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53
Seminario Toxicología 1 Óscar Santos Columnas y Consumibles 4 de Octubre de 2011

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Seminario Toxicología

1

Óscar Santos – Columnas y Consumibles

4 de Octubre de 2011

Aplicaciones de los siguientes productos:

Productos de Preparación de Muestras:

Chem Elut para Extracción L/L sobre soporte sólido

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

2

3

Fase Orgánica

Matriz Acuosa

Extracción L/L clásica

Como mejorar el área de contacto entre la fase acuosa/fase orgánica?

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

4

Chem Elut

Fase Acuosa Alta área

superficial

x

x

x

x x

x x

x

x

x

x

x

x

x

Extracción L/L sobre soporte sólido

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

Manual de uso de Chem Elut

5

PASO 1: Aplicar la muestra acuosa sobre el cartucho seco de

Chem Elut

Flujo por Gravedad!

No se necesita vacío !

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

Manual de uso de Chem Elut

6

Fase Acuosa

PASO 2:

Esperar 5-15 minutos Que ocurre en la superficie

de Chem Elut?

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

Manual de uso de Chem Elut

7

Fase Orgánica

PASO 3:

Añadir disolvente

orgánico de

extracción

Que ocurre en la superficie

de Chem Elut ?

La Elución se lleva a cabo utilizando disolventes orgánicos que son

inmiscibles con el agua. En general, la extracción con 2-3 veces

volumen de muestra es suficiente.

Flujo por Gravedad

No se necesita vacío

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

Los cartuchos de Chem Elut están

disponibles para la extracción desde 0.3 ml

hasta 300 ml de muestra acuosa

Se ha incorporado un material de

separación de las fases dentro del

cartucho para asegurar que los disolventes

orgánicos de elución no se contaminan con

la matriz acuosa

8

El Producto

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

• General, método simple

• Todos los métosdos L/L pueden ser transferidos

• No emulsiones

• Menos uso de vidrio

• Menor tiempo

• Amplio rango de analitos extraidos

• Automatizable

Chem Elut Resumen

9

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

10

Determinación de Plaguicidas Ácidos

Usando una modificación simple de un método existente

Método para extracción L/L de 17-hydrosteroids en orina

Tomar 10ml de muestra y se pre-hidroliza con b-glucuronidasa

Aplicar la muestra en un cartucho Chem elut de 10 ml. seco

Esperar 3 minutos hasta que se empape bien la columna

Elución con 12 mL de diclorometano

Esperar 3 min

Volover a eluir con 12ml. De diclorometano

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

Chem Elut

Aplicaciones de los siguientes productos:

Productos de Preparación de Muestras:

CAPTIVA paa precipitación de proteínas

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

11

CAPTIVA ND (NON-DRIP)

CAPTIVA ND LIPIDS

CAPTIVA

- Técnica de Filtración en vacío para proteínas

- 3 pasos

- Diferentes tamaño de poro (0.2um – 20um)

- Diferentes materiales (polipropileno, PDVF, lana de vidrio)

- Permite el almacenamiento de muestra

- Procesado de hasta 96 muestras a la vez

12

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

Precipitación de proteínas tradicional

1 .- Añadir la muestra de plasma

2 .- Añadir el reactivo precipitante (MeOH o ACN, 3-8 volúmenes)

3 .- Vortex para mezclar

4 .- Centrifugar

5 .- Transferir el sobrenadante al vial de inyección.

13

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

CAPTIVA

1 .- Añadir el reactivo precipitante ACN o Metanol a la muestra y

agitar

2 .- Añadir la muestra de plasma a la placa de filtración

3 .- Aplicar vacío a la placa para recoger el filtrado

14

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

PLACAS CAPTIVA MÁS UNA FASE DE CLEAN UP PARA

ELIMINACIÓN DE LÍPIDOS Y FOSFOLÍPIDOS

15

CAPTIVA LIPIDS

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

Cómo funciona Captiva ND Lipids

16

Optimized for

Protein

Removal

Best General

Method

Optimized for

Lipid Removal

3:1 or more

with pH

modified ACN

3:1 with pH

modified

MeOH

2:1 with pH

modified

MeOH

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

Ventajas

- Permite la automatización

- Elimina la fase de centrifugación

- Sin goteo y flujo uniforme (evita la contaminación cruzada y

mejora la reproducibilidad)

- Fácil utilización

- Elimina el paso de transferencia del sobrenadante (tiempo y

facilidad de manejo)

- En placas de 96 pocillos o en cartuchos

- Retiene proteínas y lípidos sin interacciones específicas de los

analitos

17

Aplicaciones Productos de Preparación de Muestras

TLC o Thin Layer Chromatography

19

En la cromatografia en capa fina, la fase estacionaria es una capa

uniforme, de un absorbente (ej Sílica Gel) sobre un soporte plano y la

fase móvil es líquida.

La fase estacionaria será polar y el eluyente será por lo general menos

polar que la fase estacionaria, de forma que por capilaridad los

componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos

polares.

Para la detección se utilizan reactivos reveladores o bien su posición

relativa (Rf, Ratio of front) respecto al frente de elución

The Toxi-Lab AB Procedure

Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB

20

The changing colors of

drug identification

21

The Toxi-Lab AB Procedure consiste en un método simple

utilizando patrones, materiales y reactivos especialmente

modificados para obtener resultados fiables y reproducibles

en el menor tiempo

Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB

22

The Toxi-Lab AB Procedure

Extracción

Tomar la muestra e itroducirla en el tubo de extracción

TOXI-A/TOXI-B. Mezclar y centrifugar

Concentración

Poner un disco blanco cada pocillo para concentración.

Transferir la fase orgánica (la superior) del tubo de

extracción. Evaporar para concentrar la muestra en el disco.

Inoculación

Poner los discos secos en los canales de siembra del

TOXI-GRAM (placa cromatográfica)

Desarrollo

Correr la muestra en el TOXI-GRAM en la solución de Fase Móvil

Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB

23

The Toxi-Lab AB Procedure

Detección

Un gran espectro de analitos pueden ser detectados y diferenciados en

función de su posición (Rf) y elcolor de la reacción a través de los

diferentes pasos (4 etapas)

Las muestras se aplican en los canales centrales y los patrones en los

canales laterales

Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB

24

The Toxi-Lab AB Procedure

Detección

Etapa 1

Se expone el Toxi-Gram a los reactivos TOXI•DIP

(A-1, dip it in TOXI•DIP A-2)

Analitos y metabolitos aparecen en un esprectro de

colores

En este ejemplo la anfetamina está incado en amarillo

con centro marrón junto a su standar y la Codeina

está indicada en azul oscuro a junto patrón azul oscuro

Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB

25

The Toxi-Lab AB Procedure

Detección

Etapa 2

Se sumerge elToxi-Gram en agua

Muchos analitos y metabolitos cambiarán de color o

desaparecerán mientras otros aparecen.

La anfetamina ahora tiene un color verde pálido

y la Codeina ha pasado a una especie de marrón al igual que

sus respectivos patrones

Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB

26

The Toxi-Lab AB Procedure

Detección

Etapa 3

Se somete el Toxi-Gram a luz ultravioletaen agua

Muchos analitos y metabolitos muestran características de

fluorescencia o absorbancia

La anfetamina ahora tiene florescencia azul

y la Codeina absorbe la luz UV

Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB

27

The Toxi-Lab AB Procedure

Detección

Etapa 4

Se somete el Toxi-Gram al reactivo TOXI•DIP A-3

La mayoría analitos y metabolitos se ven marrones incluidos

nuestros ejemplos

Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB

28

The Toxi-Lab AB específicos

LTD Opiate

Desarrollado para reconocer el opiaceo exacto

Cápaz de distinguir los distintos opiaceos en 60 min.

Misma metodología que toxilab

Diferencia entre morfina, normorfina, 6-monoacetilmorfina,

hidromorfona, codeína, norcodeína, hidrocodona,

dihidrocodeína y oxycodona

Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB

29

The Toxi-Lab AB específicos

THC II

Desarrollado para reconocer THC en orina

Resultados en 20 min.

Específico, no reconoce nada más

Sensibilidad de 15ppm

Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB

30

The Toxi-Lab AB específicos

SMA (amina simpatomimética)

Desarrollado para reconocer y diferenciar derivados de

anfetaminas

Resultados en 45 min.

Diferencia MDMA, MDA, MDEA, anfetamina, metaanfetamina

PMA, MBDB, DBD, Ephedrina/pseudofedrina, fentermina,

phenylpropanolamina y fenilamina

Sensibilidad de 250 ppm

Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB

31

Toxi-Tubes A y B

Método de extracción L/L en un paso

TOXI-TUBE A (drogas Básicas y neutras)

TOXITUBE B (Drogas ácidas)

Válido paramuestras biológicas y no biológicas

Mejora la eficiencia de GC/MS yLC/MS

Incrementa la rapidez en la preparación de muestras

Muestras muy limpias

Extracción de Drogas de Abuso TOXI-TUBES

32

Toxi-Tubes A y B

Método de extracción L/L en un paso

-Tomar 1 ml de sangre y centrifugar

- Tranferir sobrenadante a TOXI A yTOXI B agitar y

centrifugar 4000rpm. 10 min.

- Transferir fase orgánica a 1 vial y dejar secar a temp.

ambiente.

- Reconstituir en metanol o diclorometano

Extracción de Drogas de Abuso TOXI-TUBES

33

Toxi-Lab AB Procedure reconoce más de 700 sustancias

ilegales y productos OTC con solo un análisis

Toxi-Lab AB detection system provee de todo el material

necesario para otener resultado fiables y reproducibles en 1

hora

Análisis de Drogas de Abuso TOXI-LAB

Columns HPLC y UHPLC

Agilent Poroshell 120

-

Page 34

min 0 2 4 6 8

Análisis

35

Columnas Rapid Resolution HT (RRHT 600 bares) o RRHD 1200 bares

para UHPLC y Columnas Poroshell

Las columnas ‘Rapid Resolution HT’ y ‘Rapid Resolution HD’ tienen tamaño

de particulas de1.8um

Esta reducción en el tamaño de partícula permite incluso el uso de columnas

más cortas con la misma resolución.

Las columnas Poroshell 120 también generan más eficacia a presiones de

HPLC convencional

Columnas más cortas implica menores tiempos de análisis y ahorro

substancial de disolventes.

Aplicaciones Productos análisis

Page 36

Productividad de columnas RRHD con el 1290 Infinity LC

1. Análisis Rápidos y con bajo consumo de disolventes

2. Más resolución en menor tiempo

1. Elección de diferentes longitudes de columna para obtener la

resolución deseada

2. Maximizar la capacidad de picos en separaciones de gradientes de

muestras complejas

Aplicaciones Productos análisis

Month ##, 200X Page 37

Análisis Rápidos en ZORBAX Rapid Resolution High Definition Eclipse Plus

min0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8

mAU

0

100

200

300

400

500

600

DAD1 D, DAD1C, DAD: Signal C, 280 nm/Bw:10 nm Ref 400 nm/Bw:50 nm (G:\1290\AOX JASMIN\AOX-AM2-45C-101.D)

0.2

72

0.4

15

0.4

80

0.7

57

0.8

83

1.0

11

1.0

55

1.5

24

1.5

56

DAD1 E, DAD1D, DAD: Signal D, 255 nm/Bw:10 nm Ref 400 nm/Bw:50 nm (G:\1290\AOX JASMIN\AOX-AM2-45C-101.D)

1.6

84

PG

THBP

TBHQ NDGA

BHA

Ionox-100

OG DG

BHT AP

Datos Cortesía de: Gerd Vanhoenacker

Research Institute for Chromatography

Kennedypark 26 8500 Kortrijk Belgium

RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 x 50mm, 1.8um,

Pmax 1070 bar

Esta muestra de 10 compuestos requiere un

gradiente que va más allá de los 1000 bar.

Es una separación de menos de 2 minutos!

Gasto de solvente: 2,9mL

Aplicaciones Productos Análisis muestras

Month ##, 200X Page 38

Elige la Longitud de la columna según el Tiempo de Análisis

Page 38

RRHD 1.8um 1200 bar

Fase Móvil: 40:60 agua:acetonitrilo, Flujo: 0.5 mL/min, Temp: ambiente, Columnas: RRHD SB-C18, 2.1 mm ID, Longitudes

abajo Picos: 1: uracilo, 2 acetofenona, 3 propiofenona, 4 butirofenone, 5 valerofenona, 6 hexanofenona

Rs3,2: 5.64

N6 : 10,700

Presión: 350 bar

Solvente: 1,25mL

Rs3,2: 11.98

N6 : 34,100

Presión :750 bar

Solvente: 2,5mL

Rs3,2: 9.02

N6 : 21,100

Presión : 566 bar

Solvente: 1,75mL

50 mm

100 mm

150 mm

min 0 1 2 3 4

min 0 1 2 3 4

min 0 1 2 3 4

0

La columna RRHD de 150mm es una buena elección para alcanzar alta

resolución con el 1290 Infinity LC.

Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC:

• 80-90% de eficicacia de las sub 2um

• A presiones un ~40-50% más bajas

• El doble de la eficacia de las columnas 3.5um

• Con un tamaño de partícula de 2.7um

• Con frita de entrada de 2um no se bloquea

• Con un límite de presión de 600 bar, para uso

en HPLC y UHPLC

• La partícula tiene y una cubierta exterior

porosa de 0.5um como zona de difusión

October 3, 2011

Confidentiality Label

39

1.7um

0.5um

0.5um

Aplicaciones Productos análisis

USP Method for Naproxen Tablets – 4.5X más rápido con Poroshell 120

min 1 2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

5

10

15

20

25

30

min 1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

5

10

15

20

25

30

4.6 x 150 mm (L1)

Eclipse Plus C18, 5um

PN 959993-902

20 ul injection

Rs = 14.9

4.6 x 100 mm (L1)

Poroshell 120 EC-C18, 2.7 um

PN 695975-902

13.67 ul injection

Rs = 17.0

P = 238 bar

4.6 x 50 mm (L1)

Poroshell 120 EC-C18, 2.7 um

PN 699975-902

6.7 ul injection

Rs = 12.6

P= 133 bar

Method Requirement N > 4000, Rs better than 11.5

Common Conditions:

Mobile Phase: 50:49:1 MeCN:H2O Acetic Acid

Flow Rate: 1.2 mL/min

Peak 1. Naproxen 2. Butyrophenone

N= 11,281

N= 12,051

N= 21,046

N= 20,676

N= 12,554

N= 14,885

2X Faster

4.5X Faster

Aplicaciones Productos análisis

min 5 10 15 20 25 30

mAU

0

20

40

60

80

100

9.7

12

11.1

16

11.5

96

12.6

74

15.2

48

16.1

51

16.4

35

20.6

87

23

.07

6

29.2

90

min 5 10 15 20 25 30

mAU

0

50

100

150

200

250

1.7

19

2.1

89

2.3

11

2.6

06

3.8

67

4.4

37 4.5

58

5.4

50

5.9

20

7.0

37

Análisis más rápido(columna más corta, flujo más alto)

Mayor sensibilidad(partícula más pequeña,pico más estrecho)

Más optimizado (un análisis más rápido permite ajustar mejor)

Ambos análisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)

No se requiere cambio en la preparación de muestra, frita de entrada

de 2 micras en ambas columnas.

325 bar

110 bar

Sulfadiazina,

Sulfatiazol

Sulfapiridina

Sulfamerazina,

Sulfametazina,

Sulfametazol,

Sulfametoxipiridazina,

Sulfacloropiridazina

Sulfametoxazol,

Sulfadimetoxina

Tiempo %B

0 8

33 33

34 33

Columna: Eclipse Plus C18

4.6 x 250mm, 5um

Flujo: 1 mL/min

Fase Móvil:

A: 0.1% Ácido Fórmico en Agua

B: 0.1% Ácido Fórmico en ACN

Tiempo %B

0 8

12 33

13.2 33

Columna: 4.6 x 100mm

Poroshell 120 EC-C18,

2.7um

Flujo: 1.85 mL/min

Page 41

13 ml de

consumo

6 ml de

consumo

Análisis de 10 sulfa drugs LC column vs Poroshell

DAD1 A, Sig=254,4 Ref=off (SULFA\S2500005.D)

Aplicaciones Productos análisis

min 5 10 15 20 25 30

mAU

0

20

40

60

80

100

9.7

12

11.1

16

11.5

96

12.6

74

15.2

48

16.1

51

16.4

35

20.6

87

23

.07

6

29.2

90

110 bar

5

mAU

0

50

100

150

200

250

1.7

19

2.1

89

2.3

11

2.6

06

3.8

67

4.4

37 4.5

58

5.4

50

5.9

20

7.0

37

325 bar

min

Page 42

Mejor Resolución ,

linea base!!

Análisis de 10 sulfa drugs LC column vs Poroshell

DAD1 A, Sig=254,4 Ref=off (SULFA\S2500005.D)

Aplicaciones Productos análisis

Month ##, 200X Page 43

Analgésicos en Poroshell

Condiciones: Columna: Poroshell 120 SB-C18, 4.6 x 50mm, 2.7um Fase Móvil: 0.2% Ácido Fórmico 80% agua:20%

ACN Temperatura: 25 C, Deteción: 275 nm, Inyección de muestra: 2ul

2

min 1 2 3 4

mAU

0

20

40

min 1 2 3 4

mAU

0

20

40

min 1 2 3 4

mAU

0

20

40

min 1 2 3 4

mAU

0

20

40

1.0 mL/min 142 bar

1.5 mL/min 211 bar

2.0 mL/min 279 bar

2.5 mL/min 347 bar

1 3 4 5

6

1. Acetaminofen 2. Cafeina 3. 2-acetamidofenol 4. Acetanilida 5. Fenacetin 6. Ácido Salicílico

DAD1 A, Sig=254,4 Ref=off (SULFA\S2500005.D)

Aplicaciones Productos análisis

Poroshell 120: Partículas parcialmente porosas

•Poroshell 120 EC-C18

•Ahorro de tiempo

•Mejora de la resolución

•Fácil traspaso de métodos entre

UHPLC y HPLC estandard

44

1.7um

0.5um

0.5um

Aplicaciones Productos análisis

46

Columnas VF-DA

Columnas de Bajo sangrado

Aptas para GC/MS

Optimizadas para drogas de abuso

Alta resistencia para inyecciones directas con metanol

Aplicaciones Productos análisis

47

Análisis de drogas de abuso en orina con VF-DA

Aplicaciones Productos análisis

48

Análisis de cannabinoides en suero VF-5ms

Aplicaciones Productos análisis

48

DMS (DRIED MATRIX SPOT)

50

- Soporte no celulósico que reduce las interacciones no específicas

- Independiente del nivel de hematocrito

- Para suero y sangre completa

- Válido para almacenamiento

- Válido para toma de muestras

- Válido para envío de muestras

Almacenamiento

DMS (DRIED MATRIX SPOT)

51

Almacenamiento

Tomar 15-30 ul de muestra con una pipeta

Poner la muestra en el centro del círculo, no tocar el papel con la punta

1. SPOTTING

2. DRYING

Dejar secar por al menos 2 h..

3. PUNCHING

Tomar el centro del círculo con el cuter e introducirlo en un vial

4. EXTRACTION

Añadir 300 µL de 0.1% ácido fórmico en 80% de metanol al vial con el

círculo

Añadir el patrón interno y agitar

Esperar 1h. Centrifugar o filtrar si es necesario

Secar la muestra y reconstituir en 100ul de fase móvil

DMS (DRIED MATRIX SPOT)

52

Ventajas:

Reduce el volumen de sangre del paciente

Simplifica el muestreo de sangre

-Menos pasos

-Mejor calidad

-Menor afectación del paciente

Reducción de coste (envío y almacenamiento)

Mejor estabilidad de los metabolitos

Almacenamiento

53

MUCHAS GRACIAS