AOX-AM2-45C-101.D)
0.2
72
0.4
15
0.4
80
0.7
57
0.8
83
1.0
11
1.0
55
1.5
24
1.5
56
DAD1 E, DAD1D, DAD: Signal D, 255 nm/Bw:10 nm Ref 400 nm/Bw:50 nm (G:\1290\AOX JASMIN\AOX-AM2-45C-101.D)
1.6
84
PG
THBP
TBHQ NDGA
BHA
Ionox-100
OG DG
BHT AP
Datos Cortesía de: Gerd Vanhoenacker
Research Institute for Chromatography
Kennedypark 26 8500 Kortrijk Belgium
RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 x 50mm, 1.8um,
Pmax 1070 bar
Esta muestra de 10 compuestos requiere un
gradiente que va más allá de los 1000 bar.
Es una separación de menos de 2 minutos!
Gasto de solvente: 2,9mL
Aplicaciones Productos Análisis muestras
Month ##, 200X Page 38
Elige la Longitud de la columna según el Tiempo de Análisis
Page 38
RRHD 1.8um 1200 bar
Fase Móvil: 40:60 agua:acetonitrilo, Flujo: 0.5 mL/min, Temp: ambiente, Columnas: RRHD SB-C18, 2.1 mm ID, Longitudes
abajo Picos: 1: uracilo, 2 acetofenona, 3 propiofenona, 4 butirofenone, 5 valerofenona, 6 hexanofenona
Rs3,2: 5.64
N6 : 10,700
Presión: 350 bar
Solvente: 1,25mL
Rs3,2: 11.98
N6 : 34,100
Presión :750 bar
Solvente: 2,5mL
Rs3,2: 9.02
N6 : 21,100
Presión : 566 bar
Solvente: 1,75mL
50 mm
100 mm
150 mm
min 0 1 2 3 4
min 0 1 2 3 4
min 0 1 2 3 4
0
La columna RRHD de 150mm es una buena elección para alcanzar alta
resolución con el 1290 Infinity LC.
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC:
• 80-90% de eficicacia de las sub 2um
• A presiones un ~40-50% más bajas
• El doble de la eficacia de las columnas 3.5um
• Con un tamaño de partícula de 2.7um
• Con frita de entrada de 2um no se bloquea
• Con un límite de presión de 600 bar, para uso
en HPLC y UHPLC
• La partícula tiene y una cubierta exterior
porosa de 0.5um como zona de difusión
October 3, 2011
Confidentiality Label
39
1.7um
0.5um
0.5um
Aplicaciones Productos análisis
USP Method for Naproxen Tablets – 4.5X más rápido con Poroshell 120
min 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
5
10
15
20
25
30
min 1 2 3 4 5 6 7
mAU
0
5
10
15
20
25
30
1 2 3 4 5 6 7
mAU
0
5
10
15
20
25
30
4.6 x 150 mm (L1)
Eclipse Plus C18, 5um
PN 959993-902
20 ul injection
Rs = 14.9
4.6 x 100 mm (L1)
Poroshell 120 EC-C18, 2.7 um
PN 695975-902
13.67 ul injection
Rs = 17.0
P = 238 bar
4.6 x 50 mm (L1)
Poroshell 120 EC-C18, 2.7 um
PN 699975-902
6.7 ul injection
Rs = 12.6
P= 133 bar
Method Requirement N > 4000, Rs better than 11.5
Common Conditions:
Mobile Phase: 50:49:1 MeCN:H2O Acetic Acid
Flow Rate: 1.2 mL/min
Peak 1. Naproxen 2. Butyrophenone
N= 11,281
N= 12,051
N= 21,046
N= 20,676
N= 12,554
N= 14,885
2X Faster
4.5X Faster
Aplicaciones Productos análisis
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
9.7
12
11.1
16
11.5
96
12.6
74
15.2
48
16.1
51
16.4
35
20.6
87
23
.07
6
29.2
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
1.7
19
2.1
89
2.3
11
2.6
06
3.8
67
4.4
37 4.5
58
5.4
50
5.9
20
7.0
37
Análisis más rápido(columna más corta, flujo más alto)
Mayor sensibilidad(partícula más pequeña,pico más estrecho)
Más optimizado (un análisis más rápido permite ajustar mejor)
Ambos análisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparación de muestra, frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas.
325 bar
110 bar
Sulfadiazina,
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina,
Sulfametazina,
Sulfametazol,
Sulfametoxipiridazina,
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol,
Sulfadimetoxina
Tiempo %B
0 8
33 33
34 33
Columna: Eclipse Plus C18
4.6 x 250mm, 5um
Flujo: 1 mL/min
Fase Móvil:
A: 0.1% Ácido Fórmico en Agua
B: 0.1% Ácido Fórmico en ACN
Tiempo %B
0 8
12 33
13.2 33
Columna: 4.6 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18,
2.7um
Flujo: 1.85 mL/min
Page 41
13 ml de
consumo
6 ml de
consumo
Análisis de 10 sulfa drugs LC column vs Poroshell
DAD1 A, Sig=254,4 Ref=off (SULFA\S2500005.D)
Aplicaciones Productos análisis
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
9.7
12
11.1
16
11.5
96
12.6
74
15.2
48
16.1
51
16.4
35
20.6
87
23
.07
6
29.2
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
1.7
19
2.1
89
2.3
11
2.6
06
3.8
67
4.4
37 4.5
58
5.4
50
5.9
20
7.0
37
325 bar
min
Page 42
Mejor Resolución ,
linea base!!
Análisis de 10 sulfa drugs LC column vs Poroshell
DAD1 A, Sig=254,4 Ref=off (SULFA\S2500005.D)
Aplicaciones Productos análisis
Month ##, 200X Page 43
Analgésicos en Poroshell
Condiciones: Columna: Poroshell 120 SB-C18, 4.6 x 50mm, 2.7um Fase Móvil: 0.2% Ácido Fórmico 80% agua:20%
ACN Temperatura: 25 C, Deteción: 275 nm, Inyección de muestra: 2ul
2
min 1 2 3 4
mAU
0
20
40
min 1 2 3 4
mAU
0
20
40
min 1 2 3 4
mAU
0
20
40
min 1 2 3 4
mAU
0
20
40
1.0 mL/min 142 bar
1.5 mL/min 211 bar
2.0 mL/min 279 bar
2.5 mL/min 347 bar
1 3 4 5
6
1. Acetaminofen 2. Cafeina 3. 2-acetamidofenol 4. Acetanilida 5. Fenacetin 6. Ácido Salicílico
DAD1 A, Sig=254,4 Ref=off (SULFA\S2500005.D)
Aplicaciones Productos análisis
Poroshell 120: Partículas parcialmente porosas
•Poroshell 120 EC-C18
•Ahorro de tiempo
•Mejora de la resolución
•Fácil traspaso de métodos entre
UHPLC y HPLC estandard
44
1.7um
0.5um
0.5um
Aplicaciones Productos análisis
Columnas CG
VF-DA (drugs of Abuse)
Page 45
min 0 2 4 6 8
Análisis
46
Columnas VF-DA
Columnas de Bajo sangrado
Aptas para GC/MS
Optimizadas para drogas de abuso
Alta resistencia para inyecciones directas con metanol
Aplicaciones Productos análisis
DMS (Dried Matrix Spot)
Page 49
Almacenamiento
DMS (DRIED MATRIX SPOT)
50
- Soporte no celulósico que reduce las interacciones no específicas
- Independiente del nivel de hematocrito
- Para suero y sangre completa
- Válido para almacenamiento
- Válido para toma de muestras
- Válido para envío de muestras
Almacenamiento
DMS (DRIED MATRIX SPOT)
51
Almacenamiento
Tomar 15-30 ul de muestra con una pipeta
Poner la muestra en el centro del círculo, no tocar el papel con la punta
1. SPOTTING
2. DRYING
Dejar secar por al menos 2 h..
3. PUNCHING
Tomar el centro del círculo con el cuter e introducirlo en un vial
4. EXTRACTION
Añadir 300 µL de 0.1% ácido fórmico en 80% de metanol al vial con el
círculo
Añadir el patrón interno y agitar
Esperar 1h. Centrifugar o filtrar si es necesario
Secar la muestra y reconstituir en 100ul de fase móvil
DMS (DRIED MATRIX SPOT)
52
Ventajas:
Reduce el volumen de sangre del paciente
Simplifica el muestreo de sangre
-Menos pasos
-Mejor calidad
-Menor afectación del paciente
Reducción de coste (envío y almacenamiento)
Mejor estabilidad de los metabolitos
Almacenamiento