cromatografía líquida de alta...
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Cromatografía líquida de alta resolución
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LAURA MATKOVIC’2019
Introducción� Cuando se quiere conocer la composición de una
sustancia es necesario seguir tres etapas básicas.
� 1. Obtener una muestra representativa.
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� 1. Obtener una muestra representativa.
� 2. Separar o aislar cada una de las sustancias
componentes de la mezcla.
� 3. Identificación de cada uno de los componentes de
dicha muestra.
¿Por qué estudiar cromatografia?
� Método que en su origen, se utilizó para separar
sustancias coloreadas. En la actualidad, por extensión,
es el método utilizado para separar mezclas de gases,
líquidos o sólidos en disolución mediante diferentes
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líquidos o sólidos en disolución mediante diferentes
procesos físicos. Proceso en que una mezcla química
disuelta en un líquido o gas se separa en componentes
como resultado de una distribución diferencial de los
elementos solubles.
¿Por qué a alta presión?� La cromatografía en columna con una fase estacionaria
formada por partículas muy pequeñas hace el
empaquetamiento de la columna muy compacto. Y como
consecuencia de ello, la hace muy lenta.
� Entonces se instala a la entrada de la columna un sistema
de bombeo que tiene dos finalidades:
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de bombeo que tiene dos finalidades:
� I) Superar la resistencia del relleno.
� II) Aportar un flujo de fase móvil que puede ser
controlado a lo largo de toda la cromatografía
� En estas condiciones, se consigue acortar el tiempo de
análisis.
Equipos a estudiar
� HPLC
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� FPLC
Objetivo
� El estudiante aprenderá a correlacionar las propiedades de una sustancia como medio para separarla de una mezcla.
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� Deberá adquirir el criterio necesario para hallar la mejor combinación de variables para la separación de los compuestos a estudiar y su posible cuantificación y/o caracterización.
Esquema del equipo
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Componentes del equipo
� A) Solventes o mezcla de solventes a utilizar� B) Bombas� C) Tipos de columnas
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� C) Tipos de columnas� D) Inyectores� E) Diferentes detectores.� F) Graficadores.
� Aplicaciones generales
� . HPLC preparativo.� . Separaciones químicas.
. Purificación.
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� . Purificación.� . Identificación de sustancias� . Cuantificación
Cámara del solvente
� Se utilizan solventes con un estricto control de pureza
física y química, deben ser filtrados y muchas veces
desgasificados.
Es conveniente que en esta cámara (reservorio) existan
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� Es conveniente que en esta cámara (reservorio) existan
desgasificadores (aplicación de ultrasonidos) para
eliminar los gases del disolvente pues producen
burbujas en la columna y en el sistema de bombeo que
interfieren con los resultados.
Fase móvil
� Elución isocrática: una sola fase móvil de composición
única
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� Elución con gradiente: la separación ocurre cuando se
incrementa la fuerza del solvente orgánico. Puede ser
en paso o con un incremento lineal.
Elución isocrática vs. Elución por gradiente
�
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Columnas de separación
� Existen cuatro tipos de cromatografías� A) De partición PM < 104 g/mol.� B) De adsorción, especies no polares PM <
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� B) De adsorción, especies no polares PM < 104 g/mol.
� C) De intercambio iónico, PM < 104 g/mol.� D) De exclusión molecular o cromatografía
en geles PM >104 g/mol.
Columnas de Partición
� Denominadas de fase normal.� Utilizan una fase estacionaria polar y una
fase móvil menos polar.
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� Compuesto hidrofóbicos eluyen más rápido que aquellos hidrofílicos.
� Ejemplo: columnas de sílica gel.
Columnas de adsorción
� Denominadas de fase reversa, se basa en interacciones hidrofílicas y lipofílicas de las moléculas.
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� Empaque: de sílica gel con cadenas n-alquilo unidas covalentemente, lo que le dan un carácter hidrofóbico a la columna.
� Ejemplo C-18
Columnas de intercambio iónico
� Exclusión selectiva de los iones de la muestra con el contraión de la fase estacionaria.
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� Tipo de columnas utilizadas en Química Biológica:
� Columnas catiónicas CM-celulosa� Columnas aniónicas DEAE-celulosa
Curvas de titulación
δ+
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pH
δ-
Columnas de exclusión molecular o cromatografía en geles
� Separación por tamaño de partícula. Los compuestos de PM más grandes serán los primeros en eluir. Los más pequeños entrarán en el lecho cromatográfico y podrán ser
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en el lecho cromatográfico y podrán ser separados.
� Tipos de columnas utilizadas:� Sephadex, Biogel P, etc.
• Sephadex•Separa proteínas globulares en el rango de 4.000 –150.000 Da.
•Retiene una cantidad de agua de 10,0 ± 1,0 mL por gde Sephadex seco.
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de Sephadex seco.
•Su densidad es de 1,04 g/mL.
•La forma de gel se consigue por hidratación. Para elloes necesario calentarlo a 90 ºC durante 5 h enpresencia de la fase móvil, con tal de conseguir que elgel absorba toda el agua que es capaz de retener.
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Constante de distribución
� – Parámetros importantes:
� • Volumen de exclusión, Vo
� • Volumen total de eluyente, Vt
� • Volumen de elución, Ve
� • Coeficiente de reparto Kav = V e −Vo
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� • Coeficiente de reparto Kav = V e −Vo
Vt−Vo
� Gel Tipo de polímero Tamaño de poro
� Sephadex G-25 Dextrano 2.500
� Biogel P-60 Poliacrilamida 30.000
� Sepharose 6B Agarosa 2.000.000
Tipos de Sephadex� Polisacáridos Péptidos y Proteínas
� G10 hasta 700 hasta 700
� G15 hasta 1 500 hasta 1 500
� G25 100 - 5 000 1 000 - 5 000
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� G25 100 - 5 000 1 000 - 5 000
� G50 500 - 10 000 1 500 - 30 000
� G75 1 000 - 50 000 3 000 - 80 000
� G100 1 000 - 100 000 4 000 - 150 000
� G150 1 000 - 150 000 5 000 - 400 000
� G200 1 000 - 200 000 5 000 - 800 000
Cálculo del PM de una sustancia
� K = Ve-Vo� Vt - Vo � Gel 1 Gel 2
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�
� Log PM
Columnas específicas� De Afinidad: poseen inmovilizados compuestos
de alta afinidad por uno de los componentes de la muestra. Son altamente específicas.
De Fase Quiral: contienen modificadores
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� De Fase Quiral: contienen modificadores quirales que funcionan formando compuestos diasteroisómeros con el analito. Separan isómero ópticos debido a su diferente capacidad de unión a la fase estacionaria.
CÁMARA DE INYECCIÓN DE LA MUESTRA - INYECTOR.
� Dispositivo por medio del cual se introduce la muestra enel sistema cromatográfico.
� La inyección se realiza con una jeringa que se introduceen el inyector y descarga la muestra para su análisis.
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en el inyector y descarga la muestra para su análisis.
� La muestra no debe contener sólidos para que no seatasque, si es necesario hay que proceder a su filtración.La muestra debe ser disuelta en el mismo eluyente que seva a utilizar.
� El volumen a inyectar de muestra debe ser el menorposible para obtener mejores resultados.
Inyectores para HPLC
� Es una válvula de inyección con un loop calibrado que
permite la inyección de la muestra a estudiar. La
muestra se disuelve en general en la fase móvil, se
inyecta en el loop a traves de la válvula de inyección y
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inyecta en el loop a traves de la válvula de inyección y
mediante un giro del rotor de la válvula la muestra se
inyecta en la fase móvil.
Inyector Rheodyne
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BOMBAS DE ALTA PRESIÓN
� Es la encargada de introducir la fase móvil (eluyente)
en la columna de cromatografía. Estas bombas deben
aportar un flujo constante del solvente entre 0,001
hasta 10 ml/minuto. Las elevadas presiones que
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hasta 10 ml/minuto. Las elevadas presiones que
generan las bombas (varios centenares de atmósferas)
no constituyen un peligro de explosión ya que los
líquidos no son muy compresibles. No obstante,
muchos cromatógrafos presentan válvulas de
seguridad y purga por si se produce este proceso.
Tipos de Bombas para cromatografía de alta presión
� Existen diferentes tipos de bombas, algunas de ellas
aptas para todo tipo de solventes y otras sólo con
posibilidad de ser utilizadas con solventes orgánicos-
acuosos pero no con el agregado de sales minerales.
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acuosos pero no con el agregado de sales minerales.
BOMBA MONO PISTÓN
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BOMBA DE DOBLE PISTÓN
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BOMBA DE PISTÓN DUAL
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Sistema precolumna concentradora
inyector
Columna
Valvu
la
PC-CL
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detector
Pre columna
Columna
Analítica
Esquema de un sistema de acoplamiento con pre-columna
enriquecedora (PC-CL).
Cromatografía acoplada
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COLECTOR DE FRACCIONES
� Es un equipo que recoge las fracciones a medida quevan llegando al detector. Esta recogida separa loscomponentes de idénticas propiedades entre sí, salvoque aparezcan picos solapados. A continuación se
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que aparezcan picos solapados. A continuación setoman las muestras, se comprueba su pureza medianteuna cromatografía en capa fina y se efectúan losensayos de identificación con las técnicas disponibles,IR, RMN, Fluorescencia, Masas, etc. La mayoría delos cromatógrafos de HPLC llevan incorporados uncolector de fracciones.
ORDENADOR CROMATOGRÁFICO
� Microprocesador diseñado sólo para esta técnica, es elnexo entre todos los componentes del equipo. Su misiónes controlar todas las variables del proceso e indicar en
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es controlar todas las variables del proceso e indicar encada instante las condiciones del sistema. Puede ser unmero graficador o puede tratarse de un integrador. Hoyen día tenemos computadoras con sistemas adecuadospara el análisis cromatográficos.
Cromatografía en columna:
� El movimiento del soluto puede sólo ocurrircon la mezcla líquida
� La velocidad promedio a la cual la banda delsoluto migra en la columna depende de la
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soluto migra en la columna depende de lafracción de tiempo que pase en la FaseEstacionaria
� El tamaño de la banda del soluto aumentacon el tiempo debido al proceso de dilución
Velocidad de migración y ancho del pico en la resolución.
� Velocidad de migración del soluto
� – La velocidad de migración se determina por el
valor de la K de equilibrio para las reacciones en las
que los solutos se distribuyen entre la fase móvil y la
fase estacionaria
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fase estacionaria
� Constantes de distribución:
� – Amóvil � Aestacionaria
� – K= C est/Cmóvil : C=concentración molar
� – K= constante de distribución, razón de partición,
coeficiente de partición.
Tiempo de retención
� Tiempo que tarda la muestra inyectada (analito), en alcanzar el detector. (tR)
� tM: tiempo muerto para especies no retenidas. (tiempo
� requerido para que una molécula en la fase movil pase a las
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� requerido para que una molécula en la fase movil pase a las de la columna).
� � Velocidad lineal promedio de migración del soluto
� v= L/tR L = longitud de la columna
� � Velocidad lineal promedio del movimiento de las moléculas en la fase móvil.
� U = L/tM
Eficiencia
� Se utilizan dos términos para medir
cuantitativamente la eficiencia de una columna:
� • Altura del plato teórico : H
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� • Número del plato teórico: N
� N =L/H
� � L= longitud del relleno de la columna
Eficiencia� H, N pueden ser obtenidas mediante el ancho del pico
cromatográfico.
� La eficiencia aumenta cuanto mayor es el número de platos y
cuanto menor es la altura de plato.
� Martin y Synge (1941) trataron a la columna como una
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Martin y Synge (1941) trataron a la columna como una
columna de destilación fraccionada formada por capas
denominadas plato teórico donde se establece el equilibrio del
soluto entre la fase estacionaria y la móvil.
� La teoría de platos explica con éxito la forma gaussiana de los
picos cromatográficos. Falla al intentar justificar el
ensanchamiento de los picos, surge la teórica de la velocidad.
Altura de plato teórico
� Comparamos el pico con una distribución gaussiana� – H = σ2 / L� σ2 = varianza del pico del analito (cm2)� – σ2 se puede obtener gráficamente
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� – σ2 se puede obtener gráficamente
Eficiencia de la columna� La eficiencia de una columna esta relacionada
con la resolución de la fase estacionaria para una dada separación de compuestos.
� Cálculo general del número de platos teóricos:
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� N = a tr2 / W2
� a = Cte. Que depende de la altura donde se mide el pico
� tr = tiempo de retención� W = ancho del pico
Método del punto de inflexión
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Altura media del pico
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Método de las tangentes
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Método de los sigmas
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Variables que afectan la eficiencia de la columna
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Métodos para describir la eficiencia
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Separación con diferentes mezclas de solventes
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Variables que afectan a la separacióncromatográfica.
� Parámetros relacionados por la cinética.� Parámetros dependientes de las propiedades
de los solutos.
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� Parámetros dependientes de propiedades del soluto y de la columna.
� Los dependientes de las propiedades del soluto y lacolumna pueden variar más fácilmente variando laT, composición de la fase móvil, tipo de columna(empaquetamiento).
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(empaquetamiento).
� Los relacionados con la cinética pueden variarsecambiando la longitud de la columna alterando lavelocidad de flujo de la fase móvil, el tamaño departícula de empaquetamiento, la viscosidad de lafase móvil, el espesor de la película absorbida de laFE
� Variación de N
� Aumenta el número de platos, acompañados por una reducción de H. (así se optimiza el tiempo requerido para completar la separación)
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requerido para completar la separación)
� Variación de H
� Reducción de H disminuyendo el tamaño de partícula en la columna, reduciendo la viscosidad del solvente (aumentar coeficiente de difusión de la Fase Móvil).
Cuantificación de la muestra
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Detectores y límite de detección
� Esta colocado inmediatamente después de la fase estacionaria.
� Existen varios tipos de detectores:� * De índice de refracción (IR)
* Ultra violeta (UV)
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� * Ultra violeta (UV)� * Fluorescencia� * Radioquimico� * Infrarojo cercano� * Espectroscopía de masa� * Resonancia magnética nuclear� * Dispersión de la luz
Detectores UV
� A) Longitud de onda fija
� B) Longitud de onda variable
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� B) Longitud de onda variable
� C) Arreglo de diodos
� Límite de sensibilidad10-8 a 10-9 mg/mL
Detectores de fluorescencia
� Miden la capacidad de los compuestos de absorber a una λ y reemitir a otra
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� Límite de sensibilidad: 10-9 a 10-11 g/mL.
Aplicación
� Medición de DNA y RNA� Reactivos utilizados Hoechst-33258 y bromuro
de etidio.
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� λexcitación 355nm� λemisión 460nm� Medición de la aparición o desaparición de
productos fluorescentes formados por la interacción enzima-sustrato
Detectores radioquímicos
� Homogéneos: por agregado de líquido de centelleo se produce una fluorescencia medible.
Heterogéneos: el silicato de lítio más la
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� Heterogéneos: el silicato de lítio más la fluorescencia causada por la emisión beta interactuan con el detector
� Límite de sensibilidad: 10-9 a 10-10 g/mL.�
Detectores electroquímicos
� Los compuestos deben tener propiedades de oxido reducción.
� Se mide diferencia de potencial.
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� Sensibilidad: 10-12 a 10-13 g/mL
Detectores de espectroscopia de masas� Impacto electrónico: una corriente electrónica
ioniza la muestra.
� Ionización química: Menos agresivo, un gas
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� Ionización química: Menos agresivo, un gas ionizado remueve electrones del compuesto.
� Fast Atom Bombardment: átomos de xenón ionizan los compuestos.
� Sensibilidad: 10-8 a 10-10 g/mL
Ejemplo
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� Características del ión molecular
� * Debe ser el ión con mayor masa de todos los del espectro.
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� * Debe contener todos los elementos presentes en sus fragmentos.
� * Debe corresponder al ión con el potencial de ionización más bajo.
� * Su relación m/e debe ser par cuando no posee
Nitrógeno o posee un número par de él; por la misma
razón debe ser impar cuando posee un número impar de
átomos de Nitrógeno.
� * Las diferencias de masa entre dicho ión molecular y
los fragmentos que aparecen en el espectro deben ser
químicamente lógicas.
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químicamente lógicas.
� * Su abundancia relativa depende en gran medida de la
naturaleza química del producto
� * Se puede utilizar el ión molecular para la
determinación de la fórmula molecular de la sustancia
Aplicaciones
� * Determinación del peso molecular de compuestos orgánicos volátiles.
� * Identificación de un compuesto, o un fragmento del mismo mediante su espectro de masas por
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del mismo mediante su espectro de masas por comparación con librerías.
� * Análisis cuantitativo de mezclas volátiles.� * Determinación de masas exactas de
compuestos orgánicos volátiles.
COMPUESTO M+ PICOS MÁS INTENSOS
CH3CH2CH2CH2OH m/e 74 m/e 56,43,41,31, 29 y 27
CH3CH2OCH2CH3 m/e 74 m/e 74, 59,45,31, 29,27
m/e 74 m/e56
C3H7 CH2 O H+.
C4H8 + H2O+.
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.C3H7 + CH2 O H
+.
m/e 31
C3H7 + CH2OH+ ..
m/e 43
C3H5 + H2+
m/e 41
CH3 CH2 O CH2 CH3
+.
m/e 74
CH3 CH2 O C2H3
++
.
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CH3 CH2 O C2H3+
m/e 59
CH2 O H CH2 CH2
+
m/e 31
+
Rupturas característicasMASA DEL IÓN ASIGNACIÓN � 29 Etilo (C2H5), formilo (CHO) � 30 Nitroso (NO) � 31 Metoxilo (CH3O), hidroximetilo (CH2OH) � 41 Alilo (CH2CH=CH2) � 43 Propilo (C3H7), acetilo (CH3CO) � 45 Carboxilo (COOH) � 46 Nitro (NO2)
55 Butenilo (C H )
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� 55 Butenilo (C4H7) � 56 C4H8
� 57 t-Butilo (C4H9), Propanoilo (CH3CH2CO)
� 60 Acido acético � 65 Ciclopentadienilo (C5H5) � 77 Fenilo (C6H5) � 91 Bencilo (tropillo, Ph-CH2) � 105 Benzoilo (Ph-CO) � 127 Iodo
Nitrofuranos en mieles
� El origen de estas sustancias se debe al uso de productos veterinarios cuyas formulaciones contienen nitrofuranos, aplicados en las colmenas para el control de enfermedades bacterianas y
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para el control de enfermedades bacterianas y parasitarias de las abejas
�
Alta Toxicidad� Los ensayos toxicológicos realizados desde el año
1993, tanto in vivo como in vitro arrojan resultados que demuestran el potencial mutagénico (Capacidad de alterar al ADN de las células), carcinogénico (Capacidad de provocar
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carcinogénico (Capacidad de provocar transformaciones tumorales en células sanas), y teratogénico (Capacidad de provocar alteraciones en el desarrollo embrionario), de estos compuestos.
Grado de tolerancia
� La Unión Europea, basada en los resultados de estos ensayos y en las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), establece una tolerancia CERO para estos
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establece una tolerancia CERO para estos compuestos y sus metabolitos
Validación
� Por el momento la única técnica validada internacionalmente que permite detectar e identificar los 4 metabolitos de Nitrofuranos es la que se aplica mediante un equipo denominado
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que se aplica mediante un equipo denominado HPLC masa masa, o LC/MS/MS (Cromatografía Líquida con doble detector espectrométrico de masa).
� Donde se realiza: en laboratorios del SENASA
Deporte
� En el deporte, los entrenadores y atletas utilizan las
drogas teniendo conocimiento de las prohibiciones a
las que están sometidas, con el único objetivo de lograr
buenos resultados competitivos, sin pensar que pueden
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buenos resultados competitivos, sin pensar que pueden
perder la vida o verse obligados a abandonar su carrera
por determinado tiempo. El problema va mas allá de
una simple sanción o restricción, sino que llega hasta la
degradación social que sufre el individuo consumidor.
Doping� - CLASES DE SUSTANCIAS PROHIBIDAS.
� A- Estimulantes.
� B- Narcóticos.
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� C- Agentes anabólicos.
� D- Diuréticos.
� E- Hormonas peptídicas, miméticos y análogos.
Determinación de una sustancia prohibida
� Puede darse tres casos diferentes:
� 1.- Las pruebas muestran la presencia de una sustancia prohibida
que refuerza la actuación, y muestra entrenamiento simple. En
este caso, no hay ninguna duda de que esta persona debe ser
sancionada.
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sancionada.
� 2.-Las pruebas muestran la presencia de una sustancia que
necesariamente no refuerza la actuación. En este caso la
comisión médica tendría que valorar profundamente el caso.
� 3.- La prueba no revela ninguna sustancia doping porque se
� "enmascaró", temporalmente, y es indetectable como una
sustancia exógena. En este caso, sancionar al deportista seria
imposible.
Recuerde, si algo no se separa o no lo detecta el detector, no es culpa del equipo!!!!
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