survival of vibrio cholerae and

8/10/2019 Survival of Vibrio Cholerae And

1/8

1982, 43(3):578.Appl. Environ. Microbiol.

M A Hood and G E Nesswaters and sediments.

Escherichia coli in estuarineSurvival of Vibrio cholerae and

http://aem.asm.org/content/43/3/578

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2/8

V o l .

4 3 ,

N o .

3

P P L I E D

AND

ENVIRONMENTAL

M I C R O B I O L O G Y ,

M a r . 1 9 8 2 ,

p .

5 7 8 - 5 8 4

0 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 2 / 0 3 0 5 7 8 - 0 7 0 2 . 0 0 / 0

S u r v i v a l o f

V i b r i o c h o l e r a e a n d E s c h e r i c h i a

c o l i i n

E s t u a r i n e

W a t e r s

a n d

S e d i m e n t s

MARY A . HOOD* A N D

G R E G O R Y E . N E S S

D e p a r t m e n t o f

B i o l o g y ,

T h e

U n i v e r s i t y

o f

W e s t

F l o r i d a ,

P e n s a c o l a ,

F l o r i d a

3 2 5 0 4

R e c e i v e d

1 2

A u g u s t

1 9 8 1 / A c c e p t e d

3 0 N o v e m b e r 1 9 8 1

I n i n

v i t r o e s t u a r i n e

w a t e r

a n d

s e d i m e n t c h a m b e r s ,

t h e

s u r v i v a l o f

V i b r i o

c h o l e r a e a n d

E s c h e r i c h i a c o l i w a s d e t e r m i n e d

b y

p l a t e

c o u n t i n g

a n d

d i r e c t

c o u n t i n g

t e c h n i q u e s .

V . c h o l e r a e s t r a i n s

i n c l u d e d

e n v i r o n m e n t a l ,

c l i n i c a l ,

a n d

s e r o t y p e

0 1 a n d

n o n - O 1

i s o l a t e s ,

w h e r e a s

E . c o l i

s t r a i n s

i n c l u d e d

A T C C 2 5 9 2 2

a n d

a

f r e s h l y c u l t u r e d human

i s o l a t e . R e c o v e r y o f V . c h o l e r a e

v a r i e d s i g n i f i c a n t l y

w i t h

i n c u b a t i o n

t e m p e r a t u r e .

G r o w t h

a n d e x t e n d e d p e r i o d s

o f

s u r v i v a l

o c c u r r e d

i n s t e r i l e

s e d i m e n t s ,

s t e r i l e

w a t e r s ,

a n d n o n s t e r i l e

w a t e r s ,

b u t

n o t

i n n o n s t e r i l e

s e d i m e n t s .

I n c o nt r a s t t o

V .

c h o l e r a e ,

v i a b l e

c e l l s

o f

E .

c o l i

d e c r e a s e d

r a p i d l y

i n

b o t h s t e r i l e a n d n o n s t e r i l e e s t u a r i n e

w a t e r s .

D i r e c t c o u n t s

r e v e a l e d

t h a t E .

c o l i

c e l l s w e r e i n t a c t

i n t h e e s t u a r i n e

w a t e r ,

b u t

a t t e m p t s

t o

r e s u s c i t a t e

t h e m

w e r e

u n s u c c e s s f u l .

T h e

d a t a

s u g g e s t

t h a t

V .

c h o l e r a e s u r v i v e s

b e t t e r

i n

e s t u a r i n e

w a t e r s

t h a n

E . c o l i . T h e r e s u l t s

may e x p l a i n

t h e r e c e n t o b s e r v a t i o n s

t h a t V .

c h o l e r a e

l e v e l s d o

n o t c o r r e l a t e

w e l l

w i t h f e c a l c o l i f o r m

c o n c e n t r a t i o n s

i n

e s t u a r i n e w a t e r s .

F u r t h e r m o r e ,

t h e

r e s u l t s

a d d

i n c r e a s i n g

e v i d e n c e

t o

s u p p o r t

t h e

t h e o r y

t h a t V .

c h o l e r a e

i s

a n a u t o c h t h o n o u s

b a c t e r i u m

i n e s t u a r i e s .

T h e

common

o c c u r r e n c e o f

V i b r i o

c h o l e r a e

i n

t h e

e s t u a r y

( 7 , 8 , 1 3 , 1 4 ,

1 8 )

h a s l e d

t o

t h e

c o n c l u s i o n t h a t t h e

o r g a n i s m

i s

a n

i n d i g e n o u s

r e s i d e n t

o f

t h e

e s t u a r y 8 ,

1 4 ) .


t h e r e i s

i n c r e a s i n g

e v i d e n c e

s u g g e s t i n g

t h a t t h e

p r e s e n c e

o f V . c h o l e r a e

d o e s n o t

c o r r e l a t e

w e l l

w i t h l e v e l s

o f f e c a l c o l i f o r m s

( 8 ,

1 3 ,

1 4 ) .

T h e

p o s s i b i l i t y

t h a t

f e c a l c o l i f o r m s

ma y

n o t i n d i c a t e

t h e p r e s e n c e


i n e s t u a r i n e

w a t e r s

i s

e s p e c i a l l y s i g n i f i c a n t f r o m

a

p u b l i c

h e a l t h

s t a n d p o i n t ,

s i n c e

f e c a l c o l i f o r m s h a v e h i s t o r i c a l -

l y

b e e n

u s e d a s

i n d i c a t o r s o f w a t e r a n d s h e l l f i s h

q u a l i t y .

W i t h t h e r e c e n t o u t b r e a k s

o f c h o l e r a

a n d

g a s t r o i n t e s t i n a l

d i s o r d e r s c a u s e d

b y

V . c h o -

l e r a e

2 , 4 - 6 , 2 0 )

a n d

t r a c e d t o

s h e l l f i s h ,

t h e

q u e s t i o n

b e c o m e s

e v e n

m o r e

r e l e v a n t .

T h e r e h a v e b e e n

many

s t u d i e s

o n t h e s u r v i v a l

o f

t h e c o l i f o r m E s c h e r i c h i a

c o l i

i n

s e a w a t e r

( 1 0 ,

1 9 )

a n d

a

n u m b e r o f

e a r l y

w o r k s o n

t h e

s u r v i v a l

o f

V .

c h o l e r a e

i n

s e a w a t e r a s

r e v i e w e d

b y P o l -

l i t z e r

( 1 6 ) .

S u r v i v a l

o f

c o l i f o r m s i n

m a r i n e

w a -

t e r s

w a s

c o n c l u d e d

t o b e

a f u n c t i o n o f

s a l t

c o n c e n t r a t i o n , p r e d a t i o n ,

c o m p e t i t i o n b y

n a t i v e

m i c r o f l o r a ,

h e a v y

m e t a l s , a n d

n u t r i e n t s ( 3 , 1 1 ,

1 5 ) .

V .

c h o l e r a e

s u r v i v a l

i n s e a w a t e r w a s f o u n d

t o

b e

r e l a t e d

t o t e m p e r a t u r e , p H , s a l t c o n c e n t r a -

t i o n ,

t h e

a m o u n t

o f o r g a n i c

m a t e r i a l , a n d t h e

d e g r e e o f

b a c t e r i a l

c o n t a m i n a t i o n ( 1 6 ) .

A l t h o u g h

t h e s e s t u d i e s

h a v e

r e p o r t e d

t h e

s u r v i v a l

r a t e s

o f

E .

c o l i a n d V .

c h o l e r a e , t h e r e i s

n o c o m p a r a t i v e

i n f o r m a t i o n

o n t h e s u r v i v a l o f t h e s e

t w o

o r g a n -

i s m s

i n

e s t u a r i n e

e n v i r o n m e n t s .

T h u s , i t w a s t h e

p u r p o s e

o f t h i s

s t u d y

t o e x a m i n e

t h e s u r v i v a l

o f

s t r a i n s

o f

V . c h o l e r a e i n e s t u a r i n e w a t e r s a n d

s e d i m e n t s

a n d

t o

c o m p a r e

t h e i r

s u r v i v a l

t o

t h a t

o f E s c h e r i c h i a

c o l i .

M A T E R I A L S A N D M E T H O D S

S u r v i v a l

c h a m b e r s . W a t e r

a n d

s e d i m e n t

w e r e

c o l -

l e c t e d

f r o m

A p a l a c h i c o l a B a y , F l a . ,

w i t h a

P o n a r

g r a b

( W i l d l i f e

S u p p l y

C o . ,

S a g i n a w ,

M i c h . )

a n d

s t e r i l e

w a t e r

b o t t l e s . T h e s e d i m e n t s a m p l e s

w e r e p l a c e d

o n

i c e ,

r e t u r n e d t o t h e

l a b o r a t o r y ,

a n d

k e p t

a t

4 C

u n t i l

t h e

s u r v i v a l c h a m b e r s

w e r e

e s t a b l i s h e d

( w i t h i n

5

d a y s

a f t e r

c o l l e c t i o n ) .

W a t e r

s a m p l e s

w e r e

s t o r e d

a t

a m b i -

e n t

t e m p e r a t u r e

a n d f i l t e r e d

t h r o u g h

a

Whatman

n o . 1

f i l t e r

t o

r e m o v e

l a r g e

d e t r i t a l

p a r t i c l e s .

S a l i n i t i e s o f

t h e

w a t e r s r a n g e d f r o m 6 t o

2 0 I / o I .

I n t o

s t e r i l e

g l a s s

c o n t a i n e r s

( 2 0 0

m l ) d e s i g n a t e d

t h e

s u r v i v a l

c h a m b e r s ,

1 0 0

m l

o f

t h e

c o l l e c t e d

e s t u a r i n e

w a t e r

w a s a d d e d .

S e d i m e n t c h a m be r s

w e r e p r e p a r e d

w i t h 5 0 g o f s e d i m e n t

a n d

5 0 m l

o f

e s t u a r i n e

w a t e r . T h e

s t e r i l e

w a t e r a n d s e d i m e n t

c h a m b e r s w e r e a u t o c l a v e d

a t s t a n d a r d

c o n d i t i o n s .

A l l

c h a m b e r s w e r e

a l l o w e d

t o

e q u i l i b r a t e

a t

2 0 C

f o r 4 8

h

b e f o r e

i n o c u l a t i o n ,

a n d t w o

o r

t h r e e

r e p l i c a c h a m b e r s w e r e

p r e p a r e d

f o r

e a c h

e x p e r i m e n t .

C u l t u r e

p r e p a r a t i o n .

E n v i r o n m e n t a l

V .

c h o l e r a e

s t r a i n s

w e r e i s o l a t e d

f r o m

o y s t e r s

c o l l e c t e d

f r o m A p a -

l a c h i c o l a

B a y

b y

t h e

m e t h o d s

o f

Hood

e t a l .

( 1 3 ) a n d

K a p e r e t a l .

( 1 4 )

a n d

w e r e m a i n t a i n e d o n T r y p t i c a s e

s o y

(BBL M i c r o b i o l o g y S y s t e m s ,

C o c k e y s v i l l e , M d . ) -

1

N a C l

a g a r .

V .

c h o l e r a e

s t r a i n s

i n c l u d e d a n

e n v i -

r o n m e n t a l

0 1

I n a b a ,

W F / 1

( 1 3 ) ,

a n

e s t u a r i n e

w a t e r -

a d a p t e d

0 1

s t r a i n ,

f i v e

e n v i r o n m e n t a l

n o n - O 1 s t r a i n s ,

W F / 2 3 , W F / 5 4 ,

W F / 1 0 3 ,

W F / 1 0 8 ,

a n d

W F / 1 1 1 ,

a n d a

c l i n i c a l

0 1

s t r a i n

( 6 ) .

N o n - O 1

V .

c h o l e r a e s t r a i n s w e r e

t y p e d b y

Ron

S i e b e l i n g ,

L o u i s i a n a S t a t e

U n i v e r s i t y ,

B a t o n

R o u g e , a s

T T

( W F / 2 3 ) , Un k ( W F / 5 4 , W F / 1 0 8 ,

5 7 8

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3/8

V . C H O L E R A E

AND

E .

COLI I N

E S T U A R I E S

5 7 9

o

7

10

10 5

1 0 4

1 0 2

1 0 1

1

2 3

4

5

6 7

8 9

1 0 1 n 1 2

Days

F I G . 1 . E f f e c t

o f i n o c u l u m

s i z e on t h e s u r v i v a l o f

V .

c h o l e r a e

0 1

( W F / 1 ) i n e s t u a r i n e

w a t e r s a n d

s e d i -

m e n t s i n c u b a t e d a t 2 0 C . T h e v a l u e s

a re

e x p r e s s e d a s

c o l o n y - f o r m i n g

u n i t s .

a n d

W F / 1 0 3 ) ,

a n d

B B

( W F / 1 1 1 ) . T h e e s t u a r y - a d a p t e d

i s o l a t e

was s t r a i n

W F / 1

p l a c e d

i n

e s t u a r i n e

w a t e r s .

T h e

o r g a n i s m

was

r e c o v e r e d

f r o m

t h e

w a t e r

a f t e r

6

w e e k s a n d

r e v i t a l i z e d

o n

T r y p t i c a s e s oy b r o t h

( B B L ) .

T h e

E .

c o l i

s t r a i n s

i n c l u d e d

A TCC

2 5 9 2 2

a n d a

f r e s h l y

i s o l a t e d

s t r a i n f r o m human

f e c e s .

E .

c o l i s t r a i n s

were

b i o c h e m i c a l l y

c o n f i r m e d

w i t h

t h e A P I 2 0 E

s y s t e m

( A n a l y t a b

P r o d u c t s , P l a i n v i e w ,

N . Y . ) .

V .

c h o l e r a e

a n d

E .

c o l i

i s o l a t e s were

grown

i n

T r y p t i c a s e

s o y

b r o t h - 1

N a C l

f o r 2 4 h

a t

3 5 C .

C u l t u r e s

were

c e n t r i f u g e d

a t

2 0 0 0 rpm f o r 2 0 m i n a n d

w a s h e d

i n

p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e . T h e

p r o c e d u r e

wa s r e p e a t e d

t w i c e ,

a n d t h e

c e l l s were

i n o c u l a t e d

i n t o

t h e s u r v i v a l

c h a m b e r s .

I n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e s , i n i -

t i a l i n o c u l u m

s i z e ,

a n d

t i m e a n d

l o c a t i o n o f w a t e r a n d

s e d i m e n t

c o l l e c t i o n were

v a r i e d .

R e c o v e r y

o f

v i a b l e

c e l l s .

A t

s e l e c t e d t i m e

i n t e r v a l s ,

s a m p l e s

were

t a k e n f r o m t h e c h a m b e r s

a n d

d i l u t e d i n

p h o s p h a t e - b u f f e r e d

s a l i n e b l a n k s . E n u m e r a t i o n was

p e r f o r m e d b y

t h e

s t a n d a r d

p l a t e

c o u n t m e t h o d o n

b r a i n

h e a r t

i n f u s i o n

agar ( D i f c o

L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t ,

M i c h . ) , T r y p t i c a s e

s o y - 1

NaCl

a g a r ,

a n d

t h i o s u l f a t e

c i t r a t e b i l e s a l t

sucrose

agar ( D i f c o )

f o r

V .

c h o l e r a e .

F o r E .

c o l i

recovery,

e o s i n

m e t h y l e n e

b l u e

( E M B )

agar ( D i f c o )

a n d b r a i n h e a r t

i n f u s i o n agar

were u s e d .

E n u m e r a t i o n

o f

V .

c h o l e r a e a n d

E .

c o l i

c o l o n i e s

was

p e r f o r m e d

b y

c o m p a r i n g

t h e m w i t h

c o n t r o l c o l o n i e s .

01

s t r a i n s

were

c o n f i r m e d

b y u s i n g p o l y v a l e n t

a n t i s e -

rum

( D i f c o ) , w h e r e a s n o n - O 1 s e r o t y p e

a n d E .

c o l i

c o l o n i e s were

c o n f i r m e d

b y

u s i n g

t h e

API 2 0 E

S y s -

t e m .

I n

a d d i t i o n ,

t h e

most

p r o b a b l e

n u m b e r

f o r f e c a l

c o l i f o r m s was d e t e r m i n e d

b y u s i n g

t h e

s t a n d a r d m e t h -

o d w i t h

l a u r y l

t r y p t o s e

b r o t h

( D i f c o )

a n d

i n c u b a t i o n

a t

3 5 C

f o r 4 8

h

1 .

P o s i t i v e

t u b e s

were

t r a n s f e r r e d

t o E C

b r o t h

( D i f c o )

a n d

i n c u b a t e d

a t

4 4 . 5 C

f o r 4 8

h .

P o s i t i v e

t u b e s were t h e n s t r e a k e d o n t o EMB

a g a r . A t t e m p t s

w e r e m a d e

t o r e s u s c i t a t e

t h e E . c o l i c e l l s i n t o

l a c t o s e

b r o t h ( D i f c o ) b y i n c u b a t i n g

f o r

3

h a t

2 0 C

b e f o r e

i n c u b a t i o n f o r 4 5 h

a t

3 5 C .

T u b e s w h i c h s h o w e d

g r o w t h

w i t h

o r w i t h o u t g a s w e r e s t r e a k e d o n t o l a c t o s e

a g a r

a n d E M B a g a r

a n d w e r e t r a n s f e r r e d

t o E C b r o t h

a n d

i n c u b a t e d

a t

4 4 . 5 C

f o r

4 8

h .

E C

t u b e s w i t h g a s

o r

g r o w t h

w e r e s t r e a k e d

o n t o

l a c t o s e

a n d EMB

a g a r .

C o l o n i e s w e r e c o n f i r m e d o n

t h e A P I

2 0 E s y s t e m .

D i r e c t

c o u n t s .

C e l l s w e r e e n u m e r a t e d

b y

t h e

a c r i d i n e

o r a n g e

d i r e c t

c o u n t i n g p r o c e d u r e

o f H o b b i e e t a l .

( 1 2 ) .

A Z e i s s

s t a n d a r d

1 8 m i c r o s c o p e

w a s

u s e d

w i t h a

4 5 0

t o 4 9 0 - n m b a n d p a s s

f i l t e r ,

FT

5 1 0 b e a m s p l i t t e r , L P

5 2 0 b a r r i e r

f i l t e r ,

a n d a 1 0 0 - W

h a l og e n l a m p .

S e v e r a l

m o d i f i c a t i o n s

w e r e

m a d e i n t h e

a c r i d i n e

o r a n g e d i r e c t

c o u n t i n g p r o c e d u r e o f H o b b i e

e t

a l .

( 1 2 ) . N u c l e p o r e

p o l y c a r b o n a t e

m e m b r a n e s

( N u c l e p o r e

C o r p . ,

P l e a s a n -

t o n ,

C a l i f . ) o f 0 . 2 - , u m p o r e

s i z e w e r e

s t a i n e d f o r 2 0 m i n

i n

I r g a l a n

B l a c k ( C e i ba - G e i g y

C o r p . , G r e e n s b o r o ,

N . C . ) ,

a n d

t h e f i l t e r s , a f t e r

t h r e e r i n s e s i n d i s t i l l e d

w a t e r ,

w e r e u s e d

d a m p .

N o

s u r f a c t a n t

w a s

u s e d

9 .

A f t e r s t a i n i n g w i t h a c r i d i n e

o r a n g e ,

t h e f i l t e r

w a s

r i n s e d w i t h 0 . 8 5 s a l i n e . T h e

u n d e r - p a d

c e l l u l o s e

f i l t e r w a s n o t

e m p l o y e d .

T h e

d a m p

m e m b r a n e

f i l t e r

w a s p l a c e d o n

t h e s l i d e , a c o v e r s l i p

w a s

p l a c e d

d i r e c t l y

o n

t o p

o f

t h e

f i l t e r ,

a n d t h e

c e l l s

w e r e c o u n t e d

i m m e d i a t e l y .

A d r o p o f n o n f l u o r e s c e n t

o i l

o r s a l i n e

w a s a d d e d t o p r e v e n t r a p i d

d r y i n g o f

t h e m e m b r a n e .

S t a t i s t i c a l

a n a l y s i s . By u s i n g

a s t a n d a r d s t a t i s t i c a l

p r o g r a m ( S A S ) , a n a l y s i s

o f

v a r i a n c e

w a s

c o n d u c t e d .

C a l c u l a t e d f

v a l u e s w e r e

c o m p a r e d

w i t h

t a b u l a t e d

f

v a l u e s ( 1 7 ) .

D i f f e r e n c e s

i n

t h e d a t a w e r e

c o n s i d e r e d

s t a t i s t i c a l l y

s i g n i f i c a n t

a t

t h e 95 l e v e l

o f c o n f i d e n c e .

R E S U L T S

S u r v i v a l

o f

V .

c h o l e r a e

s e r o t y p e

0 1 . T h e e n v i -

r o n m e n t a l

V .

c h o l e r a e s e r o t y p e

0 1 s t r a i n

( W F /

1 )

s u r v i v e d

w e l l

i n

e s t u a r i n e

w a t e r s

a n d

s e d i -

m e n t s . F i g u r e 1 i l l u s t r a t e s t h e

e f f e c t o f t h e

i n o c u l u m

s i z e

o n

t h e

s u r v i v a l o f

t h e

o r g a n i s m i n

e s t u a r i n e

w a t e r s

a n d s e d i m e n t s . T h e i n i t i a l i n -

o c u l u m

h a d l i t t l e e f f e c t o n t h e

n u m b e r o f

o r g a n -

i s m s

r e c o v e r e d f r o m s t e r i l e s e d i m e n t s a f t e r 3

d a y s . A l t h o u g h

t h e n u m b e r o f v i a b l e

c e l l s r e c o v -

e r e d

w a s

i n i t i a l l y g r e a t e r i n

t h e e s t u a r i n e

w a t e r

a n d s e d i m e n t

c o n t a i n i n g

t h e

h i g h e s t

i n o c u l u m ,

t h e

d i f f e r e n c e s

w e r e

n o t

s i g n i f i c a n t .

A f t e r

7

d a y s , t h e

o r g a n i s m g r e w a b u n d a n t l y

i n

t h e

s t e r -

i l e

s e d i m e n t

a n d ( d a t a n o t

s h o w n )

c o u l d

b e

r e c o v e r e d

a f t e r

3 5 a n d 6 0

d a y s .

A t

3 5

d a y s ,

t h e

c o n c e n t r a t i o n o f

v i a b l e c e l l s h a d d e c l i n e d t o

1 0 4

c e l l s

p e r m l ,

a n d

b y

6 0

d a y s

t h e c o n c e n t r a t i o n

h a d f u r t h e r d e c r e a s e d

t o

1 0 2

c e l l s

p e r

m l . I n

n o n s t e r i l e

s e d i m e n t ,

v i a b l e c e l l s d e c l i n e d

r e l a -

t i v e l y q u i c k l y

a n d w e r e n o

l o n g e r

r e c o v e r a b l e

a f t e r

1 2

d a y s .

V i a b l e c e l l s a l s o d e c r e a s e d

i n

n o n s t e r i l e

w a t e r s , a l t h o u g h r e c o v e r y

wa s

p o s s i -

b l e f o r

u p

t o

3 5

d a y s .

T h e

s u r v i v a l

o f W F / 1 was e x a m i n e d

i n

s e d i -

m e n t s

( a n d w a t e r s )

c o l l e c t e d

f r o m

two

d i f f e r e n t

s i t e s

i n

A p a l a c h i c o l a B a y

d u r i n g J u l y .

S i t e 3 6

w a s t h e

l o c a t i o n

f r o m

w h i c h

t h e

o r g a n i s m

was

o r i g i n a l l y

i s o l a t e d ,

a n d

s i t e

2 9

was a n

a r e a

w i t h a

l o w e r

mean

s a l i n i t y

l o c a t e d

n e a r

t h e

m o u t h o f

V O L .

4 3 ,

1 9 8 2

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adedfrom


4/8

A P P L . E N V I R O N .

M I C R O B I O L .

- - - - - - - - _ ,

1 0 5

K

n o n s t e r i l e

1 0

l o , L

1 0

0

1

2

3

4 5

6

7 8

9 1 0

1 1

1 2

Days

F I G .

2 .

S u r v i v a l

o f

V . c h o l e r a e 0 1

( W F / 1 )

i n s e d i m e n t s a n d

w a t e r s c o l l e c t e d

f r o m t w o

d i f f e r e n t s i t e s i n

A p a l a c h i c o l a

B a y a n d i n c u b a t e d

a t 2 0 C .

S i t e 2 9 h a d a

s a l i n i t y o f

6 / 0 0 ,

a n d s i t e 3 6 h a d a s a l i n i t y

o f 1 5 O I o .

T h e

v a l u e s a r e

e x p r e s s e d a s c o l o n y - f o r m i n g

u n i t s .

t h e

A p a l a c h i c o l a

R i v e r .

A l t h o u g h

t h e s a l i n i t i e s

o f

t h e

w a t e r s

w e r e

6

a n d

1 5 0 / 1 0 ,

t h e r e

w a s n o

s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e

i n t h e

s u r v i v a l

o f t h e

o r g a -

n i s m

i n

t h e

t w o

d i f f e r e n t

s e d i m e n t s

( F i g .

2 .

T h e s u r v i v a l

o f

W F / 1 v a r i e d

w i t h

t h e t i m e o f

y e a r

t h a t

w a t e r

a n d s e d i m e n t

w e r e c o l l e c t e d

( F i g . 3 .

A l t h o u g h t h e r e

w a s

n o s i g n i f i c a n t

d i f f e r -

e n c e i n

t h e s u r v i v a l o f

t h e

o r g a n i s m

i n

s t e r i l e

s e d i m e n t s

c o l l e c t e d

d u r i n g t h e

t h r e e m o n t h s ,

e a r l y r e c o v e r y ( l e s s

t h a n

5 d a y s ) o f v i a b l e c e l l s

i n

s t e r i l e w a t e r ,

n o n s t e r i l e

w a t e r , a n d

n o n s t e r i l e

s e d i m e n t

w a s g r e a t e s t

i n

t h e

S e p t e m b e r

s a m -

p l e s .

H o w e v e r ,

r e c o v e r y

i n n o n s t e r i l e w a t e r

a n d

n o n s t e r i l e s e d i m e n t

f r o m a n y s a m p l e

a f t e r

5

d a y s

w a s

n o t s i g n i f i c a n t l y

d i f f e r e n t .

T h e t e m p e r a t u r e a t

w h i c h t h e s u r v i v a l

c h a m -

b e r s

w e r e

i n c u b a t e d

h a d

a

s i g n i f i c a n t e f f e c t

o n

t h e

s u r v i v a l

o f

t h e o r g a n i s m

( F i g . 4 ) .

T h e o r g a -

n i s m

w a s o b s e r v e d

t o g r o w b e s t

a t 3 5 C i n s t e r i l e

e s t u a r i n e w a t e r

a n d

s e d i m e n t . H o w e v e r ,

i n

n o n -

s t e r i l e

s e d i m e n t a t t h i s t e m p e r a t u r e ,

t h e

o r g a -

n i s m

d i d n o t g r o w ,

n o r c o u l d

i t

b e

r e c o v e r e d

a f t e r

5

d a y s .

A t

i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e s

o f

2 5 C , r e c o v e r y

w a s

l i m i t e d

t o

5 d a y s i n

n o n s t e r -

i l e

s e d i m e n t a n d

1 0 d a y s i n

n o n s t e r i l e e s t u a r i n e

w a t e r .

A t

4 C , t h e

o r g a n i s m d i d

n o t g r o w

i n

s t e r i l e

s e d i m e n t s o r w a t e r s ,

n o r

w a s i t

r e c o v e r e d

a f t e r 5

d a y s ,

b u t

i t s u r v i v e d f o r

u p

t o

1 5 d a y s i n

n o n s t e r i l e

s e d i m e n t s

a n d

1 0

d a y s

i n

n o n s t e r i l e

e s t u a r i n e w a t e r .

S u r v i v a l

o f

o t h e r

V .

c h o l e r a e

s t r a i n s .

C o m p a r i -

s o n s o f

d i f f e r e n t V .

c h o l e r a e s t r a i n s r e v e a l e d n o



i n t h e

s u r v i v a l

o f s e r o t y p e

0 1

a n d

n o n - O 1 i s o l a t e s

i n

s t e r i l e

o r n o n s t e r i l e

s e d i m e n t s o r

w a t e r s .

N o



w e r e n o t e d i n

v i a b l e

c o u n t s

a m o n g

V . c h o l e r a e

0 1

( W F / 1 )

a n d

n o n - O 1

( W F / 2 3

o r W F / 5 4 )

s t r a i n s

i n

s e d i m e n t s

o r w a t e r s

( F i g .

5 ) .

T h e r e w a s

a l s o

n o s i g n i f i c a n t

d i f f e r e n c e

i n

t h e s u r v i v a l o f

W F / 1

a n d W F / 1 0 3

a s m e a s u r e d b y

v i a b l e

c o u n t s

( F i g .

6 .

S i m i l a r l y ,

t h e c l i n i c a l

V .

c h o l e r a e

0 1

i s o l a t e

s u r v i v e d

i n s e d i m e n t s

a n d

w a t e r

m u c h

l i k e

t h e


0 1 i s o l a t e

( F i g .

7 .

D i r e c t c o u n t s

o f 0 1 a n d n o n - O 1

s t r a i n s s h o w e d n o


d i f f e r e n c e s .

S t r a i n s W F / 1

a n d

W F / 1 0 8 ( F i g . 8 )

a n d W F / 1 a n d

W F / 1 1 1 ( F i g . 9 )

e x h i b i t e d t h e

s a m e r e s p o n s e

i n

s t e r i l e

e s t u a r i n e

w a t e r s .

S u r v i v a l o f

E .

c o l i .

I n

c o n t r a s t t o

t h e

V .

c h o l e r a e

s t r a i n s ,

E .

c o l i

A TCC 2 5 9 2 2

d i d

n o t

s u r v i v e

w e l l

i n

e s t u a r i n e

w a t e r s ( F i g . 6 ) a n d

c o u l d

n o t

b e

r e c o v e r e d

b y

p l a t i n g

o r

m o s t

p r o b a -

b l e

n u m b e r

p r o c e d u r e s

a f t e r 7

d a y s

i n

n o n s t e r i l e

w a t e r

a n d

1 4 d a y s

i n

s t e r i l e

w a t e r .

I n s t e r i l e

s e d i m e n t ,

E .

c o l i

d i d n o t

s u r v i v e

a s

w e l l a s V .

c h o l e r a e ;

b u t

i n

n o n s t e r i l e

s e d i m e n t ,

i t a c t u a l l y

s u r v i v e d b e t t e r

t h a n

t h e V . c h o l e r a e

s t r a i n s .

When a

f r e s h l y

i s o l a t e d

human s t r a i n

o f

E .

c o l i

w a s

e x a m i n e d ,

i t a l s o d i d n o t

s u r v i v e

a s

w e l l

a s t h e

V .

c h o l e r a e s t r a i n s

i n s t e r i l e e s t u a r i n e

w a t e r

( F i g .

9 ) .

A l t h o u g h

E .

c o l i

m o s t p r o b a b l e

n u m b e r s

w e r e

s t a t i s t i c a l l y

t h e

s a m e

a s

t h e

v i a b l e

c o u n t s ,

t h e

d i r e c t c o u n t s

w e r e much

h i g h e r .

A l l

a t t e m p t s

t o

r e s u s c i t a t e

t h e

i n t a c t

E .

c o l i

c e l l s

b y

u s i n g

l a c t o s e

e n r i c h m e n t

f a i l e d .

D i r e c t

a n d

v i a b l e c o u n t s .

T h e


b e -

t w e e n d i r e c t

c o u n t s

a n d v i a b l e

c o u n t s o f

V .

c h o l e r a e

s t r a i n s

i n

s t e r i l e

e s t u a r i n e

w a t e r w e r e

f a r

l e s s

t h a n

w i t h E .

c o l i

s t r a i n s .

V i a b l e

c o u n t s

5 8 0

HOOD

AND

N E S S

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5/8

V .

CH O L E R A E

AND

E .

COLI IN ES TUARIES

10 4

1 0

1 0 2

0 1

0

4 * C

1 0

1 0

1 0

1 0 3

1 0 2

1 0

1

2

3

4

5 6

7

8

9 1 0 n 1 1 2 1 3

1

1 5

D a y s

F I G . 4 .

E f f e c t

o f

t e m p e r a t u r e

o n

t h e

s u r v i v a l

o f V .

c h o l e r a e

0 1

( W F / 1 )

i n

e s t u a r i n e

w a t e r s a n d

s e d i m e n t s .

T h e

v a l u e s a r e

e x p r e s s e d

a s


u n i t s .

S y m b o l s :

* ,

s t e r i l e

s e d i m e n t ;

0 ,

s t e r i l e

e s t u a r i n e

w a t e r ;

O ,

n o n s t e r i l e

s e d i m e n t ;

0 ,

n o n s t e r i l e

e s t u a r i n e

w a t e r .

1

2

3 4

5

6

7

8

9 1 n 12

Days

F I G .

3 .

S u r v i v a l

o f

V .

c h o l e r a e

01

( W F / 1 )

i n

e s t u a -

r i n e w a t e r s a n d

s e d i m e n t s c o l l e c t e d

d u r i n g

3 d i f f e r e n t

m o n t h s

a n d

i n c u b a t e d a t

2 0 C . T he v a l u e s

are

ex -

p r e s s e d as


u n i t s .

S y m b o l s :

* ,

s t e r i l e

s e d i m e n t ; 0

s t e r i l e e s t u a r i n e

w a t e r ;

0

n o n s t e r i l e

s e d i m e n t ;

0

n o n s t e r i l e

e s t u a r i n e

w a t e r .

o f

V .

c h o l e r a e

s t r a i n s

were

1

t o

0 . 5

l o g

l e s s

t h a n

d i r e c t

c o u n t s , a n d

t h e

d i f f e r e n c e

r e m a i n e d

con-

s t a n t

over

t h e

e x p e r i m e n t a l

p e r i o d

( F i g .

8

a n d

9 ) .

H o w e v e r ,

v i a b l e

c o u n t s

o f

E .

c o l i

were

a s

muc h

as

3

l o g s

l o w e r

t h a n

d i r e c t

c o u n t s ; o v e r

t h e

e x p e r i m e n t a l

p e r i o d , b o t h

d e c l i n e d

a t

d i f f e r e n t

r a t e s

( F i g .

9 ) .

T h e

g r e a t e s t

d i f f e r e n c e

b e t w e e n

v i a b l e

a n d

d i r e c t

c o u n t s

o f

V .

c h o l e r a e

was

o b s e r v e d

w i t h

t h e

a d a p t e d 01

s t r a i n

( F i g . 9 ) .

V i a b l e

c o u n t s

o f

t h i s

o r g a n i s m

i n

s t e r i l e

e s t u a r i n e

water

were 2

l o g s

l o w e r t h a n

d i r e c t

c o u n t s

a t

d a y

0 .

H o w e v e r ,

a f t e r 2

d a y s ,

t h e

d i f f e r e n c e i n

d i r e c t

a n d

v i a b l e

c o u n t s

was

o n l y 0 . 5

l o g . W h y

t h i s

response

occurs i s

u n c e r t a i n , b u t

t h e

i n i t i a l

l o s s o f

v i a b i l i -

t y

o f

s u c h

a

l a r g e p o p u l a t i o n

o f c e l l s

may b e

a

r e f l e c t i o n

o f

s t r e s s

f a c t o r s .

T h e s e

a d a p t e d

01

c e l l s

were

n u t r i e n t

s t a r v e d , r e v i t a l i z e d

on

T r y p -

t i c a s e

soy

b r o t h ,

p l a c e d i n

e s t u a r i n e

w a t e r ,

a n d

t h e n

p l a t e d

o n t o

b r a i n

h e a r t

i n f u s i o n

agar.

E x p o -

s u r e t o

s u c h

e x t r e m e

c o n d i t i o n s

may r e s u l t

i n

a n

i n i t i a l

l o s s

o f

v i a b i l i t y

on

b r a i n

h e a r t

i n f u s i o n

a g a r .

DISCUSSION

S t r a i n s o f

V .

c h o l e r a e ,

i n c l u d i n g

e n v i r o n m e n -

t a l ,

c l i n i c a l ,

a n d

s e r o t y p e

01

a n d

n o n - O 1

s t r a i n s , s h o w e d

n o d i f f e r e n c e s

i n s u r v i v a l

r a t e s

i n

e s t u a r i n e

w a t e r s

a n d

s e d i m e n t s .

T h e

o b s e r v e d

g r o w t h

o f V .

c h o l e r a e

i n

s t e r i l e

s e d i m e n t

wa s

p r o b a b l y

d u e

t o

t h e

a b s e n c e

o f

c o m p e t i n g

o r g a n -

i s m s

a n d

t h e

a b u n d a n c e

o f

a v a i l a b l e

n u t r i e n t s .

G e r b a

a n d

McLeod

( 1 0 ) h a v e d e m o n s t r a t e d

t h a t

a u t o c l a v i n g

r e s u l t s i n

t h e

r e l e a s e

o f

b o u n d

n u t r i -

e n t s

f r o m s e d i m e n t s .

T h e s e n u t r i e n t s

w o u l d

n o t

b e

a v a i l a b l e

i n t h e

n a t u r a l e n v i r o n m e n t .

T h e r e -

f o r e ,

t h e

o b s e r v e d

g r o w t h


i n

s t e r i l e

s e d i m e n t

w o u l d b e

d u e , i n

p a r t ,

t o

t h e

a v a i l a b i l i t y

o f s e d i m e n t - b o u n d

n u t r i e n t s .

I

I

z

V O L .

4 3 ,

1 9 8 2

5 8 1

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adedfrom


6/8

s t e r i l e

s e d i m e n t

E

1 0 2

0

n o n s t e r i l e

water

o 3

1 0

2

10 1

1

2

3

4 5 6

7

8

9

1 0 1 1

1 2

D a y s

F I G . 5 . S u r v i v a l

o f V .

c h o l e r a e

0 1

( W F / 1 )

a n d t w o

n o n - 0 1

s t r a i n s

( W F / 2 3

a n d

W F / 5 4 )

i n

e s t u a r i n e w a t e r s

a n d

s e d i m e n t s a t

2 0 C .

T h e

v a l u e s a r e

e x p r e s s e d

a s


u n i t s .

S y m b o l s :

O , 0 1 ;

* ,

n o n - 0 1

( W F / 2 3 ) ;

* ,

n o n - 0 1

( W F / 5 4 ) .

G r o w t h

a n d

l o n g

s u r v i v a l were

a l s o n o t e d i n

s t e r i l e

e s t u a r i n e

w a t e r s

a n d a r e

p r o b a b l y

d u e

t o

t h e a b s e n c e

o f

c o m p e t i n g

o r g a n i s m s .

I n n o n s t e r -

i l e

w a t e r s ,

t h e

o r g a n i s m s e x h i b i t e d

g r o w t h

a n d

s u r v i v e d

f o r

l o n g p e r i o d s

o f

t i m e ,

b u t

t h e y

d i d

n o t

s u r v i v e

e s p e c i a l l y

w e l l i n

s e d i m e n t s .

T h e s e

r e s u l t s

s u g g e s t

t h a t

s e r o t y p e

01

a n d

n o n - O 1

o r g a n i s m s

a re b o t h

w e l l

a d a p t e d

t o a n d

c a p a b l e

o f

l i v i n g

i n

e s t u a r i n e

w a t e r s .


t h e

c l i n i c a l

i s o l a t e , e x h i b i t i n g

t h e same s u r v i v a l

r e -

sponse,

a l s o

appears

t o

b e

w e l l

a d a p t e d

t o

e s t u a r i n e

w a t e r s .

I n

c o n t r a s t t o

V .

c h o l e r a e ,

s t r a i n s

o f

E .

c o l i

d i d

n o t

s u r v i v e w e l l i n

e s t u a r i n e

w a t e r s .

T h e f a c t

t h a t E .

c o l i

d o e s n o t s u r v i v e

w e l l i n

seawater

a l o n e

b u t

i s

a b l e t o

s u r v i v e

b e t t e r

i n

t h e

pres en ce

o f m a r i n e

s e d i m e n t s

h a s

b e e n

p r e v i o u s l y

d e m o n -

A P P L . E N V I R O N .

M I C R O B I O L .

1 0

e

10 4

1 0 3

2

10

l o

1 0 3

0 2

10

0

10 7

10 5

O

4

0

1 2

3

4 5 6 7

8 9 1 0

1 1 1 2

1 3

1 4

D a y s

F I G . 6 . S u r v i v a l o f V . c h o l e r a e

01

( W F / 1 ) ,

n o n - 0 1

( W F / 1 0 3 ) ,

a n d

E .

c o l i

A T CC 2 5 9 2 2

i n

e s t u a r i n e

w a t e r s

a n d

s e d i m e n t s a t

2 0 C .

T h e v a l u e s are

e x p r e s s e d

a s


u n i t s .

s t r a t e d

( 1 0 ) .

Our

r e s u l t s

c o n f i r m t h a t

a

s i m i l a r

r es p on s e o cc u rs

i n

e s t u a r i n e

w a t e r s

a n d

s e d i -

m e n t s .

E .

c o l i

was

r e c o v e r a b l e

f r o m

e s t u a r i n e

s e d i m e n t s

f o r

c o n s i d e r a b l y l o n g e r

t h a n

f r o m

w a t e r s .


i t s u r v i v e d

e v e n b e t t e r

i n

n o n s t e r i l e

s e d i m e n t s

t h a n V .

c h o l e r a e .

T h e

f i n d i n g

t h a t E .

c o l i d o e s n o t s u r v i v e as

w e l l

as V .

c h o l e r a e

i n

e s t u a r i n e

w a t e r s h a s


i m p l i c a t i o n s

i n t e r m s

o f w a t e r

a n d

s h e l l f i s h

s a f e t y .

S i n c e

f e c a l

c o l i f o r m

E .

c o l i

l e v e l s are u s e d

t o

i n d i c a t e t h e

q u a l i t y

o f

w a t e r

a n d

s h e l l f i s h ,

t h e

q u e s t i o n

a r i s e s a s

t o t h e v a l i d -

i t y

o f

f e c a l

c o l i f o r m s a s

i n d i c a t o r s

o f

V .

c h o -

l e r a e .

One o f

t h e

b a s i c c r i t e r i a

f o r

a

g o o d

i n d i c a -

t o r

o r g a n i s m

i s t h a t

t h e i n d i c a t o r m u st

s u r v i v e a s

l o n g

as t h e

p a t h o g e n .

T h e

r e s u l t s o f

t h i s

s t u d y

d e m o n s t r a t e

t h a t

E .

c o l i

d o e s

n o t s u r v i v e i n

5 8 2

HOOD AND

N E S S

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7/8

V . C H O L E R A E AND

E .

COLI IN ES TUARIES

5 8 3

E .

c o l i

Human

Isoate

E

10 '

1 0 8

0 1

( C l i n i l

I s o l a t e

10

7

1 0

10

1 0 5

10 4

10 3

1

2

3

4

5

6

7

9

1 0

1 2

1 3

14

1 5

Days

F I G .

7 . S u r v i v a l

o f

V . c h o l e r a e

0 1

( W F / 1 )

a n d a

c l i n i c a l V . c h o l e r a e

0 1

s t r a i n

i n

e s t u a r i n e

w a t e r s a n d

s e d i m e n t s a t 2 0 0 C .


e x p r e s s e d

a s

c o l o -

n y - f o r m i n g

u n i t s .

S y m b o l s :

* ,

s t e r i l e

s e d i m e n t ; * ,

s t e r i l e

e s t u a r i n e

w a t e r ;

O ,

n o n s t e r i l e

s e d i m e n t ;

0


w a t e r .

e s t u a r i n e

w a t e r

as w e l l

as

V .

c h o l e r a e .

T h i s

s u g g e s t s

t h a t

m e a s u r i n g

t h e l e v e l s

o f f e c a l c o l i -

f o r m s i n

t h e

w a t e r c o l u m n may n o t

b e a d e q u a t e

f o r m o n i t o r i n g

t h e

presence

o f

V .

c h o l e r a e .

F u r t h e r m o r e , t h e r e i s i n c r e a s i n g

e v i d e n c e

f r o m


s t u d i e s

t h a t

f e c a l c o l i f o r m l e v e l s

3

0

1 0 2 .

1 0 7 .

1 0

1 o 5

1 0 o

1 0 2

z

1 0 7

1 o 6

1 o 5

1 0 4

1 0 2

1 0 1

1 0 7

1 0 6

1 0 5

1 0

1 0 1 .

1 0 6

E

z

0

ODC

. . . . . . . . . . . . . .

o

N o n - 0 1

IC

o

N

o n - 0

1 0 4

A O D C

a t p N v

NON

01

ODC

F U

Adapted

01

ODC

CFU-

0 1

ODc

CF U

2

4

6

DAYS

a 10

12 14

F I G .

9 .

S u r v i v a l

o f

V .

c h o l e r a e

01 ( W F / 1 ) ,

a n

e s t u a r y - a d a p t e d

s t r a i n

( W F / 1 ) ,

a n o n - O 1

s t r a i n

( W F /

1 1 1 ) , a n d a n

E . c o l i human

i s o l a t e i n s t e r i l e e s t u a r i n e

w a t e r a t

2 0 C . T h e v a l u e s are

e x p r e s s e d as

a c r i d i n e

orange

d i r e c t

c o u n t s

(AODC)

a n d


u n i t s

( C F U ) .

1

2

3

4 5

6

7

Day s

F I G .

8 .

S u r v i v a l o f

V .

c h o l e r a e

0 1 ( W F / 1 )

a n d a

n o n - O 1

s t r a i n

( W F / 1 0 8 )

i n

e s t u a r i n e

w a t e r s

a t

2 0 C .


e x p r e s s e d

a s

a c r i d i n e

orange

d i r e c t

c o u n t s

(AODC)

a n d


u n i t s

( C F U ) .

S y m b o l s :

U

s t e r i l e s e d i m e n t ; 0

s t e r i l e

e s t u a r i n e

w a t e r ;

l,

n o n s t e r i l e

s e d i m e n t ;

0


w a t e r .

i n

e s t u a r i n e w a t e r s

d o

n o t

c o r r e l a t e

w e l l

w i t h V .

c h o l e r a e l e v e l s

( 8 ,

1 3 ,

1 4 ) .

T h u s ,

i f

f e c a l c o l i f o r m

l e v e l s

i n

e s t u a r i n e

w a t e r s

d o n o t

i n d i c a t e

t h e

presence

o f

V .

c h o l e r a e ,

o t h e r

means o f

d e t e r -

m i n i n g p o t e n t i a l l y

d a n g e r o u s

l e v e l s

o f

V . c h o -

l e r a e

i n

e s t u a r i n e

w a t e r s

a n d

s h e l l f i s h

mus t

b e

f o u n d .

A C K N O W L E D G M E N T S

W e

g r a t e f u l l y

a c k n o w l e d g e

R on

B a k e r ,

J o h n

C h e n e y ,

a n d

K a t h y

W i l l i a m s

f o r t h e i r

e x c e l l e n t

t e c h n i c a l

s u p p o r t ,

t h e

V O L . 4 3 ,

1 9 8 2

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8/8

5 8 4

HOOD

AND N ESS

F l o r i d a S t a t e

D e p a r t m e n t o f N a t u r al R e s o u r c e s

f o r t h e i r

l o g i s t i c a l s u p p o r t ,

a n d

R . R .

C o l w e l l

f o r

h e l p f u l

d i s c u s s i o n s .

T h e

w o r k

i s

a

r e s u l t

o f

r e s e a r c h s p o n s o r e d b y

F l o r i d a

S e a

G r a n t ,

N a t i o n a l

O c e a n i c

a n d

A t m o s p h e r i c A d m i n i s t r a t i o n ,

O f f i c e

o f S e a G r a n t , D e p a r t m e n t

o f C o m m e r c e , u n d e r g r a n t

SG NA

8 0 A A - D - 0 0 0 3 8 .

L I T E R A T U R E

CITED

1 . A s s o c i a t i o n

o f A n a l y t i c a l C h e m i s t s .

1 9 7 5 .

O f f i c i a l m e t h o d s

o f a n a l y s i s o f t h e

A s s o c i a t i o n o f A n a l y t i c a l

C h e m i s t s , 1 2 t h

e d .

A s s o c i a t i o n o f A n a l y t i c a l

C h e m i s t s , W a s h i n g t o n ,

D . C .

2 . B l a k e ,

P . A . , D . T . A l H e g r a ,

J .

D .

S n y d e r ,

T .

J . B a r r e t t ,

L .

M c F a r l a n d , C .

T .

C a r a w a y ,

J .

C . F e e l e y ,

J .

P .

C r a i g ,

J .

V . L e e ,

N . D .

P u h r ,

a n d

R . A .

F e l d m a n .

1 9 8 0 . C h o l -

e r a - a

p o s s i b l e

e n d e m i c

f o c u s

i n t h e U n i t e d S t a t e s .

N .

E n g l .

J . M e d .

3 0 2 : 3 0 5 - 3 0 9 .

3 . C a r l u c c i ,

A .

F . ,

a n d

D . P r a m e r . 1 9 5 9 . F a c t o r s

a f f e c t i n g

s u r v i v a l o f

b a c t e r i a

i n

s e a w a t e r .

A p p l .

M i c r o b i o l . 7 : 3 8 8 -

3 9 2 .

4 .

C e n t e r s

f o r

D i s e a s e

C o n t r o l .

1 9 7 8 .

V i b r i o

c h o l e r a e - L o u i -

s i a n a .

M o r b i d .

M o r t a l .

W e e k l y R e p .

2 7 : 3 6 7 .

5 .

C e n t e r s

f o r D i s e a s e

C o n t r o l .

1 9 7 9 .

N o n - O 1

V i b r i o

c h o l e r a e

i n f e c t i o n s - F l o r i d a .

M o r b i d .

M o r t a l .

W e e k l y

R e p .

2 8 : 5 7 1 - 5 7 2 .

6 . C e n t e r s

f o r

D i s e a s e

C o n t r o l .

1 9 8 0 . C h o l e r a e - F l o r i d a .

M o r b i d . M o r t a l .

W e e k l y R e p .

2 9 : 6 0 1 .

7 .

C o l w e l l ,

R .

R . ,

J . K a p e r ,

a n d

S .

W.

J o s e p h .

1 9 7 7 . V i b r i o

c h o l e r a e ,

V i b r i o

p a r a h a e m o l y t i c u s ,

a n d

o t h e r v i b r i o s :

o c c u r r e n c e

a n d d i s t r i b u t i o n

i n

C h e s a p e a k e

B a y .

S c i e n c e

1 9 8 : 3 9 4 - 3 9 6 .

8 .

C o l w e l l ,

R . R . , R . J . S e i d l e r , J . K a p e r ,

S .

W.

J o s e p h ,

S .

G a r g e s ,

H .

L o c k m a n ,

D .

M a n e v a l ,

H .

B r a d f o r d ,

N .

R o b -

e r t s ,

E .

R e m m e r s ,

I .

H u q ,

a n d

A .

H u q .

1 9 8 1 . O c c u r r e n c e

o f V i b r i o

c h o l e r a e s e r o t y p e

O 1

i n

M a r y l a n d

a n d

L o u i s i a n a

e s t u a r i e s .

A p p l .

E n v i r o n . M i c r o b i o l .

4 1 : 5 5 5 - 5 5 8 .

9 .

D a l e y ,

R .

J .

1 9 7 9 . D i r e c t

e p i f l u o r e s c e n c e

e n u m e r a t i o n

o f

n a t u r a l

a q u a t i c

b a c t e r i a : u s e s , l i m i t a t i o n s ,

a n d

c o m p a r a -

t i v e a c c u r a c y , p . 2 9 - 4 5 .

I n

J .

C o s t e r t o n

a n d

R .

R .

C o l w e l l

( e d . ) ,

N a t i v e a q u a t i c

b a c t e r i a : e n u m e r a t i o n , a c t i v i t y ,

a n d

e c o l o g y .

A m e r i c a n S o c i e t y f o r T e s t i n g

a n d

M a t e r i a l s ,

W a s h i n g t o n ,

D . C .

1 0 .

G e r b a ,

C . P . ,

a n d

J . S .

M c L e o d . 1 9 7 6 . E f f e c t s o f s e d i -

m e n t s o n s u r v i v a l

o f

E s c h e r i c h i a

c o l i i n m a r i n e

w a t e r s .

A p p i .

E n v i r o n .

M i c r o b i o l .

3 2 : 1 1 4 - 1 2 0 .

1 1 . G r e e n be r g, A .

E .

1 9 5 6 .

S u r v i v a l o f

e n t e r i c

o r g a n i s m s

i n

s e a w a t e r .

P u b l i c H e a l t h

R e p .

7 1 : 7 7 - 8 6 .

1 2 .

H o b b i e ,

J . E . ,

R . J .

D a l e y ,

a n d S . J a s p e r . 1 9 7 7 . U s e

o f

n u c l e p o r e f i l t e r s

f o r c o u n t i n g

b a c t e r i a b y

f l u o r e s c e n c e

m i c r o s c o p y .

A p p l .

E n v i r o n .

M i c r o b i o l .

3 3 : 1 2 2 5 - 1 2 2 8 .

1 3 . H o o d ,

M .

A . , G . E . N e s s ,

a n d G . E .

R o d r i c k .

1 9 8 1 . I s o l a -

t i o n

o f V i b r i o

c h o l e r a e s e r o t y p e 0 1 f r o m

t h e e a s t e r n

o y s t e r ,

C r a s s o s t r e a

v i r g i n i c a .

A p p l .

E n v i r o n .

M i c r o b i o l .

4 1 : 5 5 9 - 5 6 0 .

1 4 .

K a p e r , J . , H . L o c k m a n , R .

R . C o l w e l l , a n d

S .

W. J o s e p h .

1 9 7 9 . E c o l o g y ,

s e r o l o g y ,

a n d e n t e r o t o x i n

p r o d u c t i o n

o f

V i b r i o c h o l e r a e i n C h e s a p e a k e B a y .

A p p l . E n v i r o n . M i -

c r o b i o l .

3 7 : 9 1 - 1 0 3 .

1 5 . M i t c h e l l , R . 1 9 6 8 . F a c t o r s

a f f e c t i n g t h e

d e c l i n e

o f n on -

m a r i n e m i c r o o r g a n i s m s

i n

s e a w a t e r .

W a t e r

R e s . 2 : 5 3 5 -

5 4 3 .

1 6 .

P o l l i t z e r ,

R .

1 9 5 9 . C h o l e r a ,

p .

1 8 5 - 1 8 6 .

I n W o r l d H e a l t h

O r g a n i z a t i o n

m o n o g r a p h s e r i e s

n o .

4 3 .

W o r l d H e a l t h

O r g a n i z a t i o n ,

G e n e v a .

1 7 .

S n e d e c o r ,

G . W . , a n d

W.

G .

C o c h r a n .

1 9 6 7 .

S t a t i s t i c a l

m e t h o d s ,

6 t h e d . I o w a S t a t e U n i v e r s i t y

P r e s s , A m e s .

1 8 .

T w e d t ,

R . M . , J . M.

M a d d e n , J . M . H u n t , D .

W .

F r a n c i s ,

J .

T .

P e e l e r , A .

P .

D u r a n ,

W. 0 .

H e b e r t ,

S . G . M c C a y ,

C .

N . R o d e r i c k ,

G .

T .

S p i t e ,

a n d

T .

J . W a z e n s k i .

1 9 8 1 .

C h a r a c t e r i z a t i o n

o f V i b r i o c h o l e r a e i s o l a t e d

f r o m o y s t e r s .

A p p l .

E n v i r o n . M i c r o b i o l .

4 1 : 1 4 7 5 - 1 4 7 8 .

1 9 .

W e i s s , C .

M .

1 9 5 1 . A d s o r p t i o n o f E . c o l i

o n

r i v e r a n d

e s t u a r i n e

s i l t s .

S e w a g e

I n d .

W a s t e s .

2 3 : 2 2 7 - 2 3 7 .

2 0 .

W e i s s m a n ,

J . B . , W. E . D e W i t t ,

J . T h o m p s o n , C . N .

M u c h n i c k ,

B .

L .

P o r t n o y , J . C .

F e e l e y , a n d

E .

J . G a n g a r o -

s a .

1 9 7 5 .

A

c a s e o f c h o l e r a

i n

T e x a s ,

1 9 7 3 .

Am.

J .

E p i d e m i o l .

1 0 0 : 4 8 7 - 4 9 8 .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

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