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SESIÓN 1: AUTOINMUNIDAD-1

Moderadores: Mª Carmen Gelpí Sabater (Barcelona), Enrique García Olivares (Granada)

1. PRESENCIA DE ANTICUERPOS CONTRA LA PROTEÍNAÁCIDA DE LA GLIA EN PACIENTES DIABÉTICOS Y SUJE-TOS SANOS. Otero I, Camiña F, Rodríguez J, Rodríguez-Sega-de S, Peakman M, Varela R. Departamento de Bioquímica, Facultadde Farmacia, Universidad de Santiago de Compostela.

La diabetes mellitus tipo 1 (DM1) es una enfermedad autoinmu-ne caracterizada por la destrucción de las células productoras de insu-lina de los islotes de Langerhans del páncreas. Esta destrucción estámediada por distintas células del sistema inmune que infiltran el inte-rior de los islotes en el periodo prediabético y destruyen específica-mente a las células  productoras de insulina.

Aunque la infiltración observada en la DM1 parece estar restrin-gida en gran medida a los islotes, todavía son pocos los antígenos iden-tificados que podrían dirigir el proceso. Algunos de estos antígenos seexpresan exclusivamente en los islotes, como la pre-proinsulina, peromuchos otros muestran una expresión más amplia y han sido detecta-dos en el tejido nervioso periférico, como por ejemplo, la decarboxila-sa del ácido glutámico (GAD) y más recientemente la proteína ácidade la glía (GFAP). GFAP es un autoantígeno en la DM1 descrito recien-temente, expresado por las células de Schwann que rodean los islotes.

En este trabajo se demuestra la presencia de antoanticuerpos circu-lantes contra GFAP en plasmas de pacientes diabéticos de tipo 1 (DM1) yde tipo 2 (DM2), mediante Inmunoblotting y ELISA. Para ello hemos clo-nado, expresado y purificado GFAP como una proteína de fusión con laproteína de unión a maltosa (MBP) para usarla en la detección de autoan-ticuerpos. Nuestros resultados muestran que hasta un 75% de los pacien-tes DM1 tienen autoanticuerpos anti-GFAP en el suero, frente a sólo un25% de los sujetos sanos de la misma edad (p= 0,021; Test de Fisher). Unalto porcentajede los pacientes DM2 también muestran autoanticuerposanti-GFAP, casi un 50%; sin embargo, la presencia de estos autoanticuer-pos podría estar relacionada con la edad porque un porcentaje similar(52%) de los sujetos sanos con el mismo rango de edad también muestranautoanticuerpos anti-GFAP. Estos resultados muestran que GFAP es unantígeno reconocido específicamente por el sistema inmune de los pacien-te DM1, pero que con los años se induce una respuesta tanto en indivi-duos sanos como en DM2. Debido a que la neuropatía y el daño a nervioses una de las complicaciones más frecuentes en la diabetes, nuestros resul-tados sugieren que, al menos en parte, este daño puede ser debido a larespuesta inmune contra componentes del sistema nervioso.

2. LINFOCITOS T REGULADORES EN PACIENTES CONENFERMEDAD INFLATORIA INTESTINAL TRATADOS CONCITAFÉRESIS ABSORTIVA. Alonso M, Echaniz P, Juan MD de,Arenas JI, Cuadrado E. Hospital Donostia.

La citaféresis de monocitos y granulocitos se ha demostrado útilen el tratamiento de enfermos con colitis inflamatorias pero el meca-

nismo de acción terapéutico es mayormente desconocido. Dada laimplicación de los linfocitos T reguladores en el control de la autoin-munidad, hemos especulado que el efecto terapéutico podría relacio-narse con un incremento y función de esta población celular

Material y métodos. Hemos estudiado 4 pacientes de colitis ulce-rosa y 2 con enfermedad de Crohn tratados con citaférsesis absortiva(adacolumnR, 5 sesiones semanales); dos de ellos presentaban lesio-nes cutáneas severas asociadas (pioderma gangrenoso y eritema nodo-so). Muestras de sangre se tomaron antes y un mes despues del trata-miento. El numero de linfocitos T reg se determinó por citometría deflujo y cuantificación de la expresión de FOXP3 en los linfocitos CD4por PCR a tiempo real. Paralelamente se cuantificó la expresión de TGFbeta.

Resultados. Los resultados fueron muy heterogéneos no aprecián-dose correlación entre el efecto terapéutico sobre la enfermedad infla-matoria intestinal y las variaciones de linfocitos reguladores o la expre-sión de FOXP3 y TGF beta. Sin embargo, las lesiones cutáneas se resol-vieron rápidamente con el tratamiento y en ambos casos aumentaronel número de linfocitos Treg y los niveles de FOXP3 y TGF beta. El efec-to beneficioso del tratamiento se confirmó en una posterior recidivadel pioderma gangrenoso.

Conclusión. Aunque los resultados no apoyan que el efecto tera-péutico de la citáferesis en las colitis inflamatorias se deba a la movi-lización de linfocitos Treg, la resolución de las lesiones cutáneas obser-vada en los dos casos si parece asociada a tal efecto.

3. VARIABILIDAD CLINICA EN LA FORMA DE PRESENTA-CION DEL SINDROME POLIGLANDULAR AUTOINMUNETIPO III. Carbone J. Servicio de Inmunología. Hospital Gregorio Mara-ñón. Madrid.

Introducción. En una reciente clasificación de síndromes poliglan-dulares autoinmunes (SPA, Amerio et al, 2006), se define como SPAtipo III (SPA-III) a la asociación de enfermedad tiroidea autoinmunecon: diabetes autoinmune, adeno y/o neurohipofisitis o fallo ováricoprematuro (SPA-III-A); anemia perniciosa, enfermedad celiaca, hepa-titis autoimmune o CBP (SPA-III-B); vitiligo, miastenia gravis (SPA-III-C); o con enfermedades del colágeno, vasculitis o enfermedad hema-tológica autoinmune (SPA-III-D). El retraso diagnóstico de algunas deestas enfermedades autoinmunes conlleva un riesgo de desarrollo decomplicaciones graves y/o secuelas. Diseño: Estudio retrospectivo decaso clínico. Objetivo. Presentación de casos clínicos en los que no sehabía sospechado el diagnóstico de SPA. Setting: Clínica Senra, Madrid.Pruebas diagnósticas realizadas en distintos centros.

Caso 1. Una mujer de 29 años, procedente de Cadiz, tenía diag-nosticado un hipotiroidismo autoinmune y recibía tratamiento susti-tutivo hormonal. Asocia vitiligo y polidactilia. Cuando acude a la con-sulta refiere cansancio, tinnitus, vértigo y palpitaciones de 5 meses deduración. Se solicitan estudios en los que se constata: anemia megalo-blástica (Hb 9,1 g/dl, VCM 125,45 fl, HCM 41 pg); niveles muy bajosde vitamina B12 (<88 pg/mL), anticuerpos anti-células parietales gás-tricas y anti-factor intrínseco; gastritis atrófica (biopsia) y niveles ele-vados de gastrina. Se establece un diagnóstico de anemia perniciosa

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en el contexto de un SPA-III- B+C. Un estudio neurológico realizadopor la deficiencia de vitamina B12 evidenció compromiso de cordónposterior (potenciales somatosensoriales anormales). El retraso en laterapia con vitamina B12 puede causar una secuela neurológica per-manente, por lo que se inició inmediatamente terapia con vitamina B12IM. Los síntomas y la anemia de la paciente se corrigieron.

Caso 2. Una mujer de 18 años, procedente de Zaragoza, acude a laconsulta por hipogammaglobulinemia (IgG 547, IgA 58 mg/dl) y porla coexistencia inexplicable de múltiples problemas. Ha sido evaluadapor varios especialistas. Es portadora de la mutación del Factor V deLeiden. En un plazo de 2 años (2004-2006) la paciente presenta secuen-cialmente: hipotiroidismo autoinmune (Tiroiditis de Hashimoto), ade-nohipofisitis (alteraciones de campo visual, hiperprolactinemia y aumen-to de tamaño y de captación de gadolinio por hipófisis, sin microade-noma), síndrome de dolor regional complejo tipo 1, radiculopatía espon-tánea múltiple cervical y lumbar con prolapso y destrucción discal inva-lidantes, y fallo ovárico prematuro. No hay datos de síndrome linfo-proliferativo ni de trombosis. La capacidad para formar anticuerposesta conservada. Se establece un diagnóstico de SPA-III-A.

Conclusiones. Se insiste en la necesidad de una evaluación com-pleta encaminada a descartar otras enfermedades autoinmunes enpacientes seleccionados con tiroiditis autoinmune. La patología discalmúltiple (se ha postulado la posible naturaleza autoinmune de estaentidad) no se ha descrito previamente en el SPA.

4. ICTUS LACUNAR RECURRENTE EN PACIENTE JOVEN CONTÍTULOS BAJOS DE ANTICUERPOS ANTIBETA2GLICOPRO-TEINAI. IMPORTANCIA DEL TRATAMIENTO PRECOZ. Alec-sandru D1,2, Sánchez-Ramón S1, Rodríguez-Mahou M1, OliverMiñarro D1, Fernández-Cruz E1. 1Unidad de Inmunología Clínica, Ser-vicio de Inmunología, Hospital Gregorio Marañon, Madrid. 2Servicio deInmunología Clínica, Hospital Clínico San Carlos, Madrid.

Introducción y objetivos. Los criterios diagnósticos del síndromeantifosfolípido (SAF) incluyen al menos una manifestación clínica(trombosis vasculares y morbididad obstétrica), y al menos un dato delaboratorio: presencia en suero de anticoagulante lúpico, anticuerpos(Ac) anticardiolipina IgM e IgG (ELISA) a títulos moderados o altosen al menos 2 ocasiones separadas 12 semanas y recientemente los Acantibeta2glicoproteina-I IgM e IgG (ELISA) a títulos moderados o altosen al menos 2 ocasiones separadas 12 semanas entre sí. Quedan fue-ra del diagnóstico pacientes con títulos bajos de Ac relacionados conel SAF y por tanto, se plantea el dilema de la indicación del tratamien-to anticoagulante precoz y permanente en estos pacientes.

Paciente y métodos. Paciente mujer de 37 años, con anteceden-te de hirsutismo no filiado y cefalea crónica de 10 años de evolución,es remitida a nuestra consulta por presentar ictus lacunar sensitivoderecho de repetición (2 episodios en abril y junio de 2006) asociadoa títulos séricos bajos de Ac antibeta2glicoproteina-I IgG (ELISA,OrgenTec Diagnostika GmBH). No presentaba factores de riesgo car-diovascular. Refería alteraciones de la sensibilidad perioral y lingualy pérdida de equilibrio ocasional, como secuelas del último episodiode ictus, astenia marcada, fenómeno de Raynaud distal en extremi-dades y tumefacción en cara, manos y miembros inferiores. No pre-sentaba lívedo reticularis, no aftas orales, no artralgias ni fotosensi-bilidad. No otra sintomatología de interés. Se inició tratamiento conacenocumarol (manteniendo INR 2-3) y se realizó un estudio inmu-nológico.

Resultados. Los datos de laboratorio evidenciaban la presencia deAc antibeta2glicoproteina-I IgG en dos ocasiones a títulos bajos, 10 y12 U/ml, respectivamente (vn 0-8 U/ml). Ac. Anticardiolipina IgG eIgM y anticoagulante lúpico negativos. Inmunoglobulinas séricas nor-males, salvo IgE elevada (484 KU/L). Factores C3, C4 y factor B delcomplemento normales. Ac. antinucleares, ENA (anti-SSA/Ro, anti-SSB/La, anti-RNP/Sm, anti-SM), ANCAs, factor reumatoide, crioglo-bulinas fueron negativos. Homocisteina plasmática normal. Sistemá-tico de sangre (serie roja, blanca y plaquetaria), bioquímica de sangre,perfil tiroideo (T4Libre, TSH): Normales. Serologías a hepatitis B y Cy VIH negativas. Se realizó un estudio ecocargiográfico transtoráci-co, que fue normal.

Discusión y conclusiones. Una serie de manifestaciones no-trom-bóticas, no incluidas en los criterios de diagnóstico, han sido asocia-das al SAF. Entre ellas se encuentran la enfermedad vascular, epilep-sia, corea, mielitis transversa, síndrome esclerosis múltiple-like, mani-festaciones cutáneas (lívedo reticularis, ulceras cutáneas, lesiones pseu-dovasculíticas), necrosis femoral avascular, hemorragia alveolar difu-sa, síndrome de distress respiratorio agudo e hipertensión pulmonar.Se ha descrito también la asociación de cefalea o migraña, alteracionescognitivas, con la presencia en suero de Ac antifosfolípidos, si bien noexiste la evidencia necesaria para incluir estas alteraciones en los cri-terios diagnósticos del SAF.

La paciente, una joven con historia de dos episodios de trombosiscerebral y sin otros factores de riesgo cardiovascular, recibió terapiaanticoagulante precoz como profilaxis secundaria de nuevos procesostrombóticos asociados a los Ac antifosfolípidos, si bien a títulos bajosque no permiten incluirla bajo el diagnóstico de SAF. En este tipo depacientes con títulos de Ac antibeta2glicoproteina-I bajos en al menosdos ocasiones, proponemos la valoración individual y en función desu clínica, del momento de la detección en suero de los anticuerpos(aislado o en el contexto agudo) y de la presencia o ausencia de otrosfactores de riesgo trombótico, instaurar una terapia o profilaxis secun-daria precoz que permita evitar futuras manifestaciones clínicas (poten-cialmente más severas) relacionadas con el SAF.

5. VALORACION DE UN EXTRAÑO PATRÓN DE ANA PRESEN-TE EN PACIENTES PREFERENTEMENTE INFECTADOS POREL VIRUS DE LA HEPATITIS C. Castro-Serrano R. Laboratoriode Referencia de Cataluña.

En este trabajo exponemos la presencia de un patrón desconoci-do, que se observa en el citoplasma de la células Hep 2, por inmuno-fluorescencia indirecta. Patrón que presenta una imagen lineal únicaen la célula, redondeando al núcleo o extendida en el citoplasma, quese asemeja al Aparato de Golgi.

Esta imagen se observó en 36 muestras de pacientes (0,05%) delos ANA realizados en nuestro laboratorio entre los años 2005-06, delos cuales 21 muestras pertenecían a pacientes de hepatitis C (VHC)y 14 muestras a pacientes con patologías diversas. El total de pacien-tes diagnosticados de VHC fue de 340, de los que un 3,1% dieron posi-tivos. Todos VHC habían sido confirmados por RIBA, respondiendomayoritariamente al genotipo GHC1b, y eran pacientes que fuerontratados con interferón alfa. Los títulos observados variaban entre1/80 a 1/ 640.

En una exposición previa presentada por otros autores se rela-cionó la presencia de este patrón con el tratamiento recibido con inter-feron alfa. Nosotros vimos que, aunque los ANA de pacientes con el

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VHC previamente al tratamiento, no presentaban esta imagen y sidurante, o después del tratamiento, también que se presentaban enpacientes con otras patologías y que no habían sido tratados con inter-ferón alfa.

A su vez observamos que, al estudiar estas muestras positivas conotros portas de Hep2, o en tejidos de riñón, hígado, estómago deratón/rata, no dieron ninguna imagen de positividad.

En esta presentación exponemos de forma preliminar: 1º de la pre-sencia de esta imagen puntualmente en un tipo de porta de Hep2 y2º su posible relación o no con la terapia aplicada en estos pacientes.

6. ANTICUERPOS ANTI CELULAS CALICIFORMES Y ANTICELULAS PANCREATICAS EXOCRINAS EN EL DIAGNOS-TICO DE LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL.Rodríguez R1, Panés J2, Viñas O1. 1Gastroenterología, 2Inmunología.Hospital Clinic. Barcelona.

Introducción. La Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) inclu-ye la Enfermedad de Crohn (EC) y la Colitis Ulcerosa (CU). Estas enfer-medades son frecuentes en nuestro medio, son de etiología descono-cida y se caracterizan por la presencia de inflamación crónica intesti-nal. El diagnóstico diferencial entre éstas dos entidades tiene implica-ciones terapéuticas i pronósticas importantes, pero las técnicas con-vencionales (endoscopia, histología) no permiten diferenciar un 10-20% de los casos.

Objetivos. Estudiar la utilidad de la determinación sérica de anti-cuerpos anti-células caliciformes (ACC) y anti-células pancreáticas(ACP) para el diagnóstico de pacientes con sospecha de EII y en la dife-renciación entre EC y CU.

Comparar la eficacia diagnóstica de la determinación de estos anti-cuerpos con los anticuerpos anti-citoplasma de neutrófilos (ANCA)y anti-Saccaromyces cerevisiae (ASCA).

Determinar si la utilización combinada de estos anticuerpos incre-menta la precisión en el diagnóstico.

Ver si la determinación de estos anticuerpos guarda alguna rela-ción con el fenotipo de la EC o con la extensión en la CU.

Pacientes y métodos. En este estudio hemos incluido las muestrasde suero en una población normal de 50 individuos y 119 pacientescon EII (65 con EC y 54 con CU). En cada muestra se determinaron losANCA mediante inmunofluorescencia indirecta sobre leucocitos poli-morfonucleares, fijados en un porta. Los ASCA tipo IgG e IgA median-te técnicas de Elisa (Palex Medical SA). Y la determinación de los anti-cuerpos ACC y ACP tipo IgG e IgA mediante técnica de inmunofluo-rescencia indirecta (Euroimmun).

Resultados. 1. No se detectaron antiguerpos IgG ANCA, IgG ASCAni IgAAGC en ninguna muestra de los controles sanos pero sí se encon-taron IgA ASCA (2%), IgG ACC (2%), IgA APC (10%) IgG APC 6% enalgunos controles sanos.

2. En comparación del grupo control las sensibilidades para losAcs IgA e IgG ACC como marcadores de Enfermedad InflamatoriaIntestinal son muy bajas (13 y 11% respectivamente), pero las especi-ficidades (98-100%) son idénticas tanto para los ANCA como paralos ASCA (99-100%). Para los Ac ACC IgA e IgG encontramos sensibi-lidades superiors (21-38%) pero la especificidad es menor (90-94%).Sin embargo cuando se detectan simultaneamente Acs IgA e IgG en lamuestra de un paciente la especificidad es del 98%.

3. En contraposición de los ASCA, no encontramos diferencias sig-nificativas en la sensibilidad y especificidad de los anticuerpos ACC y

APC de isotipo de IgA y IgG entre los grupos de pacientes con EC yCU.

Conclusiones. Estos datos sugieren que la determinación de anti-cuerpos IgA y IgG ACC y ACP puede constituir un marcador serolo-gico de valor relativo para el diagnostico de la Enfermedad Inflama-toria Intestinal pero no parece ser útil para el diagnóstico difernecialentre EC y CU.

7. ÓPTIMA DETECCIÓN DE AC ANTI MITOCONDRIALES M2,AC ANTI SP100 Y AC ANTI GP210 POR ELISA, COMPARA-CIÓN CON MÉTODOS CONVENCIONALES. Perdomo H,Alvarez Doforno R, Lozano M, Salcedo C, Marco E, Marcos MJ,Yañez F, Fontan Casariego G. Hospital Universitario La Paz, Madrid.

Introducción. Los Ac anti mitocondriales (AMA) son marcadoresserológicos de la cirrosis biliar primaria (CBP), sin embargo Ac antinucleares (ANA) se detectan en aproximadamente 50% de estos pacien-tes. La mayoría de los laboratorios usan inmunofluorescencia indirec-ta (IFI) para detectarlos y los dos patrones de ANA que predominanen la CBP son membrana nuclear porosa y múltiples puntos nuclea-res. No siempre es fácil detectarlos debido a que los pacientes puedenpresentar una o varias especificidades a la vez, así como ser positi-vos para otros autoanticuerpos. Los Ac que dan estos patrones reco-nocen la proteína de membrana nuclear gp210 y la proteína cuerponuclear sp100 respectivamente.

Objetivo: Comparar técnicas convencionales de inmunofluores-cencia indirecta (IFI) e inmunobloting frente a ELISA de antígenosrecombinantes para la detección y caracterización de AMA, Ac antisp100 y Ac anti gp210.

Materiales y métodos. Se estudiaron 74 sueros de pacientes ensa-yados por IFI sobre portas de triple tejido de rata y células HEp-2(Euroimmun, Lübeck) que presentaban positividad para AMA patrónM2, Ac anti múltiples puntos nucleares y Ac anti membrana nuclear yasea patrón poroso ó liso. Para la caracterización de AMA por inmuno-bloting se empleó la fracción citosolica purificada de extracto de híga-do humano. Para la detección de los AMA M2, Ac anti sp100 y Ac antigp210 se utilizó un ELISA específico (INOVA Diagnostics, San Diego,CA).

Los pacientes se agruparon según el diagnostico en CBP, otrashepatopatías y otras patologías. Como sueros seronegativos se anali-zaron 10 controles sanos.

Resultados. El perfil serológico de los sueros ensayados por IFIfue 42,8% para AMA, 41,7% Ac anti múltiples puntos nucleares y 29,8%Ac con patrón membrana nuclear. La correlación entre IFI y ELISA fuebuena, sobre todo en el grupo de pacientes con diagnostico CBP.

En el grupo diagnostico de otras patologías aumentó la frecuen-cia de Ac anti M2 por ELISA sobre todo a títulos medios, solo dos casosse confirmaron por otra técnica. En este grupo disminuyó la detecciónde Ac anti gp210 debido a que mayoritariamente el patrón que se obser-va por IFI corresponde a membrana nuclear lisa.

Los Ac anti sp100 se detectan en los tres grupos de pacientes demanera similar.

Conclusión. La IFI es un método sencillo que requiere personalcon experiencia para la interpretación de patrones. El ELISA es un méto-do sencillo que permite identificar los Ac sobre todo en aquellos casosde múltiples especificidades.

Entre IFI y ELISA específico (INOVA Diagnostics, San Diego, CA)se encontró una buena correlación sobre todo en los pacientes con diag-

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nostico CBP, en este grupo los AMA M2, Ac anti sp100 y Ac anti gp210solos o en combinación tienen un significado muy importante de mar-cadores serológicos.

En el grupo de otras patologías la presencia de los AMA M2 y Acanti sp100 deben ser estudiados en seguimiento y cuidadosamentevalorados en el contexto clínico del paciente ya que su significado esincierto.

Los Ac anti gp210 son altamente específicos de la CBP, ocasio-nalmente reactividades similares se encuentran en otras enfermeda-des reumáticas.

8. ESTUDIO DE LOS FACTORES SOLUBLES QUE INTERVIE-NEN EN LA REGULACIÓN DE LA SECRECIÓN DE IGM ENLA ESCLEROSIS MÚLTIPLE. Espiño M, Álvarez-Cermeño JC,Sádaba MC, Gómez-Rial J, García-Barragán N, Díaz-Sánchez M,González-Porqué P, Villar LM. Hospital Ramón y Cajal.

Introducción. La esclerosis múltiple es una enfermedad cróni-ca del sistema nervioso central (SNC) que se caracteriza por pre-sentar desmielinización, inflamación y daño axonal. La presencia debandas oligoclonales de IgM frente a lípidos de la mielina (BOCML+)en el líquido cefalorraquídeo (LCR) se asocia con una peor evoluciónde la enfermedad. Estos anticuerpos son producidos por linfocitos BCD5+ presentes en el SNC de los pacientes. Clásicamente se ha des-crito que esta subpoblación de linfocitos B se activa sólo mediante lapresencia de su antígeno sin precisar de la colaboración de otras célu-las del sistema inmune. Sin embargo, datos recientes indican que hayuna serie de citoquinas que intervienen en su desarrollo y diferen-ciación.

Objetivo. Estudio del perfil de citoquinas presentes en LCR depacientes con esclerosis múltiple con y sin síntesis intratecal de IgM.

Metodología. Detección de bandas oligoclonales: la presencia debandas oligoclonales de IgG e IgM se determinó mediante isoelectro-enfoque (IEF) e inmunoblotting. Pacientes: Se estudiaron 79 pacientescon EM, de los cuales 31 eran BOCML+ y 48 no mostraban bandas oli-goclonales frente a lípidos (BOCML-), y 17 controles con otras enfer-medades neurológicas. Cuantificación de los niveles de citoquinas yquimioquinas. Se realizó mediante kits de ELISA comerciales. Se estu-diaron las siguientes citoquinas y quimiocinas: Osteopontina, IL-5, IL-6, IL-9 e IL-10.

Resultados. IL5: No se pudo detectar esta citoquina en las mues-tras estudiadas. Osteopontina, IL-9 e IL-10: No se encontraron diferen-cias significativas entre los tres grupos en LCR. CXCL12: Observamosun aumento significativo en el LCR de los pacientes BOCML+ con res-pecto a los BOCML- (p= 0,01) y al grupo control (p= 0,01). IL6: Encon-tramos valores elevados en los pacientes con brote con respecto a aque-llos en fase estable (p= 0,003) y con respecto al grupo control (p= 0,019).CXCL13: En el grupo control no se pudo detectar esta quimioquina enLCR. En la EM encontramos un aumento significativo en el grupoBOCML+ en brote vs el BOCML- (p= 0,007). Este aumento correla-ciona con los valores de IgM en LCR que están aumentados en lospacientes BOCML+ en brote (p< 0,0001).

Conclusiones. El aumento de los valores de IgM en LCR presen-te en los pacientes con BOCML+ puede venir mediado por un reclu-tamiento de linfocitos BCD5+ hacia el SNC mediado por CXCL13 enlas fases activas de la enfermedad. El aumento de CXCL12 en el LCRde estos pacientes puede contribuir al mantenimiento de esta pobla-ción en LCR.

9. ANTICUERPOS ANTI-INCENP EN UN PACIENTE CON ELSÍNDROME DE GRAHAM LITTLE-PICCARDI-LASSUEUR.Rodríguez-Bayona B, Ruchaud S, Rodríguez C, Linares M, Asto-la A, Ortiz M, Earnshaw WC, Brieva JA, Valdivia MM. Serviciosde Inmunología y Dermatología, H.U. Puerta del Mar; Wellcome TrustCentre for Cell Biology, School of Biological Sciences, University of Edim-burgh; Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad deCiencias, Puerto Real.

El síndrome de Graham Little-Piccardi-Lassueur (GLPL) es unarara dermatosis que cursa con alopecia cicatricial progresiva del cue-ro cabelludo, pérdida de vello púbico y axilar e hiperqueratosis foli-cular. Presentamos el caso de una paciente afectada por dicho sín-drome en el que se pone de manifiesto una respuesta de auto-anti-cuerpos (auto-Ac) frente a antígenos nucleares asociados a cromo-somas y cuerpo medio. Para analizar la presencia y patrón de tin-ción de los auto-Ac se testó el suero de la paciente mediante técni-cas de inmunofluorescencia e inmnunoblot, utilizando para ello cul-tivos de líneas celulares de mono, hamster, ratón, bovina y humana.El suero autoinmune mostró un patrón moteado atípico que afecta-ba principalmente a los centrómeros y a la región central del huso.La distribución del auto-Ag a lo largo de las distintas fases del ciclocelular se correspondía con la dinámica de un grupo de proteínasdependientes de ciclo celular: las proteínas passengers cromosó-micas. La expresión de un complejo de proteínas en baculovirus per-mitió el análisis por inmunoblot de la reactividad del suero GLPL,determinando que la proteína INCENP era el principal auto-Ag reco-nocido por el suero. Conclusiones: Se describe una respuesta autoin-mune en el síndrome GLPL dirigida frente a la proteína centromé-rica INCENP.

SESIÓN 2: INMUNOGENÉTICA

Moderadores: Dolores Jaraquemada López (Barcelona), Manuel Muro Amador (Murcia)

10. DETECCION DE ANTICUERPOS HLA CLASE II EN DAÑOPULMONAR AGUDO RELACIONADO A LA TRANSFUSION(TRALI). Muro M2, Rivera J1, Ferrer F1, Botella C2, Salgado G2,Lucas D2, López M2, Sanchis MJ2, Alemany JM2, Minguela A2, Gar-cia-Alonso AM2, Vicente V1, Álvarez-López MR2. 1Centro Regio-nal de Hemodonación de la Comunidad Autonoma de la Región de Mur-cia y 2Servicio de Inmunología, Hospital Universitario Virgen de la Arri-xaca, Murcia.

TRALI es una seria complicación de la transfusión sanguínea.Aunque la incidencia actual es realmente desconocida (en Europaentre 1.3/1000000-1/7900), el síndrome se piensa que esta severa-mente pobremente diagnosticado e informado, debido a la caren-cia de criterios diagnósticos sensitivos y específicos, y a la poca difu-sión fuera de los bancos de sangre. Todos los productos sanguíne-os se han asociado con TRALI. Con este síndrome, se han asociadoanticuerpos anti-granulocitos y anti-HLA class I en donantes y recep-tores, y muy recientemente en lípidos de la sangre almacenada, tanbien como anti-HLA class II. En los ultimos años, la tecnología paradetectar anticuerpos ha cambiado y se ha incrementado el podery la especificidad del ensayo, especialmente con el uso de la cito-

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metria de flujo y luminex. Nosotros presentamos un caso de TRA-LI que ocurrió en un paciente de 74 después de una transfusiónde plasma. El screening de anticuerpos anti-HLA clase I y clase II,y el análisis de especificidad se realizaron por Labscreen (Mixed,PRA, One Lambda, CA) y los tipajes HLA de los donantes y recep-tor fueron realizados por técnicas PCR-SSO. Las pruebas cruza-das se realizaron por técnicas CDC entre todos los donantes impli-cados y el receptor.

Identificamos anticuerpos anti-HLA clase II en un donante(%PRA=80), sin anti-HLA clase I (%PRA=0), y se correlacionó amplia-mente con los 2 antígenos HLA portados por el receptor (DRB1*11y DRB1*13). La presencia de anticuerpos anti-HLA clase II sin anti-HLA clase I ha sido informado en muy pocos casos y estos hechospodrían facilitar el entendimiento de la patogénesis de este síndro-me.

11. ANÁLISIS DEL GEN CD209 EN LA ENFERMEDAD INFLA-MATORIA INTESTINAL. Núñez C1, Oliver J2, Mendoza JL3, Taxo-nera C3, Gómez-García M2, Martín J2, Martínez A1. 1Servicio deInmunología Clínica, Hospital Clínico San Carlos, Madrid. 2Instituto deParasitología y Biomedicina, CSIC, Granada. 3Unidad de EnfermedadInflamatoria Intestinal, Hospital Clínico San Carlos, Madrid.

Introducción. La enfermedad inflamatoria intestinal, que englo-ba la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), presenta unorigen complejo con factores genéticos y ambientales implicados. Enla etiología de ambas enfermedades existen factores genéticos comu-nes así como factores característicos de cada enfermedad.

CD209 es una molécula de superficie presente en células dendrí-ticas implicada en el reconocimiento de patógenos y activación de larespuesta inmune. Se ha descrito un polimorfismo funcional en estegen que in vitro afecta a su transcripción y que se ha relacionado consusceptibilidad o severidad a ciertas infecciones. El objetivo de estetrabajo es conocer la posible influencia de CD209 en la susceptibilidada EC y CU.

Material y métodos. Se llevó a cabo un estudio caso-control inclu-yendo un total de 515 pacientes con EC, 497 pacientes con CU y 731individuos sanos empleados como control. Las muestras fueron reco-gidas en el Hospital Clínico San Carlos (Madrid) y el Hospital Virgende las Nieves (Granada), todas ellas correspondían a individuos blan-cos de origen español. Todas las muestras fueron tipadas para el poli-morfismo rs4804803 existente en el promotor del gen CD209 median-te el empleo de sondas TaqMan. La comparación de frecuencias entreenfermos y controles se llevó a cabo empleando el test chi-cuadrado oel test exacto de Fisher cuando fue necesario.

Resultados. El estudio caso-control no mostró ningún resultadosignificativo en el estudio conjunto de IBD o de cada enfermedad porseparado. A continuación, los enfermos fueron estratificados por losprincipales factores genéticos implicados: CARD15 positivamente aEC, y HLA-DR3 negativamente a CU. En los enfermos de CU se obser-vó una ligera tendencia a aumentar la susceptibilidad en enfermospositivos para HLA-DR3 (portadores del alelo rs4804803 G, p= 0,04OR= 1,73 (1.00-3.01) cuando se comparan DR3 positivos frente a DR3negativos).

Discusión. El gen CD209 no parece estar implicado en el desarro-llo de la enfermedad de Crohn. Sin embargo, podría desempeñar algúnpapel en el origen o desarrollo de la colitis ulcerosa en individuos posi-tivos para HLA-DR3.

12. NUEVA REGIÓN CROMOSÓMICA ASOCIADA A COLITISULCEROSA. Márquez A, Mendoza JL, Taxonera C, Díaz RubioM, Urcelay E. Hospital Clínico San Carlos, Madrid.

Un estudio reciente describe una nueva región cromosómica en2q24.3 con influencia en la susceptibilidad a diabetes tipo 1. En dicharegión se encuentran ubicados los genes «interferon-induced helicase»(IFIH1), «grancalcin» GCA y el canal de potasio KCNH7. Todos ellos sonpotenciales genes candidatos a alterar la susceptibilidad a enfermedadinflamatoria intestinal (EII). El primero codifica un receptor citoplás-mico de reconocimiento de infección viral lo cual es importante ya queinfecciones por distintos virus se han implicado en la patología de laEII. La proteína codificada por GCA se expresa específicamente en neu-trófilos y monocitos/macrófagos, y es particularmente abundante encélulas provenientes de focos de infección bacteriana. Por otra parte,no es extraña la perturbación de la homeostasis iónica en EII.

Estudiamos tres polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) quepreviamente habían mostrado su efecto protector en diabetes:rs13422767, localizado «upstream» del gen IFIH1; rs1990760, que pro-voca un cambio aminoacídico Ala946Thr en el gen IFIH1 y rs2068330en el intrón 14 de KCNH7. La discriminación alélica se realizó median-te la tecnología TaqMan MGB (Applied Biiosystems, Foster City Ca,EEUU). También se estimaron los haplotipos conformados por dichospolimorfismos mediante el algoritmo EM incluido en Arlequín Ver.2000.

El estudio individual de cada SNP no reveló diferencias significa-tivas entre controles sanos y enfermos de colitis ulcerosa (CU) o deenfermedad de Crohn (CD). Ahora bien, tras estratificación por géne-ro, se observó en las pacientes de CU un efecto protector de los alelosmutantes de las variantes localizadas en los genes IFIH1 y KCNH7[enfermas de CU portadoras alelo mutante vs. enfermos: p= 0,0027; OR(95% IC)= 0,51 (0,32-0,81) y p= 0,004; OR (95% IC)= 0,54 (0,34-0,84), res-pectivamente], no así para el rs13422767. Esta estratificación por sexono alteró la ausencia de efecto en CD. El estudio de haplotipos no apor-tó información adicional.

En conclusión, la región cromosómica donde se localizan los genesIFIH1-GAC-KCNH7 influye selectivamente en la susceptibilidad a pade-cer colitis ulcerosa en mujeres, no influyendo en los pacientes mas-culinos de colitis ni en el riesgo a padecer enfermedad de Crohn.

13. ESTUDIO DEL POLIMORFISMO DEL PRION P M129V ENPACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE. León VJ1, LeonAJ2, Alonso Sardon M3. 1Serv Analisis Clinicos. Hospital Universita-rio de Salamanca. 2Laboratorio de Pediatria e Inmunologia, Univ. deValladolid. 3Dept. Med. Preventiva. Univ. De Salamanca.

Introducción. La Artritis Reumatoide AR es un desorden inmu-nodegenerativo que ha sido asociado con la presencia de depositos deproteinas anormales, en los cuales pueden influir de la Proteina B Ami-loide PrPC (PrionC) en sus formas insolubles PrP SC. Los Priones estanlocalizados en la membrana citoplasmatica. Presentan radicales a losque se ligan moleculas de Cobre, y juegan un papel esencial en el trans-porte transmembrana del cobre y en el mecanismo antioxidante celu-lar. los heterozigotos del PrNP al polimorfismo Met 129 Val presentanun efecto protector ó al menos un mayor periodo de incuvación de cier-tas enfermedades con componente autoinmune. El proposito del pre-sente estudio es relacionar la presencia de este polimorfismo en enfer-mos de AR.

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Material y métodos. Nuestro estudio se efectuó sobre 28 pacientesde AR, de y 48 sujetos controls se incluyeron en nuestro estudio. Unfragmento de 775 bp del gen PrNP fué amplificado empleando los pri-mers (for: 5'-GTG GCC ACA TGG AGT GAC CTG GGC CTC -3'; rev:5'-GTG AAA CAG GAA GAC C -3'). La PCR fue efectuada utilizando10 ng de ADN genomico en 20 mcl de mezcla de reacción. Las condi-ciones de la PCR fueron: 95ºdurante 5 min, 1 ciclo; 95º 30 seg, 30º 30 seg,72º 60 seg 34 ciclos, y 72º 10 min. El producto de la PCR fué digeridocon el enzima de restricción NspI y revelado en geles de agarosa al 2%.

Resultados. La distribución alelica en el grupo control fué: 42%M/M, 45% M/V, 13% V/V. En pacientes de AR : 44% M/M, 44% M/V,12% V/V. No hemos encontrado diferencias entre el grupo control yenfermos de EM (El test Chi-square, p< 0,05).

14. RELACIÓN ENTRE LOS GENES CYP46 Y DRB1*03 EN ARTRI-TIS REUMATOIDE. Leon VJ1, Montilla CA2, Hernandez-Cerce-ño ML1, Ingelmo Rodriguez MT3. 1Serv Analisis Clinicos, 2Serv Reu-matologia. Hospital Universitario de Salamanca. 3A Primaria, CS StaMarta del Tormes, Salamanca.

Introducción. La Artritis Reumatoide, AR, es un desorden com-plejo con multitud de factores genéticos implicados en su desarrollo ypatologia clinica. Cada vez existen más evidencias que implican altransporte transmembrana celular del colesterol en con la AR. El genCYP 46 codifica la enzima 24 colesterol hydrolasa juega un papel impor-tante en la salida al exterior celular del colesterol citoplasmatico .

Recientemente se ha comenzado a asociar un polimorfismo delIntron 2 del gen CYP 46 conel riesgo a adquirir la AR. En el presenteestudio, examinamos la posible asociacion del polimorfismo del genCYP 46 y el gen HLA DRB1*03 con AR .

Material y métodos. El presente estudio se efectuo en 32 enfermosdiagnosticados de AR, 38 de otras enfermedades reumatologicas (OER)y 98 controles.

El gen DRB1*03 fue determinado con el kit Classic SSP DQ »Lowresolution» de Dynal. El gen CYP 46 fué estudiado mediante una PCRemplenado los primers For 5'-TGA AAA CGA GTT TCC CGT CC-3' yRev-5'-GTG TGA CCA GGT AAC AGT CA-3', las condiciones de la PCRfueron: 95ºdurante 5 min, 1 ciclo; 95º 30 s, 53º 30 s, 72º 30s 34 ciclos, y final-mente 72º 10 min. El amplicon de 285 bp fué digerido co el enzima derestricción MspI, el alelo CYP C presenta dos fragmentos de 209 y 76 bp.

Resultados. La distribución del polimorfismo en AR es: 51,7% TT,41,3% TC, 3,3% CC, en OER: 56,6% TT, 40,0% TC , 6,9% CC, y en el gru-po control: 42,8 TT, 46,9 TC 10,2 CC Existen diferncia significativa enteel grupo control y los grupos de enfermos (Chi-square test P< 0,001).La distribucion de DRB1* 03 es 15,6% en AR, 16,4 en OER y 14,6% engrupo control. No se encontraron diferencias significativas en la corre-lación CYP 46 y DRB1*03 (Chi-square test, p< 0,05).

15. ESTUDIO DE ALGUNOS ALELOS HLA EN ENFERMEDADESREUMATOLÓGICAS. Leon VJ1, Leon AJ2, Gómez Castro S3, Her-nandez-Cerceño ML1. 1Serv Analisis Clinicos. Hospital Universitariode Salamanca. 2Laboratorio de Pediatria e Inmunologia, Univ. de Valla-dolid. 3Serv Reumatologia, Hospital Universitario de Salamanca.

Introducción. Los estudios epidemiológicos de alelos HLA rela-cionados con la susceptibilidad ó resistencia a ciertas enfermedades,la presencia de determinado alelo HLA modula la presentación anti-

génica inhibiendo o activando la respuesta inmune frente a exo o autoantígeno, presentan el inconveniente del alto precio de los estudiosgenómicos clásicos HLA, para soslayar este inconveniente hemos apli-cado el análisis individualizado del alelo HLA A3, B7, DR2 y DR4,mediante PCR, habiendo selecionado estos alelos por su relación enotras enfermedades autoinmunes.

Material y métodos. 47 pacientes diagnosticados de diversas enfer-medades reumatológicas (32Artritis Reumatoide, AR, 15 espondiloar-tropatias, EP ), y 80 sujetos sanos control, fueron el objeto de nuestroestudio. El ADN fue extraído mediante el kit DNA Direct II (Dynal),fundamentado en una resina con núcleo metálico que permite separarel complejo ADN-resina mediante un imán.

Los primers para el estudio del gen HLAA3 : For 5' AgC gAC gCCgCg AgC CA 3',

Rev 5' CAC TCC Acg CAC gTg CCA 3' ; para HLA B7: For 5` ggAgTA TTg ggA CCg gAA C 3`, Rev 5´ TAC Cag CgC gCT CCA gCT 3';para DR2:

For 5´ TCC TgT ggC AgC CTAAgA g 3´, Rev 5´ CgC TgC ACT gTgAAg CTC TC 3´ y DR4: For 5´gTT TCT Tgg AgC Agg TTA AAC A 3´,Rev 5´ CgC TgC ACT gTg AAG CTC TC 3´.

Las condiciones de PCR fueron: 95º, 5 min, 1 ciclo; 95º 30 seg, 53º30 s, 72º 30s 34 ciclos, y 72º 10 min. Los amplicones fueron visualiza-dos en electroforesis de agarosa al 2%

Resultados. La frecuencia génica de alelo HLA A3 fue 21,3% enAR, 19,2% EP (13,6% en GC), el alelo HLA B7 se un 18,3% AR, 17,5%EP (12,5% en GC) el alelo DR 2 17,6% en AR, 17,2 EP (15,5% en el GC),El DR4 32,4% AR, 28,3% EP ( 15,6% GC).

Las diferencian estatisticas entre las frecuencias génicas , Chi Cua-drado, entre enfermos y controles no fueron significativas, p< 0,05, aexcepción de las del alelo DR4 , p< 0,001, siendo este ultimo alelo elmás prometedor como posible marcador aplicado al grupo de Enfer-medadrs Reumatologicas.

16. IDENTIFICACIÓN DE UN NUEVO ALELO DE HLA MEDIAN-TE TIPAJE DE ALTA RESOLUCIÓN. Bernardo I, Castillo-RamaM, Calleja S, Romo E, Paz-Artal E, Grande C, Serrano A, CastroMJ. Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid.

El locus más polimórfico del sistema HLA es HLA-B, con más de800 alelos diferentes identificados hasta el momento. En este estudio, sedescriben los pasos seguidos para caracterizar un nuevo alelo de HLAen un paciente incluido en una búsqueda de donante de médula ósea.

Para el tipaje serológico de clase I se emplearon placas de tipajecon anticuerpos monoclonales (Lote 3A; One Lambda Inc, Canoga Park,CA). Después se realizó una PCR utilizando primers específicos desecuencia (PCR-SSP) seguida de un dot-blot reverso (INNO-LiPA; Inno-genetics, Ghent, Belgium) para obtener el tipaje de baja resolución. Acontinuación se completó el tipaje de alta resolución mediante el empleode un kit de tipaje por ADN específico de alelo (Micro SSPDNA typing trays, One Lambda Inc), con resultados concluyentes paratodos los alelos salvo para uno del locus B.

Con el fin de comparar la secuencia nucleotídica del paciente conlas bases de datos disponibles, se realizó una secuenciación directa,utilizando primers específicos de los exones 2, 3 y 4, y el resultado obte-nido fue comparado con las secuencias del BLAST (Basic Local Align-ment Search Tool; http://www.ncbi.nlm.nhl.gov/BLAST). La mayoridentidad encontrada fue con el alelo HLA-B*4004 (819 de 822 nucle-ótidos), seguido por HLA-B*4008 (817 de 822). El exón 2 del propósi-

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tus era idéntico al del alelo HLA-B*4008 y el 3 al de HLA-B*4004 (elexón 4 era, en los 3 casos, idéntico a la secuencia de referencia, HLA-B*070201). Se hipotetiza que este nuevo alelo podría haber surgido araíz de una recombinación entre el exón 2 de HLA-B*4008 y el 3 deHLA-B*4004, aunque no pudo comprobarse al no disponer de mues-tras del progenitor que lo transmitió.

17. PAPEL DEL GEN MHC2TA EN LA ARTRITIS REUMATOIDE.Sánchez-López M, Varadé J, Fernández-Gutierrez B, Concha EGde la. Hospital Clinico San Carlos. Madrid.

La expresión de los genes del complejo mayor de histocompatibi-lidad de clase II (MHCII) está casi exclusivamente regulada por el trans-activador de clase II (MHC2TA). Un polimorfismo situado en el pro-motor del MHC2TA (-168A/G, rs3087456) se asocia a un incrementoen la susceptibilidad a la artritis reumatoide (AR), a la esclerosis múl-tiple y al infarto de miocardio en la población del Norte de Europa. Sinembargo, esta asociación no ha sido replicada posteriormente en cohor-tes independientes. Ante esta aparente controversia nos propusimosel estudio del efecto de este gen en la susceptibilidad a AR.

Para poder estimar el patrón de haplotipos en este gen, se analizódicho polimorfismo y otro cambio G/C localizado en el exón 11 (nt16114de la secuencia codificante, rs4774). En el estudio caso-control se emple-aron 350 pacientes con artritis reumatoide y 519 controles sanos deMadrid. El genotipado se realizó con TaqMan assays-on-demand enun analizador 7900HT, siguiendo las condiciones recomendadas porApplied Biosystem (Foster City, California, USA). Se infirieron loshaplotipos con el algoritmo de expectación-maximización implemen-tado por el software Arlequín V2.0.

El resultado del estudio caso-control para cada marcador indepen-diente no evidenció ninguna asociación con el riesgo a padecer AR. Sinembargo, al comparar los haplotipos presentes en los pacientes fren-te a los hallados en controles, se observó una diferencia en la distribu-ción global, evidenciando un haplotipo protector (-168*A/1614*C, p=0,006; OR= 0,7); y otro de riesgo (-168*G/1614*C, p= 0,019; OR= 1,6).

Se estudió la posible interacción génica entre el MHC2TA y el epí-topo compartido («shared epitope», SE) en el gen DRB1, el principalfactor genético de susceptibilidad a AR conocido hasta la fecha. Al com-parar el haplotipo de riesgo MHC2TA G/C en los pacientes estratifi-cando por SE, se observó una diferencia significativa entre los subgru-pos SE positivo y SE negativo (8,2% vs 4%; p= 0,029). Comparado concontroles los individuos EC positivos tienen una mayor probabilidadde portar el haplotipo de riesgo (OR= 1,81, p= 0,012).

En conclusión, el gen MHC2TA influye en la predisposición a AR,si bien el polimorfismo -168A/G situado en la región promotora notiene un papel etiológico per se.

18. GENERACIÓN DEL GRUPO DE ALELOS HLA-B*41 DEDU-CIDA A PARTIR DE SECUENCIAS DE INTRONES. Martinez-Laso J1, Moscoso J2, Zamora J2, Gomez-Casado E2, Arnaiz-Ville-na A2. 1Instituto de Salud Carlos III, Madrid. 2Universidad Compluten-se y Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid, Madrid.

La generación de alelos HLA-B*41 se ha analizado a partir de lassecuencias del exón 1, intrón 1, exón 2, intrón 2 y exón 3. Los resultadosmuestran que primero se originó el alelo B*4102 por un mecanismo derecombinación entre el alelo B*400102 y B*0801 ó B*4201 en el que esta-

ba implicado en intrón 2. Los alelos B*4101, B*4104 y B*4107 pudieronsurgir a partir de B*4102 tras un fenómeno de conversión génica quearrastró 3 fragmentos diferentes de secuencias pertenecientes a partedel intrón 2 y el exón 3 de los alelos B*45, B*50 ó B*49. La aparición delos alelos B*4105 y B*4106 pudo tener lugar por mutaciones puntualesen el alelo B*4101, y la generación del alelo B*4103 no está clara debi-do a la ausencia de intrón 2. En este trabajo se incide sobre la importan-cia de los intrones en la generación del polimorfismo del gen HLA-B.

19. POLIMORFISMO DEL GEN HLA-E EN POBLACIONES AME-RINDIAS DE MEXICO (MAZATECOS), COLOMBIA (INDIOSWAYU) Y CHILE (MAPUCHES). EVOLUCIÓN DEL GEN MHC-E. Arnaiz-Villena A1, Vargas-Alarcon G2, Serrano-Vela JI1, Marti-nez-Laso J3, Silvera-Redondo C4, Granados J2, Reguera R1, Mos-coso J1. 1 Universidad Complutense y Centro de Transfusión de la Comu-nidad de Madrid. 2Instituto Nacional de Nutrición Salvador Zubirán,Mexico. 3Instituto de Salud Carlos III. 4Universidad de Barranquilla.

HLA-E es un gen de histocompatibilidad de clase I no clásico (HLA-Ib) con un polimorfismo limitado. Sólo se han descrito 8 alelos que danlugar a 3 proteínas diferentes. El polimorfismo del gen HLA-E se haestudiado en 6 poblaciones amerindias y mestizas del continente ame-ricano y se ha comparado con resultados obtenidos en otras poblacio-nes. Además, se han calculado las frecuencias alélicas entre poblacio-nes amerindias, caucasoides, orientales, indias asiáticas y negroides.HLA-E*0101 es el alelo más frecuente en todas las poblaciones, excep-to en afrocolombianos y amerindios wayu, cuyos grupos sanguíneosrevelan una mezcla importante con poblaciones caucasoides y africa-nas. Los grupos amerindios de mazatecos (Norteamérica) y mapuches(Sudamérica) presentan frecuencias similares de alelos HLA-E, mien-tras que los indios wayu se parecen más a los afrocolombianos. Por suparte, las poblaciones mestizas mexicanas y colombianas muestran fre-cuencias parecidas a las de poblaciones amerindias, en las que pre-dominan los alelos HLA-E*0101 y HLA-E*010302. Las poblacionesnegroides y los indios asiáticos también presentan una distribuciónparecida de los aleos HLA-E. Aunque las frecuencias alélicas varíande unas poblaciones a otras, el bajo polimorfismo es común en todasellas, no habiéndose encontrado ningún alelo nuevo en las 6 poblacio-nes estudiadas ahora. Esta poca variabilidad también es patente el losgenes MHC-E de primates como el chimpancé (1 alelo), el bonobo (2alelos), el gorila (2 alelos), el orangután (1 alelo), el macaco rhesus (8alelos), el macaco cangrejero (2 alelos) y el cercopiteco verde (2 alelos).

20. EVOLUCIÓN Y FUNCIÓN DE LOS GENES MHC-E, MHC-F YMHC-G. Moscoso J, Serrano-Vela JI, Pacheco R, Reguera R,Arnaiz-Villena A. Universidad Complutense y Centro de Transfusiónde la Comunidad de Madrid.

La región de histocompatibilidad de clase I incluye los llamadosgenes MHC clásicos (A, B y C) y no clásicos (E, F y G), además de pseu-dognes y genes truncados. Las moléculas MHC-E, -F y -G son consi-deradas como tolerogénicas, ya que no sólo interaccionan con célulasNK, sino también con subpoblaciones de linfocitos T y algunas otrascélulas. Además, tienen un papel importante en la aceptación del feto.De nuestros resultados observamos que existe una fuerte presión selec-tiva que favorece la invariabilidad de los genes MHC-E, -F y -G tantoen humanos como en otros primates.

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21. ORIGEN DE LA POBLACIÓN NAHUA (AZTECA O MEXICA)DE MEXICO SEGÚN LOS GENES HLA: EL POBLAMIENTODE AMÉRICA Y LA SINGULARIDAD DE LOS AMERINDIOS.Moscoso J1, Vargas-Alarcon G2, Martinez-Laso J3, Serrano-VelaJI1, Reguera R1, Granados J2, Arnaiz-Villena A1. 1Universidad Com-plutense y Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid. 2Insti-tuto Nacional de Nutrición Salvador Zubirán, Mexico DF. 3Instituto deSalud Carlos III.

Se han estudiado los genes HLA en un grupo aislado de Nahuas(Aztecas o Mexicas) que habitan en las montañas del centro de Mexi-co (Santo Domingo Ocotitlan). Las relaciones genéticas entre los ame-rindios y poblaciones del resto del mundo se han establecido utilizan-do las frecuencias de alelos HLA para calcular distancias genéticas yconstruir dendrogramas Neighbor-Joining y análisis de corresponden-cia. En total se han comparado 13818 cromosomas. Se han encontrado3 nuevos haplotipos extendidos HLA en Nahuas (A30-B49-DRB1*1001-DQB1*0501; A2-B52-DRB1*1402-DQB1*0301; A68-B61-DRB1*1602-DQB1*0303), siendo el primero de ellos el más frecuente en esta pobla-ción. Tanto las distancias genéticas como el análisis de corresponden-cia muestran claramente que los Mexicas de Santo Domingo Ocotitlantienen una estrecha relación genética con algunos de los grupos mexi-canos más antiguos (Mayas, Zapotecos, Mixtecos), lo que sugiere quela lengua de los Nahuas (Nahuatl) pudo ser impuesta a grupos mexi-canos aislados; de lo contrario habría que pensar que los Aztecas yavivían en Mexico mucho antes del siglo XII, momento en el que se pos-tula que llegaron allí.

22. ORIGEN DE LOS TEENEKS (HUASTECOS) DEL GOLFO DEMEXICO SEGÚN LOS GENES HLA. Arnaiz-Villena A1, Mosco-so J1, Serrano-Vela JI1, Murguia E2, Reguera R1, Granados J3, Var-gas-Alarcon G3. 1Universidad Complutense y Centro de Transfusión dela Comunidad de Madrid. 2Instituto Nacional de Cardiología IgnacioChávez, Mexico DF. 3Instituto Nacional de Nutrición Salvador Zubirán,Mexico.

Se han calculado las frecuencias de alelos HLA de los indios Tee-nek (Huastecos) del golfo de Mexico y se han comparado con las deotras poblaciones amerindias y del resto del mundo (en total se hananalizado 15694 cromosomas de 73 poblaciones diferentes). El estudioconfirma el reducido polimorfismo que se observa en los genes HLAde poblaciones amerindias y muestra una homogeneidad en dichaspoblaciones que los diferencia de otros grupos de indios americanoscomo los Na-Dene o los Eskimos. También se pone de manifiesto laausencia de correlación entre genes y lenguas a nivel microgeográfi-co: los Teeneks hablan una lengua Maya a pesar de la poca relacióngenética que tienen según se observa en nuestros resultados.

23. GENERACIÓN DEL GRUPO DE LOS ALELOS HLA-B*1516/B*1567/B*1595/B*1517 DESDE LOS PRIMATES NOHUMANOS. Román A, Cervera I, Head J, Rodriguez M, FuentesP, Gutierrez-Solar B, Martínez-Laso J. Unidad de InmunoterapiaCelular. Instituto de Salud Carlos III. Centro Nacional de Microbiología.Majadahonda. Madrid.

La generación de los alelos B*1516, B*1517, B*1567 y B*1595 se haanalizado utilizando las secuencias de los exones 1, 2 y 3 y de los intro-

nes 1 y 2, tanto de humanos como de primates no humanos. Los resul-tados mostraron que para la formación de dichos alelos habrían sidonecesarias tres fases evolutivas: 1) Una fase situada en los primates nohumanos con la presencia de un ancestro común para B*1516/1517generado por dos eventos independientes de conversión génica. Estosincluyen un fragmento del exón 1 y un fragmento que engloba el finaldel exón 2 y el principio del intrón 2, respectivamente. 2) Esta segun-da fase se puede situar tanto en el hombre como en los primates nohumanos donde se generarían dos vías evolutivas diferentes que darí-an lugar por un lado a un ancestro de B*1516 y por otro a un ancestrode B*1517. 3) Por último, en la tercera fase se produciría una evoluciónintra especie humana. En esta fase y siguiendo las dos vías de evolu-ción del apartado anterior, se generarían los alelos HLA-B*1516 y HLA-B*15170101. HLA-B*1516 sería el resultado de una conversion génicaen el exón 3 y una mutación puntual en el exón 2 y HLA-B*15170101se formaría por otra conversión génica en el exón 3. Del alelo HLA-B*1516 se formarían los alelos B*1567 and B*1595 mediante mutacio-nes puntuales específicas. Del mismo modo los alelos B*151701012 yB*151702 se generarían mediante mutaciones puntuales en el intrón2 y en el exón 3, respectivamente. En conclusión, se puede establecerla hipótesis en la que los alelos B*1517, B*1516 B*1567 y B*1595 se habrí-an generado mediante dos vías diferentes de evolución que proven-drían de una única vía cuyo origen estaría en los primates no huma-nos.

24. LOS POLIMORFISMOS CDX2, BSMI Y FOKI DEL GEN VDRPERMITEN DIFERENCIAR A LOS PACIENTES CELIACOS DESUS HERMANOS SANOS HLA IDÉNTICOS. Manzanares B1,Casado A2, González R1, Sánchez F3, Rodríguez-Reynosod MF3,Jiménez J3, Santamaría M1, Quesada JM2, Peña J1. 1Servicio Inmu-nología, Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba. 2Sanyres (Gru-po PRASA), Unidad de Metabolismo Mineral, Hospital UniversitarioReina Sofía de Córdoba. 3Servicio Gastroenterología Pediatrica, Hospi-tal Universitario Reina Sofía de Córdoba.

Introducción. La enfermedad celiaca (MIM 212750) es un desor-den crónico autoimmune causado por una intolerancia al gluten ensujetos genéticamente susceptibles. Aunque la participación del Com-plejo Mayor de Histocompatibilidad es muy importante, se conoce queéstos no son los únicos genes involucrados en su patogenia. Los enfer-mos celiacos presentan con cierta frecuencia alteraciones en el meta-bolismo de la vitamina D. También es conocido que la vit D tiene unefecto inmunomodulador y que ejerce su función a través de unosreceptores polimórficos (VDR). Recientemente se han demostrado dife-rentes asociaciones entre los polimorfismos de VDR y diferentes enfer-medades autoinmunes. Por tanto, en el presente estudio nos plantea-mos determinar si los polimorfismos de VDR permitirían diferenciaraquellos hermanos HLA idénticos a los pacientes que tienen menorriesgo de padecer celiaquía.

Pacientes y métodos. Se estudiaron un total de 50 familias quetenían al menos un hijo con enfermedad celiaca y algún hermano HLAidéntico al paciente. Se tiparon los locus HLA-A, B, DRB1, DQB1 yDQA1 de los padres, el paciente y sus hermanos para confirmar la iden-tidad HLA. El paciente y su(s) hermano(s) HLA idéntico fueron geno-tipados para el polimorfismo de VDR (CDX 2, Fok I, Bsm I) usandouna amplificación por PCR seguido por digestión por endonucleasasde restricción y electroforesis en geles de agarosa. También se estudia-ron 225 controles.

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Resultados. La comparación de los genotipos VDR de los pacien-tes con sus hermanos HLA idénticos demostró que la proporción de«heterocigotos» GA (CDX-2), Bb (Bsm-I) TC (Fok-I) para los tres poli-morfismos estudiados era significativamente superior en el grupo delos hermanos sanos. Ninguno de los 50 pacientes celiacos estudiadosresultó ser heterocigoto a la vez para los tres polimorfismos. En el gru-po control también encontramos una mayor proporción estadísticamen-te significativa de sujetos heterocigotos respecto a los pacientes celiacos.

25. IL12 EN ENFERMEDAD CELIACA EN LA POBLACIÓN ESPA-ÑOLA. Alecsandru D1, Polanco I2, Maluenda C3, Núñez C1, Figue-redo MA1. 1 Servicio de Inmunología Clínica, Hospital Clínico San Car-los, Madrid. 2Servicio de Gastroenterología Pediátrica, Hospital La Paz,Madrid. 3Servicio de Pediatría, Hospital Clínico San Carlos, Madrid.

Introducción y objetivos. La Enfermedad Celiaca (EC) es unaenfermedad crónica del intestino delgado proximal, producida poruna intolerancia inmunológica permanente a determinadas proteí-nas del gluten. Los genes HLA y no-HLA junto con el gluten y otrosposibles factores ambientales están involucrados en la etiología de laenfermedad celiaca. La IL-12 es un inductor de la maduración de loslinfocitos T en subtipo Th1, y de la producción de IFN-γ, altamenteexpresado en las lesiones celiacas. Varios estudios han emitido la hipó-tesis de que la IL12, un heterodímero formado por las subunidadesp35 y p40, juega un papel importante en la patogénesis de la EC. Elgen de p40 (IL12B) está ubicado en 5q33.3, y hemos estudiado el papelde 2 microsatélites y 2 SNPs, situados en esta región, en la suscepti-bilidad a EC en nuestra población.

Material y metódos. Se han estudiado los microsatélites D5S2038y D5S1352 y el SNPs 1188A/C (rs3212227) en el gen de la IL12, y elSNP rs1368297 (en EBF, gen cercano al anterior) en enfermedad celia-ca en la población española mediante estudios caso-control y fami-liares. Los microsatélites D5S2038 y D5S1352 se han estudiado por PCRcon primers fluorescentes seguido de electroforesis capilar en el secuen-ciador automático AbiPrism 3100 (Applied Biosystems). El análisis delos SNPs 1188A/C y EBF se ha realizado mediante ensayos TaqMan(C_2084293 y respectivamente C_2085085) en las condiciones recomen-dadas por el fabricante (Applied Biosystems). El estudio ha incluido378 pacientes, además de sus familiares y 472 controles sanos de lapoblación española. Se han analizado los microsatélites y SNPs porseparado, y los haplotipos extendidos formados por ellos se han dedu-cido en familias o han sido estimados con el algoritmo EM. Las fre-cuencias alélicas y haplotípicas en pacientes y controles han sido com-paradas utilizando la prueba Chi-cuadrado y el test de Fisher cuan-do ha sido necesario (valores esperados<5), utilizando el paquete infor-mático Epi Info v6.02.

Resultados. No hemos observado asociaciones estadísticamentesignificativas en los microsatélites y los SNPs estudiados considera-dos de uno en uno. Hemos encontrado asociaciones de la enfermedadcon los haplotipos de dos microsatélites D5S2038_5-D5S1352_3 (p=0,015;OR=0,62) y D5S2038_8-D5S1352_4 (p=0,017; OR=1,87). No hemos obser-vado asociaciones significativas con los haplotipos formados por los2 SNPs estudiados y tampoco con los haplotipos formados por el SNPdel gen EBF y los 2 microsatélites. En el estudio de los haplotipos delSNP 1188A/C con los 2 microsatélites hemos encontrado asociacionesde los minihaplotipos 1188A-D5S2038_2 (p=0,023; OR=3,16) y 1188A-D5S1352_2 (p=0,023; OR=1,39). No se observaron diferencias signifi-cativas en el estudio TDT.

Conclusiones. Los polimorfismos de la IL12 estudiados no se aso-cian con la enfermedad celiaca en la población española, tras aplicarla corrección de Bonferroni. Resultados similares se han obtenido enestudios realizados en las poblaciones italiana y escandinava, y sugie-ren que la expresión aumentada de la IL12 en los enfermos celiacospuede ser una consecuencia de la enfermedad, y no causa de ella.

26. ANALISIS DEL POLIMORFISMO DE CARD15 EN ENFERME-DAD CELIACA. Rodríguez-Gutiérrez JF1, Sampalo A1, Sánchez-Velasco P2, Rubio A3, Brieva JA1, Nieto A1. 1Inmunología. HospitalPuerta del Mar. Cadiz. 2Inmunología, Hospital Marqués de Valdecilla,Santander. 3Pediatría, Hospital SAS de Jerez.

La enfermedad celíaca se reconoce como un proceso genéticocomplejo. Aprox. un 40% del riesgo genético reside en la región HLA.Estudios recientes señalan la importancia de la inmunidad innata enla patogénesis de la celiaquía, abriéndose así un nuevo abanico deposibles genes candidatos. CARD15 codifica Nod2, proteína que reco-noce componentes de la pared bacteriana e induce respuesta inmu-ne innata. Algunas variantes de CARD15 se han asociado consisten-temente a enfermedad de Crohn. Por otro lado, un estudio prospec-tivo muy reciente muestra una alta prevalencia de celiaquía en pacien-tes afectados de enfermedad de Crohn. En este estudio analizamosel posible papel de CARD15 en la susceptibilidad a enfermedad celí-aca. Se genotiparon los SNPs R702W, G908R y L1007fsinsC en un gru-po de 101 pacientes con diagnóstico de celiaquía siguiendo los crite-rios de la ESPGHAN y en 117 controles sanos no relacionados. La fre-cuencia de portadores de 702W estaba ligeramente incrementada encontroles (10% vs 12%). Sin embargo, la frecuencia de 908R estabasignificativamente aumentada en pacientes (8% vs 1,8%; p= 0,04; OR=4,95, 95%CI 0,94-34,6). La variante L1007fsinsC también se encontra-ba aumentada en pacientes (4,9% vs 10,8%) si bien la diferencia noalcanza significación. Curiosamente, los haplotipos 908R y L1007fsinsCcomparten algunos marcadores polimórficos que no están presentesen haplotipos 702W. Por tanto, se realizó un análisis considerandoser portador de 908R o L1007fsinsC como factor de riesgo. En estecaso una fuerte asociación con la enfermedad se hizo evidente (OR=4,17, 95%IC 1,21-15,76; p= 0,009). Este estudio muestra que polimor-fismos en CARD15 o en otros genes en fuerte desequilibrio de unióncon ellos pueden conferir una susceptibilidad diferencial a enferme-dad celíaca.

27. POLIMORFISMOS EN EL GEN DE LA INTERLEUQUINA 6EN PACIENTES ESPAÑOLES CON DÉFICIT DE IGA. López-Mejías R1, Cruz García-Rodríguez M2, Ferreira A2, Fontán G2, Fer-nández-Arquero M1. Hospital Clínico San Carlos, Madrid.

Introducción. La deficiencia selectiva de IgA es la inmunodefi-ciencia primaria mas común en individuos de raza blanca, con una fre-cuencia de aparición de 1/600 individuos. Es una enfermedad multi-factorial en la cual intervienen diversos factores genéticos, dentro delos cuales el HLA es el factor de susceptibilidad más importante des-crito hasta el momento.

La interleuquina 6 (IL-6) es una citoquina que, entre otras fun-ciones, estimula el crecimiento de los linfocitos B diferenciados en célu-las plasmáticas e in vitro causa un aumento en la producción de IgA.Además, niveles excesivos de esta citoquina han sido observados en

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pacientes con determinadas enfermedades inflamatorias como la artri-tis reumatoide.

En este gen se han descrito varios polimorfismos que se han estu-diado para evaluar su posible relación con susceptibilidad a enferme-dades como la diabetes y la artritis reumatoide. Nuestro objetivo seráanalizar el posible papel que dichos polimorfismos en el gen de laIL-6 puedan desempeñar en el desarrollo del déficit de IgA.

Material y métodos. Se han analizado un total de 195 enfermoscon déficit de inmunoglobulina A diagnosticados en el servicio deinmunología del Hospital La Paz de Madrid y 417 sujetos sanos. Todoslos individuos eran blancos y de origen español. Así mismo, ambosprogenitores de 72 de estos enfermos fueron analizados para llevar acabo un estudio familiar. Se analizaron nueve polimorfismos de unúnico nucleotido (SNPs) localizados a lo largo del gen de la IL-6:rs1546762, rs1880242, rs206982, rs1800797, rs3087226, rs2069830,rs2069849, rs2069861 y rs1818879. Para todos los SNPs, el tipaje sellevó a cabo mediante el uso de ensayos Taqman, siguiendo las instruc-ciones recomendadas por la casa comercial (Applied Biosystems, Fos-ter City, CA, USA).

La comparación de frecuencias entre la muestra enferma y controlse realizó mediante tests chi-cuadrado o test exacto de Fisher cuando losvalores esperados eran menores de 5. Las frecuencias haplotípicas fue-ron estimadas mediante el algoritmo EM (Expectation-Maximization)incorporado en el software para Genética de Poblaciones Arlequin.

El estudio familar se llevó a cabo mediante la aplicación de un TDT(transmission disequilibrium test).

Resultados. Todos los polimorfismos estudiados se ajustan a lasproporciones esperadas bajo Hardy-Weinberg.

La comparación de frecuencias alélicas y genotípicas entre enfer-mos y controles no mostró ningún resultado estadísticamente signifi-cativo. Sin embargo, el análisis de haplotipos reveló un haplotipo, con-cretamente CGGGCCA, que parecía proteger frente al desarrollo de laenfermedad (OR=0,35 I.C. 0,17-0,72; p =0,002; p corregida <0,05). Esteresultado no pudo ser observado en el estudio con familias, probable-mente debido a su menor potencia estadística por el reducido núme-ro de familias.

Discusión. El gen IL6 parece estar implicado en el desarrollo deldéficit de IgA. Estudios posteriores serán necesarios para comprobarsi existe algún polimorfismo que caracterice este haplotipo y sea el úni-co responsable de la asociación observada.

28. ASOCIACION SEXO ESPECIFICA DEL POLIMORFISMOC1857T DEL GEN PTPN22 CON ACALASIA IDIOPÁTICA.Cenit MC1, Santiago JL1, Benito MS1, Ruiz de León A2, MendozaJL2, Díaz-Rubio M2, Concha EG de la1. 1Servicio de Inmunología Clí-nica, y 2Servicio de Gastroenterología, H. Clínico San Carlos. Madrid.

Introducción y objetivos. La acalasia idiopática es un desordende la motilidad esofágica caracterizado por aperistalsis y por una insu-ficiencia del esfínter esofágico inferior para relajarse durante la deglu-ción. Está desencadenada principalmente por una pérdida del efectoinhibitorio del plexo mientérico del esófago. Entre las posibles cau-sas propuestas para esta enfermedad se incluyen: degeneración neu-ronal, infección vírica, predisposición genética y destrucción mediadapor el sistema inmune del plexo mientérico. En apoyo de la etiologíaautoinmune se han descrito tres grupos de evidencias: la presencia decélulas T y eosinófilos en el tejido esofágico, los elevados títulos deautoanticuerpos contra el plexo mientérico que aparecen en algunos

pacientes y la alta prevalencia de ciertos antígenos del HLA de claseII. Nuestro objetivo fue estudiar por primera vez en la acalasia el poli-morfismo C1858T localizado en el gen PTPN22 (protein tyrosin phos-phatase N22) que se ha encontrado asociado a varias enfermedadesautoinmunes, lo que apoyaría su carácter autoinmune.

Metodología. Realizamos un estudio caso-control con 231 pacien-tes diagnosticados de acalasia y 554 controles sanos, todos españoles dela Comunidad de Madrid. Tanto en enfermos como en controles se ana-lizó el SNP PTPN22 C1858T (rs2476601) por sondas TaqMan medianteFast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Las diferencias en frecuencias alélicas y genotípicas fueron cal-culadas por el estadístico Chi-cuadrado y las asociaciones fueron esti-madas mediante odds ratio (OR) con un intervalo de confianza del 95%(Epi Info v. 6.02, CDC, Atlanta,USA).

Resultados. En el estudio global de la población no encontramosuna asociación significativa del alelo 1858T con un aumento del ries-go a sufrir acalasia (OR= 1,38; p= 0,13). Sin embargo, la distribuciónde este alelo fue significativamente diferente entre mujeres y hombresenfermos (OR= 2,06; p= 0,042) y también entre pacientes mujeres y con-troles (OR= 1,94; p= 0,01), pero no entre hombres enfermos y contro-les (OR= 0,94; p= 0,85). Cuando estratificamos por el principal aleloHLA de susceptibilidad y por la presencia de anticuerpos anti-plexomientérico, solo las mujeres DQA1*0103 negativas (OR= 2,23; p= 0,004),auto-anticuerpos positivos (OR= 2,14; p= 0,035) o las que presentanambos caracteres simultáneamente (OR= 2,62; p= 0,017) fueron signi-ficativamente diferentes de controles.

Conclusiones. Describimos por primera vez al alelo 1858T del genPTPN22 como factor de susceptibilidad para mujeres españolas conacalasia. Se trata de un factor de riesgo adicional al HLA de clase II, loque apoya el carácter autoinmune de la acalasia incluso en aquellaspacientes sin factores HLA de susceptibilidad conocidos.

29. ESTUDIO DE ASOCIACIÓN DEL POLIMORFISMO C1858TDEL GEN PTPN22 EN LA INFECCIÓN POR TRYPANOSOMACRUZI. Robledo G1, Calzada JE1, González CI2, Martín J1, Gon-zález A1. 1Instituto de Biomedicina y Parasitología López-Neyra, CSIC,Granada. 2Facultad de Salud. Universidad Industrial de Santander, Buca-ramanga, Colombia.

Introducción. Se ha sugerido recientemente que las proteínas tiro-sín fosfatasas (PTPs) son fundamentales en procesos celulares críticosen la respuesta inmune y que alteraciones en ellas están implicadas enel desarrollo de diferentes enfermedades humanas desde el cáncer alas deficiencias del sistema inmune. Una de estas PTPs, la PTPN22(protein tyrosine phosphatase nonreceptor 22), localizada en el cromo-soma 1p13.3, interviene en la señalización del receptor de las célulasT. Se ha descrito un polimorfismo de PTPN22 (C1858T; rs2476601;R620W), situado en el motivo P1 de este gen, que inhibe la activaciónde células T y está asociado con susceptibilidad a múltiples enferme-dades autoinmunes así como a infección por M. tuberculosis. Basándo-nos en estas premisas, evaluamos la posible influencia del polimorfis-mo C1858T del gen PTPN22 en la susceptibilidad a infección por T.cruzi y en el desarrollo de síntomas cardíacos.

Métodos. Se analizaron dos cohortes caso-control independientesprovenientes de zonas endémicas de Colombia y Perú. Los pacientesde enfermedad de Chagas se clasificaron, a su vez, entre cardiomiopá-ticos (n= 126 en colombianos y n= 28 en peruanos) y asintomáticos(n=113 en colombianos y n= 44 en peruanos). El genotipado del poli-

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morfismo PTPN22 C1858T se realizó mediante PCR a tiempo real consondas Taqman.

Resultados. No se observaron diferencias estadísticamente signi-ficativas entre las dos cohortes de pacientes chagásicos analizadas jun-tas o por separado y sus controles, en cuanto a la distribución alélicay genotípica del polimorfismo PTPN22 C1858T. Tampoco encontra-mos diferencias significativas entre pacientes cardiomiopáticos y asin-tomáticos separadamente o combinando ambas poblaciones.

Conclusiones. Nuestros resultados sugieren que el polimorfismoanalizado del gen PTPN22 no parece estar implicado en el desarrollode la enfermedad de Chagas.

30. POLIMORFISMO GENÉTICO DE TAP Y LMP EN BRUCELO-SIS HUMANA Y SUS COMPLICACIONES. Bravo MJ, LavadoR, Miranda JM, Fernández N, Colmenero JD, Martín J, AlonsoA, Caballero A. Servicio de Inmunología, Hospital Carlos Haya, Mála-ga.

Introducción. La brucelosis es una zoonosis causada por una bac-teria del género Brucella. La enfermedad afecta a humanos en áreasdonde permanece endémica, especialmente en países de la cuencaMediterránea. La inmunidad frente a Brucella depende de forma cru-cial de las células T antígeno específicas que median en la activaciónde los macrófagos, que son los mayores efectores en la eliminación deeste patógeno intracelular. Los antígenos proteicos bacterianos se pre-sentan a células T cooperadoras con fenotipo CD4+. Sin embargo, algu-nos antígenos de Brucella se expresan en el contexto del MHC de cla-se I, que provoca la activación de células T citotóxicas, con fenotipoCD8+. Hay dos grupos de proteínas, que participan en el procesamien-to antigénico, los transportadores de péptidos (TAP) y los polipépti-dos de bajo peso molecular (LMPs).

El grupo génico LMP/TAP está codificado en el cromosoma 6, enel CMH, en la región de clase II entre los loci DQB1 y DPB1, ambos sonpolimórficos y están relacionados con enfermedades del tipo autoin-munes y enfermedades infecciosas del tipo lepra y tuberculosis. Debi-do a su papel en el procesamiento antigénico, su localización dentrodel CMH y su polimorfismo, pensamos que los genes que codificanpara el procesamiento y transporte antigénico que median en la víaendógena como son TAP y LMP son considerados como importantescandidatos para la asociación con susceptibilidad para brucelosis huma-na.

Objetivo. El presente estudio se diseñó con el objeto de determi-nar si existe asociación entre el polimorfismo genético de TAP y LMPy la brucelosis humana.

Métodos. Se han estudiado 61 pacientes de brucelosis humana y102 individuos sanos. El análisis del polimorfismo de los genes TAP yLMP se realizó mediante PCR-RFLP con sitios de restricción creadosdurante la amplificación. Para estudios de asociación los valores deP se calcularon utilizando el test de χ2 con corrección de Yates.Los valores de P menores de 0,05 se consideraron significativos.

Resultados. No encontramos diferencias en las frecuencias de losgenotipos LMP y TAP entre los pacientes y los controles. Al conside-rar los pacientes con ausencia y presencia de formas focales o compli-cadas, encontramos un aumento significativo del genotipoTAP2A/TAP2F en los pacientes con formas focales cuando se compa-ró con el grupo de pacientes sin formas focales (16% vs 0%, P= 0,02),aunque estas diferencias no fueron estadísticamente significativas alcorregir por el número de comparaciones.

Conclusión. Este estudio pone de manifiesto que los genes de pro-cesamiento y transporte antigénico (LMP y TAP) no confieren suscep-tibilidad genética ni protección frente a la brucelosis humana.

31. POLIMORFISMOS DEL PROMOTOR DE MCP-1 Y DE CCR2EN PACIENTES CON HEPATITIS CRÓNICA POR VIRUS C.Montes-Cano MA, García-Lozano JR, Aguilar-Reina J, Romero-Gómez M, Barroso N, Núñez-Roldán A, González-Escribano MF.Servicio de Inmunología. HU Virgen del Rocío. Sevilla.

Antecedentes. La infección por virus de la hepatitis C (HCV) con-duce al desarrollo de hepatitis crónica en más del 80% de los infecta-dos, mientras que solo 10%-20% aclara espontáneamente el virus. Laevolución de los pacientes que desarrollan hepatitis crónica es tambiéndiversa y así el 20-30% desarrolla fibrosis progresiva y cirrosis, mien-tras que en el resto de los casos la evolución oscila entre la ausencia defibrosis y el desarrollo de un grado moderado de la misma. La respues-ta al tratamiento es también diversa encontrándose pacientes no res-pondedores, respondedores que recaen y pacientes que presentan res-puesta sostenida. La diferente evolución de la infección por HCV podríaestar influenciada por diferentes factores genéticos tanto del hués-ped como del hospedador. Entre los factores genéticos del hospeda-dor que podrían condicionar la evolución se encuentran las quimio-quinas. MCP-1 es una ‚-quimioquina que tiene un importante papelcomo mediador en los procesos de inflamación crónica y como regu-lador de la homeostasis de citoquinas en el hígado. El principal recep-tor de MCP-1 es CCR2 cuya expresión aumenta considerablemente ensituaciones de inflamación crónica.

Objetivo. Estudiar la posible relación de los polimorfismos -2518G/A de MCP-1 y 190 G/A y rs3138042 G/A de CCR2 en el desarro-llo de hepatitis crónica y en la evolución de la misma y respuesta altratamiento en pacientes infectados por HCV.

Material y métodos. Se incluyeron en el estudio 284 pacientes conhepatitis crónica, 65 pacientes con aclaramiento viral espontáneo y 193controles no infectados. Los pacientes con hepatitis crónica se estrati-ficaron según el índice de Scheuer de fibrosis en F0-F2 (n=202) and F3-F4 (n=82) y según su respuesta a la terapia antiviral en individuos conrespuesta sostenida (SR, n=84) y sin respuesta sostenida (NSR, n=91).El genotipado de los 3 SNPs estudiados se realizó utilizando diversosmétodos de PCR.

Resultados. La única diferencia significativa observada fue unaumento de la frecuencia del alelo 190 CCR2 A en el grupo de pacien-tes con hepatitis crónica comparado con el grupo de controles no infec-tados (15,0% vs 10,1%, p=0,03; OR=1,57; 95% CI 1,03-2,39) y con el gru-po de controles que aclaraban espontáneamente el virus (9,2%) si bienla comparación no alcanzaba la significación estadística en este caso(p=0,09).

Conclusión. El polimorfismos 190 CCR2 A podría influir en el des-arrollo de hepatitis crónica en pacientes infectados por virus C.

32. GENOTIPOS KIR EN PACIENTES CON TUBERCULOSIS. Gue-rrero MA, Ocejo-Viñals G, Sánchez-Velasco P, Ausín F, Fariñas C,Leyva-Cobián F. Servicio de Inmunología. Hospital Universitario Mar-qués de Valdecilla.

Introducción. Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) sonmiembros de un grupo de moléculas reguladoras que se encuentran en

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algunas células del sistema inmune. Existen isotipos inhibidores y esti-muladores de la actividad de las células NK. Es por ello por lo que secree que este tipo de receptores juegan un papel importante en el con-trol de la respuesta inmune, lo cual podría explicar la asociación obser-vada entre ciertos genes KIR y diferentes enfermedades.

Materiales y métodos. Se incluyeron un total de 78 pacientes contuberculosis (TB) y 60 controles, ninguno de ellos relacionado, todosellos de la Comunidad Autonómica de Cantabria. Se estudió la pre-sencia o ausencia de genes KIR (killer cell immunoglobulinlike Recep-tor), mediante técnica de PCR-SSO-Luminex y análisis de los datosmediante el software LifeMatch.

El test exacto de Fischer fue utilizado para realizar las compara-ciones estadísticas.

Resultados. El número de pacientes con TB que presentan KIR2DLdifiere significativamente comparado con el grupo de controles sanos(30 vs 14, p= 0,025). El número de controles sanos que presentanKIR3DL1 difiere significativamente comparado con el grupo de pacien-tes con TB (54 vs 60, p= 0,035). Del mismo modo el número de con-troles que presentan KIR2DS5 difiere significativamente respecto delgrupo de pacientes con TB (31 vs 25, p= 0,016).

Conclusión. Nuestros resultados muestras diferencias en la expre-sión de genes KIR inhibidores (KIR2DL2, KIR3DL1) y activadores(KIR2DS5) entre pacientes con TB y controles sanos en nuestra pobla-ción. Al tratarse de una muestra pequeña, sería necesario incluir unnúmero mayor de pacientes con TB en el estudio, para confirmar siestos datos se mantienen.

33. DISTRIBUCIÓN DE LA FRECUENCIA DE LAS VARIANTESGENOTÍPICAS DE +874(A→T) EN CÁNCER DE MAMA ESPO-RÁDICO EN LA PROVINCIA DE MÁLAGA. Lavado R1, Bra-vo MJ1, Miranda JM1, Fernández-Arcás N1, Alés I2, Alonso A1, Bena-vides M2, Caballero A1. 1Servicio de Inmunología y 2Sección de Onco-logía Médica, Hospital Regional Universitario Carlos Haya, Málaga.

Antecedentes y estado actual del tema. El cáncer de mama es unade las neoplasias más frecuentes entre mujeres occidentales. El IFN-γes una citocina secretada por linfocitos T (CD4+ y CD8+) activados porantígenos, que son los efectores de la respuesta inmune mediada porcélulas. Es, junto al TNF-α, el principal activador de macrófagos y célu-las NK. El efecto neto de IFN-γ es promover las reacciones inflamato-rias ricas en Th1 y macrófagos, por lo que altos niveles del mismo favo-recerían teóricamente una respuesta antitumoral.

Objetivos. Análisis de la frecuencia de los genotipos de IFN-γ aso-ciados con alta, media y baja producción de dicha citocina en pacien-tes con cáncer de mama.

Material y método. En un grupo de 96 pacientes y 94 controlessanos pertenecientes a la misma región geográfica, se analizó por PCR-SSP el punto polimórfico +874(A→T) del gen que codifica IFN-γ. Estepunto polimórfico da lugar a tres posibles genotipos: AA, AT y TT, aso-ciados con baja, media y alta producción de la citocina respectivamen-te. Los resultados se analizaron mediante una χ2 con corrección deYates, Odd Ratios (OR) con un 95% de intervalo de confianza. Se apli-có el Test exacto de Fisher en los casos en los que n ≤ 5.

Resultados. No se encontraron diferencias estadísticamente sig-nificativas entre los grupos para ninguno de los alelos analizados. Dadoque ha sido previamente descrita una asociación entre el alelo HLA-B7 y susceptibilidad a padecer cáncer de mama en nuestra área geo-gráfica, se analizó la distribución de frecuencias de los alelos de IFN-

γ en pacientes HLA-B7 frente a pacientes con cualquier otro alelo. Nose hallaron diferencias estadísticamente significativas.

Conclusión. En base a nuestros resultados, concluimos que nin-guna de las variantes alélicas del punto +874(A → T) de IFN-γ relacio-nadas con diferentes niveles de producción de la citocina se asociancon susceptibilidad o protección frente al cáncer de mama en nuestraárea geográfica.

34. DISTRIBUCIÓN DEL POLIMORFISMO DEL PRION P M129VEN PACIENTES DE ALZHEIMER. León VJ1, Cacho JL2, Rodri-guez Perez R2, Ortin A2. 1Serv. Analisis Clinicos. 2Serv. Neurología,Hospital Universitario de Salamanca.

Introducción. La Enfermedad de Alzheimer, EA, es un desordenneurodegenerativo que ha sido asociado con la presencia de depositosde proteinas anormales, los cuales pueden ser producidos por la conver-sion de la Proteina B Amiloide PrPC (PrionC) en una forma insoluble PrPSC. Los Priones estan localizados en la neurona preferentemente en lasvesiculas sinapticas así como en la membrana citoplasmatica. Presen-tan radicales a los que se ligan moleculas de Cobre, y juegan un papelesencial en el transporte transmembrana del cobre y en el mecanismoantioxidante celular. Esta establecido que algunas mutaciones del PrPSCausa algunas, raras, formas familiares de enfermedad de priones, sinembargo los heterozigotos del PrNPal polimorfismo Met 129 Val presen-tan un efecto protector ó al menos un mayor periodo de incuvación deciertas enfermedades neurodegenerativas. El proposito del presente estu-dio es relacionar la presencia de este polimorfismo en enfermos de EA.

Material y métodos. 44 pacientes de Alzheimer, de acuerdo conlos criterios de NINCDS-ADRDA, y 42 sujetos controls se incluyeronen nuestro estudio. Un fragmento de 775 bp del gen PrNP fué ampli-ficado empleando los primers (for: 5'-GTG GCC ACA TGG AGT GACCTG GGC CTC -3'; rev: 5'-GTG AAA CAG GAA GAC C -3'). PCR fueefectuada utilizando 10 ng de ADN genomico en 20 mcl de mezclade reacción. Las condiciones de la PCR fueron: 95ºdurante 5 min, 1ciclo; 95º 30 seg, 30º 30 seg, 72º 60 seg 34 ciclos, y 72º 10 min. El pro-ducto de la PCR fué digerido con el enzima de restricción NspI y reve-lado en geles de agarosa al 2%.

Resultados. La distribución alelica en el grupo control fué: 42%M/M, 45% M/V, 13% V/V. En pacientes de EM: 48% M/M, 42% M/V,10% V/V. No hemos encontrado diferencias entre el grupo control yenfermos de EA (El test Chi-square, p< 0,01).

35. MIF (MACROPHAGE MIGRATION INHIBITORY FACTOR):ESTUDIO DE ASOCIACIÓN CON ESCLEROSIS MÚLTIPLEEN POBLACIÓN ESPAÑOLA. Mas A, Heras V de la, BartoloméM, Arroyo R, Martínez A. Hospital Clínico San Carlos, Madrid.

Introducción. La citoquina MIF está implicada en la patogénesisde varias enfermedades autoinmunes. Nuestro objetivo consistió enanalizar el papel en la susceptibilidad a padecer Esclerosis Múltiple enla población española de dos polimorfismos funcionales situados enel promotor de MIF, el SNP -173G/C y el microsatélite (CAAT)n enla posición -794. El haplotipo de riesgo (CAAT)7/-173C se había yadescrito previamente asociado a otras enfermedades autoinmunes.

Pacientes y métodos. se realizó un estudio caso-control con 412pacientes españoles de Esclerosis Múltiple y 534 controles sanos dela misma población. El genotipado para el SNP -173G/C se efectuó

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mediante un ensayo TaqMan, mientras que para el microsatélite se pro-cedió a realizar una PCR con «primers» marcados con fluorescenciaseguida de electroforesis capilar. Los haplotipos presentes fueron esti-mados con el algoritmo de expectación-maximización.

Resultados. Los portadores del alelo -173C, del alelo (CAAT)7, odel haplotipo que contiene a ambos no evidenciaron una predisposiciónsignificativamente mayor a padecer Esclerosis Múltiple (p= 0,17, p= 0,16y p= 0,2, respectivamente). La estratificación de los enfermos atendien-do al factor de susceptibilidad HLA-DRB1*1501 mostró diferencias sig-nificativas al comparar los portadores del (CAAT)7 frente a los contro-les sanos (p= 0,05; OR= 1,53). Asimismo, el haplotipo de riesgo (CAAT)7/-173C se encontró significativamente elevado en los enfermos HLA-DRB1*1501 positivos frente a los controles (p= 0,046; OR= 1,54).

Conclusiones. La asociación de los polimorfismos del gen MIFencontrada en los enfermos HLA-DRB1*1501 positivos puede sugerirun papel de este gen en la patogénesis de la Esclerosis Múltiple, aun-que serán necesarios estudios adicionales para confirmar nuestros resul-tados en otras poblaciones.

36. DISTRIBUCION DE POLIMORFISMOS EN GENES DE CITO-KINAS EN PACIENTES DE ESCLEROSIS MULTIPLE. León VJ1,Cacho JL2, Bowakin D2, Sevillano MD2. Serv. Análisis Clínicos, 2Serv.Neurología. Hospital Universitario de Salamanca

Hemos estudiado 24 pacientes de Esclerosis Multiple, EM, de acuer-do con los criterios de POSER, y 28 sujetos control.

El ADN fue obtenido a partir de sangre entera, con el kit DNADirect II de Dynal, los polimorfismos fueron analizados empleando elkit Citokine genotiping Kit (Pel-freez).

Los polimorfismos hallados para el grupo control fueron:IL-1alpha/ - 889 (52.5 CC/40 CT/7.5 TT), IL-1beta/ -511 (40 CC/

45 CT/15 TT), IL-1beta/ 396 (60 CC/35CT/5 TT),IL-1RA/mspa 11100(5 CC/47.5 CT/47,5 TT), IL1R/psti 1970 (50 CC/40 CT/10 TT), IL-2/- 330 (15 GG/ 45 GT/40 TT), IL-2/ 166 (50 GG/40 GT/10 TT), IL-4/ -1098 (10 GG/ 27.5 GT/ 62,5 TT), IL-4/ - 590 (72.5 CC/25 CT/ 2,5 TT),IL-4/ - 33 (75 CC/20 CT/5 TT), IL-4R alpha/1902 (60 AA/35 AG/5GG), IL-6/ - 174 (20 CC/ 40CG/40 GG), IL-6/ 565 (12.5 AA/52,5 AG/35GG), IL-10/ - 592 (5 AA/45 AC/50 CC), IL-10/ - 819 (50 CC/40 CT/10TT) IL-10/ - 1082 (25 AA/50AG/25 GG), IL-12/ - 1188 (62.5 AA/32.5AC/5CC), IFN gamma/utr 5644 (32.5 AA/42,5 AT/25 TT), TNF alpha/- 238 (0 AA/2O AG/80 GG), TNF alpha/ - 308 (10 AA/25 AG/65 GG),TGF beta1/codon 10 (25 CC/50 CT/25 TT), TGF beta1/codon 25 (0CC/15 CG/85 GG)

Los polimorfismos para el grupo de pacientes EM IL-1alpha/ - 889(52.5 CC/40 CT/7.5 TT), IL-1beta/ -511 (35 CC/ 50 CT/15 TT), IL-1beta/ 3962 (55 CC/35CT/10 TT),IL-1RA/mspa 11100 (0CC/50 CT/50TT), IL1R/psti 1970 (45 CC/52.5 CT/7.5 TT), IL-2/ - 330 (15 GG/ 50GT/35 TT), IL-2/ 166 (55 GG/35 GT/10 TT), IL-4/ - 1098 (10 GG/ 22GT/ 70 TT), IL-4/ - 590 (75CC/25 CT/ 0 TT), IL-4/ - 33 (75 CC/20 CT/5TT), IL-4R alpha/1902 (75 AA/15 AG/10 GG), IL-6/ - 174 (15CC/45CG/40 GG), IL-6/ nt 565 (10 AA/50 AG/40 GG), IL-10/ - 592 (5AA/45 AC/50 CC), IL-10/ - 819 (55 CC/35 CT/10 TT) IL-10/ - 1082(20 AA/50AG/30 GG), IL-12/ - 1188 (60 AA/35 AC/5 CC), IFN gam-ma/utr 5644 (35 AA/40AT/25 TT), TNF alpha/ - 238 (0 AA/2O AG/80GG), TNF alpha/ - 308 (5 AA/30 AG/65 GG), TGF beta1/codon 10 (25CC/50 CT/25 TT), TGFbeta1/codon 25 (0 CC/10CG90 GG)

El test de Chi-Cuadrado no muestra diferencis significativas p<0,05, entre los polimorfismos del grupo control y EM.

37. POSIBLE ASOCIACION DE POLIMORFISMOS DEL PRIONP Y NIVELES DE COBRE SERICO. León VJ1, León JA2, GarciaJL3, Hernández Galante B1. 1Servicio de Análisis Clinicos. HospitalUniversitario de Salamanca. 2Laboratorio Pediatria e Inmunologia. Univde Valladolid. 3Centro Investigación del Cancer Salamanca.

Introducción. Los priones son receptores celulares que ha sido aso-ciados con la presencia de depositos de proteinas anormales, que pue-den ser producidos por la conversion de la Proteina B Amiloide PrPC(PrionC) en una forma insoluble agregada PrP SC que es neurotoxica.Los Priones estan localizados en la neurona preferentemente en las vesi-culas sinapticas así como en la membrana citoplasmatica. Presentan radi-cales a los que se ligan moleculas de Cobre, jugando un papel esencialen el transporte transmembrana del cobre y en el mecanismo antioxi-dante celular. Esta establecido que algunas mutaciones del PrPS Causaalgunas, raras, formas familiares de enfermedad de priones, sin embar-go los heterozigotos del PrNP al polimorfismo Met 129 Val presentanun efecto protector en ciertas enfermedades neurodegenerativas. El obje-tivo de nuestro estudio ha sido relacionar el polimorfsmo Met 129 Valdel PrNp y los niveles de cobre serico presentes en un grupo control.

Material y métodos. Se selecionaron 46 sujetos sanos, a los que sele extrajo ADN genómico mediante el kit Tripure (Roche). Mediante PCRse obtuvo un fragmento de 775 bp del gen PrNP amplificado con los pri-mers (for: 5'-GTG GCC ACA TGG AGT GAC CTG GGC CTC -3'; rev: 5'-GTG AAA CAG GAA GAC C -3'). La PCR fue efectuada empleando10 ng de ADN genomico en 20 mcl de mezcla de reacción. Las condicio-nes de la PCR fueron: 95ºdurante 5 min, 1 ciclo; 95º 30 seg, 30º 30 seg,72º 60 seg 34 ciclos, y 72º 10 min. El producto de la PCR fue digerido conel enzima de restricción NspI y revelado en geles de agarosa al 2%.

El cobre sérico fué medido mediante absorción atómica en un equi-po Shimadzu AA670.

Resultados. La distribución alelica en el grupo control fué: 42% M/M,45% M/V, 13% V/V. Estos resultados resultaron similares a otros efectua-dos en poblaciones caucasianas, No hemos hallado correlación entre elnivel de cobre serico y los polimorfismos Met 129 Val del gen PrNP.

38. ASOCIACION DE POLIMORFISMOS MBL-2 (MANNOSE-BINDING LECTIN 2) CON ENFERMEDAD CELIACA. Manza-nares B1, González RA1, Rodríguez-Reynoso MF2, Jiménez J2, Carri-llo J1, Sánchez-Ruiz F2, Santamaría M1, Peña J1. 1Servicio de Inmu-nología, Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba. 2Unidad Gastro-enterología Pediátrica, Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba.

Introducción. La lectina de unión a la manosa (MBL) representaactualmente una molécula de creciente interés debido a su papel en lainmunidad innata. La misma es codificada por el gen MBL2 (10q11.2-q21). Se han descrito 7 haplotipos principales: HYPA, LYPA, LXPA,LYQA, HYPD, LYPB, LYQC. La deficiencia de MBL incrementa la sus-ceptibilidad a infecciones y puede afectar el curso de enfermedadesautoinmunes como recientemente se ha publicado en el caso de artri-tis reumatoide y lupus eritematoso sistémico. Por tanto nos propusi-mos estudiar el polimorfismo del gen MBL-2 en EC, así como com-parar los EC y sus hermanos HLA idénticos.

Pacientes y métodos. Se han estudiado 50 familias de pacientesceliacos seguidos en la unidad de gastroenterología Pediátrica del Hos-pital Reina Sofía de Córdoba. Todas estas familias tenían al menos unhermano HLA idéntico. Se tipó a los miembros de la familia en los locusHLA-A, B, DRB1, DQA1 y DQB1 (INNOLIPA). Para el polimorfismo

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de MBL2 se utilizó un ensayo que permite la detección simultánea delas 6 variaciones más relevantes de este gen (INNOLIPA MBL-2).

Resultados. De los polimorfismos estudiados aquel que presentamayores diferencias entre la población de celiacos por una parte y loscontroles o hermanos HLA idénticos no enfermos por otra es en -221G>C observándose un 45,5%, 30% y 33,3% respectivamente. Tambiénhemos encontrado diferencias entre las familias de celiacos (enfermoso no) y controles en la presencia o no del haplotipo HYPA (WT) (52%en controles, frente a celiacos 41,8% y sus hermanos HLA idénticos 42%).El haplotipo más frecuente en celiacos y sus hermanos es LXPA, mien-tras que este haplotipo en controles es muy poco frecuente.

Conclusiones. Diferentes polimorfismos en el gen MBL permitediferenciar pacientes celiacos de sus hermanos sanos HLA idénticos,mientras que otros polimorfismos nos muestran un mayor riesgo deque algún miembro de la familia sea celiaco.

39. LA SUSCEPTIBILIDAD A LA DIABETES TIPO 1 CONFERIDAPOR EL POLIMORFISMO C1857T DEL GEN PTPN22 VARIACON EL SEXO Y LA EDAD DE DEBUT DE LA ENFERMEDAD.Santiago JL1, Calle H de la2, Figueredo MA1, Concha EG de la1.1Servicio de Inmunología Clínica, H. Clínico San Carlos, Madrid. 2Ser-vicio de Endocrinología, H. Ramón y Cajal. Madrid.

Introdución y objetivos. El gen PTPN22 (protein tyrosin phospha-tase N22) codifica para una fosfatasa específica de linfocitos en los queactúa como inhibidor de la activación de las células T lo que se tra-duce en una eliminación menos eficaz de los linfocitos autorreactivos.

El polimorfismo C1858T localizado en este gen se ha encontradoasociado en diferentes poblaciones a varias enfermedades autoinmu-nes incluida la diabetes tipo 1 (T1D). Se ha descrito que la actividadfosfatasa es mayor cuando el alelo 1858T esta presente, por lo que elpropósito de este estudio fue confirmar el papel de esta variante enla predisposición a la T1D por primera vez en población española.

Metodología. Realizamos un estudio caso-control con 316 enfer-mos diabético tipo 1 (157 hombres y 159 mujeres) y 554 controles sanostodos de la Comunidad de Madrid. La edad de debut varia entre 1 y55 años (media: 17,3 ± 10,0 y mediana: 15 años) siendo todos ellos insu-lino dependientes en el momento del estudio. Tanto en enfermos comoen controles se analizó el SNP PTPN22 C1858T (rs2476601) por sondasTaqMan mediante Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems,Foster City, CA, USA).

Las diferencias en frecuencias alélicas y genotípicas fueron cal-culadas por el estadístico Chi-cuadrado y las asociaciones fueron esti-madas mediante odds ratio (OR) con un intervalo de confianza del 95%(Epi Info v. 6.02 ,CDC, Atlanta, USA).

Resultados. Por primera vez en población española replicamos laasociación del alelo 1858T con el riesgo a sufrir T1D (OR= 1,73; p=0,004). Además, la distribución de este alelo fue diferente entre muje-res diabéticas y controles (OR= 2,06; p= 0,001) pero no entre hombresenfermos y controles (OR= 1,41, p= 0,16). Asimismo, una asociaciónsignificativa dependiente de sexo pudo establecerse después de estra-tificar por la edad. Fijamos el punto de corte en la mediana ya que endistribuciones asimétricas, como la edad de debut en T1D, es mejorestadístico de centralización que la media. Así encontramos que enpacientes jóvenes existían diferencias significativas entre mujeres yhombres enfermos (OR= 2,61; p= 0,022).

Conclusiones. Nuestros resultados parecen sugerir que el alelo1858T del gen PTPN22, implicado en la susceptibilidad a T1D, podría

jugar un papel diferente en mujeres y hombres diabéticos en las eta-pas más tempranas de debut de la enfermedad.

SESIÓN 3: CÉLULAS DENDRÍTICAS Y MACRÓFAGOS. PRESENTACIÓN ANTIGÉNICA. VACUNAS E INMUNOTERAPIA

Moderadores: Pedro Aparicio Alonso (Murcia), África González Fernández (Vigo)

40. EXPRESIÓN DE HLA-G POR LA CÉLULAS DECIDUALESDENTRÍTICAS HUMANAS. Tirado I, Muñoz-Fernández R, Blan-co O, Mata C de la, Leno E, Abadia-Molina AC, García OlivaresE. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular 3 e Inmunología,Facultad de Medicina, Universidad de Granada.

La decidua humana de primer trimestre contiene una poblaciónde células dentríticas (DC) mieloides inmaduras con un fenotipo:CD11c+ DC-SIGN+ CD14± CD83-. Esta población decrece en abortoespontáneo, al parecer, porque las DC emigran a los ganglios linfoideslocales para madurar y estimular a las Th. Las DC deciduales, por otraparte, forma complejos con la NK deciduales. No conocemos que fun-ción tienen estos complejos, pero el hecho de que las DC presenten cla-ros signos de apoptosis, sugiere que las NK deben desarrollar un pro-ceso de edición de las DC deciduales. El HLA-G, es un antígeno mono-mórfico, con una distribución muy restringida fundamentalmente limi-tada al trofoblasto. Aunque no está totalmente probado, existen evi-dencias que sugieren que este antígeno se une a los receptores inhibi-dores de las NK deciduales para inhibir la actividad citotóxica de estascélulas frente a trofoblasto. En el presente trabajo, hemos estudiadomediante citometría de flujo la expresión de HLA-G en las DC deci-duales de primer trimestre. Las DC han sido identificadas por la expre-sión de DC-SIGN. Hemos observado una proporción significativa deDC expresan HLA-G, lo que sugiere que mediante esta expresión lasDC controlan la actividad citotóxica que desarrollan las NK sobre ellas.

41. EL PAPEL DE LA HIPOXIA EN LA ACTIVACIÓN DE LOSMACRÓFAGOS. Acosta-Iborra A, Elorza A, Olazabal I, Martín-Puig S, Martín-Cofrades N, Sánchez-Madrid F, Landázuri MO.Hospital Universitario de la Princesa.

Los macrófagos son células mieloides que provienen de mono-citos circulantes que migran a los tejidos transformándose en macró-fagos residentes. Estos macrófagos constituyen la primera línea dedefensa frente a infecciones y juegan un papel muy importante en lainflamación. En estas áreas inflamadas hay una disminución de las ten-siones de oxígeno debido a la oclusión de los vasos sanguíneos y losmacrófagos residentes son capaces de responder rápidamente a estasvariaciones de oxígeno. En hipoxia los macrófagos responden activan-do un gran número de genes como VEGF, EPO, enzimas glicolíticas,etc. La expresión de estos genes, en hipoxia, está controlada, a nivel detranscripción, por el Factor de transcripción Inducible por Hipoxia(HIF). HIF es un heterodímero a/b que se expresa de manera consti-tutiva. En presencia de oxígeno la subunidad HIF-a va a ser hidroxi-lada, en 2 residuos de prolina, por las prolil-hidroxilasas (PHDs) lo quepermite que sea reconocida por Von Hi ppel Lindau (VHL) marcando

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a la subunidad HIF-a para su degradación vía proteosoma. En ausen-cia de oxígeno las PHDs no pueden hidroxilar a la subunidad HIF-a,por lo que se estabiliza, viaja al núcleo, heterodimeriza con la subu-nidad HIF-a, y se unen a los Elementos de Respuesta a Hipoxia (HRE)controlando la expresión de los genes ya mencionados.

En el presente trabajo se estudia como la hipoxia regula funcionesbásicas de los macrófagos como son la fagocitosis y la presentaciónantigénica a linfocitos T.

42. PAPEL DE LA HIPOXIA EN EL FOCO INFLAMATORIO. Elor-za A, Olazabal I, Acosta-Iborra B, Martín-Puig S, Martín-Cofra-des N, Sánchez-Madrid F, Landázuri MO. Hospital Universitario dela Princesa.

En un proceso inflamatorio el tejido responde con una serie decambios metabólicos, uno de los más importantes es el debido a la dis-minución de la tensión de oxígeno (hipoxia), que es debida a la inte-rrupción del flujo sanguíneo local; mientras que en un tejido sano latensión de oxígeno está generalmente comprendida entre 2.5 y 9% deO2 (20 y 70 mmHg), en un tejido dañado se pueden formar áreas tran-sitorias o crónicas de hipoxia, en las cuales se alcancen tensiones deO2 de menos del 1% (10 mmHg). Los macrófagos tienen que actuar enestos sitios hipóxicos, donde son capaces de funcionar mediante la alte-ración de su expresión génica, mediada por la up-regulación del fac-tor de transcripción inducible por hipoxia, HIF, y la adaptación consi-guiente de su actividad metabólica a este ambiente adverso. HIF es unheterodímero a/b que se expresa de manera constitutiva. En presen-cia de oxígeno la subunidad HIF-a va a ser hidroxilada, en 2 residuosde prolina, por las prolil-hidroxilasas (PHDs) lo que permite que seareconocida por Von Hippel Lindau (VHL) marcando a la subunidadHIF-a para su degradación vía proteosoma. En ausencia de oxígenolas PHDs no pueden hidroxilar a la subunidad HIF-a, por lo que seestabiliza, viaja al núcleo, heterodimeriza con la subunidad HIF-b, yse unen a los Elementos de Respuesta a Hipoxia (HRE) controlando laexpresión de los genes ya como EPO, VEGF, enzimas glicolíticas.

En el presente trabajo hemos estudiado como la hipoxia puederegular a los macrófagos en la expresión de marcadores de superficieimplicados en su activación, y en procesos como la fagocitosis y la pre-sentación antigénica.

43. DETERMINACIÓN DE LOS VALORES ABSOLUTOS DE LOSSUBTIPOS DE CÉLULAS DENDRÍTICAS EN SANGRE PERI-FÉRICA DE INDIVIDUOS SANOS. Pérez-Cabezas B, Naranjo-Gómez M, Fernández MA, Grífols JR, Pujol-Borrell R, Borràs FE.Laboratori d'Immunobiologia i Diagnòstic Molecular (LIRAD). Banc deSang i Teixits (BST). Dept. de Biologia Cel.lular, Fisiologia i Immuno-logia. Universitat Autònoma de Barcelona. Institut Investigació Ger-mans Trias i Pujol. 08916. Badalona (Barcelona).

Las células dendríticas (DC) desempeñan funciones fundamenta-les para la respuesta inmmune, tanto en su componente innato comoadaptativo. En sangre periférica pueden identificarse dos subtiposmayoritarios de DCs, denominados DC convencionales (cDC) y DCplasmacitoides (pDC). En diversas situaciones patológicas, así comoen el envejecimiento, los valores absolutos de estas subpoblacionespueden verse modificados y su capacidad funcional alterada. En estetrabajo se han determinado, mediante citometría de flujo, los valores

absolutos de las subpoblaciones de DCs en donantes de sangre de unrango de edad comprendido entre los 18 y 65 años. Los valores obte-nidos indican, como dato destacable y en concordancia con observa-ciones previas, una disminución significativa de la subpoblación pDCcon la edad, mientras que la subpoblación cDC no muestra modifica-ciones significativas. Los resultados de este estudio pueden conside-rarse como valores de referencia para las determinaciones analíticasque incluyan el análisis cuantitativo de las DCs en sangre periférica.

44. LA ESTIMULACIÓN CON IL-12+IL-18 INDUCE A LA PRO-DUCCIÓN DE IFN-GAMMA EN MACRÓFAGOS. Darwich L,Coma G, Peña R, Bofill M. Institut de Recerca de la SIDA- Funda-ció IrsiCaixa. Hospital Germans Trias i Pujol. Badalona.

Existe cierta controversia acerca de la acción autocrina de la IL-12y IL-18 en células del linaje mieloide, y en concreto en monocitos ymacrófagos. El objetivo de este estudio ha sido determinar la pro-ducción in vitro de IFN-gamma en cultivos de monocitos, monocitosmadurados a macrófagos y monocitos diferenciados en dendríticas,que han estado co-estimulados con IL-12 + IL-18, mediante las técni-cas de ELISPOT y ELISA.

A partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de5 voluntarios sanos se realizó una separación positiva de monocitosmediante anticuerpo anti-CD14 y de células CD4+, obteniendo unaspurezas superiores al 95% y 98% respectivamente. Por un lado se pro-cedió a la estimulación de monocitos no diferenciados con IL12 + IL18a fin de realizar una cinética de producción de IFN-gamma que abar-caba de 24h a 144 horas de cultivo, obteniéndose lecturas cada 24h.Como controles positivos se utilizaron CMSP y células CD4+ a dife-rentes concentraciones. No se observó producción de IFN-gamma enlos monocitos durante ese periodo de co-estimulación, por ninguna delas dos técnicas. Por otro lado se cultivaron monocitos aislados en pre-sencia del factor de estimulación de colonias de macrógagos (M-CSF)o en presencia del factor estimulador de colonias de granulocitos ymacrófagos (GM-CSF,) más IL-4, durante 7 días para diferenciar losmonocitos a macrófagos o a células dendríticas, respectivamente. Alcabo de una semana se lavaron los cultivos, se añadió IL-12 e IL-18 yse midió la producción de IFN gamma a las 72h. A diferencia de loscultivos de monocitos inmaduros que no son capaces de producir IFN-gamma bajo la estimulación continua de IL-12+IL-18, los monocitosdiferenciados a macrófagos producen elevados niveles de IFN-gam-ma en las mismas condiciones de cultivo. Las células dendríticas deri-vadas de monocitos producen IFN gamma pero en menor cantidad.

Conclusión. Los macrófagos pero no los monocitos producen IFN-gamma en presencia de IL-12 y IL-18 confirmando la función auto-crina del IL-12 e IL-18 en células mieloides.

45. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DEISOFORMAS DE «SPLICING» Y VARIANTES POLIMÓRFI-CAS DE DC-SIGN: IMPACTO DEL DOMINIO DEL «CUELLO»EN LA MULTIMERIZACIÓN Y RECONOCIMIENTO DEPATÓGENOS. Sierra-Filardi E, Serrano-Gómez D, Martínez-Nuñez R, Caparrós E, Muñóz-Fernández MA, Corbí AL. Centrode Investigaciones Biológicas (CSIC).

DC-SIGN es una lectina tipo C que se expresa en células dendrí-ticas mieloides (DC) y en algunas subpoblaciones de macrófagos. DC-

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SIGN reconoce estructuras glicosiladas en la superficie de un grannúmero de patógenos (HIV, Mycobacterium, HCV), participa en la for-mación de la sinapsis inmunológica al interaccionar con ICAM-3 delos linfocitos T vírgenes, interviene en la migración transendotelial deDCs al unirse a ICAM-2 en el endotelio, y facilita la interacción entreDCs y neutrófilos al reconocer la integrina CD11b/CD18.

DC-SIGN presenta una región formada por ocho repeticiones de23 aminoácidos («cuello»), que posibilita la multimerización de la lec-tina y lo que conlleva un aumento de la avidez de DC-SIGN por susligandos. Se ha descrito la existencia de isoformas generadas median-te «splicing» alternativo y variantes polimórficas a nivel genómico quedifieren en el número estas repeticiones, lo que podría afectar a suscapacidad de reconocimiento de patógenos.

En este trabajo se demuestra que las isoformas generadas median-te «splicing» alternativo se expresan en células dendríticas derivadasde monocitos tanto a nivel de RNA como a nivel proteico, que la mul-timerización de DC-SIGN en la membrana depende del dominio lec-tina, y que es inhibida por la glicosilación del «cuello». Estas varian-tes, aún presentando diferente grado de multimerización en la mem-brana, mantienen su capacidad de reconocer patógenos. Parece, portanto, que la agrupación de moléculas de DC-SIGN inducida por lospatógenos es suficiente para incrementar la avidez de estas isoformaspor sus ligandos.

Por otro lado, se identifican variantes polimórficas de DC-SIGNque sólo poseen siete dominios repetidos de la región del «cuello». Suanálisis estructural muestra que no tienen alterada la capacidad demultimerización y revela la existencia de hetero-oligómeros entre lasvariantes y la forma de ocho repeticiones. Además, estudios funciona-les sugieren que su capacidad de reconocimiento de patógenos es simi-lar a la de la forma prototípica de DC-SIGN.

En definitiva, estos resultados ayudarán a determinar las basesmoleculares de la asociación entre las variantes polimórficas de DC-SIGN y la susceptibilidad alterada a infecciones virales (HIV, Dengue)y bacterianas (Mycobaterium tuberculosis).

46. MODULACIÓN DE LAS ACTIVIDADES FUNCIONALES DECÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS POR BACTERIAS PRO-BIÓTICAS. Aragoneses-Fenoll L, Dominguez-Soto A, Jimenez E,Rodríguez JM, Corbí AL. Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC).

Los probióticos se definen como «microorganismos vivos cuyaingestión en número adecuado ejerce efectos beneficiosos para la saludque van más allá de sus efectos nutritivos». De hecho, ciertos probió-ticos son capaces de modular la respuesta inmunitaria. Tomando comobase este hecho, nuestra hipótesis es que el efecto inmunomoduladorde los probióticos tiene su origen en su acción sobre las células den-dríticas, esenciales para la inmunidad innata y para la iniciación y regu-lación de la respuesta adaptativa.

Con el objeto de clarificar los mecanismos de la actividad inmu-nomoduladora de probióticos hemos llevado a cabo ensayos de uniónde diferentes cepas de bacterias probióticas a células dendríticas huma-nas derivadas de monocitos (MDDC), y hemos determinado su capa-cidad de inducir maduración fenotípica y funcional, evaluando ade-más la posible inducción de citoquinas polarizadoras (IL-12p70, IL-10).

Nuestros resultados indican que todas las cepas ensayadas (L. reu-teri, L. casei, B. lactis, Lb. gasseri, L. rhamnosus) son capaces de unirse aMDDC de manera Ca2+- y DC-SIGN independiente. Sin embargo, las

diversas cepas difieren en su capacidad inducir maduración fenotí-pica (aumento de moléculas coestimuladoras, CD83 y CD86, disminu-ción de la lectina DC-SIGN) y funcional (producción de IL-10). Lacto-bacillus gasseri ha resultado ser la bacteria que induce una maduraciónmás potente, y Lactobacillus reuteri es la única capaz de inducir acti-vación de NF-κB vía TLR-2. Por este motivo hemos seleccionado ambascepas para llevar a cabo estudios sobre los cambios de expresión géni-ca inducidos en MDDC por bacterias probióticas. Los resultados obte-nidos serán presentados y se discutirá la posible implicación de losgenes identificados en la generación de respuestas inmunitarias tipoTh1 y Treg.

47. COGNATE INTERACTION BETWEEN T- AND ACTIVATEDB- CELLS INDUCE AN INCREASED RELEASE OF FUNCTIO-NAL MHC-II ON B CELL EXOSOMES. Muntasell A, Roche P.Experimental Immunology Branch, National Institutes of Health, USA.

Exosomes are membrane microvesicles released by haematopoieticcells in an exocytic manner. Recently, dendritic cell derived exosomesraised a great deal of interest with the demonstration of their potentimmunostimulatory functions in tumor models. Although exosomesare currently used as therapeutic tools to stimulate immune responsesagainst solid tumors in phase II clinical trials, little is known abouttheir physiological role. To study the role of APC-derived exosomes inantigen presentation to CD4 T cells, we characterized the origin, function,and the regulated secretion of pMHC-II on B cell exosomes. We foundthat activated spleen B cells release 10% of specific peptide-MHC-IIcomplexes (pMHC-II) on exosomes every day. Analysis assessing thetrafficking pathway followed by MHC II molecules showed thatexosomes mostly concentrate pMHC-II that had been previouslyexpressed on the surface of the donor cells. While these exosomes wereunable to activate naïve CD4 T cells, they very efficiently inducedproliferation of and cytokine secretion by primed CD4 T cells. Interestingly,we found that cognate interactions between T and B cells induce anincreased release of pMHC-II bearing B cell-exosomes. This regulatedsecretion of exosomes from the B cell is an active mechanism that couldsimilarly be triggered upon specific pMHC-II cross-linking. Based onthese results we propose that T cell-induced secretion of pMHC-II onB cell exosomes is a mechanism that allows antigenic pMHC-II complexesto escape from degradation in the donor APC. This secreted «burst» ofexosomes could act in vivo as an spatial expansion of the APC surfaceto increase antigen availability for the surrounding additional T cells.

48. EL ÁCIDO RETINOICO INCREMENTA EL EFECTO TOLERO-GÉNICO DE LA VITAMINA D3 SOBRE CÉLULAS DENDRÍ-TICAS DERIVADAS DE MONOCITOS. Atencia R, Arrieta A,Riñón M, Prada A, Maruri N. Hospital de Cruces.

Uno de los campos emergentes en la inmunología del siglo XXI esel que estudia las posibilidades de manipulación de las células dendrí-ticas para obtener fenotipos capaces de inducir lo que se conoce comotolerancia inmunológica. Entre ellas, la acción in vitro de la vitaminaD3 es uno de los mejor documentados.

Nuestro trabajo valora las posibilidades de potenciar el efecto tole-rogénico de la vitamina D3 sobre las células dendríticas mediante sucombinación con moléculas de la familia de los retinoides, como el áci-do retinoico, de las que se conoce su capacidad de establecer sinergis-

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mos en otros modelos experimentales de diferenciación celular. Paraello, se han realizado cultivos de células dendríticas en presencia deVitamina D3, 9-cis ácido retinoico y bexaroteno así como de combina-ciones de Vitamina D3 y uno de estos retinoides, valorando su influen-cia sobre el proceso de maduración de las células dendríticas deriva-das de monocitos mediante el.

Los resultados del análisis del fenotipo de superficie nos permi-ten confirmar de forma preliminar nuestra hipótesis de que existe unefecto aditivo sobre la maduración de las células dendríticas deriva-das de monocitos cuando se combinan agonistas de los RxR y Vitami-na D3 y que este efecto se manifiesta en una mayor inhibición de laexpresión de moléculas coestimuladoras si se comparan con los resul-tados de los cultivos tratados sólo con Vitamina D3 análisis del feno-tipo de superficie por citometría de flujo. Los ensayos funcionales (cul-tivos mixtos, producción de IL-12) han proporcionado resultados ini-ciales que apuntan en la misma dirección.

La obtención mediante tratamientos in vitro de células dendríticascon capacidad tolerogénica proporcionaría una herramienta terapéuti-ca aplicable en distintas patologías (autoinmunidad, trasplante...).

49. EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES DEL METABOLISMODEL HIERRO EN LA ACTIVACIÓN CLÁSICA Y ALTERNATI-VA DE MACRÓFAGOS. Burgui I, Sierra-Filardi E, Puig-KrögerA, Corbí AL. Centro de Investigaciones Biológicas.

La correcta activación de macrófagos ante diferentes situacionespatológicas, como el ataque por agentes patógenos o el desarrollo detumores, determina el éxito de la resolución de dichas patologías. Así,es posible clasificar la activación de macrófagos como clásica (indu-cida por citoquinas de tipo Th1, lo que favorece una función microbi-cida o tumoricida) o alternativa (inducida por citoquinas de tipo Th2,promoviendo la eliminación de parásitos). Además de los diferentesfenotipos según la activación, existen distintos tipos de macrófagos enestado basal. Con objeto de identificar genes con un papel fundamen-tal en las distintas clases de macrófagos hemos analizado los perfilesde expresión génica de macrófagos en estado basal (obtenidos en pre-sencia de GM-CSF o M-CSF) y activados por la vía clásica o alternati-va (en presencia de IFNγ o IL-4 respectivamente). Entre ellos, cabe des-tacar la expresión diferencial de genes implicados en el metabolismodel hierro, como la enzima hemo oxigenasa-1 (HO-1) o CD163. Losestudios efectuados hasta el momento indican que esta ruta condicio-na las funciones efectoras y el fenotipo de macrófagos tras su activa-ción.

50. ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS T MEDIANTE CÉLULASDENDRÍTICAS PULSADAS CON PÉPTIDOS DERIVADOSDE LA PROTEÍNA P53. Marcos I, Visús C, Martínez-Lorenzo MJ,Godino J, Mayordomo JI, Tres A, DeLeo A. Instituto Aragones deCiencias de la Salud y Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa-Zara-goza.

Diversos estudios han demostrado que la mayoría de pacientescon cáncer no logra generar una respuesta inmune eficaz, capaz deimpedir el crecimiento del tumor. Estos resultados se han corrobora-do en modelos animales observándose que cuando los antígenos sonpresentados al sistema inmune por las propias células tumorales segenera una respuesta inmune ineficaz. Por el contrario, si son pre-

sentados por células presentadoras de antígenos profesionales, comoes el caso de las células dendríticas, se genera una reacción eficaz.

La inmunización con células dendríticas preincubadas con antí-genos tumorales reconocidos por linfocitos T no sólo ha inducido pro-tección frente a una posterior inyección de tumor sino que ha induci-do la regresión de tumores establecidos en modelos animales. Este pro-yecto pretende determinar la capacidad funcional de las células den-dríticas obtenidas a partir de precursores hematopoyéticos para pre-sentar antígenos tumorales a linfocitos T.

El gen p53 es un gen supresor de tumores por lo cual desempeñaun importante papel en la apoptosis y control del ciclo celular. Diver-sos estudios han demostrado que la degradación de esta proteína enel proteosoma del citoplasma da lugar a péptidos altamente inmuno-génicos. Los trabajos que se están desarrollando en la actualidad estándirigidos hacia la presentación de dichos péptidos a los linfocitos T.Algunos autores han descrito que la modificación de algunos amino-ácidos de esos péptidos (aquellos asociados a la unión o reconocimien-to por parte de los linfocitos T) podrían mejorar la respuesta inmune.

El objetivo de este trabajo fue valorar la eficacia de las células den-dríticas para presentar diversos péptidos tumorales derivados de laproteína p53, así como la respuesta que generan los linfocitos T unavez que han sido estimulados por dichas células dendríticas.

Para desarrollar el trabajo se utilizaron células dendríticas culti-vadas a partir de monocitos obtenidos de aféresis realizadas a pacien-tes sanos y posteriormente estimulados en presencia de IL-4 y GM-CSF. Se realizaron cocultivos de estas células dendríticas, previamen-te pulsadas con el péptido p53 wt149-157 y otros dos derivados de este(T150L Phospho y T150L), con linfocitos T. La activación celular se ana-lizó mediante ELISPOT cuantificando la presencia de células secreto-ras de IFN-γ y granzima B.

En los resultados obtenidos referentes a los valores de células secre-toras de IFN-γ en los ensayos de ELISPOT realizados se observó unamayor activación con el péptido salvaje (p53-wt) y con el T150L Phos-po frente al péptido T150L.

Cuando se analizaron mediante ensayos de ELISPOT, el númerode células que producían granzima-B, no se observaron diferencias sig-nificativas en la activación celular comparando los tres tipos de pép-tidos utilizados.

51. AUMENTOS EN EL NÚMERO ABSOLUTO DE CÉLULASDENDRÍTICAS MIELOIDES Y DISMINUCIÓN DE PLASMA-CITOIDES EN PACIENTES CON LEUCEMIA LINFÁTICACRÓNICA DE CÉLULAS B (LLC-B). Sánchez MA1, Villarroel M1,Hernández A1, Mur S1, Barcenilla H1, Díaz D1, Prieto A1, Reyes E1,Monserrat J1, Sanroman IL3, Alvarez-Mon M1,2. 1Unidad I+D aso-ciada UAH/CNB-CSIC,IMMPA. Dpto. Medicina. UAH. 2Ser. de enfer-medades del sist. inmune y oncología.HUPA.Alcalá de Henares. 3Serv.de hematologia del Hospital Universitario de Guadalajara.

Introducción. Las células dendríticas (DCs) de sangre periféricacomprenden diferentes subtipos que están involucrados en la induc-ción de la respuesta inmune frente a tumores. Se ha comprobado comolas células dendríticas están afectadas en pacientes con enfermedadesautoinmunes y enfermedades degenerativas crónicas. En los pacien-tes con leucemia linfática crónica (LLC-B) se desconocen las alteracio-nes que puedan existir en las células dendríticas.

Objetivo. Definir las alteraciones en las cifras sanguíneas de las célu-las dendríticas en los pacientes con leucemia linfática crónica (LLC-B).

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Materiales y métodos. Se obtuvieron muestras de sangre periféri-ca de varios pacientes de LLC-B y controles sanos. El estudio fenotípi-co fue realizado mediante citometría de flujo de 4 colores utilizando elkit de enumeración de células dendríticas de MiltenylBiotec-MACS®.Las células dendríticas de sangre periférica fueron marcadas con anti-cuerpos monoclonales anti-BDCA 1 (mieloides tipo 1), anti-BDCA 2 (plas-macitoides) y anti-BDCA 3 (mieloides tipo 2) en poblaciones CD19-CD14-EMA- (excluyendo a linfocitos B, monocitos y células no viables).

Resultados. En los pacientes con LLC-B se observaron aumentossignificativos en el número absoluto de células dendríticas mieloidesde tipo 1 (BDCA 1+) y tipo 2 (BDCA 3+) con respecto de los controlessanos. La magnitud de estos incrementos fue del 46% para las célulasdendríticas mieloides de tipo 1 y del 34% para las células dendríticasmieloides tipo 2. Por otra parte se observo una disminución signifi-cativa en el número absoluto de las células dendríticas plasmacitoides(BDCA 2+) que fue un 33% inferior al encontrado en los controles sanos.

Conclusión. La leucemia linfática crónica de células B no solo secaracteriza por alteraciones en el número de células B y una alteraciónde la funcionalidad de sus linfocitos T sino que además presentanaumentos en el número absoluto de células dendríticas mieloides yuna disminución de las plasmacitoides.

52. VECTORIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICASA TRAVÉS DE CÉLULAS DENDRÍTICAS Y SU UTILIZACIÓNEN HIPERTERMIA MAGNÉTICA PARA TERAPIA ONCOLÓ-GICA. Sáez-Gutiérrez B1, Marcos Campos I1, Asín L1, TabuencaPérez P1, Mayordomo Cámara JI1, Goya, GF2, Ibarra R2, Tres Sán-chez A1. 1Servicio de Oncología Médica, Hospital Clínico Unive. 2Serviciode Oncología Medica. Hospital Clínico Universitario «Lozano Blesa».

El objetivo central de este trabajo es el estudio de la viabilidad de lautilización de Células Dendríticas (CDs) marcadas con Nanopartículas(NPs) magnéticas, como vectores de material magnético para la aplica-ción de Hipertermia Magnética (MHT) en modelos tumorales animales.El proceso para lograr este objetivo es intrínsicamente multidisciplinare incluye diversos desafíos específicos de cada área, a saber:

1. El diseño e ingenieria de NPs biocompatibles funcionalizadaspara una máxima eficiencia en la generación de calor por MHT.

2. .El desarrollo de protocolos eficientes y altamente repetitivos decultivo y marcaje de CDs con NPs biocompatibles.

3. La determinación del papel de las células tumorales en la induc-ción de características de células endoteliales en las CDs cultivadas in vitro.

4. Verificar la incorporación de las CDs marcadas con NPs a losvasos tumorales mediante técnicas histológicas y magnetométricas.

5. Estudiar la dinámica de destruccion de la vasculatura tumoralcon la aplicación de campos magneticos (MHT).

Las células a ser utilizadas serán obtenidas a partir de cocultivosde células tumorales y CDs (en la misma placa separadas por una mem-brana permeable) en condiciones de cultivo que favorecen la diferen-ciación de células mielomonocíticas a CDs. Una vez diferenciasdas,estudiaremos en estas últimas la expresión de marcadores caracterís-ticos de células endoteliales (VEGFR-2, vWF, VE-caderina) por citome-tría de flujo y «western blot». Estas CDs, marcadas con nanopartícu-las magnéticas, serán inyectadas en un modelo murino de melanomadonde se estudiará su papel en la vascularización del tumor por RMN,magnetometría e Histología. Finalmente se realizarán experiencias exvivo e in vivo para determinar la eficiencia de la tecnica MHT en la des-truccion de la vasculatura tumoral en el modelo animal desarrollado.

53. LA ADMINISTRACIÓN COMBINADA DE LOS ADYUVAN-TES POLY(I:C) Y ANTI-CD40 Y DE UN ANTÍGENO INDUCEPOTENTES EFECTOS PROFILÁCTICOS Y TERAPÉUTICOSANTITUMORALES. Llopiz D, Dotor J, Zabaleta A, Lasarte JJ,Prieto J, Borrás-Cuesta F, Sarobe P. Centro de Investigación Médi-ca Aplicada, Pamplona.

La escasa inmunogenicidad de las células tumorales es una de lasprincipales causas de la ausencia de respuestas inmunitarias antitu-morales. Uno de los principales retos de la inmunoterapia frente al cán-cer se centra en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas quemejoren la presentación de antígenos tumorales a los linfocitos T. Coneste objetivo analizamos la eficacia de la administración de los adyu-vantes poly I:C y un anticuerpo agonista anti-CD40 junto con un antí-geno tumoral. La administración intravenosa simultánea de estos adyu-vantes y de ovoalbúmina (OVA), considerada como antígeno tumoralen el timoma de ratón EG7.OVA, generó una respuesta de linfocitos Tpotente y duradera, que protegió a corto y largo plazo frente al creci-miento tumoral. En un contexto terapéutico, la administración intra-tumoral repetida de los adyuvantes y OVA permitió la remisión com-pleta de tumores establecidos en un 100% de los animales. Del mismomodo, la administración intratumoral e intravenosa de los adyuvan-tes y OVA indujo la remisión de los tumores tratados y de tumores con-tralaterales no tratados. Los linfocitos T fueron en todos los casos res-ponsables del efecto terapéutico y profiláctico inducido por estos pro-tocolos. En conclusión, la administración de los adyuvantes poly I:Cy anti-CD40 y de un antígeno tumoral podría ser una estrategia eficazde inmunoterapia antitumoral.

54. POSIBLES APLICACIONES TERAPÉUTICAS DEL ANTICUER-PO MONOCLONAL HUMANO ANTI- CD69 (HAIM-29). DíazFreitas B, Valladares M, Magadán S, Sancho D, Sánchez-MadridF, González-Fernández A. Universidad de Vigo.

La glicoproteina CD69 es una molécula de activación temprana(AIM) de los linfocitos, de las células Natural Killer y de los eosinó-filos activados. Aunque se desconoce su ligando, CD69 está impli-cada en el incremento de calcio intracelular, en la liberación de cito-cinas y en la proliferación celular. Actualmente, se relaciona a la molé-cula CD69 con una amplia variedad de enfermedades de origen infla-matorio y/o autoinmune, (Artritis Reumatoide, Hepatitis Vírica Cró-nica, Lupus Eritematoso, Diabetes Mellitus Insulina Dependiente).Nuestro grupo generó un anticuerpo monoclonal (mAb) completa-mente humano (hAIM-29) de isotipo IgM/l, que reconoce específica-mente a la molécula CD69 humana. Este mAb fue obtenido a partirde ratones transgénicos portadores de genes para las cadenas pesa-da μ y ligeras κ y λ de las inmunoglobulinas humanas. El mAb hAIM-29, al tratarse de una inmunoglobulina completamente humana, podríaser un posible agente terapéutico de gran interés en enfermedadesdonde existe activación leucocitaria o una alta expresión de este mar-cador, ya que no tendría las restricciones (inmunogenicidad) que pre-sentan algunos de los anticuerpos murinos que se emplean en tera-pia. Para evaluar si el mAb hAIM-29 tiene potencial terapéutico, ana-lizamos por citometría de flujo muestras de líquido sinovial de pacien-tes diagnosticados con Artritis Reumatoide. Nuestro anticuerpo escapaz de reconocer específicamente a células inflamatorias CD69+del líquido sinovial de los pacientes, y en presencia de complemen-to, es capaz de provocar la lisis celular de las células que poseen en

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su membrana está molécula de activación. Datos obtenidos con san-gre periférica muestran que el anticuerpo no reconoce a células mono-nucleares en ausencia de activación, pero hAIM-29 tiñe células acti-vadas en presencia de éster de forbol, y las lisa en presencia de com-plemento. Nuestros resultados indican que el anticuerpo hAIM29podría ser útil para el tratamiento de pacientes con Artritis Reuma-toide y otras enfermedades donde estuviesen implicadas célulasCD69+.

55. LAS CÉLULAS NK ESTIMULADAS CON IL-15 Y CPG ODNA, POTENCIAN LA CITOTOXICIDAD CELULAR ANTI-LIN-FOMA B MEDIADA POR RITUXIMAB. Moga E, Álvarez E, Can-tó E, Vidal S, Rodríguez-Sánchez JL, Sierra J, Briones J. Hospitalde la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona.

Introducción. La citotoxicidad celular dependiente de anticuer-pos (ADCC) es uno de los principales mecanismos de acción del Ritu-ximab (Ac monoclonal anti-CD20) frente al linfoma B. Las células NK,a través de receptores estimuladores FcγRIIIa, juegan un papel funda-mental en la ADCC mediada por Rituximab. Hemos estudiado el papelque juegan moléculas activadoras de células NK, como la IL-15, y deoligodesoxinucleótidos con secuencias CpG (ODN A), en la ADCCinducida por el Rituximab en el linfoma B.

Material y métodos. La ADCC se analizó mediante estudios deliberación de 51Cr. Para ello se utilizaron como células efectoras célu-las mononucleares de sangre periférica (PBMC), células NK purifica-das y PBMCs depleccionadas de células NK, obtenidas de donantessanos, que fueron cultivadas durante 18 horas con IL-15 (10 ng/ml) oCpG ODN A (5 μg/ml). Tras esta incubación, las células efectoras seco-cultivaron, durante 4 horas, con células de linfoma B (línea celularRaji, CD20+) marcadas con 51Cr en presencia de Rituximab (10 μg/ml)o IgG1 control (10 μg/ml). Tras este tiempo se detectó la liberaciónde 51Cr en el sobrenadante del co-cultivo. Los resultados de la ADCCse valoraron a partir del porcentaje de lisis obtenido de ratios diferen-tes. Dada la contribución del polimorfismo del receptor FcγRIIIa enla ADCC se genotiparon, mediante PCR alelo-específica y digestiónenzimática, las células mononucleadas de los donantes para la muta-ción FcγRIIIa-158V-F.

Resultados. Las PBMCs activadas con IL-15 o con ODN A poten-ciaron significativamente la ADCC de las células de linfoma B tra-tadas con Rituximab. Así, la ADCC de PBMCs activadas con IL-15se incrementó el doble respecto a la ADCC de PBMCs no activadas(73% ± 7% vs 37% ± 4% lisis respectivamente) (media ± DE) (p< 0,001).Y por otro lado, cuando se comparó la ADCC de PBMCs estimula-das con ODN control vs ODN A el incremento fue del 36% ± 8% al61% ± 11% respectivamente (p= 0,02). Células NK purificadas mos-traron un incremento de la ADCC cuando su estímulo fue la IL-15pero no con ODN A. Sin embargo, con ambos estímulos las célulasNK fueron la población efectora más importante, ya que PBMCsdepleccionadas de estas células y posteriormente activadas no mos-traron ADCC. Este incremento de la ADCC se observó tanto con célu-las efectoras homocigotas (FcγRIIIa-V/V) como con heterocigotas(FcγRIIIa-V/F).

Conclusión. La adición de IL-15 o ODN A incrementa la citoto-xicidad mediada por el Rituximab frente a células de linfoma B. Estosdatos tienen implicaciones clínicas en el tratamiento del linfoma B, yaque su utilización como adyuvantes en combinación con el Rituximabpodría aumentar su efecto terapéutico.

56. HLA-G COMO MARCADOR ESPECÍFICO DE EVOLUCIÓNDE LAS CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICASCD34/CD133 Y DE LAS CÉLULAS DENDRÍTICAS DE COR-DÓN UMBILICAL. Martinez-Laso J1, Peñaloza J2, Vidart J2,Herrainz MA2, Picazo JJ3, Román A1, Head J1, Rodriguez M1, Rodrí-guez-Avial I3, Jordá J4. 1Unidad de Inmunoterapia Celular. CentroNacional de Microbiología. Instituto de Salud Carlos III. 2Servicio deGinecología y Obstetricia. Hospital Clínico de San Carlos. 3Servicio deMicrobiología

La expresión de HLA-G se testó en las distintas subpoblacionesCD34/CD133 de células madre hematopoyéticas y en las células den-dríticas de sangre de cordón umbilical. Se midió la expresión en super-ficie celular e intracelularmente por citofluorometría de flujo y se obtu-vo la presencia de transcritos por RT-PCR con primers específicos. Losresultados mostraron la presencia de HLA-G tanto en superficie comointracelular en las subpoblaciones de células madre hematopoyéticasy en las células dendríticas. El análisis de los diferentes marcadorespresentes en las células madre mostró una correlación absoluta de lapresencia de CD1a (marcador de células dendríticas inmaduras) conHLA-G. Por otra parte, se obtuvieron resultados similares cuando setestó este marcador en las células dendríticas de cordón umbilical y enlas generadas a partir de células CD34 positivas. La isoforma G1 sedetectó en todos los casos estudiados y sólo en unos pocos apareció laisoforma G5. Estos datos difieren de los obtenidos para este tipo decélulas en sangre periférica de adulto donde sólo se consiguió unaexpresión parcial en superficie y una secreción limitada de la formasoluble en las células dendríticas derivadas de las CD34 positivas. Estosresultados demuestran que estos tipos de células presentan un com-portamiento diferente si se considera la sangre de cordón umbilical yla de sangre periférica. Estos datos concuerdan con los resultados dife-renciales de los trasplantes de células progenitoras dependiendo de suorigen (cordón umbilical, medula ósea y sangre periférica). Por lo tan-to, se puede afirmar que HLA-G estaría implicado en el proceso dediferenciación de las células madre hematopoyéticas hacia las célulasdendríticas y su influencia en el comportamiento inmunológico de losprogenitores de cordón umbilical.

57. FARMACOCINÉTICA Y FARMACODINÁMICA DE INMU-NOTOXINAS DIRIGIDAS CONTRA LA ENDOGLINA ENRATONES. Ferreras JM, Citores L, Iglesias R, San Miguel A, Gir-bés T. Universidad de Valladolid.

En los últimos años se han desarrollado terapias antiangiogénicasy antiangiostáticas para el tratamiento de tumores(1). Uno de los agen-tes antiangiogénicos utilizados son los anticuerpos monoclonales diri-gidos contra antígenos de la neovasculatura(2). Entre ellos están los anti-cuerpos dirigidos contra la endoglina (CD105), que se sobreexpresa enla neovasculatura y que es un marcador tumoral(2). Para potenciar elefecto antiangiogénico del anticuerpo hemos ligado covalentementelas RIPs (proteínas inactivadoras de ribosomas) de tipo 2 no tóxicasebulina l y nigrina b(3) con el anticuerpo MJ7 (antiendoglina de ratón).Los conjugados obtenidos (immunotoxinas) son citotóxicos para lascélulas B16MEL4A5 (melanoma de ratón) que expresan la endoglina.Con el fin de utilizar estas inmunotoxinas en modelos de ratones contumores, se las hemos inyectado por vía intravenosa a ratones controly hemos determinado sus principales parámetros farmacocinéticos yfarmacodinámicos.

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Los resultados obtenidos indican que la inmunotoxina preparadacon la nigrina b es más estable que la inmunotoxina preparada conebulina l mientras que ambas presentan una toxicidad similar. Por lotanto la inmunotoxina preparada con la nigrina b es un candidato mejorpara llevar a cabo los estudios sobre los efectos de esta inmunotoxinaen tumores desarrollados en ratones.

Bibliografía1. Folkman J. (2006) Annu Rev Med. 57: 1-18.2. Benitez J, Ferreras JM, Munoz R, Arias Y, Iglesias R, Cordoba-Diaz

M, del Villar R, Girbes T. (2005) Med Chem. 1: 65-70.3. Girbes T, Ferreras JM, Arias FJ, Stirpe F. (2004) Mini Rev Med Chem.

4: 461-476.

58. RESPUESTA NY-ESO-1 ESPECÍFICA EN CÉLULAS CD8 Y CD4DE RATONES TRANSGÉNICOS INMUNIZADOS CON LEN-TIVIRUS. Casado JG, Colombetti S, Dojcinovic D, Luescher I,Lévy F. Ludwig Institute for Cancer Research, Lausanne Branch, Uni-versity of Lausanne, Epalinges, Switzerland. Departmento de Fisiología,Área de Inmunología, Facultad de Veterinaria, Universidad de Extrema-dura, Cáceres.

Los vectores lentivirales poseen la capacidad de infectar célulasdendríticas que permiten la expresión estable de un gen y el desarro-llo de una repuesta in vivo CD8 cuantitativa y cualitativamente supe-rior. En este trabajo hemos analizado la respuesta inmune en ratonesHLA-A2 transgénicos inmunizados con lentivectores de tercera gene-ración que codifican para la proteína NY-ESO-1. La inmunización sub-cutánea con lentivectores disparó una respuesta de células CD8+ NY-ESO-1 (157-165) específicas mayor que la obtenida después de la inmu-nización con péptidos NY-ESO-1 (157-165). Las células CD8+ NY-ESO-1 (157-165) específicas mostraron un fenotipo efector/memoria(CD127pos, CD62Lneg) mientras que el análisis por citometría delrepertorio de TCRs demostró un uso predominante de las cadenas Vbe-ta4 y Vbeta6. Por otro lado, para analizar la respuesta CD4 hemos inmu-nizado ratones dobles transgénicos HLA-A2/HLA-DR4 con el lenti-vector que codifica para NY-ESO-1. La respuesta CD4 se monitorizóutilizando tetrámeros HLA-DR4 específicos para la región 87-101 y119-143 y cuantificando la producción de IFN-gamma. Finalmente, lainmunización de ratones transgénicos con el lentivector que codificapara la proteína NY-ESO-1 estimuló una respuesta CD8 frente a otrosepítopos inmunodominantes que será identificados.

En conclusión, la vacunación con vectores lentivirales que codi-fican para el gen NY-ESO-1 es una herramienta para estimular in vivouna respuesta específica en células CD4 y CD8.

59. TLR4-MEDIATED SURVIVAL OF MACROPHAGES IS MYD88-DEPENDENT AND REQUIRES TNF-α AUTOCRINE SIGNA-LLING. Knaus U, Alvarez-Barrientos A, Maroto B, Boscá L, Lom-bardo E. Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC).Madrid.

Modulation of macrophage survival is a critical factor in the resolutionof inflammatory responses. Exposure to LPS protects innate immunecells against apoptosis, although the precise pathways responsible forprolongation of macrophage survival remain to be fully established. Thegoal of this study was to characterize the mechanism of TLR4-mediatedsurvival of murine bone marrow derived macrophages upon M-CSF

withdrawal in more detail. Using a combination of knockout mice andpharmacological inhibitors allowed us to show that TLR4 and TLR2stimulation promotes long-term survival of macrophages in a MyD88,PI3K, ERK and NF-κB-dependent manner. LPS-induced long-term, butnot short-term, survival requires autocrine signalling via TNF-α and isfacilitated by a general cytoprotective program, similar to that mediatedby M-CSF. TLR4-mediated macrophage survival is accompanied by aremarkable upregulation of specific cell surface markers, suggestingthat LPS stimulation leads to the differentiation of macrophages towardsa mixed «macrophage/dendritic cell-like» phenotype.

60. RELEVANCIA DEL CONTEXTO VIRAL Y DIVERSIDAD DEVÍAS DE PROCESAMIENTO ANTIGÉNICO PARA EPÍTOPOSCTL DE LA PROTEÍNA F DEL VIRUS RESPIRATORIO SIN-CITIAL. Johnstone C, Guil S, Rico MA, García-Barreno B, LópezD, Melero JA, Val M del. Unidades de Inmunología Viral, Proteómicay Biología Viral, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de SaludCarlos III. Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, CSIC-UAM.

Se ha estudiado en diferentes contextos virales el procesamiento anti-génico de los epítopos de la proteína F del virus respiratorio sincitial (VRS)F85-93 y F249-258 presentados a linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) porla molécula de MHC de clase I murina Kd. El epítopo F85-93 es presen-tado por una vía clásica endógena dependiente de los transportadoresasociados al procesamiento de antígeno (TAP) cuando la proteína F seexpresa en el contexto de VRS o de virus vaccinia recombinante (rVV).Al menos en células infectadas con rVV codificando la proteína F nativao citosólica se requiere el proteasoma para el procesamiento del epítopo.En células infectadas con un rVV que codifica la proteína F nativa, exis-te una vía adicional independiente de TAP para F85-93. Por el contrario,el epítopo F249-258 es presentado únicamente por vías independientesde TAP, siendo la presentación sensible a brefeldina A (BFA) cuando laproteína F está en el contexto natural de VRS, o fundamentalmente resis-tente a BFA cuando la proteína está codificada en rVV. Por lo tanto, iden-tificamos vías de procesamiento antigénico con diferentes mecanismosy localizaciones subcelulares, que son accesibles a epítopos presenta-dos por la misma molécula de MHC de clase I y procesados a partir dela misma proteína pero en diferentes contextos virales. Estos resultadossubrayan tanto la diversidad de vías disponibles como la influencia dela infección del virus en la presentación de epítopos a CTL.

SESIÓN 4: INMUNIDAD E INFECCIONES.INMUNORREGULACIÓN

Moderadores: Javier Martín Ibáñez (Granada), Alfredo Minguela Puras (Murcia)

61. DIFERENCIAS EN LTCD4+CD28+, LTCD8+CD28+ Y CÉLULASNK EN PACIENTES ADVP CON INFECCION POR HIV/HCVVS INFECCION POR HCV+. Cianchetta Sivori M, Garcia R, Para-visini A, Raso S, Llorente P, Gorgolas M, Fernandez-Guerrero M.Fundación Jimenez Díaz. Servicio de Inmunología. Madrid.

Introducción. En el presente trabajo se estudian los diferentes fac-tores de la respuesta inmune en pacientes monoinfectados HCV o coin-fectados HIV/HCV, incluyendo las células NK de la inmunidad inna-

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ta y los valores de LTCD4+CD28+ y LTCD8+CD28+ como células res-ponsables de la citotoxicidad y cooperación en la inmunidad.

Método. Fueron incluidos 88 pacientes, ADVP: 21 HIV/HCV coin-fectados, 27 HCV monoinfectados, 20 HIV monoinfectados y 20 con-troles HIV-/HCV-.

Se determinaron, en sangre periférica, los valores de LTCD4+CD28+, CD8+CD28+ y células NK (CD3-CD56+26+) por citome-tría de flujo (citómetro FacsCalibur BD). La carga viral de HIV y HCVfue determinada por amplicor Cobas Ultrasensible y PCR en tiemporeal Taqman, respectivamente.

Resultados. En los LTCD4+, la proporción de la expresión deCD28+ decreció significativamente junto con los niveles de LTCD4+en pacientes HIV+ monoinfectados y en pacientes coinfectados(HIV/HCV). Se encontró una disminución de LTCD4+CD28+ enpacientes HIV+ monoinfectados en comparación con pacientes HCV+monoinfectados (63,95 ± 29% versus 89,39 ± 6% p= 0,0002) y con pacien-tes coinfectados (HIV/HCV) (63,95± 29% versus 78,42 ± 16% p= 0,05).

El porcentaje de LTCD8+ en pacientes coinfectados estaba incre-mentado, y se mantuvo dentro de los parámetros normales en los pacien-tes HCV monoinfectados. Sin embargo los LTCD8+CD28+ estaban dis-minuidos en pacientes coinfectados (HIV/HCV) en comparación conlos pacientes HCV+ (49,65 ± 13% versus 67,08 ± 10% p< 0,001). Las célu-las NK se mantuvieron dentro de la normalidad en los cuatro grupos.

Conclusiones. El precursor de células citotóxicas (CD8CD28) estádisminuido en los pacientes coinfectados (HIV/HCV) en comparacióncon los pacientes HCV monoinfectados. Este resultado revela que la res-puesta del sistema inmune esta más afectada en pacientes coinfectados(HIV/HCV) que en pacientes monoinfectados HCV, posiblemente refle-jando la influencia de la infección HIV sobre la respuesta de LTCD8+especifica de HCV. Esto podría contribuir a explicar porque los pacien-tes coinfectados no son capaces de controlar la infección por HCV, per-mitiendo una progresión más rápida de la enfermedad hepática.

62. EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DE ALOPURINOLSOBRE LA EXPRESIÓN CLÍNICA DE LA ENFERMEDAD DEBEHCET Y MARCADORES DE ACTIVACIÓN INMUNE.INFORME DE UN CASO. Figueroa-Vega N, Arriaga J, GaliciaO, Martínez-Morales F, Abud-Mendoza C, Gonzalez-Amaro R.Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina, UASLP.

La enfermedad de Behcet (EB) es una condición inflamatoria convasculitis sistémica, alteraciones inmunes y con opciones terapéuticasdiversas. El alopurinol es un inhibidor de la xantina oxidasa que poseeun importante efecto anti-oxidante y que por lo tanto puede tener unpotencial efecto antiinflamatorio. Se reporta el estudio de una pacien-te con EB que recibió terapia adyuvante con alopurinol y en la que seregistró su evolución clínica y de diversos parámetros inmunes. Antesde la terapia con alopurinol, la paciente tenía una EB de 7 años de evo-lución caracterizada por lesiones ulcerosas orales y faríngeas inten-samente dolorosas e incapacitantes, úlceras genitales, fiebre y der-matosis acneiforme aislada pero diseminada, así como una pobre res-puesta a la terapia convencional. Posterior a la administración de alo-purinol (300 mg/día por una semana), la paciente presentó una mejo-ría clínica notable, con desaparición de todas las lesiones cutáneas yde mucosas y un notable descenso en la escala análoga visual de dolor(8 a 0). Se encontró además un descenso significativo en marcadoresde inflamación (velocidad de sedimentación globular, proteína C reac-tiva), así como una disminución importante en el estallido respirato-

rio de neutrófilos y la expresión de CD11b (integrina alfa M beta 2).Por otra parte, también se detectó una disminución en los niveles delinfocitos CD4+CTLA-4+ y un aumento de linfocitos Ts (CD8+CD28–)y de células CD4+ productoras de TGF-beta e IL-10. Además se encon-tró una disminución de la expresión de CD69 posterior a la activaciónde células mononucleares con PMA y de ICAM-1, CD11b y CD11c encélulas sin estimular. Por último, se detectó un incremento en la pro-ducción de TNF-alfa por monocitos. Posteriormente, se suspendió laadministración de alopurinol y se inició terapia con colchicina; unasemana después, reaparecieron las lesiones cutáneas y de mucosas yla escala análoga visual de dolor se incrementó de 0 a 4. Los resulta-dos de este caso sugieren que el alopurinol tiene un potencial terapéu-tico en la EB y que ejerce diferentes efectos sobre el proceso inflama-torio y el sistema inmune.

63. ESTUDIO MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO DE CITO-QUINAS EN RESPUESTA AL STRESS QUIRÚRGICO EN DOSTÉCNICAS ANALGÉSICAS. Jurado Roger A2, Rodríguez Mora-les R1, Martínez Fernández E, Santana Pineda M, Rodríguez Huer-tas F. 1Servicio de Anestesiología y Reanimación. Hospital del SAS deJerez FRA. Cádiz. 2Servicio de Laboratorio. Hospital Infanta Margaritade Cabra. Córdoba.

Introducción. La cirugía produce un trauma tisular inevitable ycon ello una reacción inflamatoria cuya misión es atraer defensas celu-lares. La lesión tisular provoca la liberación de potentes mediadoresde la inflamación y el dolor. Por su parte, los anestésicos pueden modi-ficar la función inmunitaria, tanto al reducir la respuesta al estrés, comoal ejercer efectos directos sobre las células inmunológicas.

Objetivo. El propósito de este estudio es analizar los cambios pro-ducidos en diferentes momentos del intra y postoperatorio, en pacien-tes sometidas a histerectomía, introduciendo como variable dos técni-cas analgésicas de uso habitual. Para ello se midió el cortisol, la PCR,citoquinas proinflamatorias (IL-1B, IL-6, IL-8, TNF e IL-12) y antinfla-matorias (IL-10).

Materiales y métodos. Estudio clínico randomizado y prospecti-vo a doble ciego en pacientes sometidas a histerectomía abdominalbajo anestesia general balanceada. Las pacientes (n=29) fueron dividi-das en dos grupos de forma aleatoria; en uno de ellos se realizó anal-gesia con remifentanilo en perfusión y rescate analgésico con morfinay AINEs; en el otro se efectuó analgesia con fentanilo a demanda segúnvalores hemodinámicos. Se recolectó sangre venosa periférica en esta-do basal, en el momento de la incisión quirúrgica, y en la 1ª, 4ª y 24ªhoras del postoperatorio. El cortisol se determinó mediante quimiolu-miniscencia (Nichols Advantage Chemiluminescence Cortisol Immu-noassay). La PCR se determinó mediante Inmunoturbidimetría (Roche).La determinación de citoquinas se realizó mediante Citometría de flu-jo en un ensayo tipo CBA (Cytometric bead array) para la detección decitoquinas anti y proinflamatorias (Becton Dickinson). El CBA empleauna mezcla de partículas revestidas de anticuerpos para capturar ana-litos solubles como las citoquinas. Cada tipo de partícula estará reves-tida de un anticuerpo de captura dirigido contra una citoquina deter-minada y tiene la capacidad de emitir una intensidad de fluorescenciaespecífica que se detecta en Fl3. La unión de la citoquina soluble a lapartícula se pone de manifiesto con un segundo anticuerpo marcadocon ficoeritrina que se detecta en Fl2. La concentración del analito secalcula mediante el uso de una curva con estándares conocidos. El CBApermite detectar citoquinas a concentraciones entre 20 y 5.000 pg/ml.

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Análisis estadístico: Las diferencias entre los dos grupos se eva-luaron mediante la prueba U de Mann-Whitney para datos indepen-dientes. Asimismo se realizaron comparaciones de las variables en losdiferentes momentos del intra y postoperatorio mediante la prueba derangos de Friedman.

Resultados:• Ambos grupos de pacientes resultaron comparables tanto en los

datos epidemiológicos como en los clínicos (quirúrgicos y anesté-sicos) (TablaI).

Tabla I. Datos epidemiológicos y clínicos

Grupo Fentanilo Grupo Remifentanilo Promedio ± DE Promedio ± DE

Número de pacientes 15 14Edad (años) 51,1 ± 13,4 48,6 ± 11,3Peso (kg) 72,1 ± 24,2 72,9 ± 21,3Duración de la cirugía (min) 77 ± 26 84 ± 29Duración de la anestesia (min) 92 ± 30 96 ± 28

• No se encontraron diferencias significativas entre ambos gruposde pacientes en las Citoquinas estudiadas, ni en los valores de PCRy de Cortisol. Los resultados de los diferentes parámetros estudia-dos se resumen en la Tabla II.

Tabla II. Resultados

Basal Incisión 1ª hora 4ª hora 24 horas

IL-10 pg/ml Rp 2,89(0,4) 2,26(0,3) 2,43(0,5) 15,27*(2,1) 7,56*(1,6)Fb 2,08(0,5) 2,28(0,4) 1,90(0,4) 16,68*(2,8) 7,49*(1,8)

IL-6 pg/ml Rp 4,46(1,2) 3,62(1,3) 4,68(1,9) 105,52*(21,2) 67,82*(14,5)Fb 4,47(1,3) 4,92(1,4) 5,87(1,8) 108,94*(22,7) 51,58*(17,8)

Prot.Cr mg/dl Rp 0,77(0,3) 0,458(0,4) 0,734(0,4) 0,603(0,4) 8,01*(1,7)Fb 1,13(0,3) 0,968(0,5) 0,83(0,5) 0,815(0,4) 8,775*(1,5)

Cortisol µg/dl Rp 14,506(2,4) 10,12(2,2) 22,624*(5,1) 36,707*(6,8) 18,935(4,2)Fb 14,84(2,9) 12,527(2,7) 26,224*(6,7) 38,823*(8,9) 16,128(4,5)

Abreviaturas: Rp: Remifentanilo en perfusión; Fb: Fentanilo en bolos. P< 0,05 (Rp vs Fb); Valo-res: Media (Desviación Standard). *Diferencias significativas respecto a los niveles basales.

• La IL-6 e IL-10 mostraron cambios estadísticamente significativosanalizando la cinética de cada parámetro en los diferentes tiem-pos del estudio, observándose un pico máximo de producciónen la cuarta hora (Figs. 1 y 2).

• Los valores de PCR mostraron un valor máximo (estadísticamen-te significativo) en la muestra de 24 horas con respecto a la basal(Fig. 3).

• El cortisol presenta un aumento progresivo que es estadística-mente significativo en la 1ª y 4ª hora, y un descenso posterior(Fig. 4).

Conclusiones. En nuestro estudio no se han encontrado diferen-cias en la respuesta al estrés quirúrgico (valorada mediante el análisisde citoquinas pro y anti-inflamatorias, cortisol y PCR) entre estas dostécnicas analgésicas.

64. ¿INFLUYE EL GRADO DE INFLAMACIÓN EN EL FENOTIPODE CÉLULAS T REGULADORAS EN PACIENTES CONARTRITIS REUMATOIDE? Pérez-García V, Peris-Pertusa A,Marín-Alberca G, Navarro-Blasco FJ, Romero-Sánchez J, Sempe-re-Ortells JM. División de Inmunología del departamento de Biotecno-logía de la Universidad de Alicante.

Introducción. Las células T reguladoras (Treg) tienen un papelimportante en el mantenimiento de la autoinmunidad fisiológica yen la prevención de las enfermedades autoinmunes. Su función regu-ladora parece estar mediada por contacto directo célula-célula omediante la liberación de citocinas, pudiendo inhibir las respuestasTh1 y Th2.

Objetivos. Pretendemos caracterizar los diferentes fenotiposde Treg en pacientes con Artritis Reumatoide (AR), tratando de iden-tificar posibles marcadores que puedan ser considerados típicos deesta enfermedad y/o estar ligados a los brotes o a los periodos deremisión.

Métodos. Se han incluido 28 pacientes tratados y los hemos clasi-ficado según el estado de activación de la AR, empleando el «DiseaseActivity Score» (DAS 28). De estos pacientes, 15 estaban en remisión(DAS 28 ≤ 3,2), 9 con una actividad de la enfermedad moderada (3,2 <DAS 28 ≤ 5,1) y 4 con enfermedad muy activa (DAS 28 > 5,1). La mayo-ría de estos pacientes fueron tratados con Metrotexate (dosis bajas) y/o

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Figura 1. IL-6. Resultados.

Figura 2. IL-10. Resultados.

Figura 3. PCR. Resultados.

Figura 4. Cortisol. Resultados.


anticuerpos anti-TNF. Como controles sanos, analizamos 26 indivi-duos. Se analizó la expresión de los antígenos de membrana CD28,CD38, CD45RBlow, CD62L, CD134, CD152 y CD154 en células CD4+de sangre periférica, con o sin coexpresión de CD25 intermedia/alta(CD4CD25) o solamente alta (CD4CD25HD), por inmunofluorescen-cia directa de tres colores con anticuerpos monoclonales (Becton Dic-kinson) y citometría de flujo (EPICS-XL, Coulter).

Resultados. Los datos preliminares indican que los pacientes pre-sentan porcentajes más bajos para CD4/CD25 (p< 0,001),CD4/CD25HD (p< 0,001), CD4/CD28 (p= 0,007), CD4/CD38 (p= 0,009),CD4/CD62L (p= 0,004), CD4/CD25/CD28 (p= 0,01) y más altos paraCD4/CD45RBlow (p= 0,005), CD4/CD25/CD152 (p= 0,004),CD4/CD25HD/CD62L (p= 0,01) y CD4/CD25HD/CD152 (p< 0,0001).Según los diferentes grupos de DAS 28, los pacientes muy activos mos-traron, frente a los que estaban inactivos, un aumento significativo deCD152 (p= 0,05) en la población CD4/CD25 y CD4/CD25HD, con ten-dencia al aumento de expresión de CD62L y disminución de expresiónde CD28. No observamos correlaciones significativas con los nivelesen plasma de Proteína C Reactiva y factor reumatoide.

Conclusiones. Nuestros resultados sugieren que la disminuciónen el porcentaje de células CD4CD25 Treg en la sangre de pacientescon AR, se compensaría con un aumento de expresión de antígenosrelacionados con respuestas inhibitorias y un posible aumento de otraspoblaciones con carácter inmunorregulador (CD4+CD45RBlow), a finde controlar la inflamación. El grado de inflamación de los pacientes(según DAS 28) parece influir en los distintos niveles de expresión dealgunos antígenos de membrana en la población CD4CD25HD Treg,siendo mayor la expresión de CD152 y CD62L y menor la de CD28, enlos pacientes más activos (DAS 28 > 5.1).

65. LAS CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES PROTEGEN DELA APOPTOSIS A LAS CÉLULAS T. Blanco O, Tirado-Gonzá-lez I, Muñoz-Fernández R, Mata C de la, Leno E, Abadia-Moli-na AC, Garcia Olivares E, Ruiz-Ruiz MC. Departamento de Bioquí-mica y Biología Molecular e Inmunología.

Las células deciduales estromales (DSC) son células característi-cas de la decidua y representan el principal componente celular deeste tejido. Las DSC desarrollan actividades inmunitarias que podrí-an estar relacionadas con los mecanismos de tolerancia meterno-fetal.Uno de estos mecanismos de tolerancia en la interfase materno-fetalse basa en la expresión de CD95L por el trofoblasto, lo que determi-na la inducción de apoptosis en los linfocitos maternos. Hemos obser-vado por citometría de flujo que las DSC expresan CD95 y CD95L,aunque estas células presentan resistencia a la inducción de apopto-sis, medida mediante ciclo celular con citometría de flujo, utilizandoel anticuerpo anti-Fas CH-11c y TRAIL. Estas dos últimas moléculasprovocan, no obstante, apoptosis en las células Jurkat. En contactocon las DSC, se produjo una protección de la apoptosis inducida encélulas Jurkat. Esta protección se indujo tanto con DSC indiferencia-das como en DSC diferenciadas mediante progesterona. Los meca-nismos de protección se debieron a contacto célula-célula (DSC-Jur-kat), y no dependió de la liberación de moléculas protectoras por lasDSC, ya que no encontramos ese efecto protector en el sobrenadan-te de DSC, pero sí cuando utilizamos estas células tratadas con para-formaldehído. Esta actividad protectora de las DSC es probablemen-te reflejo de la función estromal que desarrollan estas células en ladecidua.

66. EL EFECTO PROTECTOR DEL TACROLIMUS Y DEL SIROLI-MUS EN UN MODELO DE LESIÓN POR REPERFUSIÓNHEPÁTICA SE ACOMPAÑA DE UNA DISMINUCIÓN DELBALANCE TH1/TH2 Y DE UN INCREMENTO EN CD4+CD25+.Arias-Díaz J, Ildefonso JA, Jiménez E, Muñoz JJ, Zuloaga J, Bali-brea J, Zapata A. Departamento Cirugía y Dpto. Biología Celular, Uni-versidad Complutense, Madrid.

Introducción. El fenómeno de isquemia-reperfusión (I-R) es elprincipal responsable de la lesión hepática resultante del trasplantehepático y estados de shock. La recuperación tras I-R hepática depen-de tanto del grado de lesión inicial como de la capacidad regenerati-va de los hepatocitos restantes. Resultados recientes asignan un papelcentral a los linfocitos T en la patogénesis de dicha lesión, así comocapacidad para modificar la regeneración hepática. Por otro lado, sedesconoce en gran medida la influencia del tacrolimus y del sirolimus,fármacos utilizados como inmunosupresores en el trasplante hepáti-co, sobre las subpoblaciones linfocitarias en el hígado sometido a I-R.

Objetivo. Estudiar el efecto del tacrolimus y del sirolimus sobreun modelo de I-R hepática, analizando las modificaciones resultan-tes en las subpoblaciones linfocitarias intrahepáticas.

Métodos. Ratas Wistar macho se asignaron aleatoriamente a 3grupos experimentales: grupo 1 (intervención simulada), grupo 2(hepatectomía) y grupo 3 (I-R). La I-R consistió en la oclusión duran-te 60 min. de la arteria hepática y la vena porta derechas (lóbulo late-ral derecho), seguido del desclampaje y extirpación de los lóbulosmedio y lateral izquierdo. Todos los animales recibieron tacrolimus(6 mg/kg), sirolimus (2 mg/kg) o bien placebo 60 min. antes de laintervención. A las 2 y 24 h se sacrificaron las ratas obteniendo mues-tras de sangre, hígado y ganglio submandibular. Se realizó un análi-sis citofluorimétrico de linfocitos aislados de hígado y ganglio. Asi-mismo, sobre criosecciones de hígado, se llevaron a cabo inmunode-tecciones de distintos marcadores celulares y de laminina. Tambiénse usó anticuerpo anti-Ki-67 para determinar la regeneración hepá-tica, mientras que la apoptosis se cuantificó mediante TUNEL. Losresultados se presentan como las medias (±SEM). Las comp aracio-nes se hicieron mediante ANOVA y el análisis de supervivenciamediante Kaplan-Meier.

Resultados. Ambos fármacos redujeron la mortalidad, así comola LDH plasmática, el grado de lesión histológica hepática, la apop-tosis y la infiltración por PMN (HIS48) y linfocitos T, todas ellas incre-mentadas a las 2 h en el grupo 3, aunque no modificaron el aumentode infiltración por monocitos-macrófagos (ED1). El sirolimus tambiénantagonizó el incremento en células NK. El tacrolimus produjo un incre-mento de núcleos Ki-67+ en los grupos 2 y 3, mientras que el sirolimusmostró un efecto opuesto. En los hígados del grupo 3 se observó unaumento a las 2 h en el cociente Th1 (CD45RC high) / Th2 (CD45RClow), efecto que fue antagonizado por ambos fármacos (0,11 ± 0,01,tacrolimus, 0,08 ± 0,01x, sirolimus, vs 0,24 ± 0,03, control, p< 0,001,ambos), los cuales produjeron también un aumento progresivo en laproporción de linfocitos T CD25+ entre los CD4+ en el hígado de losgrupos 2 y 3 (20,3 ± 2,6, tacrolimus, 26,2 ± 3,4, sirolimus, vs 8,4 ± 1,1,control, grupo 3 a 24 h, p< 0,05 y p< 0,01, respectivamente), mante-niéndose dicho efecto hasta las 24 h. Estas modificaciones no fueronobservadas en el ganglio.

Conclusión. Tanto el tacrolimus como el sirolimus muestran unefecto protector frente a la lesión por reperfusión hepática. Dicho efec-to se acompaña de una disminución a corto plazo en el balance Th1/Th2y un aumento progresivo en linfocitos T CD4+CD25+.

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67. PATRÓN DE EXPRESIÓN DE CD28 EN CÉLULAS T CD8+ ENPACIENTES CON MONOINFECCIÓN POR VIH Y VHC YCOINFECCIÓN POR VIH/VHC. Paravisini A, Cianchetta M,Raso S, Llorente P, Gorgolas M, Garcia R, Fernandez-Guerrero M.Fundación Jiménez Díaz.

Introducción. Los pacientes coinfectados VIH/VHC presentanuna más rápida evolución a cirrosis. La coexistencia de ambos virusen un mismo individuo crea complejas interacciones, cambiando lahistoria natural de ambas infecciones. De forma independiente se haobservado una disminución en la expresión de CD28 en las células TCD8+ en sangre periférica de individuos infectados por VIH y porVHC. En este estudio hemos determinado el patrón de expresión deCD28 sobre linfocitos T CD8+ en pacientes monoinfectados por VIHy HCV y en pacientes coinfectados VIH/VHC.

Métodos. 88 pacientes ADVP: 21 pacientes coinfectados VIH/VHC,27 pacientes monoinfectados VHC, 20 pacientes monoinfectados VIH,y 20 pacientes control VIH-VHC-. Ninguno de ellos con tratamientoprevio. Se determino la expresión de CD28 en linfocitos T CD8+ desangre periférica por FacsCalibur citometria de flujo. Los resultadosse expresan como media ± 1SD.

Resultados. El porcentaje de CD28- en linfocitos T CD8+ esta dis-minuido en la coinfección VIH/VHC en comparación con los pacien-te VIH (52,1 ± 15,6 vs 82,9 ± 15,6 p= <0,0001) y aumentado en compa-ración con los pacientes VHC (52,1 ± 15,6 vs 35,05 ± 12,87 p= <0,0001).Por el contrario la media de expresión CD28- en linfocitos T CD8+ enpacientes VIH-VHC- fue 38.0±13.64.

Conclusiones. La coinfección VIH/VHC disminuye el porcenta-je de expresión de CD28 en los linfocitos T CD8+. Por otra parte, laexpresión de CD28 en los pacientes VHC+ fue similar a la descrita enlos pacientes control. Este resultado sugiere un efecto dominante delVIH en los pacientes coinfectados en comparación con aquellos monoin-fectados por el VHC.

68. INHIBICIÓN DE FOSFODIESTERASA 7 EN LINFOCITOS T.González C, Hernández J, Gil C, Castaño T, Bravo B, Jérez MJ, KeH, Ballester S. Instituto de Salud Carlos III.

La actividad enzimática de las fosfodiesterasas (PDEs) consiste enla degradación de nucleótidos cíclicos (AMPc y GMPc). La inhibi-ción de estas PDEs impide esta reacción, permitiendo que AMPc yGMPc actúen en la célula como segundos mensajeros. Algunos inhi-bidores de PDE poseen un potente efecto antiinflamatorio, siendo losinhibidores de PDE4 (como el Rolipram) los más caracterizados. Sinembargo, los efectos secundarios de los inhibidores de PDE4 disponi-bles han llevado a la búsqueda de inhibidores específicos de otras PDEscomo la PDE7, o de inhibidores duales de PDE4 y PDE7 que presen-ten menores efectos negativos. Actualmente existen escasos inhibi-dores selectivos de PDE7 y su eficacia biológica no ha sido bien carac-terizada. Por ello, hemos iniciado un estudio sobre compuestos de nue-va síntesis para su análisis en cuanto a actividad de inhibición de PDE7y posibles efectos biológicos. Los derivados del sistema de benzotia-diazina habían mostrado interesantes actividades como inhibidores dePDE7, aunque sin conseguirse actividades específicas eficaces. Por tan-to, se ha llevado a cabo la síntesis de nuevos análogos derivados detioxoquinazolinona con diferentes sustituyentes en su estructura.

Han sido determinadas las actividades inhibitorias sobre PDE7 deestos nuevos compuestos y, en base a ellas, se han seleccionado aque-

llos que presentan menores IC50. Los ensayos de toxicidad de estosinhibidores frente a linfocitos T, fueron realizados en el clon D10.G4.1mediante la técnica de citometría de flujo utilizando Ioduro de Propi-dio. Los resultados obtenidos en estos ensayos han permitido descar-tar los compuestos más tóxicos. La determinación de los niveles deAMPc intracelular en linfocitos T tratados con estos inhibidores ha mos-trado que la inhibición de PDE7 no produce altos niveles de AMPc, peroes capaz de sinergizar con el efecto producido por la inhibición de PDE4.

Se ha analizado el efecto de la inhibición de PDE7 sobre algunosparámetros de activación de linfocitos T, como la proliferación media-da por TCR y la activación de los factores de transcripción NFkB, NFATy Stat6. Se ha encontrado un efecto negativo de concentraciones cre-cientes de estos inhibidores sobre la proliferación de células T, median-te ensayos de proliferación. También se ha observado que la inhibiciónde PDE7 está acompañada de una disminución de la actividad de NFkBen linfocitos T, y que este efecto no es revertido por el inhibidor de PKA(KT5720). Esta disminución de la actividad de NFkB podría estar rela-cionada con un efecto antiinflamatorio de la inhibición de PDE7. Sinembargo, ni NFAT ni Stat6 son modificados por la inhibición de PDE7.No obstante, la combinación de inhibidores de PDE4 y PDE7 muestrauna disminución del factor de transcripción Stat6.

Por tanto, los datos obtenidos hasta ahora muestran que la inhibi-ción de PDE7 afecta a la actividad de los linfocitos T, sugiriendo quePDE7 podría ser una buena diana en enfermedades mediadas por estetipo celular.

69. LA TERAPIA ANTI-RETROVIRAL FRENTE A LA INFECCIÓNPOR EL VIH-1 (TARGA) PODRÍA ESTAR INVOLUCRADO ENLA MODULACIÓN DE LA CAPACIDAD FUNCIONAL DECÉLULAS CD8 VIH-1 ESPECÍFICAS. García-Jurado G, LozanoJM, Luque J, Kindelán JM, Natera C, Rivero A, De la Rosa O, Gon-zález R, Solana R, Peña J. Hospital Universitario Reina Sofía. Ser-vicio de Inmiunología. Córdoba.

La respuesta de las células CD8 específicas se encuentra significa-tivamente alterada en la infección por VIH-1, impidiendo el control dela replicación viral. Esta situación se mantiene a pesar de los nivelessignificativamente altos de células CD8 específicas, incluso en las últi-mas fases de la infección. En los últimos años, el tratamiento antirre-troviral de gran actividad (TARGA) ha reducido considerablemente lacapacidad replicativa del virus y ha demostrado reconstituir parcial-mente los daños observados en el sistema inmune de los pacientesinfectados. Sin embargo, aún no queda claro si las mejoras introduci-das con el TARGA afectarían a la respuesta de las células CD8 espe-cíficas en la infección por el VIH-1.

Con el objetivo de responder a esta cuestión, hemos evaluado ladistribución de las subpoblaciones CD8 específicas así como su perfilfuncional en términos de expresión de IFN-γ, TNF-α y perforina, enun grupo de pacientes infectados por el VIH-1 y que siguen tratamien-to TARGA.

En este sentido, se han analizado simultáneamente la producciónde citocinas y, la expresión de perforina y el perfil fenotípico diferen-ciador de células CD8 VIH-1 específicas, en una cohorte de 14 sujetosVIH-1 positivos y divididos en dos grupos según recibieran TARGAal menos durante dos años seguidos –tratados –, o fueran asintomá-ticos y naïve para el TARGA –no tratados–.

Los resultados indican que el porcentaje de células CD8 VIH-1Gag-específicas fue significativamente más alto en el grupo de pacien-

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tes –no tratados– que en el grupo de de –tratados–. Sin embargo, cuan-do las subpoblaciones CD8 VIH específicas fueron analizadas en ambosgrupos, no se destacó diferencias significativas en la distribución decélulas memoria y memoria efectora en ambos grupos de pacientes,según el criterio seguido de análisis naïve (CCR7+CD45RA+), memo-ria (CCR7+CD45RA-), (CCR7-CD45RA-) y efectora (CCR7-CD45RA+).

Cuando la produccion intracelular de INF-γ, TNF-α y perforinafue analizada, se encontró un incremento significativo en la capacidadsecretora de INF-γ en la población CD8+CD45RA+ VIH-Gag especí-ficas en el grupo de pacientes - no tratados - De igual modo, se obser-vó un aumento significativo de la población VIH-1 específica CD8+con capacidad de expresar perforina en individuos - no tratados - queno fue constatada en el grupo de individuos - tratados -, mientras quela expresión de TNF-α intracelular no mostró diferencias significati-vas entre ambos grupos, a pesar de que fueron más elevadas en losindividuos infectados que en el grupo control sano.

En resumen, podemos asumir que el grupo de individuos infecta-dos por VIH-1 que NO reciben TARGA presentaron frecuencias simi-lares de células memoria/efectora CD8+ específicas, pero la capacidadfuncional de las mismas en términos de producción de citoquinas yperforina no se encontró afectada a diferencia del grupo de pacientesque recibieron tratamiento anti-retroviral. No obstante, no podemosexcluir que, al presentar el grupo –no tratado– mayor carga viral, loscambios observados puedan deberse a un efecto directo del virus y noa la ausencia de TARGA.

70. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DE NKRS EN INDIVIDUOSVIH-1+ INCLUIDOS EN UN PROYECTO DE INTERRUPCIÓNPROGRAMADA DEL TARGA. Luque J, García-Jurado G, Loza-no JM, González R, Soriano N, Leal M, Peña J. Servicio de Inmuno-logía, Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba y Servicio de Infec-ciosos, Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla.

La infección por el VIH-1 es en la actualidad una pandemia queafecta a más de 40 millones de personas. Hasta la fecha la única formaefectiva de controlar la replicación viral es el TARGA, pero se desco-noce el efecto real que produce en el sistema inmune. En la actualidadse está incluyendo la interrupción estructurada del tratamiento (IET)como método para paliar los efectos no deseados del TARGA. Con elobjetivo de conocer si la IET aumenta la respuesta inmune innata, nosproponemos estudiar el perfil de receptores NK (NKRs) en las dos sub-poblaciones descritas de células NK.

Para el estudio se tomaron muestras de 11 pacientes incluidos enuna cohorte de IET, en los puntos de inicio, interrupción y reinicio delTARGA. Los criterios para la inclusión de los pacientes en la cohortefueron: CV<50c/mm3, CD4+>500c/mm3 al menos durante los últimos12 meses y un recuento nadir de CD4+>250c/mm3. El estudio se hallevado a cabo mediante citometría de flujo, utilizando los anticuerposmonoclonales, anti-CD3, anti-CD56 y anti-CD94 Becton Dickinson(Mountain View, CA); anti-NKp46, anti-KIR2DS4, anti-KIR2DL1, anti-NKG2A, anti-NKG2C R&D systems (Abingdon, UK), anti-ILT2 Phar-Mingen (Oxford, U.K.). Las muestras se procesaron en FACScalibur(Becton Dickinson) y el análisis de las muestras se realizó mediante elsoftware Flowjo (TreeStar company).

Cuando se analizó el perfil de distribución de los NKRs en la sub-población NKdim de las células NK (CD3-CD56+dim) se observó quela interrupción programada del TARGA disminuyó los niveles de losreceptores NKG2 ligado a CD94 y aumentó los niveles de los recep-

tores KIR2D incluidos en el estudio (KIR2DL1 y KIR2DS4). Un aumen-to significativo se observó en el caso de los niveles de ILT-2 y NKp46tanto en la población NKdim como en la NKbright. La inclusión denuevo del TARGA en los pacientes del estudio, restableció los nive-les de NKRs observados antes de la IET. Estos resultados indican quela IET podría modificar el perfil de expresión de NKRs aunque no indu-ce un evidente perfil inhibidor o activador en las células NK.

En resumen, es necesario un mayor número de estudios para cono-cer el verdadero impacto de la interrupción estructurada del tratamien-to (IET) sobre la respuesta inmune innata de los pacientes infectadospor VIH-1 que ayude a entender si una suspensión de la terapia con-tra VIH por cortos periodos de tiempo mejora la capacidad del siste-ma inmunológico a controlar la infección.

71. CARACTERIZACIÓN DE SUBPOBLACIONES MONOCITA-RIAS EN SANGRE PERIFÉRICA EN PACIENTES CON NEU-MONÍA ADQUIRIDA EN LA COMUNIDAD. Rodriguez Pas-tore MI1, Sánchez Luengo MA, Mallo Palomares AB1, D'AngeloMendoza EA1, San Antonio E1, Torralba Gonzalez de Suso M2,Mateos Hernandez J2, Monserrat Sanz J1, Reyes Martín E1, Rodri-guez-Zapata M1,2, Alvarez-Mon M1. 1Unidad I+D asociada CNB-CSIC. Laboratorio de Enfermedades del Sistema Inmune y Oncología.Departamento de Medicina. Universidad de Alcalá. 2Servicio de Medi-cina Interna del Hospital Universitario de Guadalajara.

Introducción. La incidencia de neumonía adquirida en la comu-nidad (NAC) en España se encuentra en torno a los 420/100.000 habi-tantes, la mortalidad es del 1% en los pacientes hospitalizados y ambu-latorios aumentando al 36% en los pacientes que requieren ingreso enuna unidad de cuidados intensivos. Diferentes mecanismos inmune-inflamatorios han sido implicados en la patogénesis de la NAC. Lacaracterización de monocitos de sangre periférica en enfermedadesinfecciosas como la NAC no ha sido aún clarificada. Es conocida laheterogeneidad en la población monocitaria de sangre periféricasiguiendo criterios tanto morfológicos, fenotípicos como funcionales.Se han observado modificaciones en la distribución de subpoblacio-nes monocitarias en función de la expresión de los marcadores de super-ficie de CD14 y CD16 en diferentes enfermedades inflamatorias e infec-ciosas. En estas células se han descrito patrones de migración diferen-ciales relacionados con la expresión de moleculas de adhesión y qui-mioreceptores como CD62L y CX3CR1.

El objetivo de nuestro estudio es la caracterización de las posiblesalteraciones en subpoblaciones monocitarias en relación con caracte-rísticas inmunofenotípicas.

Metodología. Hemos analizado células mononucleares de sangreperiférica en 20 pacientes con NAC, en el momento del diagnóstico ysin tratamiento antibiótico previo y en 20 sujetos sanos pareados enedad y sexo. Se realizó un estudio multiparamétrico con citometría deflujo cuantitativa de cuatro colores con los siguientes anticuerpos mono-clonales: CD14, CD16, CD62L y CX3CR1.

Resultados. Hemos encontrado un aumento significativo de lapoblación CD14+CD16+ y asi como disminución de la poblaciónCD14+CD16- en los pacientes con NAC con respecto a los controles(p< 0,002 y p< 0,006 respectivamente). Siendo la subpoblación CD14high CD16low la que mostró un incremento mayor (p< 0,01).

Y también evidenciamos un aumento significativo de la expresiónde CD62L y CX3CR1 en la población CD14+CD16+ en los pacientescon respecto a los controles (p< 0,003 y p< 0,01, respectivamente).

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Conclusiones. Nuestros resultados podrían indicar una redistri-bución en las subpoblaciones monocitarias de sangre periférica conadquisición de marcadores con función efectora y de migración a teji-dos inflamados como el pulmón en la NAC.

72. PRIMOINFECCIÓN TUBERCULOSA EN EL TRATAMIENTOCON FÁRMACOS ANTAGONISTAS DEL FACTOR DENECROSIS TUMORAL (INFLIXIMAB) POR UVEÍTIS RECU-RRENTE. Micheloud D, Velastegui A, Sanchez Ramón S, Gil J,Fernández-Cruz E. Hospital Gregorio Marañon, Madrid.

Introducción. En los últimos años, el auge de la terapia biológicaha demostrado su eficacia en diferentes patologías de base autoinmu-ne. Sin embargo, se ha producido un notable incremento de procesosinfecciosos, algunos de gravedad, asociado a la utilización de estasterapias. La presentación clínica de las infecciones suele ser atípica yesto dificulta el diagnóstico.

Caso clínico. Varón de 28 años con antecedentes de síndrome tóxi-co a los 3 años de edad (1981), que cursó como una neumonía inters-ticial y hepatopatía y artralgias de causa no filiada a los 14 años deedad. En seguimiento por la Unidad de Retina desde 2001 por cuadrode pars planitis (uveitis intermedia) de ojo derecho (OD) recurrente.Presentó un episodio de uveitis en OD en enero de 2003, tratada conciclopléjicos con discreta mejoría. En otoño de 2003, nueva recurren-cia de uveitis en OD, iniciándose tratamiento con prednisona, ciclos-porina y azatioprina, con pauta descendente de la terapia corticoideasegún evolución clínica. El paciente es remitido a la Unidad de Inmu-nología Clínica para descartar enfermedad autoinmune sistémica. Nopresentaba manifestaciones sugestivas de enfermedad autoinmune sis-témica. La cuantificación de inmunoglobulinas séricas, estudio de fac-tores del complemento fueron normales. Proteína C reactiva negativa.Los auto-anticuerpos (ANOEs, anticuerpos antifosfolípidos y ANCAs)fueron negativos. Subpoblaciones linfocitarias de distribución y recuen-to normal, estudio linfoproliferativo a mitógenos normal. Serología ahepatitis B y C, VIH, CMV, toxoplasma y lúes fueron negativas. Sero-logía IgG positiva a VEB. Prueba de Mantoux negativa. Se descartóasociación a patología sistemica (en especial, con enfermedad de Beh-çet, síndrome de Reiter, esclerosis multiple, lupues eritematoso sisté-mico), entre otras. Se diagnosticó como uveítis unilateral recurrente enOD de causa no filiada refractaria a terapia inmunosupresora conven-cional. Debido a la persistencia de actividad inflamatoria ocular, quese extendió al ojo izquierdo, se decidió tratamiento con anticuerposmonoclonales anti-TNF-α (infliximab, Remicade®). Radiografía de tóraxnormal y se realizó tinción de BAAR en esputo (x3) que fue negativa.El paciente recibió infliximab (5mg/kg iv) a las 0 y 2 semanas, con bue-na tolerancia y rápida respuesta clínica, objetivándose remisión com-pleta de la actividad inflamatoria con recuperación del campo visual.A los 20 días de comenzar el tratamiento, el paciente comienza con fie-bre elevada de 39-40º con deterioro del estado general, sudoración pro-fusa y lesiones vesiculares en miembros superiores. Se ingresa en Urgen-cias, presentando leucocitosis 11.900 (78% granulocitos), LDH 890;hemocultivos y urocultivos negativos. Rx de tórax: adenopatías medias-tínicas paratraqueales derechas. Se comienza con antibioticoterapiaempírica con cefalosporina de tercera generación, el paciente evolu-ciona febril y con mayor deterioro del estado general, razón por la cualse realizó TAC torazo-abdominal donde sólo se evidencia un leve infil-trado intersticial en lóbulo superior izquierdo y adenopatías meno-res de 1 cm en hilio derecho y 1,5 cm paratraqueal. El cultivo de espu-

to fue negativo. Se realizaron determinaciones de Inmunoglobulinas,Complemento y subpoblaciones linfocitarias que fueron normales. Semodificó tratamiento con imipenen + gentamicina y tratamiento anti-tuberculostático empírico con asociación de izoniacida 50 mg, pirazi-namida 300 mg y rifampicina 120 mg (5 cp/día en una sola toma) yfluconazol 100 mg/día. El paciente persiste febril, se realizó fibrobron-coscopia con lavado broncoalveolar y punción del ganglio paratra-queal. No hubo rescate microbiológico, en el cultivo en el lavado bron-coalveolar y la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) para M. Tuber-culosis fue negativa La punción transbronquial no fue significativa,razón por la cual se realizó mediatinoscopía con extirpación ganglio-nar, la PCR para TBC del material fue negativa, pero en los cultivos seaisló Mycobacterium Tuberculosis. El paciente continúa con el trata-miento antituberculostático en la actualidad, con buena evolución.

Discusión. Las infecciones por bacterias intracelulares (Histoplas-ma, L. monocytogenes) pueden evitar la acción bactericida y desarro-llarse formando granulomas, como en el caso de la infección por M.Tuberculosis, en la que el TNF-α tiene la función de limitar la capacidadpatogénica del bacilo. Sin embargo, al inhibir su función no existe apop-tosis de los macrófagos, permitiendo su diseminación y reactivación encaso de infección latente. La TBC se ha asociado más frecuentementeal uso de infliximab que a otros anticuerpos anti-TNF-α monoclonales.Generalmente se ha presentado en casos clínicos en los 3 primeros mesesde tratamiento y en el 70% después de la 3 dosis. En nuestro paciente sepresento a la 5 semana de comenzar la terapia con infliximab. Sus mani-festaciones suelen ser atípicas como en este caso, la clínica inusual pue-de retrasar el diagnostico y contribuir a la morbimortalidad. La TBCextrapulmonar diseminada (33%) es la forma más habitual en este gru-po de pacientes. Sin embargo, en este caso fue una forma localizada deTBC extrapulmonar, con PCR para M. Tuberculosis negativa, la cualposee una sensibilidad del 80% y especificidad del 97%.

Conclusión. El tratamiento con antagonistas de TNF-α tiene que sersupervisado estrechamente para detectar la aparición de potenciales efec-tos adversos y realizar su diagnostico y tratamiento en forma precoz.

73. ANTICUERPOS FRENTE A HELICOBACTER PYLORI ENPACIENTES CON ENFERMEDAD PULMONAR OBSTRUCTI-VA CRÓNICA. Respaldiza N, Mateos I, Sanchez Agüera M, Fria-za V, Morilla R, De la Horra C, Montes-Cano MA, Rivero L,Muñoz-Lobato F, Varela JM, Medrano FJ, Torronteras R, Calde-rón E. CIBER de Epidemiología y Salud Pública. Servicios de MedicinaInterna y Microbiología. Hospital Universitario Virgen del Rocío. Sevi-lla.

Introducción. La infección por Helicobacter pylori es una de lasinfecciones bacterianas más comunes en humanos. Esta infección seha asociado con diferentes enfermedades gástricas y relacionada condiversas patologías extra-gastrointestinales, incluyendo enfermedadcoronaria, rosácea o enfermedades pulmonares crónicas. En nuestromedio no existe información sobre la tasa de infección por H. pylori enenfermedades extra-gastrointestinales.

Objetivo. Obtener información sobre la seroprevalencia de la infec-ción por H. pylori en pacientes con enfermedad pulmonar obstructi-va crónica (EPOC) de nuestro medio

Pacientes y metodología. Se incluyeron 37 pacientes con EPOCy 46 controles de los que se obtuvieron muestras séricas para evaluarla presencia de anticuerpos IgG anti-Helicobacter pylori. Los suerosfueron analizados mediante un ELISA comercial (Enzygnost Anti-Heli-

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cobacter pylori II/IgG; Dade Behring. Marburg, Germany) siguiendolas instrucciones del fabricante.

Resultados. En 29 de los 37 pacientes con EPOC (78,4%) se demos-tró la presencia de anticuerpos frente a H. pylori y en 28 de los 46 con-troles (61%), sin diferencias significativas entre ambas tasas (p= 0,14).Por otra parte, en los pacientes con EPOC no existieron diferencias en latasa de anticuerpos frente a H. Pyroli en relación con la edad, el sexo, elconsumo de tabaco o parámetros respiratorios funcionales (FEV-1%).

Conclusiones. Existe una alta tasa de exposición a la infección porH. Pylori en pacientes con EPOC de nuestro medio, pero similar a lade la población general. Este hecho, junto a que no existen diferenciasen la tasa de anticuerpos frente a este microorganismo relacionadascon las características clínicas de los pacientes con EPOC sugieren queno existe relación entre la EPOC y la infección por H. Pylori.

74. ELEVACIÓN DE CITOQUINAS PROINFLAMATORIAS ENPACIENTES CON EPOC COLONIZADOS POR PNEUMOCYS-TIS JIROVECII. Montes-Cano M, Rivero L, Morilla R, Friaza V,Respaldiza N, Muñoz F, Medrano FJ, Varela JM, Calderón EJ, Dela Horra. Servicio de Medicina Interna. CIBER de Epidemiología y SaludPública. Hospital Universitario Virgen del Rocío. Sevilla.

Introducción. La enfermedad pulmonar obstructiva crónica(EPOC) se caracteriza por una limitación permanente del flujo aéreodebida a la inflamación crónica de la pared bronquial. Diversos estu-dios han descrito un aumento en los niveles de IL-8, MCP-1 y TNF-alfa en el esputo inducido de estos pacientes. La repuesta inflamato-ria local y sistémica parece estar condicionada por la interacción defactores, entre los que se incluyen aspectos genéticos, característicasde la respuesta inmunitaria, tabaco, agresiones externas o la posiblepresencia de agentes infecciosos. Actualmente, se conoce la existenciade colonización por Pneumocystis jirovecii en pacientes con EPOC, ade-más en modelos animales se ha demostrado que Pneumocystis provo-ca un aumento de interleuquinas proinflamatorias; lo que permite plan-tear la posibilidad de que la colonización por P. jirovecii juegue algúnpapel en la fisiopatología de la EPOC.

Objetivo. Identificar los cambios inducidos por P. jirovecii en larespuesta inflamatoria a nivel sistémico en pacientes con EPOC.

Material y métodos. Se incluyeron 51 pacientes diagnosticadosde EPOC. La identificación de P. jirovecii se realizó mediante PCR tipoNested en muestras respiratorias. La respuesta inflamatoria se anali-zó mediante ELISA comercial (R&D systems) para IL-8, IL-6 y TNF-alfa, y Endogen para la determinación de MCP-1, en muestras séricas.

Resultados. Se identificó la presencia de P. jirovecii en 28 pacien-tes con EPOC. Los niveles de citoquinas en los pacientes con y sin colo-nización por P. jirovecii se resumen en la tabla.

Citoquinas/Pacientes EPOC sin Pj EPOC con Pj P(pg/ml) (N= 23) (N= 23) Test T-Student

IL-8 (medida ± SD) 13,89 ± 13,87 21,26 ± 9,25 0,028TNF-alfa (medida ± SD) 3,57 ± 2,03 8,15 ± 10,6 0,047IL-6 (medida ± SD) 5,34 ± 5,45 16,95 ± 25,6 0,038MCP-1 (medida ± SD) 726,99 ± 67,5 1012 ± 25,06 0,0048

Los pacientes con EPOC con y sin colonización por P. jirovecii nomostraron diferencias significativas respecto a edad, sexo, hábito tabá-quico, función respiratoria medida mediante VEF-1%, recuento san-guíneo de linfocitos y de leucocitos.

Conclusiones. Nuestros resultados muestran una asociación entrecolonización por P. jirovecii y aumento de respuesta inflamatoria anivel sistémico en pacientes con EPOC.

Son necesarios estudios más amplios para esclarecer el posible papelde la colonización por Pneumocystis en la fisiopatología de la EPOC.

Este estudio ha sido financiado con ayudas del Ministerio de Ciencia yTecnología. SAF 2003-06061 y FIS CP 04/217.

75. INFLUENCIA DEL POLIMORFISMO -174 G/C EN LA PRO-DUCCIÓN LOCAL DE IL-6 EN PACIENTES CON NEUMONÍAINTERSTICIAL IDIOPÁTICA. Montes-Cano MA1, Muñoz-Loba-to F1, de la Horra C1, Friaza V1, Rivero L1, Rodríguez-Becerra E2,Respaldiza N1, Martín-Juan J1, Morilla R1, Medrano FJ1, VarelaJM1, Calderón EJ1. 1CIBER de Epidemiología y Salud Pública. Serviciosde Medicina Interna y 2Neumología. Hosp. U. Virgen del Rocío. Sevilla.

Introducción. Las Neumonías intersticiales idiopáticas (NII) cons-tituyen un grupo heterogéneo de desórdenes de causa desconocida.La lesión causada en el parénquima pulmonar conduce a una cascadade procesos inflamatorios, que originan fibrosis. IL-6 es una moléculainflamatoria implicada en estos procesos, en cuyo promotor existeun polimorfismo descrito que regula los niveles plasmáticos de estacitoquina. El genotipo GG se asocia a una mayor producción a nivelsistémico, pero existe poca información sobre su influencia a nivel local.

Objetivo. Analizar los niveles de IL-6 en lavado broncoalveolar (LBA)y su correlación con el polimorfismo -174 G/C en pacientes con NII.

Pacientes. Se incluyeron un total de 39 pacientes (31 hombres y8 mujeres), con una edad media de 61,4 años ± 12,5 y rango (32–81)años. Todos los casos tenían diagnóstico confirmado de NII y se lesrealizó un LBA.

Métodos. La identificación del polimorfismo de la región promo-tora de IL-6 se realizó por técnicas de PCR-RFLP. Para el alelo G seobtuvo un fragmento de 163 bp y para el alelo C dos fragmentos de111 y 52 bp respectivamente.

Los niveles locales de IL-6 fueron medidos por técnica de ELISA, uti-lizando un kit comercial (R&D biosystems) siguiendo las instruccionesdel fabricante. Estos resultados fueron normalizados en base a la concen-tración total de proteína y expresados en picogramos/mg de proteína.

Resultados. A continuación la tabla muestra los resultados obte-nidos respecto de las frecuencias genotípicas y alélicas para el polimor-fismo -174 G/C de IL-6. Así mismo, se reflejan los niveles de concen-tración media de IL-6 local, en función de los fenotipos alto o bajo pro-ductor.

Genotipos NII Alélos NII

IL-6 n=39 (%) IL-6 2n= 78 (%)GG 20 (51,3) G 56 (71,8)GC 16 (41,0) C 22 (28,2)CC 3 (7,7)Fenotipos NII Concentración PIl-6 N=39 (%) media IL-6Alto productor (GG) 20 (51,3) 44,6 nsBajo productor (GC+CC) 19 (48,7) 49,4

Conclusión. Nuestros datos sugieren que el polimorfismo -174G/C del promotor del gen IL-6 no afecta la expresión de esta citoqui-na a nivel local en pacientes con NII.

Parcialmente financiado por laboratorios Pfizer (Beca ATV-IIG-158).

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76. 8 COLORS MULTIPARAMETRIC FLOW CYTOMETRY STUDYOF CYTOKINE PRODUCTION BY FOXP3 EXPRESSINGCELLS. Acuña L, Barcenilla H, Monserrat J, Prieto A, Díaz D,Villarroel M, Sánchez MA, Hernández A, Reyes E, Alvarez-MonM. Universidad de Alcalá, Madrid.

Regulatory T cells play a key role maintaining the homeostasisof the immune system. They have been well defined as CD4+CD25highcells that express the transcription factor Foxp3. However, in humansthe expression of Foxp3 is not exclusively confined to CD4+CD25highcells, a population of CD25low cells with naïve phenotype also expres-ses Foxp3 at lower levels than CD25high cells. In addition, activatedhuman T cells are able to express Foxp3.

Objective: By the use of multiparameter flow cyometry in eightcolors we have studied the production of cytokines by different sub-sets of T cells defined by the expression of Foxp3. Materials andMethods: We have studied peripheral blood mononuclear cells (PBMC)from 6 healthy controls. Freshly or activated PBMC were culturedfor six hours in the presence or the absence of PMA (50 ng/ml) plusIonomycin (1 μg/ml). Monensin (2 μM) was added to the cultures toretain the produced cytokines within the producer cells. For surfacelabelling, we used antibodies against the following antigens: CD3, CD8,CD45RA, CD25 CD27 CD31 and for intracellular labelling, antibodiesagainst: TNFα, IFNγ, IL-2, IL-4, IL-10 and Foxp3.

Results: We have found significant differences in the intracellularproduction of TNFα, IFNγ and IL-2 in the different subsets defined byFoxp3 expression and also by their naïve or memory phenotype. Foxp3+cells express reduced levels of most of the cytokines especially INFgcompared to the foxp3- cells.

Conclusion: The combination of intracellular cytokines and foxp3staining at the single cell level allow to distinguish subsets of T cellswith different function.

77. IDENTIFICACIÓN DE LA REGIÓN DE LA PROTEÍNA COREDEL VIRUS DE LA HEPATITIS C, RESPONSABLE DE SUEFECTO INMUNOMODULADOR. Domínguez-Villar M,Muñoz-Suano A, Anaya-Baz B, Aguilar S, Esperanza Gomez,Rodríguez-Iglesias M, Garcia-Cozar FJ. Universidad de Cádiz.

Introducción. La proteína core del virus de la hepatitis C es unaproteína no estructural de 191 aminoácidos con funciones inmuno-génicas y reguladoras conocidas. En células epiteliales, se ha descritoque la proteína puede tener localización subcelular tanto nuclear comocitoplasmática, y que su translocación al núcleo depende de la prote-ólisis de su región C-terminal. Nosotros hemos demostrado previa-mente que VHC infecta linfocitos CD4 en muestras clínicas de pacien-tes con hepatitis crónica por VHC, induciendo una situación de tole-rancia perférica. En células inmunes, la localización subcelular de lasproteínas del virus y su relación con el efecto del virus auún no se haanalizado. Nuestro estudio se centra en estudiar la localización subce-lular de distintas regiones de VHC-core en células CD4+ y en identi-ficar la región de la proteína responsable de la inducción de anergia.

Resultados. Hemos construido truncaciones de la proteína coredel VHC, teniendo en cuenta su distribución en dominios (aas 1-191,1-171, 1-78, 1-126, 78-126, 126-191) y hemos analizado la localizaciónsubcelular de cada una de ellas, así como el efecto de las mismas en laactivación del factor de transcripción NFAT, en su translocación alnúcleo, y en la respuesta proliferación y de producción de IL2 de célu-

las CD4+. Así hemos podido determinar la región de HCV responsa-ble de algunos de sus efectos sobre el sistema inmune.

78. MECANISMOS DE EVASIÓN INMUNOLÓGICA DEL VIRUSDE LA HEPATITIS C EN LINFOCITOS PRIMARIOS. Domín-guez-Villar M, Muñoz-Suano A, Anaya-Baz B, Aguilar S, Espe-ranza Gomez, Rodríguez-Iglesias M, Garcia-Cozar FJ. Universi-dad de Cádiz.

Introducción. EL VHC es la causa principal de hepatitis transfu-sional en el mundo, y su infección se cronifica en el 80% de los casos,evolucionando en la mayoría de las ocasiones hacia cirrosis y carcino-ma hepático. Aunque el hepatocito es el lugar primario de replicacióndel virus, se ha demostrado que el VHC también infecta células T CD4+tanto in vitro como in vivo y nosotros hemos demostrado que está pre-sente en linfocitos de pacientes infectados. Una posible causa de la cro-nificación de la enfermedad es la débil o inexistente respuesta de célu-las CD4+ frente a la infección por el virus. Se ha demostrado que laproteína core del VHC expresada en células Jurkat provoca una situa-ción de no proliferación similar a la anergia de células T, caracteriza-da por la disminución en la producción de IL2 y alteración en la rutade señalización de las MAPkinasas y nosotros hemos demostrado quealtera la proliferación y activa un programa transcripcional respon-sable de la evasión del virus. En nuestro estudio nos centramos en elefecto de la expresión de la proteína core del VHC en células prima-rias T CD4+ obtenidas de donantes sanos.

Resultados. La expresión de la proteína core del VHC en célulasCD4+ obtenidas de blastos PHA, provoca la activación de NFAT y sutranslocación al núcleo, una disminución en la proliferación celular yproducción de IL2 así como un aumento de la secreción de IL4 en con-cordancia con lo descrito en la clínica.

79. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS COSTIMU-LADORES EN PACIENTES CON PAPILOMATOSIS LARÍN-GEA PERSISTENTE POR EL VIRUS DEL PAPILOMA HUMA-NO (HPV). Anaya-Baz B, Domínguez-Villar M, Muñoz-Suano A,Aguilar-García S, Gomez E, García-Cozar FJ, Rodríguez-IglesiasMA. Universidad de Cádiz.

El virus del papiloma humano (VPH) es el causante de una de lasenfermedades de transmisión sexual mas frecuentes. En un porcen-taje bastante elevado de casos, HPV evade el sistema inmune, no des-arrollándose una respuesta inmune eficiente con la consecuencia deuna infección persistente, y el desarrollo en última instancia de cáncer.

Entre las regiones anatómicas que se ven afectadas por el HPV, nosolo se encuentra el cervix uterino sino también el epitelio de la laringe,causando en algunos casos una papilomatosis laringea persistente.

Nosotros hemos observado previamente que la evasión de HPV,podría ser debida a una alteración causada por proteínas del virusen la expresión de moléculas costimuladoras por parte de las célulasdendríticas que presentan péptidos de HPV; por lo que consideramosde interés evaluar la expresión de dichas moléculas en pacientes conpapilomatosis laringea.

En este estudio hemos analizado la expresión de las moléculas cos-timuladoras B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) en pacientes con papilomato-sis laríngea persistenten, utilizando para ello, CTLA4Ig que reconoceambas moléculas.

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Nuestros resultados muestran una tendencia al aumento de laexpresión de CD80 y/o CD86, en monocitos y células dendríticas depacientes con paplilomatosis laringea.

SESIÓN 5: INMUNODEFICIENCIAS

Moderadores: Eduardo Fernández-Cruz Pérez (Madrid), María José Recio Hoyas (Madrid)

80. ANÁLISIS MUTACIONAL DEL GEN TNFRSF13B (TACI) ENPACIENTES CON INMUNODEFICIENCIA VARIABLECOMÚN (IDVC). Detková D1, Arostegui JI2, Hernández M1, RiusJ2, Plaza S2, Gracia J de1, Salgado-Perandrés S1, Caragol I1, Espa-ñol T1, Yagüe J2. 1Unitat d'Immunologia, Hospital Universitari Valld'Hebron y 2Servei d'Immunologia Hospital Clínic, Barcelona.

La IDVC es la inmunodeficiencia primaria sintomática más fre-cuente. Su origen genético es desconocido en la mayoría de los casos.Unicamente en un 10% de ellos se han demostrado defectyos en ICOS,CD19, BAFFR y TACI. TACI (transmembrane activator and CAMLinteractor) es un miembro de la superfamilia de los receptores de TNF.Está involucrado en la respuesta inmunitaria T-independiente y en elcambio de isotipo de inmunoglobulinas.

El análisis mutacional del gen de TACI en nuestro grupo de 70pacientes adultos no emparentados diagnosticados de IDVC (criteriosESID) reveló la prevalencia de las mutaciones del 7%(5/70). Todas lasmutaciones fueron localizadas en el exon 3. Cuatro de los cinco pacien-tes presentaron una mutación missense C104R (dos heterocigotos ydos homocigotos) y uno presentó una mutación missense C89Y en hete-rocigosis (mutación no descrita anteriormente en la literatura). Todoslos pacientes con la mutación C104R estaban clasificados en el grupoBM2 (número conservado de las células B de memoria con y sin cam-bio de isotipo) y uno de los cuatro presentó enfermedad autoimmu-ne y esplenomegalia. El paciente con la mutación C89Y se clasificóen el grupo BM1 (disminución de las células B de memoria con cam-bio de isotipo) y tiene historia familiar de IDVC (hermana fallecida conIDVC a los 17 años). Se ha realizado el análisis mutacional del genTNFRSF13B en los familiares de los 5 pacientes y en 100 controles sanos.

Estos resultados serán útiles en el mejor entendimiento del papelde TACI en la patogenia de esta inmunodeficiencia.

81. HIPOGAMMAGLOBULINEA SEVERA Y DEPLECCIÓN DECELULAS B ASOCIADA CON TIMOMA (SINDROME DEGOOD). Salgado Cecilia G1, Botella-Martínez C*, López AlvarezMR1, Alemany-Frances L2, González-Billabeitia E2, Torres-Lan-zas J1, Ferri-Ñiguez B1, Bernal-Ramos A1, Muro Amador M1, Gar-cía-Pacheco M1, Alvarez-López MR1, Minguela-Puras A1, García-Alonso AM1. 1Immunologia, Cirugía torácica y anatomía patológica,Servicio Universitario Hospital Virgen de la Arrixaca. Murcia. 2Neumo-logía y oncología. Hospital Morales Meseguer. Murcia.

El síndrome de Good, es una inmunodeficiencia primaria que secaracteriza por hipogammaglobulinemia asociado a timoma. Fué des-crito por primera vez en 1954 por el Dr. Rober Good, es un caso rarode inmunodeficiencia combinada T y B que normalmente aparece enadultos en la 4ª o 5ª decada de vida.

Los timomas son tumores benignos pero alrededor del 6-11% depacientes con timoma puede desarrollar progresivamente inmunode-ficiencia.

Las manifestaciones clínicas del Síndrome de Good son timoma,aumento de la susceptibilidad a infecciones oportunistas hipogamma-globulinemia y disminución o ausencia de células B. La causa y pato-genia de este desorden son desconocidas, aunque hay algunas eviden-cias que sugieren defectos básicos en la médula osea.

Describimos el caso de un varón de 31 años, previamente sano alque en 2003 se le detectó, mediante radiografía de rayos X, una opaci-dad de 11 cm en el lóbulo inferior derecho del pulmón. Un mes antesel paciente había presentado síntomas sistémicos como fiebre noctur-na, pérdida de peso, tos y expectoración con mucosidad. Se le practi-có una biopsia cuyo estudio anatomopatológico fue informado comotimoma cortical de predominio linfocítico sin evidencia de maligni-dad. Posteriormente el paciente fue sometido a lobectomía inferiorderecha.

Después de varios episodios de neumonia, infecciones bronquia-les y rinosinusales, en enero de 2005 el paciente presentó sepsis y neu-monia por lo que fué enviado a nuestro hospital para una evaluacióninmunológica. Dicha evaluación reveló un número total de leucocitosnormal pero con niveles extremadamente bajos de inmunoglobuli-nas séricas, niveles muy bajos de células B periféricas, parálisis del des-arrollo de las células B en estadio pre-B en médula osea y otros defec-tos de la inmunidad celular, como linfopenia de células T CD4+, unaligera inversión del cociente CD4+/CD8+, aumento en el número decélulas T doble negativas CD3+CD4-CD8-TCRalfa-beta+ y respuestaproliferativa reducida en cultivos de proliferación in vitro frente a anti-CD3 o anti-CD3/anti-CD28, pegados a placa.

Tras ser diagnosticado como Síndrome de Good el paciente fuésometido a tratamiento sustitutivo con IgG endovenosa, y desde enton-ces se encuentra asintomático y libre de infecciones.

Las principales causas de muerte en pacientes con Síndrome deGood son generalmente, a consecuencia de infecciones, enfermedadesautoinmunes o complicaciones hematológicas. Nuestros datos sugie-ren que los pacientes con timoma deberían evaluarse inmunologica-mente de forma periodica tras el diagnóstico con objeto de detectaroportunamente posibles alteraciones del sistema inmune e iniciar cuan-to antes un tratamiento efectivo para prevenir las complicaciones quepuedan poner en riesgo la vida del paciente.

82. AN EDUCATIONAL PROGRAMME ORIENTED TO THESELF-CARE OF PATIENTS WITH PRIMARY ANTIBODY DEFI-CIENCIES. Carbone J, Moreno N. Asociación Española de DéficitsInmunitarios Primarios.

In the setting of chronic diseases, it is increasingly recognize thecritically important potential of effective everyday self-care decisionmaking for reducing the burden of illness and the strain on healthservice systems. People living with primary immunodeficiencies musttake personal long-term, day-to-day responsibility for care. An importantrole of doctors and the healthcare system is to help them do this.

We report on the experience with a one-year educational programmefor patients with primary antibody deficiencies developed as a pilotexperience in the Community of Madrid.

The aim of the programme was to provide basic knowledge regardingthe immune system and the management of primary antibody deficiencieswith emphasis in aspects of self-care. In the first step of the programme

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(January 2005) a 1-hour educational session was presented to 50 patientsand their relatives with an overview of the primary immunodeficienciesand their management. At the end of the educational session, patientsand relatives were asked to know if they were interested in the developmentof a one-year pilot educational programme oriented to the self-care. Atotal of 15 patients and relatives participated in 10 monthly sessionsof the educational programme (Second step: September 2005-June 2006).

The contents of the educational programme included: The immunesystem; the primary immunodeficiencies with emphasis in primaryantibody deficiencies; all aspects of treatment of primary antibodydeficiencies (indication, sustitutive therapy with immunoglobulins,antibiotics, nutrition, hygiene, dental care, common complications andits management, transplantation, sexualty, genetic council, psychologicalsupport, social, legal, work and economic issues); importance of theself-care for the management of patients and barriers to its development.

Methodology. Monthly two-hour sessions. First hour: The samedoctor developed the educational contents in a very informal way, withconstant interaction with patients. Second hour: the doctor, a phycologistand a social worker provided personal or group information regardingdifferent aspects of the care of primary antibody deficiencies.

Evaluation. At the end of the programme a questionnaire wasdeveloped by patients and relatives to evaluate the development ofthe programme and if they had adquired any new information usefulfor the day-to-day care of their immunodeficiencies. Results: All patientsand relatives agreed to indicate as important issues: the possibility ofsharing personal experiences and the opportunity to reach knowledgesdifficult to adquire in the hospital. An increased knowledge of differentaspects of the disease was observed during continuing evaluation alongthe course. The course was rated as 9/10 in usefulness by patients andrelatives. A decision was reach to start a second-year «advanced»training programme including basic knowledge for the autoadministrationof IVIG or SCIG. The experience indicated that no more than 10-15patients and relatives should be included in the sessions to facilitatea more fluid and continued interaction between patients and faculties.

Conclusion. An educational intervention might be useful to improvethe primary immunodeficiency patients' knowledge and self-care ofthe disease.

83. NUEVA MUTACIÓN EN EL GEN TNFRSF13B EN PACIENTECON INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMÚN. Martínez-Pomar N, Ferrer JM, Pons J, Iglesias J, Cambra A, Escobar D, Mata-moros N. Servicio Inmunología, Hospital Son Dureta, Palma de Mallor-ca.

La Inmunodeficiencia Variable Común (IVC) es un síndrome hete-rogéneo que se caracteriza por hipogammaglobulinemia de origen des-conocido y predisposición a sufrir infecciones de repetición. Reciente-mente se ha descrito que un 8% de los pacientes presentan mutacio-nes en el gen TNFRSF13B. Objetivo: Analizar dicho gen en la pobla-ción de pacientes afectos de IVC de Baleares (n=43).

Metodología. En este trabajo inicial se han analizado 10 pacien-tes. Se ha amplificado los exones 1-5 del gen TNFRSF13B mediantePCR-SSP y posterior secuenciación de los productos mediante unsecuenciador automático de ADN ABI 3100.

Resultados. El análisis de ADN genómico de los individuos afec-tos muestra que 1 paciente es heterocigoto para una nueva mutaciónc.119A>G, localizada en el exón 3 que origina el cambio de aminoáci-do p.E117G. El análisis comparativo de la secuencia proteica revela que

el aminoácido implicado en esta mutación está muy conservado entreespecies. El paciente presenta IVC asociada a timoma. La no existen-cia de historia familiar de inmunodeficiencia primaria sugiere que setrata de una mutación de novo.

Conclusiones. Creemos importante que se incorpore de formarutinaria el estudio genético de las moléculas implicadas en la patogé-nesis de la IVC con el fin de conocer mejor esta patología, clasificarmas detalladamente a los pacientes, aportar consejo genético y facili-tar el desarrollo de futuras terapias correctivas del defecto.

En futuros trabajos analizaremos la repercusión de la mutación enla expresión y funcionalidad de TACI.

84. CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LINFOCITOS B TRI-SÓMICOS EN UN CASO DE TRISOMÍA 8 CONSTITUCIO-NAL EN MOSAICO. Martí S, Galán F, Casero J, Fernández J,Rubio G. Inmunología, Pediatría, Bioquímica, Universidad Miguel Her-nández, Hospital Universitario de Sant Joan, Sant Joan d'Alacant.

Introducción. La trisomía 8 completa es rara y se asocia con abor-tos espontáneos. Por el contrario, la trisomía 8 constitucional en mosai-co (CT8M) es compatible con la vida. Su origen estaría en la gananciasomática de un cromosoma 8 en etapas tardías del desarrollo de unzigoto normal. La CT8M se muestra con una gran variabilidad fenotí-pica, se asocia a un riesgo elevado de neoplasias y es casi inexistentela bibliografía sobre la función inmunitaria de estos pacientes.

Objetivos. Estudio inmunitario de un caso de CT8M.Pacientes y métodos. Se presenta el caso de un lactante de 7 meses

con anomalías cardiacas, neurológicas, óseas, nefro-urológicas y ras-gos dismórficos, diagnosticado de CT8M. Utilizando mAb específicosy dynabeads se han separado células de los diferentes linajes leucoci-tarios y mediante hibridación in situ fluorescente (FISH) se ha deter-minado la presencia de trisomía 8. Se han llevado a cabo determina-ciones rutinarias de expresión de marcadores de diferenciación leuco-citarios y respuesta específica.

Resultados. Del análisis citogenético mediante sonda centromé-rica (CEP8) y sonda completa (WCP8) resultó que la totalidad de lascélulas B de sangre periférica mostraban trisomía 8, mientras que elresto de los leucocitos mostraban mosaicismo con aproximadamentela mitad de células trisómicas. Los datos de expresión en PBMC deCD3, CD4, CD8, CD11a/CD18, CD19, CD29, CD43, CD45, CD54, CD56,CD58 y TCR γδ, resultaron normales. Por la edad del lactante, se llevóa cabo un estudio de función B in vivo valorando respuesta IgM (Iso-hemaglutininas, G. hemático del lactante 0), resultando títulos 1:8-1:16(anti-A) y 1:1 (anti-B). El niño está siguiendo el calendario de vacu-nación normal y a los 20 meses se le llevará a cabo un estudio seroló-gico para valorar respuesta específica. Hasta el momento, los intentosde transformar las células trisómicas con el EBV han resultado infruc-tuosos.

85. PRESENTACIÓN DEL REGISTRO ESPAÑOL DE INMUNO-DEFICIENCIAS PRIMARIAS (REDIP) ONLINE. Escobar D,Martínez-Pomar N, Milà J, Cambra A, Matamoros N. Servicio deInmunología, Hospital Son Dureta, Palma de Mallorca.

Introducción. El REDIP inició su desarrollo en 1993. Hasta ene-ro de 2005 se registraron 2600 casos. A partir de dicha fecha se inicióla implementación del REDIP en su versión Internet.

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Objetivo: Se presenta el Registro Español de Inmunodeficien-cias Primarias basado en su nueva aplicación en Internet(http://web.hsd. es/redip) desarrollada para facilitar la accesibili-dad al análisis de los datos registrados e implicar en mayor medidaa los facultativos.

Metodología. La base de datos ha sido desarrollada con un acce-so limitado a la información básica para el público y un acceso exclu-sivo a la base de datos para los usuarios previamente registrados.

Resultados. El número de casos registrados desde su funciona-miento online es 511. Aproximadamente el 90% de los casos registra-dos se han realizado en las comunidades de Madrid, Andalucía, IslasBaleares y Cataluña. Hasta enero de 2005, en que se inició la imple-mentación del REDIP online, se habían registrado 2600 casos, siendola distribución por grandes grupos de diagnóstico: Deficiencias Pre-dominantemente de Anticuerpos 68,0%; Inmunodeficiencias Combi-nadas 12,4%; Deficiencias del Sistema del Complemento 12,0%; Defi-ciencias de Fagocitos 4,5% y otras inmunodeficiencias 3,2%. En el regis-tro online, cuyo funcionamiento se inició en enero de 2005, la distribu-ción es: Deficiencias Predominantemente de Anticuerpos 74,0%; Inmu-nodeficiencias Combinadas 6,4%; Deficiencias del Sistema del Com-plemento 6,0%; Deficiencias de Fagocitos 3,1% y otras inmunodeficien-cias 10,5%.

La puesta en funcionamiento de la versión online del RegistroEuropeo en el año 2002 (ESID, http://www.esid.org) ha obligado alREDIP a crear una conexión online a través de la cual cada facultativopodrá enviar sus casos al ESID de forma centralizada a través del REDIP.

Conclusiones. EL REDIP ha tenido una función de difusión y cono-cimiento demográfico, características clínicas y de tratamiento de lasIDP en nuestro país que con la versión online favorecemos el mante-nimiento, participación y consolidación del Registro.

86. ENFERMEDAD GRANULOMATOSA CRÓNICA: 26 AÑOS DEEXPERIENCIA EN EL H.VALLE HEBRÓN. Caragol I1, Marga-reto C2 , Soler P2, Hernandez M1, Español T1. 1Unidad de Inmuno-logía. 2Unidad de Inmunología Pediátrica, Hospital Universitari Valld'Hebron, Barcelona.

Introducción. La enfermedad granulomatosa crónica (EGC) esuna inmunodeficiencia primaria poco frecuente (1/200.000) causadapor defectos genéticos del sistema NADPH oxidasa que causa infec-ciones por organismos catalasa positivos y hongos.

Objetivos. Evaluar las características clínicas e inmunológicas delos pacientes diagnosticados de EGC.

Material y métodos. Pacientes diagnosticados de EGC en nues-tro centro entre 1980 y 2006: Total 15 (11 niños y 4 adultos). Estudio dela capacidad oxidativa por el Nitroblue Tetrazolium Test (NBT) y porCMF a partir de 1995. Estudios mutacionales realizados en Zurich (Dr.J.P. Hossle), Ámsterdam (Dr. D. Roos) y Madrid (Dr A. Ferreira)

Resultados. Niños: 11 varones. Datos al diagnóstico: edad media:37meses; clínica, por orden de frecuencia: abscesos o adenopatías abs-cesificadas (Staphylococcus aureus, Serratia liquefaciens y Klebsiella sp.),neumonía (Rhodococcus equi, Salmonella typhimurium, Pneumocistis jiro-veci), osteomielitis (Aspergilus sp), sepsis (Staphylococcus aureus), ITU(Klebsiella sp.) y aftas bucales. Evolución: 72 procesos infecciosos simi-lares destacando 2 leishmaniasis diseminadas con síndrome hemofa-gocítico. Adultos: 2 varones y 2 mujeres. Edad media al diagnóstico:23 años. Mortalidad total:33%(5/15): 4 sepsis y uno por complica-ciones post-trasplante renal. Genotipo: Forma ligada al cromosoma

X: 7 niños y 2 adultos; Forma autosómica recesiva: 2 adultos; Sin estu-dio: 4 casos.

Conclusiones. 1. Las características clínico-inmunológicas, edadal diagnóstico y genotipo de nuestra serie son similares a las publica-das. 2. Destacan la incidencia de Leishmaniasis y la infección por Rho-dococcus.

87. BASES MOLECULARES DEL DÉFICIT DE C7 EN DOS FAMI-LAS ESPAÑOLAS. Barroso S1, Álvarez AJ1, López-Trascasa M2,Lara JM1, Guzmán C1, Morales C1, Núñez-Roldán A1, Sánchez B1.1Servicio de Inmunología, HHUU Virgen del Rocío, Sevilla. 2Servicio deInmunología, Hospital La Paz, Madrid.

Las deficiencias de componentes del complemento se asocian conun aumento en el riesgo de padecer infecciones sistémicas recurrentes,principalmente por Neisseria meningitidis. Se han descrito diversasmutaciones que dan lugar a una deficiencia del componente C7 delcomplemento. En este trabajo, se han estudiado las bases genéticas deldéficit de C7 en 2 pacientes no emparentados en los que se sospecha-ba una deficiencia de algún componente del complemento por presen-tar una historia de infecciones meningocócicas así como una actividadhemolítica en suero (CH50) indetectable. Un análisis subsiguiente reve-ló que los niveles de C7 en el suero de estos pacientes eran indetecta-bles, por lo que se procedió a la amplificación y posterior secuencia-ción de los 17 exones del gen que codifica C7 para determinar las basesmoleculares responsables del déficit. En el paciente 1 se encontró unamutación no descrita previamente en homocigosis; un cambio de unabase en el exón 15 (C2107T) que da lugar a la aparición de un codón deparada que trunca la porción terminal de la proteína (Q681X). El padredel paciente 1, su madre y hermana eran heterocigotos para esta muta-ción y, sorprendentemente, los padres no se hallaban emparentados.En la paciente 2 se encontró otra mutación no descrita previamente enel exón 2 (G90A), que origina la aparición de un codón de parada quetrunca prematuramente la proteína C7 (W8X); esta mutación se halla-ba también en la madre y en una hermana de la paciente (hermana1). Por otra parte, la paciente 2, su padre y sus 2 hermanas (hermanas1 y 2) exhibían una mutación de cambio de sentido en el exón 9 (G1135C)que da lugar a un cambio de aminoácido (G357R). Esta mutación habíasido descrita por vez primera en individuos de origen judío sefarditamarroquí, aunque también la hemos encontrado en la población espa-ñola. Es de interés resaltar que, aunque la hermana 1 presentaba losmismos defectos moleculares en el gen que codifica C7 que la pacien-te 2, se hallaba asintomática. En este estudio hemos detectado 2 muta-ciones nuevas que originan déficit de C7 apoyando la idea de que lasbases moleculares de esta deficiencia son heterogéneas, ya que en dife-rentes individuos aparecen distintos defectos moleculares. Por otra par-te, algunos defectos tienen prevalencia en individuos de ciertas pobla-ciones o que viven en áreas geográficas definidas.

88. EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DE RECEPTORES TOLL-LIKE (TLR)EN MONOCITOS DE PACIENTES CON INMUNODEFICIEN-CIA VARIABLE COMÚN (IVC). Escobar D, Pons J, Iglesias J,Martínez-Pomar N, Matamoros N, Ferrer JM. Inmunología. Hospi-tal Son Dureta.

Introducción. La inmunodeficiencia variable común (IVC) es ungrupo heterogéneo de desórdenes caracterizados por hipogammaglo-

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bulinemia e infecciones de repetición, principalmente respiratorias,causadas fundamentalmente por Streptococcus pneumoniae y Hae-mophilus influenzae. Se han descrito mutaciones asociadas a IVC (ICOS,TACI, CD19) en algunos pacientes pero el defecto molecular subya-cente es, en general, desconocido. Distintas alteraciones del sistemainmunitario han sido descritas en estos pacientes. Algunas publicacio-nes recientes apuntan a deficiencias en la maduración y función de lascélulas dendríticas (CD) obtenidas a partir de monocitos de sangreperiférica.

Objetivos. Evaluar la funcionalidad del sistema inmunitarioinnato en monocitos de sangre periférica de pacientes con IVC,valorando la integridad y funcionalidad de los receptores toll-like(TLR).

Metodología. Estudiamos por citometría de flujo la expresiónde TLR-2 y TLR-4 en monocitos de sangre periférica, así como la pro-ducción de interleucinas (mediante CBA o ELISA) tras estimulacióncon distintos ligandos de TLR y extractos bacterianos de Streptococ-cus pneumoniae y Haemophilus influenzae.

Resultados. La expresión de TLR-2 es significativamente mayoren los monocitos de los pacientes con IVC que en los controles. No haydiferencias en la expresión de TLR-4. La estimulación con algunos ligan-dos de TLR-2 (SLTA) y TLR-4 (LPS) induce mayor producción de TNF-alfa por monocitos de pacientes con IVC que en controles. Sin embar-go, no hay diferencias cuando los monocitos se estimulan con extrac-tos bacterianos.

Conclusión. Alteraciones en la expresión y función de TLR enmonocitos de pacientes con IVC podrían explicar las deficienciasen la maduración y función de las CD descritas en algunos pacien-tes.

89. LACTANTE CON DEFICIENCIA DE ADA Y MUTACIÓNHOMOCIGOTA R235Q. Mora-López F, Nieto A, Bernal M, Rodrí-guez-Gutiérrez JF, Brieva JA, Sampalo A. Servicio de inmunología.Hospital Universitario Puerta del Mar.

La deficiencia de ADA es la 2ª causa de Inmunodeficiencia Com-binada Severa (IDCS) y la primera de las formas de herencia auto-sómica recesiva (AR). Se han descrito alrededor de 70 mutacionescausales, algunas con peculiar relación genotipo-fenotipo clínico.Reportamos el caso de un lactante varon de 2 meses y origen marro-quí con esta inmunodeficiencia en el que hemos detectado una muta-ción homocigota (R235Q) en el exon 8 del gen codificante para laADA.

Se ha comprobado que en células de E. coli Sθ3834, la mutaciónR235Q produce una forma practicamente inactiva de la enzima. Dichamutación sólo se ha descrito en en dos pacientes de origen japonés condeficiencia de ADA, en los cuales aparecía en heterocigosis compues-ta con otras mutaciones del gen (Q119X y del314A). Es la primera vezque se encuentra esta mutación en forma homocigota como causantede IDCS. El paciente es además homocigoto para el polimorfismo D8Nque produce una forma de enzima con actividad dism inuida, aunqueno asociada a IDCS.

El lactante debutó al més de vida con fiebre, diarrea, linfopenia,ulceras perianales y distress respiratorio. Los niveles de Ig eran inde-tectables, excepto una IgG de 508 mg/dl.

La historia familiar sugería una posible herencia AR, ya queambos padres eran consanguineos, y/o una herencia ligada a X:dos hermanos y tres tíos-abuelos paternos todos varones falleci-

dos en el periodo de lactancia. El fenotipo T- B- NK-/+ apunta-ba a un defecto de ADA o de recombinación (RAG1, RAG2, Arte-mis).

La gravedad y persistencia de las lesiones perianales (incluso seplanteó una colostomía temporal) junto con la historia familiar suge-rente, obligaron a descartar una posible EGC añadida.

Una actividad enzimática de la ADA en eritrocitos práctica-mente indetectable (< 0,07 UI/gHb) confirmó el diagnóstico en elpaciente.

El estudio de histocompatibilidad reveló que tanto el único her-mano vivo como el padre eran HLA-identicos al paciente. A los dosmeses se efectuó el trasplante de MO en el hospital Val´dHebron conevolución favorable hasta la fecha. Se discuten las peculiaridades clí-nicas y genéticas del caso.

90. INMUNODEFICIENCIA POR DÉFICIT DE ADENOSINA DEA-MINASA (ADA): ESTUDIO DE UN CASO. Pruneda L1, VIDALJR1, Tricas L1, Ramos Polo E2, BousoÑo C2, Concha Torre A2, Tou-za P2, Mayordomo J2, Benlloch T3, Hershfield MS4, Diaz de Here-dia C5, Lera E5, Olive T5, Caragol I6, Español T6. 1Servicio de Inmu-nología, HUCA, Oviedo. 2Servicio de Pediatría, HUCA, Oviedo. 3Uni-dad de Diagnóstico de Enzimopatías, Departamento de Bioquímica, Uni-versidad Autónoma de Madrid. 4Department of Medicine, Duke Univer-sity Medical Center, Durham, NC, USA. 5Servicio de Hematología, Hos-pital Valle d'Hebron, Barcelona y 6Servicio de Inmunología, HospitalValle d'Hebron, Barcelona.

Paciente de 11 meses sin consanguinidad familiar que ingresa conneumonía intersticial debida a adenovirus. Su historial clínico a la edadde 6 meses mostraba: retraso en el desarrollo, frecuentes resfriados,dos infecciones respiratorias y un episodio de gastroenteritis. Sus nive-les de linfocitos decrecieron de 1.000 a 90 linfocitos/mm3. Al ingresopresentó unos niveles de 78 linfocitos/mm3, siendo 39% LT (18% CD4+y 16% CD8+), 22% LB y 24% NK. La mitad de los linfocitos T expresa-ban antígeno HLA-DR. El nivel de inmunoglobulinas era normal parasu edad.

La actividad enzimática de ADA en eritrocitos fue indetectable.Esta actividad fue normal en los padres, en niveles bajos (padre: 0,45U/g Hb y madre: 0,33 U/g Hb) y también en una hermana de 3 años(0,98 U/g Hb).

El análisis genético del gen ADA reveló que la paciente presen-ta dos mutaciones diferentes: L107P y R156C. El alelo L107P fue here-dado del padre y el alelo R156C es de herencia materna. Ambos pro-genitores son heterocigotos y portadores de un alelo salvaje de ADA.La hermana de la paciente heredó ambos alelos salvajes.

El estudio de histocompatibilidad, para la realización de un trans-plante de médula ósea, mostró que la paciente y su hermana eranidénticas. Sus grupos sanguíneos eran AB y B, respectivamente. Lapaciente fue sometida a un transplante de médula ósea sin tratamien-to condicionante previo. Dos meses más tarde, mediante análisis demicrosatélites de ADN, se observó quimerismo en la población lin-foide.

Transcurridos 9 meses del transplante de médula ósea la pacien-te evoluciona favorablemente, con niveles de linfocitos de 1335/mm3:73% LT (33% CD4+ y 35% CD8+), 9% LB y 16% NK. La respuesta pro-liferativa frente a fitohemaglutinina y al antígeno toxoide tetánico ydiftérico es normal. El grupo sanguíneo de la paciente continúa sien-do AB.

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SESIÓN 6: AUTOINMUNIDAD-2

Moderadores: Julia Sequí Navarro (Madrid), Luisa María Villar Guimerans (Madrid)

91. CD4+FOXP3+ REGULATORY T CELLS ARE DECREASED INPERIPHERAL BLOOD OF RHEUMATOID ARTHRITISPATIENTS. Chara L, Chevarria J, Diaz D, Sanchez A, Prieto A,Monserrat J, Albarran F, Cuende E, Perez A, Turrion A, Ubeda M,Muñoz L, Lario M, Nieto M, Sanchez M, Barcenilla H, Acuña L,Villarroel M, Alvarez-Mon M. CNB-CSIC R&D Associated Unit,IMMPA, Department of Medicine, University of Alcalá, Alcalá de Hena-res, Madrid, Spain. Immune System Diseases and Oncology Service,University Hospital «Príncipe de Asturias», Alcalá de Henares, Madrid.

Background. The balance between T regulatory cells and pro-inflammatory effector cells has shown to be a great relevance for thedevelopment and persistence of autoimmune disease, becoming thisregulatory cell population important to the development of a therapeutictarget of interest in autoimmune arthritic conditions such as rheumatoidarthritis.

Objectives. To determine the distribution of T regulatory cells ofperipheral blood of rheumatoid arthritis patients compared with healthycontrols, and to relate that distribution with the disease activity.

Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 15 rheumatoidarthritis patients and 12 healthy controls were purified and characterizedin a FACSCalibur analyzer using fluorochrome-labeled monoclonalantibodies for CD3, CD4, CD25 membrane antigens combined withintracellular staining of FOXP3 molecule. Likewise, the DAS28 scorewas calculated in each patient in order to determine the disease activity.Comparisons between patients and healthy controls were carried outusing the non parametric Mann-Whitney test and considered significantwhen p< 0,05.

Results. A significant decrease in the CD3+CD4+FOXP3+ cellpopulation was found in peripheral blood lymphocytes from rheumatoidarthritis patients with respect to healthy controls, more over a significantdecrease in the CD3+CD4+FOXP3+ cell population was found inperipheral blood lymphocytes of patients with active disease (DAS28> 3,2), observing a negative correlation between the percentage ofCD3+CD4+FOXP3+ and DAS28 score value (r= -0,78; p< 0,05).

Conclusions. There is an important decrease of T regulatory cellsin rheumatoid arthritis patients that correlates inversely with the diseaseactivity, being this way an important therapeutic target and biologicalmarker of this disease.

92. SPONTANEOUS AND INDUCED APOPTOSIS ARE MAR-KEDLY DECREASED IN T LYMPHOCYTE SUBSETS FROMPATIENTS WITH RHEUMATOID ARTHRITIS. Chara L1, DiazD1, Sanchez A2, Monserrat J1, Mur S1, Chevarria J1, Prieto A1, Alba-rran F2, Cuende E2, Perez A2, Turrion A2, Sanchez M1, BarcenillaH1, Acuña L1, Villarroel M1, Alvarez-Mon M1, 2. 1CNB-CSIC R&DAssociated Unit, IMMPA, Department of Medicine, University of Alca-lá, Alcalá de Henares, Madrid. 2Immune System Diseases and OncologyService, University Hospital «Príncipe de Asturias», Alcalá de Henares,Madrid.

Background. Dysregulation of T lymphocyte apoptosis has beeninvolved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA). We have

analyzed the apoptosis in specifically defined naïve/effector/memoryT lymphocyte circulating subpopulations of RA patients.

Objective. To quantify spontaneous and induced apoptosis inlymphocytes of RA patients with regard to a control population of sexand age matched healthy individuals.

Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 7 RA patientsdiagnosed according to the Am C Rh criteria (4 with active untreatedRA and 3 with refractory disease) and 5 healthy controls were purifiedand characterized using monoclonal antibodies and annexin V by eightcolor flow cytometry in a FACSAria sorter. The apoptotic index (AI)of lymphocyte subsets were determined after 24 hour culture undertwo conditions: spontaneous apoptosis and after phytohemagglutinininduction.

Results. A marked decrease in spontaneous ex vivo apoptosiswas found in peripheral blood T lymphocytes from RA patients.This decreased apoptosis was found in effector (CD45RA+/–CD27-), naïve (CD45RA+CD27+) and memory (CD45RA–CD27+) subsetsof both CD4+ and CD8+ T lymphocyte subpopulations. Similarimpressive decreases in AI were found in mitogen-induced T cellapoptosis. Apoptosis of lymphocytes from refractory RA patientswas always lower than that found in T lymphocytes from active RApatients.

Conclusions. Patients with active RA show an impressive decre-ase in spontaneous and mitogen-induced apoptosis within naïve/effec-tor/memory CD4+ and CD8+ T-cell subsets. This decrease in Tlymphocyte apoptosis was specially marked in refractory RA patients.

93. CHARACTERIZATION OF THE DISTRIBUTION OF THEMONOCYTIC AND DENDRITIC CELLS SUBSETS IN RHEU-MATOID ARTHRITIS PATIENTS. Chara L1, Diaz D1, ChevarriaJ1, Sanchez A2, Prieto A1, Albarran F2, Cuende E2, Perez A2, TurrionA2, Monserrat J1, Ubeda M1, Muñoz L1, Lario M1, Nieto M1, San-chez M1, Barcenilla H1, Acuña L1, Villarroel M1, Alvarez-Mon M1,2.1CNB-CSIC R&D Associated Unit, IMMPA, Department of Medici-ne, University of Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid. 2Immune SystemDiseases and Oncology Service, University Hospital «Príncipe de Astu-rias», Alcalá de Henares, Madrid.

Background. Since the recent evolution of the immunopathologicthought proposes that reumatoid arthritis is an innate autoimmunepathology, the knowledge of the distribution of the different monocyticand dentritic cells (DC) subsets in these patients is important to understandthe immunopathogenic process of this disease.

Objectives. To determine the distribution of the different monocyticand dendritic cells (DC) subsets from rheumatoid arthritis patientscompared with healthy controls, and to relate that subset distributionwith the disease activity. METHODS: Peripheral blood mononuclearcells from 15 rheumatoid arthritis patients and 12 healthy controls werepurified and characterized in a FACSCalibur cytometer using fluorochrome-labeled monoclonal antibodies for CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD16,CD19, CD56, HLA-DR, and CD123 antigens. The DAS28 score wascalculated in each patient in order to determine the disease activity.Comparisons between patients and healthy controls were carried outusing the non parametric Mann-Whitney test and considered significantwhen p< 0,05.

Results. A significant decrease in the percentage ofCD14+highCD16- monocyte subset was found in peripheral bloodfrom rheumatoid arthritis patients with respect to healthy controls,

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no significant differences were found in the CD14+lowCD16+ subset.On the other hand, a significant decrease in the percentage ofplasmacyotid DCs (Lin-HLA-DR+CD123+CD11c-) subset was foundin peripheral blood monocytes from rheumatoid arthritis patientswith respect to healthy controls, as well as a significant increase inthe myeloid DC subsets (Lin-HLA-DR+CD123-CD11c+high andLin-HLA-DR+CD123-CD11c+ low). There were no significantdifferences in the distribution of these subsets between the patientgroup with active disease (DAS28 > 3.2) and the group with controlleddisease (DAS28<3,2).

Conclusions. There is an altered distribution of the differentmonocytic and dendritic cells subsets in peripheral blood of rheumatoidarthritis patients characterized by a decrease in the «classical» monocytesubset and a decrease in the plasmacytoid dendritic cell subset, probablydue to their traffic to the inflamed synovial membrane. This phenomenoncould be independent of the disease activity.

94. CITOQUINAS ANALIZADAS POR EL MÉTODO CBA EN ELLÍQUIDO SINOVIAL DE PACIENTES CON ARTRITIS REU-MATOIDE. Martínez-Lorenzo MJ, Royo-Cañas M, Anel A, Lasie-rra P, Rivas M, Larrad L. Instituto Aragones de Ciencias de la Saludy Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, Zaragoza.

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad crónica infla-matoria caracterizada por una intensa activación inmune y una granvariedad de manifestaciones sistémicas. El proceso inflamatorio guíaa la destrucción del cartílago y hueso. Aunque el proceso inflama-torio no se conoce muy bien, el gran número de células T infiltra-das en la membrana sinovial y la producción local de citoquinas deri-vadas de células T sugiere que las células T tienen un papel impor-tante en la respuesta autoinmune de pacientes con artritis reumatoi-de.

En la artritis reumatoide parece haber una respuesta de tipo Th1dominante, una subclase de células T CD4+. Sin embargo, las célulasT CD8+ parecen jugar un papel importante en la patología de la artri-tis reumatoide (Martínez-Lorenzo, 2006).

El objetivo de este trabajo fue analizar la presencia de citoquinasen el líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide en diferen-tes estadíos de la enfermedad comparando con líquido sinovial dedonantes sanos (traumatismo leve).

Las citoquinas analizadas fueron: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-18,TNF-α e IFN-γ además del péptido citrulinado (CCP) y las proteínasde la familia del receptor del TNF en su forma soluble: Fas, FasL yAPO2L.

El método para analizar IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α e IFN-γ fueel CBA-BD (Cytometry Beads Analysis), ELISA para IL18, Fas, FasLy APO2L, e inmunocaps para el péptido citrulinado.

No se observaron diferencias importantes en la cantidad de IL-4,IL-6 y TNF-α en líquidos sinoviales de pacientes con AR respecto dedonantes control.

Se observó una ligera disminución en los niveles de IL-2. La dis-minución fue más acusada en el caso de la IL-10. Sin embargo, se obser-varon niveles elevados de IL-15 e IL-18. Dichos niveles aumentaronconforme aumentaba el grado de la enfermedad.

Los niveles de IFN-γ y péptido citrulinado (CCP) fueron similaresen donantes trauma o control respecto de pacientes con artritis reuma-toide en estadíos I y II de la enfermedad. Sin embargo, los niveles tan-to de IFN-γ como de CCP aumentaron 6 veces en el caso de líquidos

sinoviales procedentes de pacientes con artritis reumatoide en esta-dios III y IV.

La cantidad de Fas soluble en los líquidos sinoviales de pacien-tes con AR fue el doble respecto de donantes trama o control.

En cuanto a los niveles de FasL soluble, se observó que ésta aumen-taba con el curso de la enfermedad. Los niveles aumentaron hasta 10veces en los líquido sinoviales de pacientes en estadíos III y IV. Final-mente, el nivel de APO2L/TRAIL aumentaba conforme aumentaba elestadío de la enfermedad.

95. PURIFICACIÓN DE IGM OLIGOCLONAL FRENTE A FOSFA-TIDILCOLINA A PARTIR DE SUERO DE UN PACIENTE CONESCLEROSIS MÚLTIPLE. Sádaba MC, González-Porqué P, Álva-rez-Cermeño JC, Espiño M, García-Barragán N, Gómez Rial J,Villar LM. Hospital Ramón y Cajal, Madrid.

Antecedentes y objetivos. La presencia en líquido cefalorraquí-deo (LCR) de IgM oligoclonal (BOCM) frente a lípidos de la mielina,mayoritariamente fosfatidilcolina (PC), predice un curso agresivo enlos pacientes con EM.

El objetivo de este trabajo es poner a punto un método para puri-ficar dichos anticuerpos. Con el fin de estudiar su patrón de reconoci-mento celular.

Material y métodos. Se partió para la purificación de 10 ml. desuero de un paciente que mostraba las mismas bandas oligoclonalesde IgM frente a PC en suero y en LCR. Para obtener la fracción IgMse sometió el suero a cromatografía sobre Sephacril S-500 (Ge Health-care). La concentración proteica de cada fracción se determinó median-te espectrofotómetría y se cuantificó IgG, IgM y albúmina de las mis-mas mediante nefelometría (BNII Dade Behring). 2- Los anticuerposIgM específicos frente a PC se purificaron mediante cromatografíade afinidad sobre una columna de octilsefarora a la que previamen-te se había unido PC. La unión de la PC a la columna re realizómediante incubación con PC (Sigma), diluida a una concentración de0,2 mg/ml en fosfato 50 mM, NaCl 3M. Para purificar la IgM frentea PC, la fracción de IgM total purificada se pasó a traves de dichacolumna. La IgM específica unida a la PC se eluyó con glicina/NaOH0,1 M pH 11,5. Se tituló la IgM específica frente a PC en el eluido, ypaso de muestra, así como en la muestra original. Así mismo estudiósu patrón de reconocimiento mediante isoelectroenfoque e inmu-nodetección.

Resultados y conclusiones. Se ha puesto a punto un método parapurificar IgM oligoclonal frente a PC a partir de suero de pacientes deEM. Con este método se han obtenido 25 µg de IgM específica a par-tir de 10 ml. de suero. Esto nos permitirá estudiar el patrón de recono-cimiento celular de estos anticuerpos.

96. LA ELECCIÓN DEL ENSAYO PARA DETECTAR ANTICUER-POS ANTICARDIOLIPINA ES DECISORIA PARA DIAGNOS-TICAR EL SÍNDROME ANTIFOSFOLÍPIDO (SAF). Cabezón A,Arribas F, Gil A, Cuesta MV, Madero R, Pascual-Salcedo D. Hos-pital Universitario La Paz, Madrid.

Introducción. El síndrome antifosfolípido (SAF) es una forma detrombofilia autoinmune adquirida, asociado con una morbilidad ymortalidad significativa. Puesto que sus manifestaciones clínicas soncomunes a otras causas, es imprescindible demostrar la presencia man-

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tenida de anticuerpos antifosfolípidos [ac anti-cardiolipina (aCL), acanti-beta-2-glicoproteina I (αβ2GPI) o anticoagulante lúpico (AL)], paraestablecer correctamente el diagnóstico del SAF. Sin embargo, la enor-me variabilidad de los ensayos para detectar estos anticuerpos gene-ra, en ocasiones, serias dificultades para el diagnóstico fiable del sín-drome.

Objetivo. Analizar las variaciones que existen en la detección deaCL y a‚2GPI entre distintos inmunoensayos en fase sólida (ELISA).

Métodos. Se ha estudiado la presencia de aCL y αβ2GPI en sue-ros de 80 pacientes (40 para isotipo IgG y 40 para isotipo IgM) conmanifestaciones trombóticas y ausencia de AL. Se han empleado ELI-SA de 12 laboratorios diferentes para los aCL y de 9 para los αβ2GPIy sus resultados se han comparado con los de los ensayos manuales(1,2).Además de las características propias de los antisueros y de los dife-rentes umbrales de corte, los ELISA difirieron fundamentalmente enla naturaleza del antígeno con que están recubiertas las placas. Paradetectar aCL 4 ensayos recubren la placa sólo con cardiolipina, 4 emple-an cardiolipina saturada con β2GPI humana, 2 emplean cardiolipinasaturada con β2GPI bovina, 1 kit emplea una mezcla de 4 fosfolípidos,y en 2 de ellos no se especifica el origen de la β2GPI.

Resultados. Los valores obtenidos mostraron una enorme varia-bilidad entre los distintos ensayos. La comparación estadística entrelos ELISA para detectar aCL indicó una correlación baja entre losensayos para los dos isotipos. El índice de correlación intraclase(ICI) tuvo valores máximos de 0,49 para aCL IgG y de 0,55 para aCLIgM, pero en algunos casos la correlación entre los ensayos fue prác-ticamente nula (ICI= 0,02). Los valores del índice <Kappa> (<K>)de concordancia cualitativa entre ensayos fueron a veces tan bajos(0,29 a –0,12 para IgG y 0,43 a –0,01 para IgM), que las coinciden-cias en los resultados podrían ser atribuibles estadísticamente alazar.

En el ensayo de αβ2GPI los valores del ICI y del índice <Kappa>fueron más altos (ICI entre 0,84 a 0,24 para IgG y 0,99 a 0,29 para IgMy <Kappa> 0,67 a 0,11 para IgG y 0,76 a 0,32 para IgM), indicando quela variación interensayo para este anticuerpo fue menor.

En los ensayos de algunas casas comerciales se detectaron pacien-tes con presencia únicamente de a‚2GPI en ausencia de aCL y AL.

Conclusión. En pacientes con trombosis y sin actividad AL, la elec-ción del ensayo para detectar anticuerpos anti-fosfolípidos es deciso-rio para establecer el diagnóstico de SAF.

Dada la inconsistencia de los resultados resulta necesario llegara un consenso metodológico para unificar las características de los ensa-yos en orden a esclarecer las dudas que aún persisten en el diagnós-tico del SAF.

Bibliografía1. Loizou S. et al. Clin Exp Inmmunol 62 (1985).2. Matsuura E. et al. J Exp Med 179 (1994).

97. UTILIDAD CLÍNICA DE LOS AUTOANTICUERPOS FREN-TE A LA MUTACIÓN CITRULINADA DE VIMENTINA (ANTI-MCV) EN PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE (AR).San Miguel A, Martín Santos J, Martin L, Alonso N, Iglesias R,Martin Gil FJ. Hospital Universiatario Rio Hortega. Valladolid.

Introducción. La AR es una de las enfermedades sistémicasautoinmunes más frecuentes, cuya etiología se desconoce. El diag-nóstico de AR depende principalmente de las manifestaciones clí-nicas. La vimetina es una proteína del citoesqueleto de diferentes

células, como células endoteliales, fibroblastos, condrocitos, osteoci-tos y leucocitos. La citrulinación es la pérdida del grupo amino demuchas proteínas por acción de deaminasas que transforman la L-arginina en L-citrulina. Las deaminasas citrulinan vimetina entre otrasproteínas del líquido sinovial. Por biotecnología se consiguió obte-ner formas mutadas de vimetina citrulinada (anti-MCV), lo cual mejo-ró el antígeno respecto del antígeno original descubierto en el año1994, llamado vimetina citrulinada o anti CCP (anti-cyclic citrullina-ted peptides). Además de la especificidad y la sensibilidad, la con-centración de anticuerpos anti-MCV expresada en U/ml, guardacorrelación con el score de actividad para AR, y permite diferenciarformas agresivas de formas leves de la enfermedad. Hay que resal-tar que la concentración de anticuerpos es influenciada por diferen-tes alternativas terapeuticas. El ensayo de MCV (Mutated-Citrullina-ted Vimetin) de Orgentec; es una técnica de utilidad para el diagnós-tico de AR, especialmente cuando existe sospecha firme, y la detec-ción del factor reumatoideo es no reactiva. También en pacientes quepresentan episodios de dolor e inflamación articular, que no se pue-den clasificar bien etiológicamente.

Objetivos. Se han determinado los niveles de Anti-MCV en ungrupo de 74 pacientes con AR de los cuales 17 eran varones y 57 muje-res, todos ellos diagnosticados clínicamente de AR. Comparandolosposteriormente con otros parámetros clásicos como son: PCR, FR, anti-cuerpos antinucleares (ANAs) título y patrón y anigenos extraibles delnúcleo (ENAs), SSa, SSb, RNP, Sm y Scl-70.

Material y métodos. Se ha utilizado un inmunoensayo enzimáti-co para la determinación cuantitativa de autoanticuerpos tipo IgG fren-te a MCV (Orgentec) en 74 pacientes diagnosticados clínicamente deAR.

Resultados y discusión. Hemos encontrado diferencias estadís-ticamente significativas al comparar los valores de controles que eran12 mujeres embarazadas sin AR, con una edad media de 31 ± 3,5 años,en comparación con los 74 pacientes de la Consulta de Reumatologíay diagnosticados clínicamente de AR (15,9 ± 11,4 U/ml vs 87,3 ± 98,6U/ml, p< 0,05), que tenían una edad media de 50 ± 15 años. Los nive-les de PCR encontrados en los pacientes con AR, presentaron unosvalores medios de 15,3 ± 20,5 mg/L y unos valores medios de FR de93,3 ± 16,7 UI/L En cuanto a los ANAs fueron positivos en 9 pacien-tes y los ENAs, se distribuyeron: - 1 paciente: Título 1/160, PatronHomogeneo.-2 pacientes, 1/160, SSA+ y SSB+, 1 paciente 1/320.- 2pacientes, 1/640, P.Centromero, SSA+ y SSB+. - 1/1.280, P. Homoge-neo, SSA+. - 2 pacientes, 1/1.280 P. Espiculado, SSA+No hemos encon-trado, asociación estadísticamente significativa al comparar medianteregresión lineal los valores de Anti-MCV y de FR, los de Anti-MCV yde PCR, ni al comparar los niveles de PCR y de FR (p > 0,05). Un estu-dio de literatura en 1.149 pacientes diagnosticados de AR comprobóla relevancia diagnóstica y el valor pronóstico del anti-MCV ELISAcomparado con el anti-CCP ELISA. En un grupo de pacientes sepa-rado del estudio se demuestra que el anti-MCV ELISA solo es mejormarcador pronóstico que la combinación de anti-CCP y FR. Tambiénse encontró una buena correlación del anti-MCV y la actividad de laenfermedad con el DAS-Score. Estos resultados demuestran la supe-rioridad de la vimentina citrulinada mutada de forma natural compa-rada con el fragmento sintético. La determinación de anti-MCV queen diferentes estudios ha demostrado ser un 98% más específica enpacientes con AR y tener una sensibilidad del 82%. Por tanto, se tratade un marcador precoz de AR temprana, y que en estudios prospec-tivos demostró la progresión de artritis no diferenciada en AR en el40% de los pacientes.

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98. EVALUACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ANTI-CCP DE TER-CERA GENERACIÓN PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAARTRITIS REUMATOIDE EN POLIARTRITIS INDIFEREN-CIADAS TRAS 4 AÑOS DE SEGUIMIENTO. Caro-Oleas JL1,Fernández-Suárez A2, Porrino C3, Reneses S4, Wichmann I1, Núñez-Roldán A1. 1Servicios de Inmunología y 4Reumatología, Hospitales Uni-versitarios Virgen del Rocío, Sevilla. 2Área de Biotecnología (AnálisisClínicos), Hospital Alto Guadalquivir, Ándujar; 3Área Integrada de Bio-tecnología (Análisis Clínicos), Hospital de Poniente, El Ejido.

Introducción. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedadautoinmune sistémica cuya detección resulta difícil en estadios tem-pranos. Tanto el factor reumatoide (FR), que forma parte de los cri-terios de la American College of Rheumatology (ACR), como losanticuerpos anti-péptido cíclico citrulinado (Ac. anti-CCP), han mos-trado ser útiles para el diagnóstico y seguimiento de la AR. La difi-cultad para conseguir un diagnóstico definitivo de AR, o de otrotipo de enfermedad reumática, se refleja en los resultados recogi-dos en nuestro hospital en los que se encontró, que el 24% de lospacientes con poliartritis de inicio seguidos durante un año tras laprimera consulta, no completaron los criterios diagnósticos de laACR de ninguna enfermedad reumática, quedando clasificadoscomo poliartritis indiferenciadas. El objetivo de este trabajo es rea-lizar una nueva revisión a fecha de enero de 2007, tras cuatro añosde seguimiento, de los pacientes con poliartritis indiferenciada quepermanecían sin diagnóstico de certeza tras el primer año, y corre-lacionar los nuevos diagnósticos obtenidos con los niveles de Ac.anti-CCP y FR.

Material y métodos. Se recogieron muestras de suero a todoslos pacientes procedentes de Atención Primaria, Servicios de Urgen-cias y Consultas Externas de Reumatología que fueron derivadospor primera vez a la Unidad de Poliartritis de Inicio del HospitalUniversitario Virgen del Rocío de Sevilla. Todos ellos fueron inclui-dos (edad ≥ 16 años; tiempo evolución ≥ 4 semanas ≤ 1 año; 2 o másarticulaciones inflamadas) en un registro informatizado prospecti-vo desde enero de 2002. Tras seguimiento de un año, desde la pri-mera consulta, se establecieron los diagnósticos según los criteriosde la ACR. Transcurrido este tiempo 56 individuos seguían mante-niendo el diagnóstico de poliartritis indiferenciada. Se revisaron lashistorias clínicas de la totalidad de estos pacientes a fecha 1 de ene-ro de 2007 (tras cuatro años de seguimiento), para verificar la apa-rición de otro diagnóstico diferente durante este tiempo. En todosellos, se han determinado los Ac. anti-CCP utilizando el métodoQUANTA LiteTM CCP3 (3ª generación) IgG ELISA (INOVA Diag-nostic Inc., San Diego U.S.A.) y el FR (anti-total) por nefelometría enBN® II (Dade Behring, Marburg, Germany) usando el método N latexRF method (Dade Behring)

Resultados. Del total de 56 pacientes con poliartritis indiferen-ciada incluidos en este estudio, 12 casos completaban criterios diag-nósticos para alguna enfermedad reumática. Los diagnósticos encon-trados son 3 artritis reumatoide seronegativas, 8 artritis reumatoideseropositivas y una artritis psoriásica. Los niveles de Ac. anti-CCPfueron positivos (y elevados) en 5 de los 12 pacientes diagnosticadosde AR, presentando también todos ellos FR positivo. Por otra parte,de los 7 pacientes con Ac. anti-CCP negativos, 6 fueron diagnosti-cados de AR (3 seropositivos y 3 seronegativos para el FR) y sólo unomostró un diagnóstico distinto. El paciente con artritis psoriásica pre-sentaba niveles muy bajos de Ac. anti-CCP y FR positivo. Tras cua-tro años de seguimiento y tras ésta última revisión, todavía quedan

44 individuos con poliartritis indiferenciada, siendo todos FR y Ac.anti-CCP negativos.

Conclusiones. A la vista de los resultados obtenidos en el presen-te estudio, se puede concluir que la concurrencia de un resultado posi-tivo para el FR y los Ac. anti-CCP en un paciente con poliartritis de ini-cio, que no cumpla los criterios diagnósticos de la ACR para el diag-nóstico de AR, puede ser un útil indicador predictivo de la presenciade una futura AR.

99. UTILIDAD DIAGNOSTICA DE LA CCP EN EL DIAGNOS-TICO DE AR EN ELÁREA SANITARIA 1 DE LA COMUNIDADDE MADRID. Pérez F, Lucendo MJ, Fragoso MA, Juan CS, Her-nandez E, Garcia M, Herranz M. CEP Vicente Soldevilla, Area Sani-taria 1. Hospital Virgen de la Torre.

Introducción. Los anticuerpos frente a los péptidos citrulinados(CCP) han sido descritos recientemente y en poco tiempo han desper-tado un gran interés desde el punto de vista diagnóstico y pronóstico,para evaluar el riesgo de desarrollar Artritis reumatoide

Material y métodos. Se han estudiado 300 sueros de pacientes,seriados remitidos a nuestro laboratorio para la evaluación del factorreumatoide.

El estudio de CCP se realizó mediante el método de Elia CCP (Pha-dia, Uppsala, Suecia).

Resultados. Con un punto de corte de 10 Elia U/ml, la sensibili-dad para Elia CCP fue de 87,8% , especificidad 96,7%, frente a 62% y80% respectivamente del factor reumatoide.

El valor predictivo negativo y positivo fue de 97,8% y 95,3% paraElia CCP, frente a 87% y 92% respectivamente del factor reumatoide.

Conclusiones. El mayor valor predictivo positivo de CCP sugie-re ser un marcador de gran utilidad en la evaluación del riesgo e ini-cio de acciones preventivas.

Elia CCP es el primer sistema de análisis totalmente automatiza-do para anticuerpos CCP existente hasta la fecha.

100.FRACTURA ATRAUMÁTICA DE METATARSO EN PACIEN-TE CON SÍNDROME DE ANTICUERPOS ANTIFOSFOLÍPI-DOS. Alecsandru D1, Fernandez-Cruz E2, Rodríguez-Mahou M2,Rodríguez-Mendez A3, Carbone J2. 1Servicios de Inmunología, Hos-pital Clínico San Carlos y 2Hospital Gregorio Marañón, Madrid. 3Ser-vicio de Medicina Interna, Hospital Virgen del Valle, Toledo.

Introducción y objetivos. Las fracturas de stress de metatarsianos(sin traumatismo previo, en hueso sano) se producen como resultadode descargas repetitivas, cíclicas y de larga duración, y son más comu-nes en personas predispuestas como militares y atletas. Han sido des-critas también en enfermedades metabólicas y más frecuentemente enel sexo femenino.

El síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (SAAF) es una enfer-medad caracterizada por episodios recurrentes de trombosis arterialo venosa y/o pérdidas fetales en presencia en suero de anticuerposanticardiolipina (ACA) o anticuerpos anti-beta-2-gligoproteina I o pre-sencia de anticoagulante lúpico. Entre las manifestaciones no-trombó-ticas del SAAF se encuentra la necrosis ósea avascular y el sitio másfrecuente de aparición es la cabeza femoral. Presentamos una pacien-te con SAAF primario, con fractura de metatarsiano sin otros facto-res de riesgo.

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Paciente y métodos. Paciente mujer de 43 años, sin factores de ries-go trombótico, que acude a la Consulta de Inmunología Clínica delHGUGM por presentar un episodio de trombosis de vena central dela retina de OI (confirmado por angiografía) en presencia de títulos ele-vados de ACA IgM. Antecedente: 3 episodios de epiescleritis. No pre-senta otra sintomatología sugestiva de proceso autoinmune sistémico.Se diagnosticó un SAAF primario y se inició tratamiento con acenocu-marol (INR 2-3). Dos años después la paciente refiere dolor en el pieizquierdo sin otra sintomatología y tras un estudio radiológico se con-firma el diagnóstico de fractura de 5º metatarsiano. Se descartaron fac-tores de riesgo y traumatismo. Familiares: una hermana con tiroiditisautoinmune.

Resultados. ACA IgM a títulos elevados en 4 ocasiones; positivi-dad de anticuerpos anti-beta-2-glicoproteína-I IgM; anticuerpos anti-tiroglobulina (869-1553 UI/ml) con perfil tiroideo normal y sin mani-festaciones clínicas; ANA positivos a título bajo (1/80), anticuerposanti-ADN negativos; inmunoglobulinas séricas, complemento y acti-vidad hemolitica del complemento normales; calcemia, fosfatasa alca-lina y perfil metabólico normales. Estudio de otras coagulopatías nor-mal.

Conclusiones. Solo un caso de características similares (SAAF ysin otros factores de riesgo de fractura de metatarso) ha sido descritoen la literatura. Es probable que los microinfartos óseos aparecidos porla interacción de los anticuerpos antifosfolípidos con el endotelio vas-cular lleven a la lesión ósea y fractura posterior, aunque no se handemostrado signos de trombosis. La fractura de metatarso, una mani-festación rara del SAAF, puede ser el primer síntoma de la enferme-dad o aparecer durante su curso, lo cual se debe tener en cuenta parael oportuno diagnóstico y tratamiento.

101.ESTUDIO COMPARATIVO DE DOS ENSAYOS PARA LADETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-SP100. LucenaJM, Montes Cano M, Caro JL, Respaldiza N, Alvarez A, SánchezRomán J, Núñez Roldán A, Wichmann I. Hospital Universitario Vir-gen del Rocío, Sevilla.

Los anticuerpos anti-Sp100 se han descrito en la cirrosis biliar pri-maria (CBP) con una prevalencia de entre 13-44%. Se ha propuesto que,incluso en ausencia de anticuerpos antimitocondriales, Sp100 podríaser un marcador para CBP. Por el contrario, otros autores han propues-to que este anticuerpo puede estar presente en otras enfermedadeshepáticas distintas a CBP o en patologías del tejido conectivo. Puestoque el patrón típico de múltiple nuclear dots (MND) por inmunofluo-rescencia indirecta (IFI) correspondiente a Sp100 en ocasiones es difí-cil de interpretar, sobre todo en casos de solapamiento con otros anti-cuerpos, el desarrollo de ELISAs confirmatorios ha sido de gran ayu-da.

En este estudio se han comparado los niveles de anticuerposanti-Sp100 de pacientes mediante dos ELISAs: (a) el kit Sp100 pro-ducido por IMTEC, Immunodiagnostica GMBH, Berlin, Alemania,y (b) el kit QuantaLite<TM> Sp100 producido recientemente porINOVA Diagnostics, San Diego, EEUU. Analizamos aquí la corre-lación entre ambos ensayos y comparamos su eficiencia para el diag-nóstico de la CBP. También comentamos la reactividad en otrasenfermedades.

Estudiamos 77 sueros por IFI con el patrón típico de MND con lossiguientes diagnósticos: 32 CBP, 5 hepatopatías no CBP, 12 Lupus eri-tematosos sistémicos (LES), 4 conectivopatías no LES, 6 enfermedades

esqueléticas, 2 enfermedades pulmonares fibrosantes, 5 enfermedadeshematológicas, 12 casos con enfermedades misceláneas, incluyéndo-se además un grupo de control IFI negativo.

La presencia de anticuerpos positivos a MND/Sp100 se detec-tó no sólo en enfermedades hepáticas, principalmente CBP, sinotambién en otras entidades clínicas, confirmándose por ambas téc-nicas. Los tests funcionan con la misma eficiencia, a pesar de sudiferente sistema de cuantificación y diferente antígeno recombi-nante de cebado: (a) está basado en una curva standard clásica y (b)en una calibración semicuantitativa sobre un valor de corte. Discre-pancias menores podrían explicarse por diferencias en el epítopoinmunodominante utilizado en los ELISAs. El antígeno usado en(a) es una secuencia recombinante truncada, inmunodominante, de26 kD, correspondiendo a los aminoácidos 240-474, nucleótidos 747-1454. El antígeno usado por (b) incluye varios segmentos de ami-noácidos contenidos en la región 240-474. Las CBP AMA negativasmostraban niveles inferiores de Sp100. Los LES Sp100+ mostra-ban niveles elevados en ambos tests, reconociendo pues el mismoepítopo que las CBP.

En resumen, concluimos que ambos ELISAs muestran una eficien-cia similar en la detección de anticuerpos anti-Sp100 en pacientes MNDpositivos. El diagnóstico de CBP debe establecerse en el contexto clí-nico adecuado, dado que en otras enfermedades, especialmente el LES,también pueden estar presentes niveles elevados de anticuerpos anti-Sp100.

SESIÓN 7: ALERGIA Y OTROS

Moderadores: Ignacio Moneo Goiri (Madrid), Gonzalo Rubio Pedraza (Murcia)

102.INFLUENCIA DEL TIPO DE MEMBRANA DE HEMODIALI-SIS EN LA LINFOPENIA Y LA ACTIVACION LINFOCITARIAEN PACIENTES HEMODIALIZADOS. Hernández A1, SánchezMA1, Villarroel M1, Barcenilla H1, Díaz D1, Parra T3, Pérez J3, Arri-ba G de3, Prieto A1, Monserrat J1, Reyes E1, Álvarez de Mon M1,2.1Unidad I+D asociada UAH/CNB-CSIC, IMMPA. Dpto Medicina. UAH.2Serv. de enfermedades del sist. inmune y oncología. HUPA. Alcalá deHenares. 3Serv. de nefrología del Hospital Univer. de Guadalajara.

Introducción. El deterioro de la función renal se asocia a altera-ciones de las células mononucleares de sangre periférica en los enfer-mos de insuficiencia renal y la hemodiálisis acentúa estas alteracio-nes.

Objetivo: Estudiar en que medida el tipo de membrana utiliza-da en el proceso de hemodiálisis afecta a las células mononucleares depacientes de insuficiencia renal crónica comparando las alteracionesasociadas al proceso de hemodiálisis.

Materiales y métodos. En el estudio se han incluido 12 pacientesde insuficiencia renal crónica, de características similares, divididos endos grupos según la membrana de diálisis que se utilizó en el proceso(7 pacientes con membrana tipo FX-80 y 5 con P-17L). Se extrajeroncélulas mononucleares de sangre periférica justo antes y después delproceso de diálisis. El estudio inmunofenotípico se realizó por citome-tría de flujo de 4 colores.

Resultados. Los pacientes sometidos a hemodiálisis con membra-na P17L presentan una menor linfopenia tras el proceso, además se obser-

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va una menor depleción de linfocitos B y linfocitos T tanto CD4 comoCD8. Por otra parte el porcentaje de linfocitos CD71+, CD40L+, CD62L+y CCR7+ se vieron incrementados tras la hemodiálisis con la membra-na P17L mientras que el porcentaje de linfocitos CD86+ y CD25+ se vie-ron incrementados en el caso del uso de la membrana FX80.

Conclusiones. La hemodiálisis realizada con la membrana P17Lproduce una menor linfopenia que la inducida por la membrana FX-80. Sin embargo los pacientes sometidos a hemodiálisis con P17L pre-sentan mayor grado de activación celular que los sometidos a hemo-diálisis con la membrana FX-80.

103.REGULACIÓN DE LA CONTRACTILIDAD DE LAS CÉLULASFOLICULARES DENTRÍTICAS POR CITOQUINAS. Muñoz-Fernandez R, Tirado I, Blanco O, Mata C de la, Leno E, Abadia-Molina AC, Garcia Olivares E. Departamento de Bioquímica y Bio-logía Molecular 3 e Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad deGranada.

Las células foliculares dentríticas (FDC) son células de los folícu-los linfoides que participan en la respuesta secundaria de las células By rescatan a estas células de la apoptosis. Nuestro grupo ha demostra-do que las FDC son células mesenquimales relacionadas con las MSC(mesenchymal ítem cells). También hemos observado que las FDC secomportan como miofibroblastos, pues expresan alfa-SM-actina y pre-sentan contractilidad in vitro. En el presente trabajo hemos estudiadola inducción de contractilidad por distintas citoquinas de las FDC conel método de contractilidad en geles de colágeno.

Las citoquinas Th1, IL-2 e IFNγ incrementaron la contractilidad delas FDC, mientras que la citoquina Th2 IL10 produjo un descenso dela contractilidad de estas células. Otras citoquinas como el TNF yLTα1β2, implicadas en la diferenciación de las FDC, también incremen-taron la contractilidad de las FDC.

Al observar la expresión de alfa-SM-actina mediante inmunofluo-rescencia las células tratadas con las distintas citoquinas, observa-mos que aquellas citoquinas que inducían contractilidad de las FDCpresentaban una mayor incorporación de alfa-SM-actina a las fibrasde estrés, mientras la IL-10, que produce un descenso de la contracti-lidad, produjo una inhibición de la incorporación de esta molécula alas fibras de estrés. Estos resultados demuestran la participación de laalfa-SM-actina en la actividad contráctil de las FDC y la regulación deesta actividad por citoquinas.

104.DEFINICIÓN DE UN PERFIL DE ALERGENOS ÚTIL EN ELDIAGNÓSTICO IN VITRO DE ALERGIA EN LA POBLACIÓNPEDIÁTRICA DE CANTABRIA. Villegas Zambrano N, SánchezCastañón M, Gómez C, López-Hoyos M. Servicio de Inmunología.Hospital Universitario «Marqués de Valdecilla».

La sospecha de alergia es una de las consultas más frecuentes enPediatría. En el diagnóstico in vitro la práctica habitual consiste en rea-lizar un cribado de alergenos aéreos y/o alimentarios mediante elempleo de sistemas con mezclas de alergenos. En caso de cribado posi-tivo, debería determinarse las especificidades.

Objetivo. Determinar la prevalencia de resultados de IgE especí-fica en las muestras de pacientes pediátricos remitidos a nuestro labo-ratorio, con el fin de determinar el panel de IgE específica útil parasu uso una vez obtenido un resultado de cribado positivo.

Métodos. Se analizaron los resultados de 369 pacientes pediátri-cos remitidos consecutivamente a nuestro laboratorio desde AtenciónPrimaria y Especializada (Pediatría, Digestivo y Neumología) solici-tando un panel de cribado de aeroalergenos o combinado. Se excluye-ron los remitidos desde Alergología Pediátrica para evitar sesgos. Sedeterminó la IgE total sérica mediante nefelometría (BNII, Dade Beh-ring) y la IgE específica mediante el sistema de CAP (ImmunoCAP250,Phadia), considerándose un resultado positivo de IgE específico todoaquel ≥ 0,35 KUA/L.

Resultados. Los alergenos frente a los que más IgE específicas sedeterminaron fueron: D. Pteronysimus (n= 254), espiguilla (n=278), hier-ba timotea (n=278), caspa de gato (n=225), caspa de perro (n=218), lechetotal (n=179), clara de huevo (n=131). De ellas, fueron positivos: 71%,29%, 28%, 14%, 7%, 23% y 26%, respectivamente. El 41% de los pacien-tes fueron positivos al tiempo para D. Pteronysimus, espiguilla y hier-ba timotea. De los pacientes positivos para IgE frente a leche total, 33%fueron positivos para a-lactoalbúmina, 28% para b-lactoglobulina y26% para caseína, mientras que el 26% no mostró IgE específica fren-te a ninguno de estos componentes. El 24% de los pacientes con IgEespecífica frente a la clara de huevo tuvieron también reactividad conla yema de huevo. Además, el 42% de los niños con IgE específica fren-te a la clara de huevo también la tuvieron frente a la leche total. Final-mente, la IgE específica frente a otros alergenos menos solicitados (A.Fumigatus, pollo, mariscos, pescados y otros alimentos), mostró un por-centaje de resultados positivos inferior al 5%.

Conclusión. Aunque el estudio adolece de datos clínicos, desdeun punto de vista de gestión del laboratorio los datos definen un per-fil de IgE específica a emplear en caso de cribado de alergia in vitropositivo. En caso de cribado a aeroalergenos positivos, el perfil se com-pone de D. Pteronysimus, espiguilla, hierba timotea, caspa de gato, cas-pa de perro y, en caso de cribado a alimentos positivo, el perfil inclu-ye clara de huevo y leche total. El resto de alergenos deberán solici-tarse de forma específica por el Pediatra en caso de clara sospecha clí-nica.

105.ALTERACIONES DE LAS CIFRAS DE SUBPOBLACIONESMONOCITARIAS EN PACIENTES CON LEUCEMIA LINFÁ-TICA CRÓNICA DE CÉLULAS B (LLC-B). Sánchez MA1, Villa-rroel M1, Hernández A1, Mur S1, Barcenilla H1, Díaz D1, Prieto A1,Reyes E1, Monserrat J1, Sanroman IL3, Alvarez-Mon M1,2. 1UnidadI+D asociada UAH/CNB-CSIC,IMMPA. Dpto. Medicina. UAH. 2Serv.de enfermedades del sist. inmune y oncología.HUPA.Alcalá de Henares.3Serv. de hematologia del Hospital Universitario de Guadalajara.

Introducción. Los monocitos y macrófagos están involucradosen la respuesta antitumoral. Los monocitos de sangre periférica cons-tituyen una población celular heterogénea de células que compren-de varias subpoblaciones. Las principales subpoblaciones de mono-citos son diferenciadas en base a la expresión de los marcadores CD14y CD16. Así se distinguen diferentes poblaciones, una poblaciónCD16+CD14+ y otras dos quecarecen de la expresión de CD16 y quese diferencian por una mayor (high) o menor (low) expresión del antí-geno CD14.

Los pacientes con LLC-B presentan alteraciones linfocitarias feno-típicas funcionales pero se desconoce si presentan alteraciones en lascifras sanguíneas de subpoblaciones monocitarias.

Objetivo: Caracterizar las cifras de las diferentes subpoblacionesmonocitarias de sangre periférica en los pacientes con LLC-B.

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Materiales métodos. Para el estudio inmunofenotípico se utiliza-ron células mononucleares de sangre periférica de 4 pacientes con LLC-B sin tratamiento y de 4 controles sanos. En el estudio inmunofenotí-pico de las diferentes poblaciones de monocitos se utilizaron anticuer-pos monoclonales frente a los antígenos CD14, CD16, CXCR1 y CD62Lpara su uso en citometría de flujo de 4 colores.

Resultados. En los pacientes con LLC-B se observaron alteracio-nes significativas en el número absoluto de monocitos de sangre peri-férica con respecto a los controles sanos. Destacando un aumento del50% del número de monocitos totales en los pacientes respecto a loscontroles sanos a su vez existe un aumento significativo del 24% enel número de los monocitos CD16+CD14+ y el 39% de los monocitosCD16-CD14+low. Por el contrario se observa una disminución signi-ficativa del 15% en los monocitos CD16-CD14+high. Estas alteracio-nes se observan también en los monocitos que coexpresan los marca-dores CD62L y CXCR1, así los monocitos CD14+low que coexpresanesos marcadores se encuentran aumentados en un 137% con respectoa las cifras de los controles mientras que los monocitos CD14+highes-tán disminuidos en un 59%.

Conclusiones. Las cifras sanguíneas de subpoblaciones monoci-tarias se encuentran significativamente alteradas en pacientes con LLC-B.

106.APLICACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES EN LADETECCIÓN DE DINOFLAGELADOS MARINOS MEDIAN-TE MICROSCOPÍA CONFOCAL Y CITOMETRÍA DE FLUJO.Garet E, Pérez D, Carrera M, Barreiro A, Muñoz S, Guisande C,González-Fernández A. Universidad de Vigo.

Antecedentes. Algunas microalgas marinas son productoras depotentes toxinas que afectan a numerosas especies, incluido el hom-bre. Su sobrecrecimiento, conocido coloquialmente como mareas rojastóxicas, provoca graves pérdidas económicas en actividades como acui-cultura y pesca. Algas del género Alexandrium producen con frecuen-cia potentes neurotoxinas, que son acumuladas por organismos filtra-dores como el mejillón, causando intoxicación en los consumidores deestos organismos contaminados. La temprana y correcta identificaciónde estas especies tóxicas es crucial para poder tomar medidas preven-tivas. Tradicionalmente, la monitorización de las mareas rojas, involu-cra técnicas lentas y poco precisas como la identificación morfológicabajo microscopia óptica. Se propone como alternativa el uso de anti-cuerpos monoclonales, que aplicados al medio marino, ofrecerían ven-tajas como: sensibilidad, especificidad y rapidez, además de la posibi-lidad de automatizar fácilment e el estudio de muestras de planctoncon técnicas como la citometría de flujo.

Objetivos. Optimizar la identificación de la microalga Alexandriumminutum, utilizando anticuerpos monoclonales específicos obtenidosen nuestro laboratorio (M90.3 y M54.3), mediante citometría de flujo.

Materiales y métodos. Cultivos monoespecíficos de microalgasde distintas especies del género Alexandrium, y representantes de otrasclases filogenéticas, fueron mantenidos bajo condiciones controladasde luz y nutrientes. Células en fase exponencial de crecimiento se reco-gieron por centrifugación y se fijaron usando paraformaldehído. A con-tinuación se lavaron e incubaron con los anticuerpos monoclonalesM90.3 y M54.3. La reacción fue evidenciada con anticuerpos secunda-rios conjugados con biotina y streptavidina-FITC o -PE. Las célulasmarcadas fueron analizadas mediante microscopía confocal y citome-tría de flujo.

Resultados. Ambos anticuerpos, M90.3 y M54.3, mostraron unatinción específica de la especie A. minutum, tanto por microscopía con-focal como por citometría de flujo, sin observarse reacción cruzada conninguna de las restantes especies testadas. El análisis mediante cito-metría de flujo, incrementa la rapidez y eficiencia de la detección demicroalgas marinas.

Conclusión. La aplicación de anticuerpos monoclonales especí-ficos frente a una de las especies productoras de mareas rojas tóxicas,A. minutum, en técnicas de inmunofluorescencia utilizando citometríade flujo, puede ser una herramienta rápida, simple y altamente espe-cífica que permita la detección temprana de esta microalga en mues-tras de plancton marino.

107.INMUNODETECCIÓN DE LARVAS DE MEJILLÓN CONANTICUERPOS MONOCLONALES: OPTIMIZACIÓN Y APLI-CACIÓN FUTURA EN MONITORIZACIÓN DE MUESTRASDE PLANCTON. Pérez D, Lorenzo S, Alves D, Fuentes JM, Gon-zález-Fernández A. Universidad de Vigo.

El cultivo de mejillón se basa en el engorde de su semilla en cuer-das colgadas de estructuras flotantes llamadas «bateas». Para su colo-cación estratégica en las Rías, es crucial conocer la distribución espaciotemporal de las larvas de mejillón. La dificultad estriba en que larvas dedistintas especies de moluscos son muy semejantes (ostra, almejas, ber-berechos, etc.), lo que hace necesaria una caracterización morfológicaindividual de cada larva. Nuestro grupo obtuvo, en colaboración congrupos de investigación marina, anticuerpos monoclonales murinosfrente a larvas de mejillón. Los anticuerpos (22,8 y 36,5) reconocen tan-to a larvas de cultivo (obtenidas tras fertilización in vitro de los game-tos), como de plancton. Con el uso de estos anticuerpos pretendemosdiseñar un método rápido y riguroso, capaz de identificar a las larvasde mejillón, y que pueda ser aplicado en la monitorización rutinariade muestras de plancton, evitando la técnica tradicional de observaciónde cada larva bajo microscopio óptico o electrónico. Para ello es necesa-rio optimizar tanto el procesado de las muestras complejas de plancton(limpieza, separación de larvas), como los distintos pasos de la inmu-nodetección de larvas (tiempos mínimos de incubación, cantidad de anti-cuerpo requerido en inmunofluorescencia), así como la técnica más ópti-ma (citometría, microscopía de fluorescencia o confocal) que permita elanálisis de gran número de muestras de forma eficaz, y en el menor tiem-po posible. En cuanto al procesamiento de las muestras, hemos opti-mizado un método que permite la separación de las larvas de los molus-cos del resto organismos presentes en el plancton, en tan solo 2 minu-tos, mediante centrifugación con gradiente. Con respecto a la Inmuno-fluorescencia de las larvas, el trabajo realizado muestra que tras pro-bar distintos tiempos de incubación para el anticuerpo primario (míni-mo 5 y máximo 120 minutos), no encontramos diferencias significativasentre los distintos tiempos estudiados, mientras que es muy importan-te para los anticuerpos secundarios (siendo necesarios tiempos mínimosde 60 minutos). Con respecto a la técnica más óptima de detección, tan-to el microscopio de fluorescencia como la citometría son válidos parala identificación de las larvas teñidas. Sin embargo, el tamaño de las lar-vas limita el uso de citómetros de flujo convencionales.

Conclusión. Hemos conseguido adaptar la técnica para su uso enla rutina diaria del recuento de larvas de mejillón. La optimización delproceso de identificación de larvas de mejillón mediante inmunofluo-rescencia permite el procesado de un mayor número de muestras, conmayor rapidez y especificidad. La inmunodetección de larvas de meji-


llón es una clara alternativa a la lenta y tediosa observación microscó-pica que se realiza actualmente.

108.MONITORIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE MXA,UN GEN INDUCIBLE POR INTERFERON ALFA, EN EL TRA-TAMIENTO DE LA HEPATITIS C CRÓNICA. Fernández-ArcásN, Ibáñez A, Miranda JM. Servicio de Inmunología, Hospital CarlosHaya, Málaga.

Introducción. El interferón alfa, tratamiento de elección en la hepa-titis crónica por Virus C, ejerce su actividad antiviral mediante la induc-ción de cientos de genes. Entre los más estudiados se encuentra el genMxA, cuya expresión génica es considerada el parámetro más espe-cífico para medir la actividad biológica del interferón alfa, ya que esinducido específicamente y de manera dependiente de la dosis de inter-ferones tipo I.

Objetivo: Evaluar la expresión del gen MxA en diferentes eta-pas del tratamiento con interferón alfa, en pacientes afectos de hepa-titis crónica por Virus C.

Material y métodos. Se realizó un estudio programado desde elinicio del tratamiento con interferón pegilado, de 20 pacientes afec-tos de hepatitis crónica por el Virus C. El seguimiento de la eficacia dela terapia se comprobó mediante la determinación de la Carga Viral(CV) en sangre del virus C, en las semanas 0, 1, 4, 12, 24, 48 y 6 mesespostratamiento. Los individuos con carga viral indetectable 6 mesesdespués de finalizado el tratamiento fueron clasificados como «Res-pondedores Sostenidos» (RS) y como «No Respondedores» (NR) aque-llos pacientes con carga viral positiva.

La evolución de la expresión génica de MxA durante el tratamien-to con interferón, se estudió mediante la cuantificación del RNA delgen MxA por PCR a tiempo real, con la misma periodicidad que la CV.

Resultados. La respuesta sostenida al tratamiento con interferónfue del 70% (14 pacientes), siendo en todos ellos indetectable el virusen semana 4 del tratamiento. Por el contrario, el 30% (6 pacientes) seclasificaron como No Respondedores, con carga viral detectable entodos ellos en semana 4.

Los niveles de RNA del gen MxA determinados para los pacien-tes RS, fueron equivalentes a los hallados en los pacientes NR antes deiniciar el tratamiento con interferón. En los pacientes NR no se obser-vó variación en la expresión génica a lo largo del tratamiento, mien-tras que los pacientes RS incrementaron los niveles de RNA del genMxA, una media de 1.10 veces en la semana 12 y una media de 1.31veces en la semana 48 con respecto a la semana 0.

Conclusiones. Aunque se observa un aumento en la expresióngénica de MxA durante el tratamiento, que podría estar implicadoen el éxito de la terapia con Interferón en los pacientes con RespuestaSostenida, es necesario un estudio más amplio para valorar si éste dis-creto aumento puede asociarse realmente a una mayor eficacia en laeliminación del Virus C.

Por otra parte, es muy interesante la observación de que todos lospacientes que No responden al tratamiento recidivan precozmente, yaque todos presentan carga viral positiva en la semana 4, mientras quela CV es negativa en todos los pacientes RS. Si estos datos se confir-man en estudios más amplios, la determinación en semana 4 de la CVpodría utilizarse como marcador precoz de respuesta al tratamientocon Interferón (actualmente se valora en semana 12), evitando de estemodo 8 semanas de tratamiento y sus posibles efectos secundariosen pacientes cuya terapia es ineficaz.

109.CUANTIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS IgG, IgA EIgM, COMPLEMENTO C3 Y C4 Y PROTEÍNA C REACTIVA.ESTUDIO DE VARIABILIDAD INTER E INTRALABORATO-RIO TALLER DE INMUNOQUÍMICA 2006. Rodríguez MolinaJJ1*, Villar Guimerans LM2*, Sequí Navarro J3*, Juárez Rubio C4*,Alsina Donadeu M5**, Amengual Guedan MJ6**, Cámara Hijón C7**,Ferrer Balaguer J8**, García Delgado R9**, García Pacheco JM10**;Jiménez Garófano C11**; López Hoyos M12**, López Trascasa M13**,Martínez Cáceres EM14**, Muñoz Calleja C15**, Nocito Colón M16**,Sanchez Mozo P17**, Varela Peña P18**. *Coordinadores Taller Inmu-noquímica 2006. **Grupo de trabajo Taller Inmunoquímica 2006. 1H GU Gregorio Marañón, Madrid; 2H Ramón y Cajal, Madrid; 3H CarlosIII, Madrid; 4H de Sant Pau. Barcelona; 5H Mútua de Terrassa; 6UDIAT-CD. Corporació Sanitaria Parc Taulí. Sabadell; 7H San Pedro de Alcán-tara. Cáceres; 8H Son Dureta. Palma de Mallorca; 9Fundación JiménezDíaz . Madrid; 10H Virgen Arrixaca. Murcia; 11H Central de la Defensa.Madrid; 12H U Marqués de Valdecilla. Santander; 13H U «La Paz».Madrid; 14H U Germans Trias i Pujol. Badalona; 15H de la Princesa.Madrid; 16H Clínico de Valladolid; 17C H U Juan Canalejo. La Coruña y18H 12 de Octubre. Madrid.

Un aspecto básico en los procesos de aseguramiento de la calidadde los Laboratorios es el conocimiento objetivo de las condiciones téc-nicas de trabajo. La participación en los Talleres de Inmunoquímica dela Sociedad Española de Inmunología constituyen una herramienta degran valor para la autoevaluación objetiva de la calidad técnica.

En el Taller de Inmunoquímica 2006 se abordó un estudio de inter-comparación consistente en la distribución de una muestra de sueroprocesada 10 veces consecutivas por los Laboratorios participantespara cuantificar las Inmunoglobulinas IgG, IgA, IgM, las proteínas deComplemento C3 y C4 y la Proteína C Reactiva. Cada Laboratoriosiguió la metodología y procedimientos técnicos habituales de los res-pectivos Laboratorios. Los parámetros analizados están estandariza-dos por la Internacional Federation of Clinical Chemistry and Labora-tory Medicine.(IFCC).

El objetivo inicial del estudio es evaluar la Variabilidad Inter eIntralaboratorio en el grupo de trabajo del Taller IQ 2006 en relacióncon los parámetros analíticos enumerados. Un segundo objetivo es lavaloración de los errores aleatorio, sistemático y total para cada Labo-ratorio y parámetro y su comparación con tablas internacionales deerrores máximos admisibles.

Los resultados globales se muestran en la tabla adjunta:

Parámetro

IgG IgA IgM C3 C4 Prot C React

Media (mg/dL) 1128,92 234,79 130,25 161,80 33,58 1.10Desv estándar (mg/dl) 52,00 13,33 7,60 9.88 2,72 nd% CV 4,61 5,68 5,84 6,11 8,11 ndError máximo admisible (mg/dL) 225,78 56,35 36,47 29,64 8,17 nd

Conclusiones del estudio. a) se ha podido evaluar los errores ale-atorio, sistemático y total de cada Laboratorio para los parámetros con-siderados. b) los errores totales por parámetro en cada laboratorio soninferiores a los errores máximos admisibles. c) la homogeneidad de loslaboratorios es aceptable, con la excepción de algunas diferencias obser-vadas asociadas a diferencias en los reactivos utilizados.

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SESIÓN 8: CÉLULAS NB.CÉLULAS B

Moderadores: Ángel Corbí López (Madrid), José Antonio Brieva Romero (Cádiz)

110. ALTERACIONES DE LAS CÉLULAS NK SEGÚN EL TRATA-MIENTO FARMACOLÓGICO DE LOS ENFERMOS DE INSU-FICIENCIA RENAL CRÓNICA. Hernández A1, Sánchez MA1,Villarroel M1, Barcenilla H1, Díaz D1, Parra T3, Calvino M3, Arri-ba G de3, Prieto A1, Monserrat J1, Reyes E1, Álvarez de Mon M1, 2.1Unidad I+D asociada UAH/CNB-CSIC, IMMPA. Dpto Medicina. UAH.2Serv. de enfermedades del sist. inmune y oncología. HUPA. Alcalá deHenares. 3Serv. de nefrología del Hospital Univer. de Guadalajara.

Introducción. Los pacientes de insuficiencia renal crónica estánsometidos a diversos tratamientos alguno de los cuales puede influiren su ya de por si alterado sistema inmune.

Objetivo: Estudiar cómo afecta el tratamiento farmacológico alestado inmunológico de los pacientes de insuficiencia renal crónica.

Materiales y métodos. En este estudio incluimos 33 pacientesde insuficiencia renal crónica (criterio de inclusión: creatinina plasmá-tica>5 mg/dl y examinados en consulta de nefrología externa). Obtu-vimos las células mononucleares de la sangre periférica y el estudioinmunofenotípico se realizó por citometría de flujo de 4 colores. Secompararon pacientes que están siguiendo un tratamiento farmacoló-gico determinado, con los enfermos de insuficiencia renal crónica queno lo siguen.

Resultados. Observamos que las mayores diferencias entre gruposde pacientes clasificados en función del tratamiento con respecto a aque-llos que no reciben tratamiento se encuentran en las cifras de célulasNatural Killer (CD3-CD56+), que se ven aumentadas en un 68% en lospacientes tratados con hipolipemiantes. El aumento fue de un 30% enlos pacientes tratados con análogos de vitamina D, de un 22% en pacien-tes tratados con anticoagulantes orales y de un 29% en los tratados concalcio. Por el contrario las cifras de células NK están disminuidas un 22%en los pacientes tratados con diuréticos y un 16% en aquellos pacien-tes tratados con fármacos antianémicos (hierro y sales de hierro).

Conclusiones. Los pacientes de insuficiencia renal crónica tratadoscon hipolipemiantes, análogos de vitamina D, anticoagulantes orales y/ocalcio, comparándolos con los pacientes que no siguen este tratamien-to, tienen aumentadas sus cifras sanguíneas de células NK, al contrarioque los pacientes tratados con diuréticos y con fármacos del hierro.

111. INMUNOSENESCENCIA Y CAPACIDAD DE CONJUGACIÓNDE SUBPOBLACIONES NK Y CÉLULAS NKT EN HOMBRESY MUJERES. Martí S, Casero J, Rubio G. Inmunología, Bioquímica,Universidad Miguel Hernández, Hospital Universitario de Sant Joan,Sant Joan d'Alacant.

Introducción. Durante la inmunosenescencia se producen cam-bios que afectan a la función de todos los componentes del sistemainmunitario. Estudios previos reflejan una disminución de la acti-vidad NK y NKT en este proceso, aunque pocos datos informan sobreparámetros de conjugación de diferentes subpoblaciones NK y NKT.

Objetivos. Determinar y establecer diferencias entre los pará-metros de conjugación AUI, Á (relativo a la afinidad) y KD en diferen-tes subpoblaciones NK y NKT, en función de la edad y sexo.

Metodología. Células mononucleares de sangre periférica se hanmarcado con anticuerpos monoclonales (mAb) frente a marcadores dediferenciación NK (CD3, CD56 y CD94/NKG2) diferenciándose 5 sub-poblaciones NK diferentes: 56+94+, 56+94-, 56++94+, 56++94-, 56-94+y 3+56+ (NKT). Se han analizado por citometría de flujo de 4 fluores-cencias. Las subpoblaciones marcadas (FL2-4) se han separado median-te sorting y se han determinado las isotermas de conjugación a célu-las K562.S5, subclón de la línea celular K562, obtenido por nuestro gru-po que carece de receptor para Fc de inmunoglobulinas (CD32-), mar-cadas con CA-AM (FL1). Los donantes se han clasificado por edad(niños: 10 ± 2, jóvenes: 25 ± 5, adultos: 50 ± 5, ancianos: 75 ± 5) y sexo.

Resultados y Conclusiones. En todos los grupos de edad y sexoCD56-CD94+ presenta los valores de AUI más altos (303 ± 13), mien-tras que en CD56++94+ son los más bajos (39 ± 11). CD56dim presen-ta valores de AUI significativamente más altos en hombres que en muje-res en todos los grupos de edad, mientras que en el resto de subpobla-ciones los valores son, en general, similares. Las mujeres presentan mástendencia a mantener la capacidad de conjugación con la edad, sobretodo en CD56-94+. Tras tratamiento con IL-2, CD56bright muestramayor capacidad de estimulación en todos los grupos de edad y sexo,mientras que los/as jóvenes presentan mayor respuesta a IL-2 que losancianos en todas las subpoblaciones. Aunque nuestros datos señalanla existencia de un grupo de ancianos/as que mantienen valores altosde AUI, en general, se observa que la capacidad de conjugación esmenor en niños/as que en jóvenes y que se produce una disminu-ción de esta con la edad en todas las subpoblaciones estudiadas.

112. INFLUENCIA DE UNA DIETA RICA EN FLAVONOIDES DECACAO SOBRE LA SÍNTESIS SISTÉMICA Y MUCOSAL DEINMUNOGLOBULINAS. Ramiro-Puig E, Ramos-Romero S,Pérez-Berezo T, Ramírez-Santana C, Pérez-Cano F, Castellote C,Permanyer J, Izquierdo-Pulido M, Franch A, Castell M. Facultadde Farmacia; Universidad de Barcelona.

Introducción y objetivo. Está claramente establecido que la die-ta tiene un papel importante en el mantenimiento de una óptima fun-cionalidad inmunitaria. Paralelamente, crece el interés por los alimen-tos funcionales, considerados como aquellos que, más allá de su valornutritivo, ejercen efectos beneficiosos en el organismo. En este senti-do, el objetivo del presente trabajo se ha centrado en establecer el efec-to de dos dietas ricas en cacao, alimento rico en flavonoides, sobre lasíntesis de inmunoglobulinas (Ig) tanto a nivel sistémico como intes-tinal.

Material y métodos. Se ha dispuesto de ratas Wistar alimentadascon dos dietas ricas en cacao Natural Forastero (4 y 10%) desde el des-tete hasta las 6 semanas de edad. Tras 2 y 3 semanas de recibir la die-ta, se han obtenido muestras sanguíneas y fecales, en las que se deter-minó la concentración de los principales isotipos de Ig por técnicas deELISA. El último día, se extrajo el bazo para cuantificar su capacidadsecretora espontánea de Ig mediante ELISPOT (IgA) y ELISA (IgM eIgG). También se obtuvieron ganglios linfáticos mesentéricos y placasde Peyer y se realizan lavados intestinales para determinar su capa-cidad secretora de IgA (ELISPOT y ELISA).

Resultados. Las concentraciones séricas de IgG, IgM e IgA dismi-nuyeron hasta un 63, 35 y 35%, respectivamente, en los animales some-tidos a la dieta con 10% de cacao (P<0,01) y no se modificaron tras la die-ta con 4% de cacao. La capacidad secretora de IgM e IgG de esplenoci-tos se cuantificó en sobrenadantes tras 3 y 6 días de cultivo. La secreción

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esplénica de IgM disminuyó significativamente en los animales some-tidos a la dieta con 4% de cacao, alcanzando la máxima inhibición tras3 días de cultivo (~66%, P<0,01). La dieta con 10% de cacao, ademásde reducir la secreción de IgM, inhibió la producción de IgG. Asimismo,esta misma dieta (10%) disminuyó el número de células esplénicas secre-toras de IgA. En ganglios linfáticos mesentéricos, la capacidad secreto-ra de IgA no se modificó por ninguna de ambas dietas. Sin embargoen placas de Peyer, el número de células con elevada capacidad secre-tora de IgA disminuyó tras la dieta con 10% de cacao. Este efecto se refle-jó por una disminución de la IgA secretada al lumen intestinal, cuanti-ficada en lavado intestinal y muestras fecales.

Conclusión. Una dieta rica en cacao, a través de sus flavonoidesu otros componentes, ejerce un efecto inmunorregulador de la síntesisde anticuerpos tanto a nivel sistémico como mucosal.

113. EXPRESIÓN Y LOCALIZACIÓN INTRACELULAR DE LASPROTEÍNAS SNARE EN LAS CÉLULAS NK HUMANAS. Del-gado-Pérez L, Campos-Caro A. Unidad de Investigación. HospitalUniversitario Puerta del Mar. Cádiz.

El principal mecanismo por el que las células NK ejercen su activi-dad citotóxica es la exocitosis de los lisosomas de secreción. Existen variasenfermedades hereditarias en las que este proceso se encuentra altera-do y entre ellas la causada por la mutación del gen de la sintaxina 11 -un miembro de la familia de proteínas SNARE (Soluble N-ethylmalei-mide-sensitive factor Attachment protein REceptors)- y la causada porla mutación del gen de la munc 13-4 -un regulador de las proteínas SNA-RE-. Sin embargo, y a pesar de que las proteínas SNARE se consideranen eucariotas los mediadores universales de la fusión entre membranas,se desconoce qué miembros de esta familia de proteínas participan enla exocitosis citotóxica de las células NK. Con la finalidad de identificar-los se realizaron técnicas de RT-PCR y western blot a partir de las líne-as celulares NK-92 y NK-L (como modelo de célula NK con actividadcitotóxica) e IM9 (como control de célula linfoide con actividad secreto-ra dependiente de proteínas SNARE) así como de células NK aisladasde sangre periférica. Se identificaron los transcritos primarios y las pro-teínas correspondientes a varios SNARE previamente identificados comoelementos de la vía exocítica en otros tipos celulares de origen hema-topoyético: VAMP-2, 4, 7 y 8; Sintaxina 2, 3 y 4; y SNAP-23. En experi-mentos preliminares de microscopía de fluorescencia confocal realiza-dos en la línea NK-92 se ha confirmado la expresión de algunas de estasproteínas y se ha obtenido información sobre su distribución intrace-lular. Así, la sintaxina 4 se distribuye por la membrana plasmática yVAMP-2, SNAP-23 y sintaxina-3 lo hacen en vesículas. Respecto a sudistribución en relación con los lisosomas de secreción se observa quela de sintaxina-3 es coincidente y la de VAMP-2 es excluyente. En con-clusión, las células NK humanas expresan proteínas SNARE cuya loca-lización intracelular sugiere un posible papel de las mismas en la exoci-tosis de los lisosomas de secreción.

114. ALTERACIONES EN EL FENOTIPO Y FUNCIÓN DE CÉLU-LAS NKT INVARIANTES EN ANCIANOS SANOS. Gayoso I,Peralbo E, Pita ML, Tarazona R, Solana R. Hospital UniversitarioReina Sofia. Sección Inmunología.

Introducción. Está ampliamente descrito que la respuesta inmu-ne se encuentra afectada con la edad, proceso denominado inmunose-

nescencia. La inmunosenescencia incluye tanto el descenso de la res-puesta como de la función inmune. Recientes estudios realizados ennuestro laboratorio han incluido a las células «invariantes NKT» (iNKT)dentro de las poblaciones afectadas por el proceso de inmunosenes-cencia. Las células iNKT en humanos se caracterizan por la co-expre-sión del receptor NK CD161 y por la expresión de un receptor T (TCR)formado por una cadena Vα24JαQ y una cadena V‚11 que reconoceantígenos glucolopídicos presentados por un MHC-I no clásico deno-minado CD1d. El glucolípido α-Galactosil Cerámida (α-GalCer) estaidentificado como un potente inductor de la activación de las célulasiNKT vía TCR. De acuerdo con la expresión de los marcadores CD4y CD8 las células iNKT se pueden dividir en tres subpoblaciones: iNKT-CD8+, iNKT-CD4+ y iNKT-Dobles Negativas. Tras la activación de suTCR, las células iNKT proliferan liberando citoquinas tipo Th1 y Th2.

Las células iNKT actúan durante la respuesta innata del sistemainmune y está demostrada su implicación en la eliminación de tumo-res y en enfermedades autoinmunes en diferentes modelos experimen-tales.

Objetivos. Estudio ex vivo del fenotipo y función, secreción de cito-quinas y proliferación de células iNKT en sangre periférica proceden-te de donantes jóvenes y ancianos sanos.

Metodología. Se obtuvieron las PBMCs de donantes jóvenes (18-35 años) y ancianos (70-95 años) sanos. La identificación de las iNKTse realizó mediante fluorescencia multiparamétrica. Se utilizaron AcMoanti-Vα24, anti-Vβ11, CD8, CD4, y otros marcadores de diferenciación,así como anticuerpos anti-IFN-γ e IL-4. Para analizar la secreción decitoquinas las PBMCs se incubaron con PMA, Ionomicina y Brefeldi-na durante 6 horas La capacidad proliferativa se determinó median-te el marcaje con CFSE. Las células marcadas con CFSE se sembraronen medio de cultivo durante 5 días con IL-2 y α-GalCer.

Resultados y conclusiones. Transcurridos 5 días de cultivo invitro de las células iNKT-CFSE observamos una mayor proliferaciónen donantes jóvenes con respecto a los ancianos. Cuando observamoslas diferentes subpoblaciones de iNKT vimos como las células iNKT-CD4 son las que principalmente proliferan mientras que las célulasiNKT-CD8 quedan retrasadas en el crecimiento tanto en jóvenes comoen ancianos. El análisis de la producción de citoquinas dio como resul-tado un incremento en la producción de IL-4 y IFN-γ en células iNKTde ancianos cuando se compara con los jóvenes.

Con respecto a la caracterización fenotípica de las iNKT no encon-tramos grandes diferencias entre jóvenes y ancianos. En ambas pobla-ciones las células iNKT tienen un fenotipo: CD28+CD27+CD45RA-CD45RO+ CCR7-.

El descenso de la capacidad proliferativa de las células iNKT deancianos y el aumento de producción de IFN-γ y IL-4 indican que lascélulas iNKT se encuentran entre las poblaciones linfocitarias afecta-das por la inmunosenescencia.

115. PROMOTOR MÍNIMO REQUERIDO PARA LA REGULACIÓNTRANSCRIPCIONAL DEL GEN BLIMP1 HUMANO. Pedreño-Horrillo N, Mora-López F, Brieva JA, Campos-Caro A. Unidad deInvestigación. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cádiz.

Los linfocitos B maduros tras entrar en contacto con el antígenosufren un proceso de diferenciación a células plasmáticas (CP), cuyafunción es la secreción de Ig. En este proceso diferenciativo, como enotros, la regulación transcripcional juega un papel esencial, intervi-niendo en él diversos factores de transcripción. Entre ellos, destaca el

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represor transcripcional BLIMP-1 (B lymphocyte-Induced MaturationProtein 1) codificado por el gen PRDM1, que es considerado el regu-lador maestro en la diferenciación del linfocito B en CP, ya que su pre-sencia es suficiente y necesaria para la diferenciación y el mantenimien-to del fenotipo de la CP.

Se sabe que BLIMP-1 reprime la expresión de genes como los delINF-β, MYC, PAX5, CIITA. Sin embargo, poco se conoce sobre la regu-lación transcripcional de su gen, PRDM1. Cómo tiene lugar esta regu-lación viene siendo nuestro objetivo en los últimos años. Medianteexperimentos con genes reporteros hemos delimitado la región pro-motora mínima del gen, en la que localizamos varios elementos «cis»capaces de regular la expresión de BLIMP-1. Para estudiar factores deimplicados en esta regulación se han utilizado técnicas de retardo engel (EMSA) mediante experimentos de competencia y supershift. Seha identificado un elemento «cis» clave para la expresión del gen: unaGC-box a la cual se une el factor de transcripción Sp1 y diferentes iso-formas del factor Sp3. La mutación o la deleción de esta secuencia impi-de la actividad del promotor del gen. Solapada con esta GC-box exis-te un sitio de unión para el factor Egr-1. El tratamiento de las célulascon PMA + Ionomicina aumenta la unión del factor Egr-1 al promotory aumenta la actividad del gen reportero, sugiriendo que este factorpuede regular positivamente la expresión de BLIMP-1. La unión deestos factores se ha comprobado tanto en ensayos in vitro como in vivo,mediante inmunoprecipitación de cromatina.

116. CO-EXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES CD94/NKG2A YCD94/NKG2C EN LA SUPERFICIE DE UNA SUBPOBLACIÓNDE CÉLULAS NK. Sáez-Borderías A, Romo N, López-Botet M.Universidad Pompeu Fabra.

Los heterodímeros tipo lectina CD94/NKG2A y CD94/NKG2C sonreceptores con función inhibidora y activadora respectivamente queinteraccionan con HLA-E y se expresan en subpoblaciones de célulasNK y de linfocitos T. NKG2A presenta ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs) citoplásmicos y se asocia a la tirosina fosfatasaSHP-1, mediante la cual inhibe la señalización de otros receptores. Porel contrario NKG2C se ensambla con el adaptador DAP12 activandovías dependientes de tirosina quinasas. La función de estas moléculasse ha estudiado en células NK que expresan una u otra selectivamen-te, sin embargo hay indicios de que ambas pueden transcribirse simul-táneamente en algunos clones. Por medio de anticuerpos monoclonales(AcM) específicos analizamos su distribución y posible coexpresión enla superficie. Los estudios fenotípicos realizados con células mononu-cleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos (n=159), presen-taron una proporción variable de células NK (CD3-CD56+) NKG2A+(rango= 6,1-69,8%, media ± SD = 34,2 ±13,2), y de NKs NKG2C+ (ran-go= 0,2-84,2%, media ± SD= 15,4±14,7), y demostraron la existencia deuna subpoblación de células NK que presentan ambos receptores en lasuperficie (rango = 0,5-18,2%, media ± SD = 3,2 ± 2,5%). Por otra parte,el análisis de un panel de clones NKG2C+ indicó que la expresión deNKG2A en la superficie puede inducirse de forma transitoria tras la esti-mulación con PBMC irradiadas e IL-2; se obtuvieron resultados simi-lares incubando las células con IL-12 (20ng/ml durante 5 días). Los ensa-yos de lisis redirigida utilizando AcM específicos demostraron que ambosreceptores pueden desempeñar sus funciones contrapuestas en el mis-mo clon. Se requieren mas estudios para valorar las implicaciones fisio-lógicas que puede tener la expresión en la misma célula de receptoresinhibidores y activadores específicos para HLA-E.

117. REGULACIÓN POR LAS CÉLULAS NK DE LA RESPUESTAESPECÍFICA DE LOS LINFOCITOS T CD4+ AL CITOMEGA-LOVIRUS HUMANO. Romo N, Gumà M, López-Botet M. Uni-versidad Pompeu Fabra.

Las células NK participan en la respuesta inmunitaria innata fren-te al citomegalovirus (CMV), secretando citocinas proinflamatorias ydestruyendo las células infectadas. Por otra parte, se ha propuesto quelas células NK podrían regular el desarrollo de la respuesta específica.La incubación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)de individuos seropositivos (CMV+) en presencia del virus promue-ve una expansión oligoclonal de linfocitos T citotóxicos CD4+ especí-ficos. En estas condiciones experimentales hemos observado que el tra-tamiento con un anticuerpo F(ab')2 anti CD94 soluble inhibe dichaexpansión sugiriendo que las células NK podrían estar implicadasen el proceso. Para analizar el hipotético papel regulador de las célu-las NK en la respuesta adaptativa de los linfocitos T CD4+ al CMV rea-lizamos experimentos de fraccionamiento celular, estimulando dife-rentes poblaciones leucocitarias con el virus y analizando su respues-ta (secreción de IFNγ y/o proliferación). La estimulación de linfoci-tos T CD4+ purificados en presencia del CMV y de células dendríticasmieloides (mDC) autólogas, generadas cultivando monocitos con IL-4 + GM-CSF, y maduradas posteriormente tras la estimulación con LPS,promovió una respuesta específica (secreción de IFNγ) frente al virus.La adición en este ensayo de poblaciones de células NK,CD94/NKG2A+ o CD94/NKG2C+ purificadas, potenció la secreciónde IFNg de los linfocitos T CD4+ en respuesta a concentraciones subóp-timas de CMV. En conjunto los resultados indican que las células NKpueden contribuir a estimular la respuesta adaptativa al virus. Se requie-ren mas estudios para analizar el papel de las NK en la expansión delas células T CD4+ en este sistema.

118. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DEL COMPARTIMENTONKT DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON ARTRI-TIS REUMATOIDE Y OSTEOARTRITIS. IMPLICACIONESBIOLÓGICAS DEL TRATAMIENTO. Villarroel M1, Sánchez MA1,Sánchez-Atrio A2, Zaldivar G1, García JDD3, Pérez-Gómez A2,Cuende E2, Lopez A2, Albarran F2, Monserrat J1, Mallo AB1, ReyesE1, Álvarez-Mon M1-2. 1Laboratorio de Enfermedades del Sistema Inmu-ne y Oncología. Unidad I+D Asociada CNB-CSIC. Dpto. Medicina.UAH. 2Servicio de Enfermedades del Sistema Inmune y Oncología.HUPA. 3Servicio de Medicina Interna. HUPA. Alcalá de Henares.

Introducción. La intensidad del tratamiento en pacientes conartritis reumatoide (AR) esta directamente relacionada con la acciónbiológica de los fármacos empleados. Las diferentes estrategias tera-péuticas van desde el uso de antiinflamatorios no esteroideos(AINEs), glucocorticoides (GC), fármacos modificadores de la enfer-medad -FAME- sintéticos (FAME S), FAME biológicos (FAME B) oterapia combinada entre estos grupos (FAME B-S). Las células NKThan sido implicadas en la regulación de la respuesta inflamatoria,entre otros mecanismos, por la eliminación de linfocitos autorreac-tivos.

Objetivo. Analizar el compartimento NKT en sangre periférica(distribución porcentual y número absoluto de células por uL) enpacientes con AR, considerando la estrategia terapéutica empleada, enun estudio observacional transversal. Se incluyen pacientes diagnos-ticados de osteoartritis (OA) como control de enfermedad.

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Métodos. 33 pacientes diagnosticados de AR, 24 con OA y 28 con-troles sanos (CS) incluidos en este estudio. Los pacientes con AR fue-ron estratificados según la estrategia terapéutica en 5 grupos: a) pacien-tes sin tratamiento (N=3); b) tratados con FAME S - AINEs- (N=9); c)terapia combinada con FAME S - GC- (N=9); d) terapia con FAME B yGC (N=2) y e) FAME B-S (N=10). El estudio de la distribución de lascélulas NKT y de su estado de activación se determinó mediante cito-metría de flujo de 4 colores y el uso de anticuerpos monoclonales (CD56,CD3, CD8, CD57, CD16). El grado de significación fue establecido paravalores P< 0,05.

Resultados. el número de células NKT (Mediana) en pacientescon AR tratados con FAME B-S (153 cels/uL) fue significativamentesuperior que el encontrado en pacientes con AR sin tratamiento, tra-tados con FAME S-AINEs, pacientes con OA y CS (44, 89 y 111 cels/uLrespectivamente). En esta población el número absoluto de células NKTCD8+CD57+ fue superior en el grupo tratado con FAME B-S (60cels/uL) respecto al grupo sin tratamiento (22 cels/uL). El porcentajede células NKT CD16+ se encuentra incrementado en pacientes tra-tados con FAME B-GC (63,7%) respecto a aquellos tratados con FAMES-AINEs, OA y CS (44,0%, 40,0%, 38,2% respectivamente).

Conclusión. En terapias con FAME B en las que se establece unamayor respuesta biológica existe una normalización (Combinada conGC) o un incremento (Combinada con FAME S) en las cifras absolutasde células NKT. Sin embargo las terapias basadas en FAME S y AINEso GC se asocian a una disminución en el número absoluto de estas célu-las. Por lo tanto las diferentes estrategias terapéuticas en pacientes conAR se asocian con una redistribución en sangre periférica de células NKT.

SESIÓN 9: TRASPLANTES

Moderadores: Jaume Martorell Pons (Madrid), Luis Larrad Mur (Cádiz)

119. ESTUDIO DESCRIPTIVO DE ACTIVIDAD DEL BANCO YREGISTRO DE DONANTES DE MÉDULA ÓSEA DE LAREGIÓN DE MURCIA (SURESTE DE ESPAÑA)(1994-2005). RojasG, López-Bermejo A, Botella C, Moya-Quiles MR, Campillo JA,Alemany JM, López M, Sanchis MJ, Álvarez-López MR, Muro M.Fundación Española para la Lucha contra la Leucemia & Servicio de Inmu-nología, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, Murcia.

The international collaboration of 75 blood stem cell registries in42 different countries around the world over the course of 16 years isan unprecedented example of global altruism directed to helping patientsirrespective of their national ethnic origin. In this sense, Spanishbone marrow donor registry (REDMO) is member from the WMDA(World Marrow Donor Association), contacting with all donor registriesworldwide (BMDW-Bone Marrow Donors Worldwide). The REDMOis placed in sixth position of Europe and USA ranking. The Bone MarrowDonor Registry from Murcia Region is included on REDMO and isreference centre of Autonomous Government of Murcia. Our objectivewas to perform a descriptive study of the activity of the Marrow DonorsRegistry from Murcia Region. All donors in the Bank of bone marrowfrom 1994 until 2005 were included. This study analysed the numberof donors, their origin, resolution level and performed donor searchesactivity. Donors were typed by serological and molecular PCR-SSOand -SSP techniques. The Bank of bone marrow approximately contains

4000 voluntary donors typed in low- and high-resolution. A total of721 donor searches have been performed. Donor's origin accordingto several Areas of Health in which the Autonomous Community ofMurcia and other provinces will be discussed. Briefly, the procedenceof donors respect to the Health Areas was: Area I (28%), Area II(18%), Area III (23%), Area IV (6%), Area VI (10%) and other provinces(12%). In conclusion, an increase is observed in the number of annualdonors as well as a very marked increase of donor searches that areperformed every year, especially from 2004. However, donors of allethnic groups other than Western European origin are still underrepresentedin all database of blood stem cell donors.

120.PREVALENCIA AUMENTADA DE INFECCIONES GRAVESEN PACIENTES CON TRASPLANTE HEPÁTICO POR INFEC-CIÓN POR VHC: IMPLICACIÓN DE FACTORES INMUNO-LÓGICOS. Micheloud D, Resino S, Salcedo M, Bañares R, Rin-cón D, Rodríguez-M JJ, Fernández-Cruz E, Carbone J. Servicio deInmunología. Hospital Gregorio Marañón. Madrid.

Introducción. Uno de los factores que influyen en la morbi-mor-talidad en el transplante hepático ortotópico (THO) es la infección, quesuele presentarse en los primeros 90 días post-THO. El 75% de lospacientes que reciben un THO tienen alguna complicación infecciosaen el primer año. La cirrosis vírica, secundaria al Virus de la HepatitisC (VHC), es la etiología más frecuente de THO en Europa.

Objetivo. Estudiar la prevalencia de complicación infecciosa y fac-tores inmunológicos asociados en el THO por VHC.

Material y métodos. Estudio prospectivo (Noviembre 2004-Junio2006) de 46 pacientes sometidos a THO. Criterios de inclusión: a) pacien-tes con cirrosis por VHC que requerían THO (grupo-VHC = 20 pacien-tes); b) pacientes con cirrosis enólica y THO (grupo no-VHC, control= 14 pacientes). Se excluyeron pacientes con cirrosis por VHC asocia-da a otras etiologías como hepatocarcinoma; fallo hepático fulminan-te y hemocromatosis. Se incluyeron en el estudio 34 pacientes. Todoslos pacientes recibieron tacrolimus más glucocorticoides a bajas dosis.Se agregó mofetil micofenolato cuando se observó efectos colateralesdel tacrolimus. Evento Infeccioso: Infección grave según criterios CDC.Estudios inmunológicos: Pre-THO, 7, 30 y 90 días post-THO. Paráme-tros: IgG, IgA, IgM, C3, C4, FB, PCR (nefelometría); subpoblacionesCD3, CD4, CD8, CD56, CD19 (citometría de flujo de 4 colores).

Resultados. 16 pacientes presentaron infecciones graves en el gru-po-VHC (tiempo medio post-THO: 50 días) en comparación con 6 pacien-tes en el grupo control (tiempo medio post-THO: 16 días, RR 2,99, p<0,05).La infección bacteriana fue predominante en ambos grupos incluyendoneumonía y bacteriemia. Alteraciones inmunológicas: En compara-ción con el grupo control, en el grupo-VHC se observó: En el estudiopre-THO: porcentajes menores de linfocitos T-CD4+, niveles más bajosde IgA sérica y cifras más altas de C3, FB y PCR; A los 7 días post-THO:porcentajes menores de células T-CD8 y de IgA sérica y niveles más bajosde IgA. En el grupo-VHC se observó una expansión transitoria del núme-ro de células B CD19+ a los 7 días post-THO, con disminución posteriora los 30 y 90 días (en posible relación con el rebrote de carga viral VHCdescrito en estos pacientes tras el THO). Los pacientes de ambos grupospresentaron niveles significativamente más bajos de IgG, IgA e IgM alos 7 días post-THO en comparación con sus niveles basales.

Conclusión. En pacientes VHC sometidos a THO se observa unamayor prevalencia de complicación infecciosa. Alteraciones inmuno-lógicas sugestivas de un estado de inmunodeficiencia celular y humo-

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ral podrían predisponer a los pacientes a esta mayor tendencia a pade-cer infecciones.

121.NUEVA HERRAMIENTA INFORMATICA PARA EL MANEJODE LABORATORIOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD. Cano J,Recio R, Gallardo JJ, García L, García A, Lavado R, Romero MJ,Miranda JM, Fernández N, Caballero A, Alonso A.Servicio de Inmu-nología. Hospital Regional Carlos Haya.

El laboratorio de histocompatibilidad recibe un gran numero demuestras a las que hay que aplicar distintos procedimientos analíticossegún la finalidad del estudio. Además, en algunos casos ha de reali-zar procedimientos de urgencia si participa en trasplante de órganos.Presentamos un programa informático que permite tener un laborato-rio «sin papel».

Entre las características de este programa, llamado «HLA» (His-tocompatibility Laboratory Assistant) destacan: • Manejo de muestras aisladas y muestras vinculadas en familias.• Búsquedas automatizadas del receptor idóneo atendiendo a varios

criterios seleccionables.• Manejo de sueros para citotóxicos y otro cualquier tipo de anti-

cuerpos, incluidos los detectables por tecnología luminex.• Selección de antígenos HLA de listas desplegables y modificables

por el usuario. Almacenamiento completo del resultado, incluyen-do las imágenes de geles.

• Acepta resultados de baja y alta resolución.• Impresión de resultados en papel o envío a lugares remotos en pdf.• Manejo de muestras de rutina, controles de calidad y proyectos de

investigación en histocompatibilidad.• Alarmas: a) mismatches donante-receptor, b) mismatches repeti-

dos en trasplantes sucesivos y c) presencia de anticuerpos en sue-ros contra antígenos del donante.

• Trabajo en red.

122.ALOANTICUERPOS HLA CLASE I Y CLASE II POST-TRAS-PLANTE Y EVOLUCIÓN DEL IMPLANTE RENAL: EXPERIEN-CIA DE UN CENTRO. Lucas D1, Llorente S2, Botella C, Gonzá-lez-Soriano MJ2, Salgado G1, López M1, Sanchis MJ1, Alemany JM1,Minguela A1, Gimeno L2, Álvarez-López MR1, Muro M1. 1Servi-cios de Inmunología y 2Nefrologia, Hospital Universitario Virgen de laArrixaca, Murcia.

Despite the progress in renal transplantation (Tx), acute rejectionand graft failure still occur and chronic rejection continues to be themain problem in long-term allograft survival. Post-Tx monitoring ofDSA HLA IgG antibodies has been suggested to be an important toolfor graft outcome. However, not all patients with failed kidney Tx haveanti-HLA antibodies, indicating that other loci may be involved (ECA,MICA, etc). Collaborative studies are needed for dilucidate the role ofHLA antibodies in chronic rejection. Our objective was to investigatethe experience in our center with those patients included in the studyof 14th International Histocompatibility Workshop submitted to thisComponent. Screening of pre- and post-transplant sera from 209 renalallograft recipients for IgG anti-HLA class I and class II antibodies wereperformed (LabScreen, OL, CA). These patients was included to havesurvived more than 6 months post-Tx. Data of donor-recipient HLAmatching, previous Tx, % pre-Tx PRA and immunosuppressor regimen

were compared. One year later follow-up clinical data were evaluatedwith respect to allograft status. The percentage of patients with IgGantibodies class I was 15.8%, 4.3% with class II and 23.9% class I+II.Thus, 44% of patients had HLA IgG antibodies. However, amongpatients whose transplant failed, 60% (40% class I+II, 20% class I and0% class II) had DSA anti-HLA IgG antibodies compared with 43.1%(23% class I+II, 15% class I and 4% class II) of those with functioningkidney. Comparing only HLA class I antibodies this difference is evenhigher (60% vs 38.7%). Indeed, all graft failures were suffered for patientswith CsA, MMF and prednisone treatment. In conclusion, these dataindicate that, a correlation exists between post-transplant HLA IgGantibodies apparition and kidney transplant outcome.

123.ESTUDIO INMUNOLÓGICO DE UN CASO DE RECHAZOHUMORAL ACELERADO: VALORACIÓN DE LAS ESPECIFI-CIDADES ANTI-HLA Y DE LOS EPÍTOPOS IMPLICADOS ENLA RESPUESTA. Marín-Crespo N, Rubio-García M, Campos-Esteban J, Andres-Martin A, Castañer-Alabau JL. Hospital Ramóny Cajal. Madrid.

Mujer de 43 años con IR secundaria a poliquistosis hepatorrenalen hemodiálisis desde 11/2004, HTA, hiperPTH secundario y nefrectomíaderecha en 07/2005. No transfusiones previas, tres hijos vivos, noabortos, no trasplantes previos. Tipaje HLA: A11 A23 B27 B44 Bw4 DR1DR7 .Presenta sensibilización previa frente a los antígenos HLA-A29+31+32+33+68 y frente a HLA-II, con valores de PRA del 37 al 54%.

Recibe un primer injerto renal en 06/2006 con las incompatibilidadesA2 A24 B51 B39 Bw6 DR8 DR14 y prueba cruzada negativa con sueroactual y previos. Terapia inmunosupresora inicial con Prednisona,Tracolimus y Everolimus. Presenta síntomas y signos de rechazo renala partir del 5º día post-Tx, biopsia en día 7 en la que se observa necrosisfibrinoide segmentaria, lesión intersticial severa con intenso infiltradoinflamatorio (PMNs, eosinófilos y linfocitos) y vasculitis. Se plantea lavaloración inmunológica para el diagnóstico del rechazo humoral medianteel estudio de las especificidades de los anticuerpos anti-HLA mediantefluorocitometría sobre partículas de látex. Se sospecha rechazo agudomediado por anticuerpos, por lo que se sustituye Everolimus porMMF y se aplica tratamiento de rescate con Timoglobulina y Plasmaféresis.No mejora la función renal, 2ª biopsia el día 22 post-Tx en la que se aprecianecrosis cortical. En 07/2006 trasplantectomía sin incidencias.

Resultados. La respuesta de anticuerpos post-Tx (previa a laadministración de timoglobulina) mantiene un patrón de especificidadessimilar al pre-Tx, al que se le añaden especificidades propias del injerto. Con la administración de timoglobulina y plasmaféresis se observala negativización de los anticuerpos anti-HLA-II; sin embargo, aumentala reactividad frente a las especificidades pre-Tx y a las incompatibilidadesdel injerto. La reactividad anti-HLA se analizó posteriormente con elprograma Matchmaker v1.1, identificándose dos posibles epítopos(62RN y 76ES) que explican las reactividades encontradas en la evolucióndel rechazo.

Estos resultados sugieren que el rechazo humoral se produce porreacción específica frente a epítopos compartidos entre sensibilizaciónpre-Tx y la incompatibilidad HLA-B (B51+39) del injerto. Este datojunto al tiempo de aparición de los signos de rechazo sugieren unarespuesta de memoria y su expresión como rechazo acelerado. Además,el tratamiento con timoglobulina y plamaféresis no presenta efectoinmunosupresor sobre esta respuesta de memoria, resultando ineficazen el rescate de esta forma de presentación del rechazo humoral.

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124.RESPUESTA PROLIFERATIVA DE LA MOLÉCULA HLA-DQB1*0302 ASOCIADA CON RECHAZO AGUDO EN TRAS-PLANTE HEPÁTICO Y DEPLECIÓN DE MOLÉCULAS DESHLA CLASE I. Muro M1, Marín L1, Botella C1, Moya-Quiles MR1,Salgado G1, Minguela A1, Campillo JA1, Lucas D1, Villar M2, Gar-cía-Alonso AM1, Álvarez-López MR1. 1Servicio de Inmunologia, Hos-pital Universitario Virgen de la Arrixaca, Murcia, y 2Servicio de Inmu-nología, Hospital Ramon y Cajal. Madrid.

Estudios previos incluyendo los de nuestro grupo han demostradoque los niveles sericos pre-transplante de HLA clase I soluble (sHLA-I) y la presencia del alelo HLA-DQB1*0302 en receptores hepáticos sondiferentes factores implicados en el desarrollo de rechazo agudo.Además, este alelo HLAse relaciona con varias enfermedades autoinmunesy podría estar implicado en un mayor estado de aloreactividad endeterminados individuos. Nuestro objetivo era investigar la respuestaproliferativa (RP) de diferentes moléculas HLA-DQB1 con y sin depleciónde sHLA sérico alogénico. Examinamos la RP primaria (MLR-I) y lasecundaria (MLR-II) de individuos con distintas combinaciones decompatibilidad HLA-DQ en situaciones de depleción de moléculassHLA en cultivos celulares.

La depleción de las moléculas sHLA clase I de suero se realizo porbinding del anticuerpo HLA clase I (isotipo IgG2a, clon w6.32) a gelSepharosa 4B y tratamiento de las muestras de séricas, como publicado.Los cultivos celulares se realizaron por unidireccional MLR-I primaria(5 dias) y MLR-II secundaria (re-estimulada a 5 dias) utilizando célulasrespondedoras alogenicas y autologas, y estimuladoras irradiadas(lineas linfoblastoides-EBV) en combinaciones alogenicas y autologasHLA-DQB1 específicas (presencia o ausencia de HLA-DQB1*0302).

La respuesta relativa (RR) de los linfocitos HLA-DQB1*0302+ enMLR-I primaria, cuando la células estimuladoras eran semialogenicaso incompatibles, no mostró una proliferación aumentada, en situacionesde ausencia o presencia de moléculas sHLA-I.

Sin embargo, en la MLR-II secundaria (respondedora primadafrente a estimuladora), detectamos una RR aumentada en situacionesde ausencia de sHLA alogénico y usando células semialogenicas HLA-DQB1*0302+. Este resultado no se obtuvo cuando se utilizaron célulasHLA-DQB1*0302-.

En conclusión, estos datos indican que, en una respuesta primarialas diferentes combinaciones testadas muestran una manera similar deresponder, pero en la respuesta secundaria, cuando las célulasrespondedoras ha sido primadas y sensibilizadas, las moléculas sHLAjuegan diferente papel en molecules plays a different role in RPdependiendo de la constitución de las moléculas HLA-DQ específicas.

125.ESTUDIO DE LA IMPLICACIÓN DE ALOTIPOS HLA-C ENEL DESENLACE DEL TRASPLANTE HEPÁTICO A CORTOPLAZO. HLA-CW*07 COMO FACTOR PREDICTIVO DE LABUENA ACEPTACIÓN DE ESTOS INJERTOS. Moya-QuilesMR1, Alvarez R, López-Álvarez MR, Miras M, Sánchez-Mozo MP,Blanco-García MR, Marín-Moreno I, Sánchez-Bueno F, Mingue-la A, Muro M, Alonso C, Álvarez-López MR. Hospital Universita-rio Virgen de la Arrixaca.

El efecto de la compatibilidad HLA en el injerto hepático es aúncontrovérsico. Sin embargo, a pesar del uso potentes drogasinmunosupresoras, la frecuencia de rechazo agudo en estos trasplanteses bastante alta. El objetivo del presente trabajo, fue valorar si con

independencia del carácter genético del donante, el status genético delreceptor puede predeterminar la buena o mala aceptación del injertoa corto plazo. Este estudio es fruto de una colaboración dentro delámbito RED-GIT y en el mismo se compararon las frecuencias de HLA-C en 446 receptores de hígado con las de 473 individuos control. HLA-Ay -B fueron tipados mediante técnicas estándar de microlinfocitotoxicidady PCR-SSO. En principio se observó una asociación entre el epitopoAsn80 y una mejor aceptación del injerto (P= 0,01), pero un análisisposterior considerando el efecto de HLA-Cw*07 frente al resto de alelosde su mismo grupo HLA-C (portando el epitopo Asn80) demostró queel efecto observado era mayoritariamente mediado por HLA-Cw*07,ya que este alelo se asociaba negativamente con la aparición de rechazoagudo (P=0.001, Pc=0.01).

En conclusión, la presencia de HLA-Cw*07, puede ser consideradacomo un factor predictivo del buen desenlace del trasplante, ya queeste alelo se asocia negativamente con el riesgo de rechazo agudo.

El trabajo ha sido financiado por el proyecto FISS PI050944, la Red degrupos RED-GIT (G03/104).

126.NIVELES SERICOS DE TGF-B1 EN TRASPLANTE HEPATICOY SU POSIBLE INFLUENCIA EN LA EXPRESION DE MOLE-CULAS B7 EN CÉLULAS B. Botella C1, Lopez-Alvarez MR1, Ruiz-Merino G1, Marin L1, Gomez-Mateo J1, Salgado G1, Lucas D1, Blan-co-Garcia RM1, Parrilla P2, Miras M3, Minguela A1, Muro M1, Alva-rez-Lopez MR1. 1Servicio Inmunología. H.U. Virgen Arrixaca. Murcia.2Servicio Cirugía. H.U. Virgen Arrixaca. Murcia. 3Servicio MedicinaDigestiva. H.U.Virgen Arrixaca. Murcia.

El trasplante hepático es mejor aceptado que otros órganos sólidostrasplantados. Otros estudios de nuestro grupo han demostrado quela expresión de moléculas B7 (CD80 y CD86) en células B está up-regulada durante los episodios de rechazo agudo (RA). Por otra parte,en relación con el polimorfismo del TGF-B1 en el codón +25, se observóque el genotipo G/G predomina en los individuos con RA, y que elgenotipo G/C predomina en los individuos NRA.

Los objetivos de este estudio fueron: Analizar los niveles séricosde TGF-B1 en TOH en relación a la up-regulación de las moléculas B7(Día 30 post-trasplante), estudiando dichos niveles para cada fenotiposecretor de TGF-B1, así como para cada genotipo. Además se planteaestudiar la posible influencia entre la concentración sérica de TGF-B1y la expresión de moléculas B7.

La determinación sérica de TGF-B1 se realizo mediante técnicaELISA, utilizando el kit comercial Quantikine Human TGF-B1 (R &D Systems), incluyendo en dicho estudio un total de 50 individuossometidos a trasplante hepático (RA n=11 y NRA n=39).

Como resultado del estudio se observó que, al comparar las mediasde las concentraciones séricas de TGF-B1 de los individuos RA vsNRA, los valores fueron muy similares en los dos grupos, aunqueligeramente mayores en el grupo de RA. Cuando se compararon losvalores de TGF-B1 en los genotipos para el codón +25 (G/G yG/C), se observó que en el genotipo G/G los niveles séricos de TGF-B1 seguían el mismo patrón que la población global, y tenían valoresmuy similares en RA y NRA. Por el contrario, en el grupo de pacientescon genotipo G/C la concentración de TGF-B1 para los pacientes conRA alcanzó valores que duplicaban los de los pacientes sin rechazo(NRA). Además, estos cambios reflejaban un perfil similar al observadopor los cambios en el número de células CD19+CD86+ en individuoscon genotipo G/C.

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En conclusión, aunque no se puede afirmar que la concentraciónde TGF-B1 en suero de individuos TOH condicione claramente laaparición de episodios de rechazo agudo, existe una tendencia alaumento de TGF- B1, acompañada de aumento del número de célulasCD19+CD86+ en individuos con genotipo G/C.

127.INFLUENCIA DE LOS GENOTIPOS DEL CODÓN +25 DE TGF-B1 EN LA GENERACIÓN DE CÉLULAS CD19+CD86+ ENTRASPLANTE HEPÁTICO. Botella C1, Gomez-Mateo J1, MarinL1, Lopez-Alvarez MR1, Ruiz-Merino G1, Salgado G1, Lucas D1,Blanco-Garcia RM1, Parrilla P2, Miras M3, Minguela A1, Muro M1,Alvarez-Lopez MR1. 1Servicio Inmunología. H.U. Virgen Arrixaca.Murcia.2Servicio Cirugía. H.U. Virgen Arrixaca. Murcia. 3Servicio Medi-cina Digestiva. H.U.Virgen Arrixaca. Murcia.

Durante varios años, nuestro grupo ha investigado factores queintervienen en la tolerancia y el rechazo del trasplante hepático. Lasinteracciones entre citoquinas regulan la respuesta inmune hacia elórgano trasplantado. Algunas citoquinas como el TNF-α, IL-6, o IFN-γ, son proinflamatorias y promueven reacciones celulares. Otras citoquinascomo IL-10 son antiinflamatorias y pueden favorecer la respuestahumoral; y algunas como TGF-B pueden tener ambos efectos. Laproducción de citoquinas puede estar influenciada por diversospolimorfismos identificados en el promotor o en la secuencia génica.Por otra parte, estudios previos de nuestro grupo demostraron que laexpresión de las moléculas B7 (CD80 y CD86) en células B estaban up-reguladas durante el periodo de rechazo agudo.

El objetivo del presente estudio fue analizar el polimorfismo deTGF-B y testar la influencia de los diferentes genotipos en la expresiónde CD86 células B de receptores hepáticos.

El grupo de estudio estaba constituido por 234 pacientes receptoresde trasplante hepático, 161 con rechazo agudo (RA) y 72 con ausenciade rechazo agudo (NRA). El estudio del polimorfismo de citoquinasse realizó mediante PCR-SSP (One Lambda). La expresión de moléculasB7 en células B , se realizó mediante citometría de flujo, utilizandocomo anticuerpos monoclonales: anti-CD80-FITC, anti -CD86- PE, anti-CD19-PerCP, y anti-CD5- APC.

El análisis de polimorfismos TGF-B en posición +10, demostróque este polimorfismo génico no estaba asociado con rechazo o conaceptación de injerto hepático. En cambio, los polimorfismos enposición +25 correlacionan con la aceptación del injerto con valoresp cercanos a la significación. El genotipo G/G estaba aumentado enel grupo de RA (p<0.07) y el genotipo G/C prevalecía en el grupo deNRA. Cuando se analizaron los genotipos combinados para lasposiciones +10 y +25 de TGF-B, se observo que el genotipo T/T G/Cestaba significativamente asociado con la aceptación del injerto (p<0,033). El porcentaje y el nº absoluto de linfocitos CD86+ resultósignificativamente incrementado en el grupo de rechazo en el día30 post-trasplante. Además, portadores de G en posición +25 (genotiposG/G y G/C) estaban up-regulados en el grupo de RA respecto algrupo de NRA, y también presentaron valores más altos de célulasCD19+CD86+.

En resumen, el estudio combinado del polimorfismo de TGF-B1 y las variaciones en las células CD19+CD86+, sugieren unadependencia entre el genotipo G/G o G/C y la expresión de CD86en linfocitos B, la cuál puede ayudar a predecir el rechazo o laaceptación del injerto, así como ser utilizado en inmunoterapiasindividualizadas.

128.EXPRESIÓN DE CD28 Y DE MOLÉCULAS HLA EN CÉLULASDE SANGRE PERIFÉRICA, DE UTILIDAD EN LA MONITO-RIZACIÓN INMUNOLÓGICA EN TRASPLANTE CARDIA-CO. Blanco-García RM, López -Álvarez MR, Villar Permuy F,Marín-Moreno IM, Botella C, Salgado- Cecilia G, Muro M, Gar-cía-Alonso AM, Pascual D, Álvarez -López MR, Minguela A. Ser-vicio de Inmunología y Cardiología, Hospital Universitario Virgen de laArrixaca. Murcia.

Las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC,HLA en humanos) se expresan en células de diversos tejidos, incluidoslos leucocitos de sangre periférica (SP), y su expresión se ve afecta porprocesos inflamatorios, entre ellos el rechazo agudo (RA) de aloinjertos.Por tanto su monitorización, puede ser de utilidad en la prediccióntemprana de la aparición del RA. Por otra parte, nuestro grupo hapuesto de manifiesto que CD28 juega un papel decisivo en la aceptaciónde injertos alogénicos de hígado, y es de utilidad en la prediccióntemprana de la aparición del rechazo agudo (RA) y en la discriminacióndel RA frente a las recidivas de hepatitis virales.

Se monitorizaron por citometría de flujo la expresión de CD28 enlinfocitos T CD4+ y CD8+ y la expresión de HLA de clase-I y declase-II en linfocitos T y B, Monocitos y Neutrófilos. Se utilizaronmuestras de SP (sangre periférica) de 42 receptores de trasplante cardiaco,tomadas en el pre-trasplante y 1, 2, 3, y 4 semanas, y 2, 3, 4 ,6 ,9 y 12meses post-trasplante. Los pacientes se clasificaron en: con-RA(n=19) y sin-RA (n=23) en función del índice de rechazo agudo que secalculó como un promedio del grado de rechazo de todas las biopsias(sumatorio del grado rechazo/nº biopsias con rechazo), considerandolos pacientes con-RA cuando el promedio fue >1.

Nuestros datos reflejan que la mayor frecuencia de rechazo agudotuvo lugar entre el 4º y 6º mes post-trasplante, en los que se contabilizaronel 64% del total de los rechazos, el resto se distribuyó homogéneamenteentre los diferentes periodos de monitorización. Coincidiendo con elperiodo de mayor rechazo agudo, se detectaron niveles de expresiónde CD28 en linfocitos T CD4+ ; CD8+ y de HLA de clase-I y de clase-II (tanto en linfocitos T y B, como en Monocitos y Neutrófilos),significativamente superiores en pacientes con-RA que en pacientessin-RA. La ciclosporinemia fue comparable en ambos grupos, aunqueligeramente superiores en los pacientes con-RA.

El estudio de la expresión de CD28, HLA clase I y HLA clase IIen células de SP, podría ser de utilidad para monitorizar la respuestaalogénica en trasplante cardiaco, y ayudar en la predicción de laaceptación del injerto.

129. USO DE GAMMAGLOBULINA INTRAVENOSA INESPECIFI-CA PARA LA PROFILAXIS Y TRATAMIENTO DE LA ENFER-MEDAD CMV EN TRASPLANTE CARDIACO. Carbone J1, Sar-miento E1, Fernández-Yáñez J2, Palomo J2, Muñoz P3, Bouza E3, LanioN1, Rodríguez-Molina JJ1, Rodríguez-Hernández C4, Ruiz M5, Fer-nández-Cruz E1. 1Servicios de Inmunología, 2Cardiología, 3Microbiolo-gía, 4Bioquímica, 5Cirugía Cardiaca, Hospital Gregorio Marañón. Madrid.

Introducción. La presencia de hipogammaglobulinemia en elperiodo post-trasplante cardiaco (TC) se asocia a un riesgo elevado dedesarrollo de infecciones, entre ellas la infección o enfermedad porCMV (Sarmiento, Transpl. Infect. Dis. 2006). Recientemente, se hasugerido que el uso de gammaglobulina intravenosa (GGIV) específicaanti-CMV es útil para prevenir el desarrollo de infección por CMV en

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pacientes con TC que tienen hipogammaglobulinemia (Yamani, J HeartLung Transplant, 2005).

Objetivo. Analizar la utilidad de las GGIV-inespecíficas para laprofilaxis y tratamiento de la enfermedad CMV en pacientes con TCque desarrollan hipogammaglobulinemia.

Justificación. Con GGIV-inespecíficas es posible administrar lamisma concentración total de anticuerpos anti-CMV que con GGIV-específicas anti-CMV (Cytotect, 50 unidades Paul-Ehrlich/mL), si seconoce la concentración de anticuerpos anti-CMV de cada lote y si seajustan las dosis a infundir de GGIV-inespecífica.

Pacientes y métodos. Estudio retrospectivo. 18 pacientes sometidosa TC, que desarrollaron hipogammaglobulinemia (IgG <600 mg/dl),y que fueron tratados con GGIV-inespecífica para la profilaxis (terapiaanticipada de pacientes con infección CMV sin haber desarrolladoenfermedad CMV) o tratamiento de enfermedad CMV entre Junio 1996y Febrero de 2006. Infección por CMV: antigenemia positiva. EnfermedadCMV: antigenemia positiva y signos o síntomas de enfermedad.

Protocolo. GGIV-inespecífica (Flebogamma): Dosis: 200-400 mg/kgcada 3 semanas con la finalidad de obtener niveles normales de IgG(>750 mg/dl). Ritmo de infusión: 0,01 a 0,04 ml/kg/min. Se utilizó elmismo lote de GGIV (con las más altas concentraciones disponibles deanticuerpos anti-CMV, media 38 unidades Paul-Ehrlich/mL) o lotescon concentraciones similares.

Resultados. En el periodo de estudio se realizaron 154 TC. Ochopacientes fueron tratados con GGIV-inespecífica para profilaxis de enfermedadCMV y 10 pacientes para tratamiento de enfermedad CMV. Los 8 pacientescon infección CMV habían utilizado ganciclovir, y uno de ellos ademásGGIV-específica profiláctica por discordancia serológica CMV (D+/R-).Todos los pacientes con enfermedad CMV habían recibido tratamientocon ganciclovir y 6 además GGIV-específica anti-CMV. En el momento deiniciar GGIV-inespecífica había persistencia de antigenemia y síntomasde enfermedad. La terapia con GGIV-inespecífica para los pacientes conenfermedad CMV se hizo en combinación con ganciclovir. Media de IgGen los pacientes con infección CMV: 569 (DS 81 mg/dl) vs pacientes conenfermedad CMV: 402 (DS 93 mg/dl), p= 0,003. Ninguno de los pacientestratados con GGIV-inespecífica por infección CMV desarrolló enfermedadCMV, y todos negativizaron la antigenemia CMV. Todos los pacientestratados por enfermedad CMV evolucionaron favorablemente (negativizaciónde antigenemia y mejoría de síntomas). La GGIV-inespecífica fue bientolerada a las velocidades de infusión administradas.

Conclusión. El uso de GGIV-inespecífica podría ser efectivo comoterapia anticipada al desarrollo de enfermedad CMV y para el tratamientode la enfermedad CMV en pacientes sometidos a TC conhipogammaglobulinemia. La confirmación de este resultado requierela realización de un estudio randomizado.

130.MONITORIZACIÓN DE SUBPOBLACIONES LINFOCITA-RIAS EN PACIENTES SOMETIDOS A TRASPLANTE HEPÁ-TICO EN FUNCIÓN DE SU TRATAMIENTO INMUNOSUPRE-SOR. Romo EM, Muñoz-Robles JA, Castillo-Rama M, Meneu JC,Pérez-Saborido B, Castro MJ, Allende L, Morales P, Serrano A,Paz-Artal E. Hospital 12 de Octubre. Madrid.

El trasplante ortotópico hepático es el tratamiento de elección parapacientes con cirrosis o necrosis hepáticas terminales. Los pacientes,una vez trasplantados, requerirán un tratamiento de inmunosupresióncon el fin de evitar un rechazo del órgano. El objetivo de este estudioes la monitorización pre- y pos-trasplante de las principales poblaciones

linfocitarias en pacientes sometidos a trasplante hepático, compararlasentre sí y en función de su tratamiento inmunosupresor pos-trasplante.

Se monitorizaron 68 pacientes sometidos a trasplante hepático, quehabían llegado a la situación de fallo hepático desde diferentes enfermedadesde base. Todos los pacientes estaban tratados con inhibidores de lacalcineurina (tacrolimus o ciclosporina), y un 20%, además estaba tratadocon Micofenolato Mofetil, como tratamiento inmunosupresor. Para esteseguimiento se tomaron muestras de sangres previas al trasplante yposteriores a él, concretamente al 6º mes pos-trasplante y se marcaroncon anticuerpos monoclonales característicos de las principales subpoblacioneslinfocitarias y subpoblaciones V‚ del TCR; por último, se midieron porla técnica de citometría de flujo. Los resultados, fueron tratadosestadísticamente con el programa SPSS para Windows.

Tras el trasplante, se observaba un aumento porcentual muysignificativos de las diferentes poblaciones linfocitarias, especialmentede los linfocitos T CD8+ y concretamente de los CD8+ activados (p =0,00000114). Este resultado se reflejaba también si comparábamos losnúmeros absolutos, tódas las poblaciones mostraban una disminuciónclara (debido al tratamiento inmunosupresor), a excepción de loslinfocitos T CD8+.

Los individuos que tomaban la combinación de fármacosinmunosupresores (tacrolimus + micofenolato mofetil), presentabanuna disminución porcentual y de números absolutos significativa delas células CD8 activadas (que podrian ser perjudiciales para el injerto).En el resto de familias estudiadas no se encontraron diferenciassignificativas entre individuos que tomaban exclusivamente inhibidoresde la calcineurina y los que tomaban tacrolimus en combinación conmicofelonato mofetil, entre las diferentes familias del TCR V‚ estudiadas,aunque la distribución de las subpoblaciones V‚ era diferente en lospacientes antes y despues del trasplante.

131.COMPLICACIONES INFECCIOSAS Y POLIMORFISMOS DECITOCINAS EN EL TRASPLANTE RENAL. Guerrero MA, Sán-chez-Velasco P, Ocejo-Viñals G, Valero R, Ausín F, Rodrigo E, RuizJC, Arias M, Leyva-Cobián F. Servicios de Inmunología y Nefrología.Hospital Universitario Marqués de Valdecilla.

Introducción. Junto con las enfermedades cardiovasculares, lasinfecciones contribuyen a una elevación en la morbimortalidad delos trasplantados renales. El conocimiento de los factores de riesgo quefavorecen la aparición de infecciones es fundamental para su prevención.Además del tratamiento inmunosupresor, los pacientes tienen unasusceptibilidad individual al desarrollo de infecciones. Mientras quela influencia de los polimorfismos genéticos de las citocinas en laaparición de complicaciones inmunológicas ha sido analizado ampliamenteen el trasplante renal, pocos estudios han evaluado el papel de estospolimorfismos en la aparición de complicaciones infecciosas.

Materiales y métodos. Se incluyeron 256 pacientes receptoresde primer trasplante renal, analizando la presencia o no de infeccionesdurante el primer año postrasplante. Se determinaron los polimorfismosgenéticos de las siguientes citocinas mediante reacción en cadena dela polimerasa usando cebadores específicos de secuencia (PCR-SSP):IL-1a, IL-1b, IL-1R, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-4Ra, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, TGF-β e IFN-γ.

Resultados. La presencia de infecciones en el primer año postrasplanteestaba asociado a polimorfismos en el gen de la IL-1b (-511: CC 65,2%,CT 77,7%, TT 51,6%, p= 0,008) y de la IL-12 (-1188: AA 43,4%, AC 50,0%,CC 78,9%, p= 0,012). Los pacientes con genotipo (-511) CC en el gen de

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la IL-1b presentaron mayor número de infecciones virales (0,1 ± 0,3vs 0,03 ± 0,1, p= 0,009) y totales (0,9 ± 1,1 vs 0,5 ± 0,9, p= 0,037) respectoal genotipo TT en el primer año postrasplante.

Los pacientes con genotipo (-1188) CC en el gen de la IL-12 presentaronun mayor número de infecciones bacterianas (1,7 ± 1,5 vs 0,5 ± 0,9, p=0,003), urinarias (1,4 ± 1,5 vs 0,3 ± 0,8, p= 0,005) y totales (1,8 ± 1,5 vs0,7 ± 1,0, p= 0,005) respecto al genotipo TT en el primer año postrasplante.No se encontraron diferencias significativas en el resto de polimorfismosanalizados.

Conclusión. Los polimorfismos en los genes de las citocinas IL-1b (-511) CC e IL-12 (-1188) CC se asocian con un mayor riesgo depresentar infecciones tras el trasplante renal. La determinación de lospolimorfismos genéticos de las citocinas puede ayudar a predecir elriesgo de presentar infecciones en pacientes trasplantados renales y asu prevención.

132.DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ATP INTRA-CELULAR EN LINFOCITOS CD4+ DE PACIENTES CONTRASPLANTE RENAL Y SU CORRELACIÓN CON EL RIES-GO DE INFECCIÓN. Benito MJ, Sánchez-Velasco P, Ocejo-ViñalsG, Valero R, Ausín F, Rodrigo E, Ruiz JC, Arias M, Leyva-CobiánF. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla.

Introducción. Uno de los principales objetivos en el trasplante renales optimizar el tratamiento inmunosupresor, puesto que una dosis queocasione un exceso de inmunosupresión se asocia con efectos secundariosgraves mientras que una dosis que origine una inmunosupresión defectuosase asocia con un riesgo elevado de rechazo del injerto. Recientemente,se ha desarrollado un ensayo para la determinar la concentraciónintracelular de trifosfato de adenosina (iATP) en linfocitos CD4+ trasestimulación con mitógenos o antígenos. Este método podría ayudar,por un lado, a monitorizar el estado inmunitario en pacientesinmunosuprimidos y, por otro lado, a predecir el riesgo de infección yrechazo en pacientes trasplantados renales. En este estudio se presentanuestra experiencia con este procedimiento al aplicarlo a la monitorizaciónde la evolución clínica de pacientes con transplantes renales.

Materiales y métodos. Se ha determinado la concentración deiATP en linfocitos CD4+ de 89 pacientes trasplantados renalesmonitorizados durante 18 meses y los resultados se han comparadocon la evolución clínica (infección o rechazo agudo) teniendo en cuentalas siguientes variables: edad, sexo, concentración sérica de sirolimus,tacrolimus y ciclosporina, y número de días postrasplante. La presenciade infección (n=81), se estableció tras la aparición de un cultivo positivo;se consideraron como rechazos agudos (n=10) los demostrados mediantebiopsia y estudio histopatológico. De acuerdo con la concentración deiATP, las respuestas inmunitarias obtenidas tras la estimulación(expresadas en ng/ml de ATP) se clasificaron como fuertes (>525 ng/ml),moderadas (225-525 ng/ml) y bajas (<225 ng/ml).

Resultados. Los valores en pacientes con infección fueronsignificativamente menores que los de aquellos pacientes que nopresentaron infección (230 159 vs 314 202 ng/ml, p = 0,018). La frecuenciade infección fue del 50% in pacientes con respuesta inmunitaria baja,del 37,97% in aquellos pacientes con respuesta inmunitaria moderaday del 15,38% en aquellos pacientes con respuesta inmunitaria fuerte (p= 0,005). El valor del área bajo la curva (ABC) «Receiver operating-characteristic» (ROC)-plot para las concentraciones de iATP fuesignificativo (ABC = 0,622, p = 0,003). Sin embargo, no hubo relacióncon la aparición de rechazo agudo ni con otras variables estudiadas.

Conclusión. La determinación de iATP en linfocitos CD4+ durantela monitorización de los pacientes trasplantados renales podría indicarcuáles tendrían un mayor riesgo de infección y por tanto podría constituirun parámetro de utilidad en la individualización del tratamientoinmunosupresor.

133.IDENTIFICACION Y CUANTIFICACIÓN DE LA LA PRODUC-CIÓN DE NOVO DE ANTICUERPOS ANTI-DONANTE TRASEL TRASPLANTE CARDIACO. Domenech N, Crespo MG, Pania-gua MJ, Moscoso I, Nemiña R, Naya C, Cursack G, Calviño R,Aldama G, Mosquera V, Cuenca J, Castro-Beiras A. CHU Juan Cana-lejo.

Introducción. En el momento actual está por definir la utilidadde la monitorización de anticuerpos anti-donante (AAD) tras el trasplantecardiaco (TC). La determinación por citometria de flujo de los AAD,tanto anti-HLA de Clase I o Clase II como los anti-noHLA, podría serun método no-invasivo y fácilmente repetible para incluir en el seguimientopost-TC.

Objetivo: Conocer la factibilidad para monitorización y la frecuenciade aparición de AAD tras el TC.

Métodos. En cada paciente con TC, se realizaron 5 extraccionesde sangre para obtención de sueros de los distintos receptores, antesdel TC y a los 1, 3, 6 y 12 meses post-TC. En dichos sueros se determinópor citometria de flujo: a) la producción de anticuerpos (Acs) anti-HLA-I y/o HLA-II (sistema FlowPRA), y b) la presencia de Acs IgG o IgManti-linfocitos del donante, utilizando las células obtenidas a partir deganglios o bazo de cada donante correspondiente.

Resultados. En el estudio se han incluido 48 pacientes correspondientesa los TC del CHU Juan Canalejo en los dos últimos años que hancompletado el año de seguimiento. Se realizó un estudio especifico dela presencia de Acs anti-HLA-I y HLA-II en un total de 210 muestrasde sueros correspondientes a dichos pacientes. Se detectaron Acs anti-HLA- I en el 14,5% de las muestas pre-TC y solo en el 12% de las muestraspost-TC, respectivamente, y Acs anti-HLA-II en el 4% de las muestraspre-TC y solo en 2 (1,6%) de las muestras post-TC correspondientes aun mismo paciente. En la mayoria de los casos los valores fueronmenores del 10%PRA. También se llevo a cabo la detección de Acs anti-linfocitos del donante en el suero de 25 de estos pacientes siendopositivos los Acs de tipo IgG en solo dos de los pacientes (8%), nomostrando ninguno de estos dos pacientes el %PRA positivo.

Conclusión. 1) En nuestro serie, la frecuencia de los pacientes enlos que se ha detectado presencia de AAD tras el TC ha sido del 18,75%para los Ac anti-HLA-I, del 2% para los Acs anti-HLA-II y del 8% paralos Acs IgG anti-linfocitos, 2) La relevancia de estos hallazgos requiereulteriores análisis

134.ANÁLISIS DE LA CONCERTRACIÓN DE ADN EN ORINACOMO INDICADOR DEL PRONÓSTICO EN EL TRASPLAN-TE RENAL. Alonso A1, Rodríguez F2, Caballero A3, Alonso-OrtizA3, López L3, Gallardo J3, Recio R3, Jiménez A3, Lavado R3, Bra-vo MJ3, Miranda JM3, Fernández-Arcás N3. 1Servicio de Nefrología.2Servicio de Análisis Clínicos. 3Servicio de Inmunología. HRU. CarlosHaya, Málaga.

Introducción. El postoperatorio inmediato del trasplante renal esun período crucial. En él pueden existir complicaciones isquémicas,

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inmunológicas, quirúrgicas e infecciosas que van a marcar la evolucióndel injerto y, por lo tanto, el éxito o fracaso del trasplante. La biopsiarenal continúa siendo el gold-standard para el estudio de la evaluaciónpost transplante pese a sus limitaciones inherentes.

El objetivo de la creación de este estudio es la utilización deparámetros inmunológicos detectables en orina que permitan lamonitorización de la función del injerto renal, lo que supondría unatécnica no invasiva alternativa o complementaria a la histología parael diagnóstico diferencial de los distintos eventos susceptibles dedeteriorar la función del trasplante.

Material y métodos. Se determinó la concentración de DNA urinarioen orina de 24 horas del primer día postrasplante a un total de 50pacientes. Se desecharon 7 muestras por no cumplir los requisitos depureza de ADN establecidos. De los 43 pacientes restantes, 13 (30,32%)presentaron una función retrasada del injerto (FRI, definida comonecesidad de diálisis postoperatoria). En 30 (69,77%) casos la evoluciónfue buena, sin necesidad de diálisis.

De cada muestra de 100 ml de orina se extrajo un volumen de100 µl de ADN purificado mediante BioRobot© EZ1 de Qiagen Laconcentración de ADN se determinó midiendo la absorbancia de lamuestra a 260 nm (A260) en un espectrofotómetro (EppendorfBioPhotometer©).

Los datos clínicos y moleculares se recogieron en una base de datosinformatizada, bajo el entorno SPSS®.

Resultados. La mediana de concentración en el grupo con funciónretrasada fue de 65 con un rango intercuartílico de 83,5 mientras queen el grupo sin FRI esta mediana resultó de 31,75 con un rangointercuartílico de 21. Se compararon estos datos mediante tests noparamétricos (U de Mann-Whitney) encontrando diferencias significativasentre los dos grupos. (p =0.004).

Se categorizó la variable cuantitativa «concentración de ADN»convirtiéndola en cualitativa dicotómica estableciendo para ello unpunto de corte en 40 ng/ml. Este punto de corte resultó el valormínimo posible (para aumentar la sensibilidad del test) que nospermitiese obtener significación estadística. Dentro del grupo confunción retrasada del injerto, el porcentaje casos con DNA en orinapor encima del punto de corte fue significativamente mayor que enel grupo con buena evolución inicial con una p= 0,007 (Test exacto deFisher).

Conclusiones. Aquellos pacientes cuya concentración de DNAurinario fue inferior a 40 μg/ml observamos una buena evolución alos 3 meses de la intervención. En aquellos con concentración superiora 40 μg/ml observamos una evolución tórpida del transplante.

135.ASOCIACIÓN ENTRE ANTICUERPOS ANTI-CITOESQUE-LETO DE CÉLULAS ENDOTELIALES (CS-AECA) Y LA APA-RICIÓN DE EPISODIOS DE RECHAZO EN EL TRASPLANTECARDIACO. Álvarez-Márquez A1, Aguilera I1, Álvarez-LópezMR2, Pascual D2, Encarnación-Carrizosa M1, Hernandez A1, Blan-co RM2, Wichmann I1, Núñez-Roldán A1. 1B. Servicio de Inmunolo-gía. H.H. U.U. Virgen del Rocío. Sevilla. 2Servicio de Inmunología. Hos-pital Virgen de la Arrixaca. Murcia.

Introducción. Los anticuerpos anti-células endoteliales (AECA)constituyen una familia muy heterogénea de anticuerpos que reaccionancon una amplia variedad de determinantes antigénicos. Su presenciase ha descrito asociada a una gran variedad de enfermedades tantoautoinmunes como inflamatorias, así como en el trasplante cardiaco

en relación con la vasculopatía del injerto. Uno de los mecanismos quepodría explicar su presencia en el trasplante cardiaco podría ser el dañoprovocado por la isquemia-reperfusión asociado con la cirugía deltrasplante.

Objetivo. Con objeto de explorar la historia natural de apariciónde los AECA nos hemos planteado investigar la aparición secuencialde estos anticuerpos en pacientes trasplantados cardiacos y en pacientessometidos a circulación extracorpórea por cirugía valvular o coronaria.

Material y método. Hemos incluido 31 pacientes trasplantadoscardiacos ( días: 0, 15, 30, 90 y 360) y 39 pacientes sometidos a CEC(dias 0, 15 y 30). Incluimos además un grupo de 87 controles sanos. Elestudio de AECA se ha llevado a cabo mediante inmunofluorescenciaindirecta (IFI) con células HUVEC.

Resultados. 26,5% de los controles sanos fueron positivos paraAECA. Observamos que, en el día 0, la frecuencia de AECA erasignificativamente mayor respecto a los controles, tanto en el grupode trasplantados cardiacos (51,6%; p= 0,0195) como en el grupo deCEC (74,3%; p= 0,00001). No había diferencias en la frecuencia deAECA antes o después de la cirugía en el grupo de CEC. Pudimosidentificar dos patrones de IFI claramente diferenciados: un patróngranular citoplasmático y otro patrón que reconocía estructuras delcitoesqueleto celular. Cuando estratificamos los resultados por elpatrón de IFI observamos un aumento gradual en la frecuenciadel patrón citoesqueleto tras el trasplante cardiaco: día 15=13,3%,día 30=22,2%, día 90=53,8%, día 360=58%). En el patrón granularno observamos diferencias signicficativas a lo largo de la evolución.La aparición de episodios de rechazo durante el primer añopostrasplante fue del 94.4% entre los pacientes que presentaban elpatrón citoesqueleto, frente al 46.2% entre los que presentaban patróngranular (p= 0,009).

Conclusión. Nuestros resultados indican una relación entre laaparición de anticuerpos anti-citoesqueleto durante el primer añopostrasplante cardiaco y la aparición de episodios de rechazo. Losanticuerpos anti-citoesqueleto podrían ser una de las principales dianasen el rechazo del trasplante cardiaco.

136.RECHAZO CRONICO EN TRASPLANTE RENAL MEDIADOPOR ANTICUERPOS ANTI-GSTT1. Aguilera I, Alvarez-Mar-quez A, Gentil MA, Wichmann I, Núñez-Roldán A. Servicio de Inmu-nología, H. U. Virgen del Rocío, Sevilla.

El rechazo crónico (RC) es una forma progresiva de daño al injertodebido a distintos factores pero fundamentalmente a mecanismos detipo aloinmune. Las características histológicas del rechazo humoralson muy variables, poco específicas y compatibles con distintas causas.Por este motivo el reciente descubrimiento de que los depósitos C4den capilares peritubulares es un marcador del rechazo humoral entrasplante renal y cardiaco, se considera de gran utilidad para undiagnóstico correcto, con presencia de anticuerpos circulantes anti-donante.

En la mayoría de los casos los anticuerpos estan dirigidos frentea antígenos HLA específicos del donante aunque en un 10% de los casosC4d+ son indetectables. Se postula que otros antígenos no identificadosde las células endoteliales del injerto pueden ser la diana en estospacientes.

El objetivo de este estudio fue ver si los anticuerpos frente a GlutationS-Transferase T1 (GSTT1) en trasplantados renales con rechazo crónicodel injerto pueden ser incluidos en este grupo de casos inexplicados

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sin anticuerpos anti-HLA. Los anticuerpos anti-GSTT1 fueron descritospor nuestro grupo en 2001, son muy específicos frente al antígeno deldonante y aparecen en pacientes que carecen del gen de la GSTT1cuando reciben un injerto de un donante positivo.

En este trabajo describimos tres pacientes que son negativos paraanti-HLA Clase I y II del donante, cuyo diagnóstico de rechazo humoralha sido confirmado por el patólogo y que actualmente solo podemosatribuir a los anticuerpos anti-GSTT1.

Tras un largo seguimiento a estos pacientes (3 a 5 años) esta es laprimera vez que detectamos evidencias morfológicas de la respuestaaloinmune en pacientes con anticuerpos anti-GSTT1 en trasplanterenal.

SESIÓN 10: INMUNOLOGÍA TUMORAL

Moderadores: Melchor Álvarez de Mon Soto (Madrid), Augusto Silva González (Madrid)

137.LAS CÉLULAS TUMORALES DE LA LEUCEMIA DE CÉLU-LAS PLASMÁTICAS PIERDEN LA FORMA DE ALTA AFINI-DAD DE LA INTEGRINA CD29 Y SON REFRACTARIOS ALESTÍMULO DE SUS FACTORES REGULADORES. Martínez-Viñambres E, García-Trujillo JA, Rodríguez-Martin E, Villa-rrubia N, Coll J, Roldán E. Hospital Universitario Ramón y Cajal,Madrid.

Introducción. El mieloma múltiple (MM) es una enfermedadclonal de las células plasmáticas (CP) presentes en la médula ósea(MO). Aunque en la gran mayoría de las ocasiones las CP clonalespermanecen acantonadas en el microambiente medular, en algunoscasos la enfermedad progresa hacia su leucemización, detectándo-se entonces la población tumoral en la sangre periférica (SP). A estafase de la enfermedad se la denomina leucemia de células plas-máticas (LCP). Nuestro grupo ha demostrado que las CP de MOnormal y de la práctica totalidad de enfermos con MM expresanla forma activa de la integrina CD29, determinada mediante la expre-sión del epítopo HUTS-21, y caracterizada por su alta afinidad porsus ligandos.

Objetivos. Estudiar la expresión del epítopo HUTS-21 y su regu-lación en las células tumorales de enfermos con LCP en comparacióncon las CP de enfermos con MM.

Métodos. Aspirados de MO y muestras de SP de individuos sanos,diagnosticados con mieloma múltiple y con LCP. Cultivos de cortaduración de CP con o sin cationes. Las poblaciones de CP así como elresto de antígenos estudiados se detectaron por citometría de flujo.

Resultados. La mayoría de la población de CP de MO de indi-viduos sanos expresaron el epítopo de activación HUTS-21 (85±12%),siendo similar al porcentaje obtenido en CP de enfermos con MM(87±9%). Por el contrario, el porcentaje de expresión de la formaactiva de la integrina en enfermos con LCP estuvo francamente dis-minuido (menos de 1%). La expresión de la forma constitutiva dela integrina, determinada con el AcMo anti-CD29 clon MAR-4, fueequivalente en todos los casos. Estudios funcionales con cationesMn2+ y plasmas autólogos y alogénicos demostraron que las célu-las clonales de los enfermos de LCP respondieron de forma muydeficiente a los reguladores del epítopo HUTS-21, tanto en MO comoen SP.

Conclusiones. La leucemización del MM está asociada a la pérdi-da de expresión de la forma de alta afinidad de la integrina CD29. LasCPs en estos enfermos son a su vez refractarias a los factores que regu-lan la expresión del epítopo HUTS-21, probablemente por defectosintrínsecos en esta molécula.

138.FASL ASOCIADO A EXOSOMAS COMO PRINCIPAL MECA-NISMO DE DEFENSA EN LÍNEAS HUMANAS DE CÁNCERDE COLON. Royo-Cañas M, Anel A, Lasierra P, Larrad L, Mar-tínez-Lorenzo MJ. Instituto Aragones de Ciencias de la Salud y Hos-pital Clínico Universitario Lozano Blesa-Zaragoza.

La apoptosis o muerte celular programada juega un importantepapel en la regulación de células normales. Diversos tumores malig-nos son resistentes a la apoptosis a través de receptores de muerte yexpresión de ligandos como FasL y APO2L/TRAIL. En el caso de algu-nos tumores, la sobreexpresión de FasL parece correlacionarse con laagresividad del tumor y el mal pronóstico.

Aunque algunos autores han descrito que las células de cáncer decolon son capaces de expresar FasL y atacar a las células linfoides queexpresan Fas, otros han indicado que FasL no se expresa en la super-ficie de esos tumores. Esto indicaría que otros factores podrían estarimplicados, tales como el balance entre forma unida a membrana y for-ma soluble o la secreción de ligandos de muerte en la superficie de exo-somas.

Algunos autores han descrito que las células de cáncer de colonson capaces de expresar FasL y atacar a las células linfoides que expre-san Fas, sin embargo, otros resultados contradictorios indican que FasLno se expresa en la superficie de estos tumores.

El objetivo del presente trabajo fue analizar la expresión de FasLen células de cáncer de colon y su funcionalidad.

La expresión de Fas, FasL, se determinó por citometría de flujo uti-lizando anticuerpos específicos. La muerte celular se cuantificó median-te análisis de la exposición de fosfatidilserina y por medida del poten-cial mitocondrial. Los estudios de sensibilidad a los diferentes induc-tores apoptóticos se llevaron a cabo por el método de Mossman (Testdel MTT).

Se analizó la expresión y posible secreción de Fas y FasL en lossiguientes carcinomas de colon: HT-29, SW480, LoVo, HCT-116 y CaCo-2. La expresión de Fas en membrana en la mayoría de las líneas celu-lares analizadas fue superior al 70%. Solamente la línea celular CaCo-2 no expresó Fas ni en la membrana ni en el interior celular. En cuan-to a la expresión de FasL, las líneas HT-29, HCT-116 y CaCo-2 expre-saron niveles similares en la membrana y en el interior celular. En laslíneas SW480 y LoVo, la expresión en membrana de FasL fue solo deun 40 y 30% respectivamente, aumentando hasta un 80% para la expre-sión intracelular. Sin embargo, a pesar de la expresión de Fas en mem-brana, ninguna de las líneas celulares analizadas fue sensible a anti-cuerpos anti-Fas (<10%).

A continuación se comprobó que FasL expresado en la membranade las células fue poco tóxico en los cocultivos utilizando células Jur-kat que expresan Fas en membrana como diana. Finalmente, se obser-vó la expresión de FasL asociado a una fracción ultracentrifugable quefue tóxica para células Jurkat. Los resultados preliminares obtenidosindican que el FasL que expresan las células de cáncer de colon en mem-brana no es funcional, sino el liberado en su forma soluble asociadoa exosomas.

Financiación: C03/02, PI020658.

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139.CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS HLA DECLASE I EN LÍNEAS CELULARES TUMORALES HUMANASDESPUÉS DEL CRECIMIENTO EN RATONES INMUNODE-FICIENTES. Casares C1, Linares I1, Romero I1, Berruguilla E1, Sala-ya G1, Paco L1, Collado A2, Algarra I3, Lopez-Nevot MA1, García-Lora A1, Garrido F1. 1Análisis Clínicos e Inmunología. 2Unidad de Inves-tigación, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada. 3Depar-tamento Ciencias de las Salud. Universidad de Jaén.

Los ratones inmunodeficientes son ampliamente utilizados paraestudios de crecimiento de líneas celulares tumorales humanas y parael análisis in vivo de terapias antitumorales. Normalmente las célulastumorales inyectadas no son analizadas para su fenotipo antes y des-pués del crecimiento en estos ratones. Resultados previos de nuestrogrupo han mostrado que en el caso de la línea de melanoma Ando2,el fenotipo HLA de clase I cambiaba después de su crecimiento en rato-nes nude.

Para poder determinar la amplitud y repetitividad de este fenó-meno, hemos inyectado diferentes líneas de melanoma humanas, yhemos estudiado su fenotipo HLA antes y después del crecimiento enlos ratones. Se han utilizado 3 líneas de melanoma, tres de ellas pre-sentan LOH en el cromosoma 6, expresando un único haplotipo HLAen superficie. Se han inyectado subcutáneamente en ratonesnude/nude, 5 ratones por grupo, 2x106 y 5x106 células. El crecimientodel tumor fue controlado mediante medición del diámetro mayor ycuando el tumor alcanzo un diámetro entre 5-8 mm el tumor fue extir-pado y adaptado a cultivo celular. Las líneas celulares obtenidas fue-ron analizadas para la expresión de moléculas HLA de clase I median-te citometría de flujo, y dicha expresión fue comparada con las líneascelulares originales.

En la mayoría de las líneas analizadas se producían alteracionesen el fenotipo HLA de clase I después del crecimiento en ratones. Lalínea celular Ando2 presenta la expresión de un haplotipo HLA de cla-se I, después del paso por ratones nude, todas las líneas obtenidas nomuestran expresión en superficie de ninguna molécula HLA de claseI, perdiendo por tanto la expresión del otro haplotipo HLA. Hemospodido determinar que esta perdida total de expresión de moléculasHLA de clase I se debía a una baja regulación de la maquinaria de pro-cesamiento antigénica. En el caso de otras dos líneas de melanoma,presentan después del crecimiento en ratones nude una perdida deexpresión de locus B. Estos resultados fueron reproducibles en dife-rentes ensayos, ya que todas las líneas analizadas provenientes de unamisma línea mostraron un fenotipo HLA de clase I muy similar, prác-ticamente idéntico.

Estos resultados muestran que el fenotipo HLA de clase I de lascélulas tumorales puede cambiar después del crecimiento en ratonesnude, siendo un fenómeno reproducible.

140.IMPLICACIÓN IN VIVO DE LAS CÉLULAS NK EN EL CAM-BIO DE FENOTIPO MHC DE CLASE I EN METÁSTASISOBTENIDAS EN RATONES NUDE. Salaya G, Romero I, Lina-res I, Berruguilla E, Casares C, Garrido F, García-Lora A. Servi-cio de Análisis Clínicos e Inmunología. Hospital Universitario Virgende las Nieves. Granada.

Estudios anteriores de nuestro grupo mostraron que metástasisgeneradas a partir de el clon B9, fibrosarcoma murino inducido pormetilcolantreno, presentaban un distinto fenotipo MHC de clase I

dependiendo del sistema inmune del huésped en el que se produje-ron: fenotipo MHC clase I negativo en ratones inmunocompetentes, yMHC clase I positivo en ratones inmunodeficientes nude/nude. Lasmetástasis MHC clase I positivas, cuando son inyectadas en ratonesinmunocompetentes presentan un alta inmunogenicidad por lo que,aunque crecen en un principio, son finalmente rechazadas. Esta inmu-nogenicidad no se presenta en ratones nude en los que no son recha-zadas. Las metástasis MHC clase I negativas, por el contrario, mues-tran una baja inmunogenicidad en ratones inmunocompetentes, nosiendo los tumores rechazados. Los ratones nude/nude carecen de lin-focitos T maduros pero tienen una elevada actividad NK que podríaestar relacionada en este cambio de fenotipo MHC de clase I. Para estu-diar la posible implicación de las células NK, se produjeron metásta-sis a partir del clon B9 en ausencia de células NK, por un lado en rato-nes nude/nude deplecionados de células NK mediante inyección peri-toneal de Ac anti-asialo GM1 una vez por semana, y por otro lado enratones SCID-Beige. Tras adaptarse a cultivo, se estudió la expresiónen superficie de moléculas H-2 clase I de estas metástasis mediantecitometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales.

Los resultados obtenidos mostraron, que tanto las metástasis obte-nidas en ratones nude depleccionados de células NK como las obteni-das en ratones SCID-Beige, no tenían expresión en superficie de molé-culas H-2 de clase I clásicas. Por tanto presentaban idéntico fenotipoMHC de clase I clásico que el clon B) y que las metástasis obtenidas enratones inmunocompetentes, y un fenotipo opuesto al de las metásta-sis obtenidas en ratones nude.

En base a estos resultados podemos concluir que en este sistematumoral murino las células NK parecen estar directamente implicadasin vivo en el cambio de fenotipo H-2 de clase I, de negativo a positi-vo, ocurrido en las metástasis obtenidas en ratones nude a partir delclon original B9.

141.CARACTERIZACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE IMPLI-CADA EN EL RECHAZO EN RATONES INMUNOCOMPE-TENTES DE TUMORES GENERADOS EN RATONES NUDE:OBTENCIÓN DE CTLs ESPECÍFICOS. Salaya G, Berruguilla E,Linares I, Romero I, Casares C, Garrido F, García-Lora A. Servi-cio de Análisis Clínicos e Inmunología. Hospital Universitario Virgende las Nieves. Granada.

En nuestro laboratorio hemos generado un sistema tumoral muri-no compuesto por metástasis espontáneas derivadas de el clon B9,fibrosarcoma murino inducido con metilcolantreno, que presentan undistinto fenotipo MHC de clase I dependiendo del sistema inmune delhuésped en el que se produjeron: fenotipo MHC clase I negativo enratones inmunocompetentes, y MHC clase I positivo en ratones inmu-nodeficientes nude/nude. Las metástasis MHC clase I positivas, cuan-do son inyectadas en ratones inmunocompetentes presentan un altainmunogenicidad por lo que, aunque crecen en un principio, son final-mente rechazadas. Esta inmunogenicidad no se presenta en ratonesnude en los que no son rechazadas. Las metástasis MHC clase I nega-tivas, por el contrario, muestran una baja inmunogenicidad en ratonesinmunocompetentes, no siendo los tumores rechazados.

El análisis de las subpoblaciones linfocitarias realizado en sangreperiférica y bazo de ratones inmunocompetentes previamente inmu-nizados con las metástasis H-2 clase I positivas, mostró un aumentode los porcentajes de linfocitos CD8+. Con el objeto de profundizar enla caracterización de esta respuesta inmune, se propuso la determina-

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ción de precursores de CTLs y el aislamiento de estos en ratones pre-viamente inmunizados. Para la realización de este ensayo se inmuni-zaron ratones inmunocompetentes mediante 4 inyecciones subcutáne-as de la metástasis MN4.5, H-2 clase I positiva, que se realizaron cada15 días. Después se les extrajo el bazo que se disgregó, y se aislaron loslinfocitos CD8+ presentes mediante un proceso de selección negativa.Se co-cultivaron a diferentes ratios con células MN4.5 irradiadas. Trasvarias reestimulaciones semanales se realizo un ensayo de lisis con51Cr utilizando como diana el propio clon B9 y diferentes metásta-sis. Este test de lisis se repitió a las 2 semanas y se obtuvieron los poci-llos en los que la lisis era específica para las células MN4.5, que fueronposteriormente clonados.

Los resultados mostraron que la frecuencia de precursores de CTLsque reconocían específicamente y únicamente a las células tumoralesMN4.5 era de 1/2703 (3,7 x 10-4). Este resultado muestra una fuerterespuesta antitumoral especifica frente a estas células tumorales porparte de linfocitos T citotóxicos. Varios pocillos positivos fueron selec-cionados y clonados. Estos clonos obtenidos podrán dar lugar a la iden-tificación de los antígenos tumorales reconocidos por los linfocitosCD8+ implicados en el rechazo tumoral de estas líneas celulares tumo-rales originadas en ratones nude.

142.GENES IMPLICADOS EN LA BAJA REGULACIÓN COORDI-NADA DE LOS COMPONENTES DEL APM Y DE LAS MOLÉ-CULAS DEL MHC DE CLASE I EN CÉLULAS TUMORALES.Romero Garcia I, Berruguilla Perez E, Salaya Algarín G, Marti-nez M, Linares I, Garrido F, Garcia Lora A. Servicio de Analisis Cli-nicos e Inmunología del Hospital Universitario Virgen de las Nieves.

En nuestro laboratorio, hemos desarrollado un modelo tumoralmurino compuesto por metastasis espontaneas, derivadas de un clontumoral (fibrasarcoma inducido con metilcolantreno), que presenta undiferente fenotipo MHC de clase I dependiendo del sistema inmunedel huésped: MHC de clase I negativo en ratones inmunocompeten-tes, y MHC de clase I positivo en ratones nude. Estudios previos hanmostrado que la falta de expresión en superficie de moléculas MHCclase I es consecuencia de una baja regulación coordinada a nivel trans-cripcional de varios componentes de la maquinaria de procesamientoantigénica (APM): TAP-1, TAP-2, LMP-2,LMP-7,LMP-10, Calnexinay Tapasina.

Para determinar el mecanismo molecular implicado en la baja expre-sión coordinada de estos genes del APM, construimos bibliotecas de sus-tracción de cDNA comparando mRNAs derivados de las diferentesvariantes metastásicas. Los diferentes fragmentos obtenidos fueronsecuenciados y su secuencia fue comparada con las basas de datos.

Se realizaron ensayos comparando líneas metastásicas MHC cla-se I positiva (MN4.5 y MN4.1) con dos líneas que carecen de expresiónde moléculas de clase I ( MP5 y MP12). Al ser estas metástisis gene-radas desde el mismo clon B9 deben expresar un número diferencialde genes muy reducidos. Hemos encontrado 12 genes expresados dife-rencialmente, unos correspondientes a genes conocidos y otros a genesnuevos. Entre los genes encontrados debemos destacar los siguientescomo posiblemente implicados: FHIT, Glis1, KPNA2, IL1r.

Actualmente, se están realizando estudios con estos genes, a nivelde expresión cuantitativa, bloqueo de la expresión y transfección, paradeterminar su implicación directa con la expresión de los componen-tes del APM y en la expresión de moléculas MHC de clase I en la super-ficie celular.

143.ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL ARNM DE CD3Z EN 13PACIENTES CON ADENOCARCINOMA GÁSTRICO. Agui-naga Barrilero A, Pérez Blas M, Rodríguez Pérez N, Gutiérrez A,Martín J, Gómez R, Martín Villa JM. Facultad de Medicina (UCM).

Introducción. Son numerosas las referencias a una disfunción delos linfocitos T en cáncer y otros procesos patológicos con inflamacióncrónica. Dicha disfunción está asociada en muchos casos a la pérdidade expresión de la cadena CD3Z en la membrana de la célula. La cau-sa del defecto de la cadena CD3Z en los pacientes de cáncer no se cono-ce, aunque se ha venido atribuyendo a algún factor derivado del tumor.Sin embargo, resultados previos de nuestro grupo han mostrado quela baja expresión de CD3Z se mantiene en líneas estables de linfoci-tos T de pacientes con cáncer gástrico, por lo que suponemos que debetratarse de una alteración inherente a las células, independiente de lapresencia de factores tumorales. Con esta hipótesis como base, quisi-mos comprobar si el ARNm de CD3Z presentaba alguna alteración(mutación, splicing alternativo) en los pacientes con adenocarcinomagástrico que explicara la reducción en membrana de la proteína y que,además, se mantendría en las líneas.

Métodos. Se partió de muestras de sangre de 13 pacientes con ade-nocarcinoma gástrico y de 8 individuos sanos, de las cuales fueron ais-ladas las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) median-te gradiente de densidad. Se obtuvo el ARN total de las CMSP en cadacaso, el cual fue retrotranscrito a cDNA para su posterior amplifica-ción y secuenciación directa, utilizando cebadores específicos del genCD3Z. El análisis de las secuencias revela que el gen CD3Z de lospacientes no muestra ningún cambio diferencial con respecto al de losindividuos sanos y al que está publicado en el GenBank. Hemos com-probado la existencia de 5 polimorfismos ya descritos y, además, hemosencontrado otros 3 polimorfismos nuevos. Ninguno de los polimorfis-mos se da con un patrón característico en los pacientes.

Conclusión. La disminución de la expresión de la cadena CD3Zque presentan nuestros pacientes de cáncer gástrico no se debe a alte-raciones de la secuencia del gen de dicha proteína, y ninguno de lospolimorfismos detectados se asocia a la enfermedad.

144.IDENTIFICATION OF APOPTOSIS-RELATED GENES REGU-LATED BY THE PLZF PROTEIN. Bernardo MV1, Yelo E1, Gime-no L1, MajadoMJ2, Álvarez-López MR1, Parrado A1. 1InmunologyService and 2Hematology Service. Hospital Universitario Virgen de laArrixaca. El Palmar. Murcia.

The PLZF gene was identified in acute promyelocytic leukemia(APL, AML-M3). PLZF expression is downregulated in most chroniclymphocytic leukemia (CLL) patients, suggesting that PLZF may playa tumor suppressor role. PLZF is a transcriptional repressor involvedin the control of cell proliferation, differentiation and survival.Overexpression of PLZF induces cell cycle arrest and growth suppression,whereas alteration of its normal function due to the presence of thereciprocal fusion proteins, PLZF-RARA and RARA-PLZF, resultingfrom the t(11;17) traslocation, is associated to the development ofAPL. We have established stable inducible PLZF expressor clonesfrom different hematopoietic cell lines, using the tet-off system. PLZFinduced inhibition of cell growth in T lymphocytic Jurkat cells, butnot in erythroid K562 cells, or B lymphocytic DG75 cells. Growthsuppression in Jurkat cells was dependent on its levels of expression,since it was observed only in the highest PLZF expressor clones.

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Moreover, it was inversely proportional to the initial density of thecultures, suggesting a dependence on exogenous mitogens. Deletionof the BTB/POZ domain abrogated growth suppression. Cell cycleand apoptosis analysis suggest that cell death may be the primaryand predominant mechanism responsible for growth suppression inJurkat cells. Since PLZF may mediate its biological effects bytranscriptional control, we conducted a search of potential transcriptionaltargets by microarray analysis (CodeLink, human whole genome,55K). Biological duplicates of a high PLZF expressor Jurkat clone,cultured at low cell density (25.000 cells per ml) in the presence andabsence of doxycycline, were analysed at 24, 48, 72, and 96 hours. Asa result, we have identified around 70 genes, involved in diversecellular functions, whose expression was significantly modulated byPLZF. Some of them, which have been implicated in cell death,were verified using real time RT-PCR: TERT, which has been describedas anti-apoptotic, was repressed; conversely, TP53INP1, ID1 and ID3,which have been described as pro-apoptotic, were induced. Theidentification of these genes is consistent with the pro-apoptoticphenotype observed for PLZF, suggesting that they could be majormediators of PLZF function. Other genes confirmed by real time RT-PCR included ZNF496 and IGLL1, significantly down-regulated, andMYCN, TBL1X, and TRB2, significantly up-regulated, respectively.None of these targets were significantly modulated when cultureswere established at high cell density (250.000 cells per ml). At thiscell density, PLZF expression did not induce growth suppression orapoptosis, suggesting that PLZF may integrate external signals beforeinitiating specific genetic programmes that lead to growth arrest andcell death. These findings could contribute to elucidate the mechanismby which PLZF induces apoptosis, and to assess the relevance thatstructural alterations or abnormal expression of PLZF, respectively,may have in APL and CLL.

145.CÉLULAS T CD3+TCRGD+CD28- EN SANGRE PERIFÉRICADE PACIENTES CON MELANOMA CUTÁNEO MALIGNO.Campillo JA, Martínez-Escribano JA, Minguela A, López-Álva-rez R, Marín LA, García-Alonso AM, Bensussan A, Álvarez-LópezMR. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca.

Antecedentes. Previamente ha sido descrito un aumento de célu-las T CD3+TCRgd+CD28- tras activación prolongada in vitro, o inclu-so durante procesos infecciosos virales.

Objetivo. Investigar la expresión de la molécula co-estimuladoraCD28 sobre linfocitos que expresan los receptores CD3/TCRgd enpacientes de melanoma cutáneo maligno.

Metodología. Se analizaron las células T CD3+TCRgd+ en sangreperiférica de 41 pacientes y 39 controles mediante citometría de flujo.Los pacientes fueron clasificados atendiendo al estadio clínico de acuer-do con los criterios establecidos por el American Joint Committee onCancer.

Resultados. El número de células T CD3+TCRgd+ circulantesestaba significativamente aumentado en pacientes en estadios clí-nicos I-II y III comparado con el grupo de individuos sanos. Esteincremento fue mediado por una acumulación de células de la sub-clase T CD3+TCRgd+CD28-, la cual expresaba altas cantidades deperforina tanto en individuos sanos como en pacientes de melano-ma.

Conclusión. Este trabajo muestra, por primera vez, un aumentode células T CD3+TCRgd+CD28- con capacidad citotóxica en pacien-

tes de melanoma, las cuales pueden tener un papel importante en inmu-novigilancia anti-tumoral.

146.PÉRDIDA DE EXPRESIÓN HLA DE CLASE I EN METÁSTA-SIS EN HÍGADO DE CÁNCER COLORRECTAL: MECANIS-MOS DE ESCAPE TUMORAL A LA INMUNOTERAPIA. LaraE1, Southgate TD2, Dangoor A2, Cabrera T1, Garrido F1, Stern PL2.1Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario Virgen de las Nie-ves. Departamento de Bioquímica, Biología Molecular 3 e Inmunolo-gía, Facultad de Medicina, Universidad de Granada. 2Immunology Group.University of Manchester, Paterson Institute for Cancer Research, Man-chester, Reino Unido

Aunque se han estudiado numerosas estrategias inmunoterapéu-ticas en pacientes con cáncer, ha sido difícil correlacionar la inducciónde una respuesta inmunológica con la producción de una respuestaclínica favorable. Las respuestas inmunológicas efectivas antitumora-les pueden verse alteradas por los mecanismos de evasión inmune. Porejemplo, la pérdida de moléculas HLA de clase I, necesarias para lasusceptibilidad de los antígenos tumorales a las células T, es un even-to muy frecuente en diversos tipos tumorales. Nosotros estamos carac-terizando los fenotipos HLA de tumores de pacientes con metástasisen hígado de cáncer colorrectal.

La inmunohistoquímica de los tumores y del tejido normaladyacente, usando AcMos locus y alelo-específicos contra antíge-nos HLA de clase I, ha dado como resultado algún tipo de altera-ción HLA en más del 50% de las muestras estudiadas. Dentro deeste 50% de muestras se ha detectado pérdida de locus HLA de cla-se I en el 60%, mientras que el resto presentaba una pérdida espe-cífica de alguno de los alelos HLA. También se ha estudiadomediante PCR a tiempo real el nivel de transcripción de los locusHLA de clase I utilizando el RNA de las células tumorales micro-disectadas con láser.

Los resultados de la PCR a tiempo real demostraron una corre-lación entre la reducción del número de transcritos de los locus HLAde clase I y la pérdida de expresión a nivel superficial observada porinmunohistoquímica. Nuestros resultados sugieren que la combina-ción de distintos factores está implicada en el diferente comporta-miento tumoral y en la tasa de éxito en los tratamientos inmunotera-péuticos.

147.REEXPRESIÓN DE HLA DE CLASE I EN LÍNEAS CELULARESDE MELANOMA DEFECTIVAS EN b2-m MEDIANTE EL VEC-TOR ADENOVIRAL b2-m (AdCMVb2m). Campo AB1, Aptsiau-ri N1, Mendez R1, Ruiz-Cabello F1, Gonzales G2, Melero I2, Garri-do F1. 1Servicio de Analisis Clínicos, Hospital Universitario Virgen delas Nieves, Granada. 2Dept. de Inmunología y Terapia Génica, Univer-sidad de Navarra, Pamplona.

Los linfocitos T citotóxicos juegan un papel fundamental en la eli-minación de células infectadas por virus y células tumorales, requi-riendo para ello de la expresión de moléculas HLA de clase I sobreestas células. Sin embargo, debido a la inestabilidad genética que carac-teriza a los tumores, la expresión de HLA en la superficie de estas célu-las se ve alterada; este hecho puede tener un efecto negativo en el reco-nocimiento inmune de las células tumorales. Uno de los principalesmecanismos de la alteración de las moléculas HLA de clase I es el defec-

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to en el gen de la beta 2-microglobulina (b2-m) indispensable para suexpresión en superficie.

Hemos descrito previamente mutaciones de b2m en dos líneascelulares establecidas de melanoma procedentes de lesiones metasta-sicas de dos pacientes. Estas mutaciones estaban asociadas con la pér-dida total de moléculas HLA de clase I, impidiendo su reconocimien-to inmunológico por linfocitos T citotóxicos. La presentación antigé-nica pudo ser recuperada después de la transfección de las células demelanoma con el gen de b2-m in vitro.

La infección de las líneas deficientes en b2-m con el vector adeno-viral AdCMVb2-m recupera la expresión en superficie de las molé-culas de HLA clase I incrementando la inmunogenicidad

148.EL POLIMORFISMO EN EL GEN NKG2D NO SE ASOCIACON MAYOR RIESGO DE CÁNCER DE COLON O DE RIÑÓNEN POBLACIÓN DEL SUR DE ESPAÑA. Romero Noguera JM1,Saenz-López P1, Cózar JM2, Tallado M2, Vilchez JR1, Jiménez P1,Ferron A3, Garrido F1, Ruiz-Cabello F1. 1Servicio de Análisis Clíni-cos. 2Servicio de Urología, y 3Servicio de Cirugía General, Hospital Uni-versitario Virgen de las Nieves, Granada.

NKG2D es un receptor activador que se expresa en la superfi-cie de las células NK estimulando su citotoxicidad natural frente aciertas dianas celulares como células neoplásicas o infectadas porvirus, pudiendo participar en los procesos de inmunovigilancia tumo-ral. El gen NKG2D se encuentra ubicado, junto a otros locus, en unazona de 270 kb dentro del llamado complejo NK (NKC). Distintospolimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) en el gen del receptorNKG2D se han relacionado con el grado de actividad citotóxica NK.Los 5 polimorfismos estudiados fueron: NKC-3, NKC-4, NKC-7, NKC-9 y NKC-11. Al estudiar estos polimorfismos quedó patente que NKC-3 (G/C), NKC-7 (A/T) y NKC-11 (C/T) están en desequilibrio deunión, pues conociendo uno de ellos se deducen los otros dos, for-mando un haplotipo. El haplotipo CAT se ha relacionado con bajaactividad NK, mientras que GTC se ha relacionado con alta activi-dad NK. De manera similar, NKC-4 (G/A) y NKC-9 (G/A) formanotro haplotipo, donde GG se ha relacionado con baja actividad NK yAA con alta actividad. Nosotros estudiamos 127 carcinomas renales,96 carcinomas de colon y 176 controles. Para el primer haplotipo, cla-sificamos los casos como de baja actividad (CAT/CAT), actividadmedia (CAT/GTC) o alta actividad (GTC/GTC); para el otro haplo-tipo hicimos lo mismo. En el primer haplotipo, en carcinoma renalencontramos un 47,2% de casos de baja actividad NK, un 43,3% deactividad intermedia y un 9,4% de actividad alta; en carcinoma decolon obtuvimos un 38,6% de baja actividad, un 49,4% de actividadintermedia y un 11,9% de actividad alta. En los controles encontra-mos un 48,9% de actividad baja, 38% de actividad intermedia y un13,1% de alta actividad. Al aplicar el test de chi cuadrado, no se encon-tró significación ni en carcinoma renal (p = 0,50) ni en carcinoma decolon (p = 0,09). En el segundo haplotipo encontramos en carcinomarenal un 63% de casos de baja actividad, 32,3% de actividad interme-dia y 4,7% de actividad alta, mientras que en carcinoma de colonencontramos un 52,1% de baja actividad, un 42,7% de actividad inter-media y un 5,2% de actividad elevada. En controles un 61,4% fueronde alta actividad, un 31,8% de actividad intermedia y un 6,8% de acti-vidad elevada. El análisis estadístico no resultó significativo para loscasos de carcinoma renal (p = 0,75) ni para los casos de carcinoma decolon (p = 0,20).

149.CARACTERIZACIÓN DE UNA LÍNEA DE MELANOMA CONPÉRDIDA TOTAL DE EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS HLA DECLASE I. Rodríguez T1, Méndez R1, Aptsiauri N1, Campo AB1,Jiménez P1, Zinchenko S1, Gallego A1, Ruiz-Cabello F1, Gauder-nak G2, Garrido F1. 1Servicio de Analisis Clínicos, Hospital Universi-tario Virgen de las Nieves, Granada. 2Section for Immunotherapy, Depart-ment of Immunology, Cancer Research Institute, The Norwegian RadiumHospital, University of Oslo, Oslo, Noruega.

Las células T citotóxicas (CTLs) juegan un papel central en la elimi-nación de células infectadas por virus y células tumorales, siendo nece-sario para ello la expresión de moléculas HLA de clase I. No obstante,la pérdida total de estas moléculas en la superficie celular es un meca-nismo frecuente empleado por el tumor para evadir la inmunovigilan-cia. Tres mecanismos principales han sido descritos en células con pér-dida total de clase I en células tumorales: mutaciones en b2-microglo-bulina (b2m), deficiencias en TAP, y baja afinidad en la unión de los ele-mentos reguladores de esos genes. El objeto de esta comunicación esla descripción de otros mecanismos molecular responsables de la ausen-cia de expresión de moléculas HLA de clase I en una línea tumoral pro-cedente de un paciente con melanoma. La línea celular denominadaM010, es totalmente negativa para la expresión de HLA de clase I tan-to en condiciones basales como tras el tratamiento de Interferón gam-ma. En cambio, en esta línea se detecta la presencia por inmunofloures-cencia indirecta de una acumulación de b2m y de la cadena pesada intra-citoplasmática. Los genes involucrados en la maquinaria de procesa-miento antigénico (LMP2, LMP7, TAP1 y TAP2) fueron estudiados mos-trando un nivel de transcripción similar a la encontrada en líneas tumo-rales positivas para la expresión de moléculas HLA de clase I en super-ficie. Estos resultados sugieren un defecto en la formación del comple-jo de cadena pesada-b2m hasta el momento desconocido.

150.EL POLIMORFISMO DEL GEN CTLA-4 SE ASOCIA A UNMAYOR RIESGO DE DESARROLLO DE CÁNCER RENAL.Saenz-López P1, Romero Noguera JM1, Cózar JM2, Tallado M2, Vil-chez JR1, Jiménez P1, Ferron A3, Garrido F1, Ruiz-Cabello F1. 1Ser-vicio de Análisis Clínicos y 2Servicio de Urología Hospital Universita-rio Virgen de las Nieves, Granada.

El polimorfismo de genes que codifican citoquinas y otras proteí-nas reguladoras de linfocitos puede influenciar en el control de proce-sos de respuesta inmune, tales como procesos inflamatorios, autoinmu-nes o antitumorales. En nuestro caso, hemos estudiado polimorfismosgénicos de un solo nucleótido relacionados con distintos grados de acti-vidad de la molécula producida. Hemos estudiado polimorfismos deCTLA-4, IL-4 e IL-10 en 117 pacientes con carcinoma renal, 96 pacientescon carcinoma de colon y en 196 controles sanos, todos procedentes delárea de Granada (España), para comprobar si existen diferencias esta-dísticamente significativas en la distribución de frecuencias de los poli-morfismos estudiados. Las frecuencias estudiadas no fueron estadísti-camente significativas para los polimorfismos estudiados de IL4 e IL10,siendo los porcentajes obtenidos similares entre casos y controles. En elgen CTLA-4 se estudiaron dos polimorfismos, CTLA4/CT60 yCTLA4/A49G, que influyen en la cantidad producida y en la actividadbiológica, respectivamente, de este factor inmunosupresor. En el poli-morfismo CT60 encontramos una mayor frecuencia del genotipo AA enpacientes con cáncer renal que en controles (p= 0,005; OR= 2,12; IC 95%:1,28-3,50) y en el polimorfismo A49G obtuvimos una mayor frecuen-

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cia del genotipo AA, también al comparar las frecuencias de los casosde carcinoma renal con la de los controles (p= 0,022; OR=1,76; IC 95%:1,11-2,80). Los genotipos que aparecen con mayor frecuencia en pacien-tes con carcinoma renal se han relacionado con una mayor producción(CT60) y con una mayor actividad biológica (A49G) de este factor inmu-nosupresor. También encontramos correlación entre el polimorfismoCT60 y el grado tumoral en los casos de cáncer renal (p = 0,022). En loscasos de carcinoma de colon se encontraron diferencias con los contro-les en ninguno de los polimorfismos estudiados.

151.DIFERENTES ALTERACIONES EN LA EXPRESIÓN DE MOLÉ-CULAS HLA DE CLASE I ENCONTRADAS EN EL ESTUDIODE CUATRO LÍNEAS CELULARES DE PRÓSTATA. Méndez R1,García Ruano A1, Campo AB1, Aptsiauri N1, Zinchenko S1, Can-tón J1, Ward S2, Ruiz-Cabello F1, Garrido F1. 1Servicio de AnalisisClínicos, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada. 2Ony-vax Ltd, St George's Hospital Medical School, London, Reino Unido.

El cáncer de próstata es la segunda causa de muerte en la mayoríade los países desarrollados. El desarrollo de esta enfermedad puede estarprobablemente influenciado por factores genéticos. Uno de esto factoresque puede influenciar la progresión del cáncer prostático es la expresiónde los antígenos HLA en estas células tumorales, dado que la pérdida deestas moléculas en la superficie celular es un mecanismo frecuente emple-ado por el tumor para evadir la inmunovigilancia. El objeto de esta comu-nicación es la caracterización de la expresión de los antígenos HLA declase I en cuatro líneas celulares de próstata establecidas de metástasisprocedentes del proyecto europeo ENACT, siendo cedidas a éste por Ony-vax. De las cuatro líneas estudiadas, una de ellas (OPCN-3) fue totalmen-te negativa para la expresión en superficie de HLA de clase I, tanto encondiciones basales como tras el tratamiento con Interferón gamma. Alestudiar el gen de la b2-microglobulina en esta línea, observamos unadeleción de aproximadamente 300 pb mediante RT-PCR. La secuencia-ción de este fragmento mostraba la ausencia del exón 2. No obstante estefragmento se encontraba presente en el DNA genómico. Se ha secuencia-do el DNA genómico de las secuencias que flanquean el exón 2 y no seha encontrado mutación en el sitio aceptor de «splicing». La línea celu-lar OPCN-1 fue positiva para la expresión de W6/32 (HLA-ABC). Noobstante, presentó una baja regulación del locus HLA-B inducible tras eltratamiento con Interferón gamma. Esta baja regulación fue tambiénobservada a nivel transcripcional, no encontrándose transcritos para ellocus B en condiciones basales. El tipaje genómico de esta línea fueA*0101,2301/B*3701,4001/C*0304,0602. Tras el tratamiento con IFN-gam-ma sólo se pudo observar la recuperación del antígeno B*3701 con unanticuerpo anti Bw4, en cambio no se pudo observar la presencia deB*4001 . Las otras dos líneas celulares fueron positivas para la expre-sión de moléculas HLA de clase I en superficie.

152.DISTRIBUCIÓN DE FENOTIPOS HLA ALTERADOS EN 92LÍNEAS CELULARES DE MELANOMA. Rodríguez T1, MéndezR1, Campo AB del1, Monge E1, Jiménez P1, Ruiz-Cabello F1, Galle-go A1, Pawelec G2, Garrido F1. 1Servicio de Analisis Clínicos, Hospi-tal Universitario Virgen de las Nieves, Granada. 2Section for Transplan-tation Immunology and Immunohaematology, Zentrum für Medizinis-che Forschung, Tübingen, Alemania.

Introducción y metodología. En este estudio, hemos aplicado unametodología para el análisis integral de los antígenos HLA de clase I

en líneas celulares de melanoma. Se ha estudiado la expresión de lasmoléculas HLA de clase I en 92 líneas celulares de melanoma proce-dentes del proyecto Europeo ESTDAB. La expresión de las moléculasHLA de clase I fue evaluada mediante la intensidad media del canaldel fluorescencia (MFI) mediante citometria de flujo y el estudio deexpresión génica para varios genes (cadena pesada HLA de clase I,b2m, LMP2, LMP7, TAP1 y TAP2) mediante PCR cuantitativa a tiem-po real, siendo realizado a las mismas el tipaje genómico.

Resultados. 11% de las líneas estudiadas han sido incluidas enel Fenotipo I. De esas líneas un 2% presentan una ausencia total demoléculas HLA de clase I (Fenotipo Ia) debido a defectos en el gende la b2-m, las 8 líneas restantes, con Fenotipo Ib (9%), se caracterizanpor una baja regulación de las moléculas HLA de clase I (HLA-ABC,MFI<100). A su vez, estas líneas poseen baja expresión de las molé-culas LMP-7 y TAP-2. En un 15% de las líneas se observa la pérdida dehaplotipo (Fenotipo II) mediante tipaje genómico. El 21 % de las líne-as celulares de melanoma presentaron una baja regulación del locusHLA-B (Fenotipo III) (HLA-B, MFI< 50). Seis líneas (7% de los casos)presentaron la combinación de dos o mas fenotipos (Fenotipo com-puesto o Fenotipo V). Solamente 2 líneas celulares no mostraron res-puesta al IFN-γ, aunque presentaban respuesta al tratamiento con IFN-α. En las 39 líneas celulares (42%) restantes, ninguna alteración HLAde clase I pudo ser identificada.

Conclusión. La pérdida de expresión de los antígenos HLA de cla-se I es un fenómeno frecuente y heterogéneo en tumores y en algu-nos casos es el resultado de cambios genéticos irreversibles en cromo-soma 6 y el 15 los cuales pueden afectar la inmunidad antitumoral einterferir con protocolos de inmunoterapia.

153.REGULACIÓN Y FUNCIÓN DEL LIGANDO DE MUERTETRAIL EN CÉLULAS T. Ruiz-Magaña MJ, Morales JC, Ruiz-RuizC. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular 3 e Inmunología,Facultad de Medicina, Universidad de Granada.

TRAIL es un ligando de muerte que pertenece a la superfamiliaTNF. La importancia de este ligando se basa en su capacidad para indu-cir apoptosis en células tumorales y no en células normales, aunqueexisten algunas células tumorales que son resistentes a la acción deTRAIL. En estudios preclínicos se ha comprobado que puede inhibir elcrecimiento de tumores de mama y de colon y el desarrollo de metás-tasis, sin presentar toxicidad como le ocurre a CD95L. Al igual que enotros tipos celulares del sistema inmunológico, TRAIL se expresa encélulas T en respuesta al tratamiento con interferones o a la activacióndel TCR, pudiendo mediar la actividad antitumoral de dichas células.

El objetivo de este trabajo es conocer la implicación del factor detranscripción NFAT en la regulación de la expresión de TRAIL en célu-las T activadas. Para ello hemos llevado a cabo ensayos de actividadluciferasa utilizando diferentes fragmentos del promotor de TRAIL yanalizando la activación de los mismos en respuesta al tratamiento conésteres de forbol y/o iónoforos de calcio. Se ha analizado también laexpresión del ARNm de TRAIL en células T activadas y en respuestaal tratamiento con ciclosporina A. Finalmente, se han realizado expe-rimentos de cocultivo de distintas líneas tumorales, sensibles o no aTRAIL, con linfocitos T activados y en reposo.

Los resultados obtenidos de este estudio demuestran que linfoci-tos T activados pueden inducir apoptosis en células tumorales sensi-bles a TRAIL y que el factor de trascripción NFAT participa en la regu-lación de la expresión de TRAIL a nivel de ARNm en dichas células

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T activadas, debiendo existir algún sitio de unión y regulación pordicho factor en una región de 165 pb en dirección 5' desde el sitio deinicio de trascripción.

154.RECEPTORES KIR2D SOBRE CÉLULAS TCD8 Y NK EN SAN-GRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON MELANOMA.IMPORTANCIA DEL FENOTIPO HLA-C. Campillo JA, Martí-nez-Escribano JA, Moya-Quiles MR, Marín L, Muro M, Guerra N,Parrado A, Campos M, Frías JF, Minguela A, García-Alonso AM,Álvarez-López MR. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca.

Introducción. Las células TCD8 y NK están implicadas en la res-puesta inmune contra el melanoma. Su actividad citotóxica está regu-lada por el balance entre señales de inhibición y de activación media-das por receptores killer pertenecientes a la superfamilia de las inmu-noglobulinas (KIR). Dado que los receptores KIR y sus correspondien-tes ligandos en el locus HLA-C han sido recientemente asociados condiferentes patologías, incluyendo enfermedades tumorales, estuvimosinteresados en el siguiente objetivo.

Objetivo. Investigar cambios tempranos en el número de célu-las TCD8 y NK que expresan receptores KIR2D en diferentes gruposde dimorfismo HLA-C de pacientes con melanoma.

Metodología. Se analizaron las células TCD8 y NK CD56 en san-gre periférica de 38 pacientes y 37 controles mediante citometría deflujo. El dimorfismo HLA-C en posición 80 se realizó mediante PCR-SSP y/o PCR-SSO.

Resultados. En 32 de un total de 38 pacientes no se detectó metás-tasis en el ganglio centinela. Las células T CD8+CD28-CD158a+ y NKCD56+CD158a+ estaban significativamente aumentadas en pacientesno metastáticos y homocigotos para HLA-CLys80, mientras que enheterocigotos solo se encontró aumentada la población de células NKCD56+CD158a+. También se observó un aumento de la expresión delreceptor CD158a sobre células NK, pero no en células T, de pacientesen estadio avanzado.

Conclusión. El presente trabajo describe, por primera vez, unaumento de las células TCD8 y NK CD56 que expresan el receptorCD158a en pacientes que portan el correspondiente ligando HLA-C,lo cual puede ser de interés en el planteamiento de terapias inmunesindividualizadas.

155.EXPRESIÓN DEL EPÍTOPO A-10 EN LÍNEAS CELULARES DETUMOR DE PULMÓN HUMANAS Y SU REACTIVIDAD CONANTICUERPOS NATURALES DE CLASE IGM. Cillero L, Mol-tó L, López-Asenjo JA, Trancho H, Subiza-Lestache JL. HospitalClínico San Carlos. Madrid.

Introducción. El Ac-A-10 es un anticuerpo monoclonal original-mente seleccionado por su reactividad frente a células de tumor muri-no de Ehrlich. Identifica un epítopo de carbohidrato dentro de la muci-na MUC-1 presente en adenocarcinoma de colon humano. La expresiónde este epítopo tiene valor de factor pronóstico en cáncer de colon y secorrelaciona con la reactividad de IgM natural con este tipo de tumores.

Objetivo. Valorar la expresión del epítopo A-10 en Cáncer de pul-món humano y su relación con la reactividad de IgM natural en el sue-ro de individuos sanos.

Material y métodos. La reactividad de IgM natural se ha ensaya-do tanto por Inmunofluorescencia de superficie como por células per-

meabilizadas por citospin frente a diferentes líneas de tumor de pul-món humanas tales como H-1355, Calu-3, H-1299, A-549 cedidas porATTC. La muestra ascendió a n=115.

Analisis estadístico. Las variables cuantitativas se resumen enMediana y Rango Intercuartílico (P25 y P75). La correlación se eva-luó mediante el Coeficiente de Correlación de Spearman. La compa-ración de medianas se realizó mediante el Test de U de Mann- Whit-ney y Kruskal Wallis. El paquete informático utilizado fue SPSS 12.

Resultados. Diferentes Líneas de tumor de pulmón humanas tie-nen diferente expresión del epítopo A-10. H-1355 y Calu-3 son alta-mente positivas mientras que A-549 y H-1299 son negativas.

Existe una muy buena correlación entre la expresión del epítopoA-10 y la reactividad de IgM natural de los sueros de los individuostestados con las líneas H-1355 y Calu-3 (p< 0,001, r = 0,82) frente a laencontrada con las líneas A-549 y H-1299 (p< 0,001, r = 0,50). Datosque se corroboran con el análisis descriptivo de un subgrupo (n=26)por Inmunofluorescencia por Citospinas, el 78% de los sueros que fue-ron positivos para H-1355 lo son para Calu-3 por otra parte las líneasA-549 y H-1299 fueron negativas para los sueros analizados.

Conclusión. Los anticuerpos naturales de tipo IgM y el anticuer-po monoclonal A-10 reaccionan con un epítopo de carbohidrato pre-sentes en células de tumor de pulmón humanas.

156.ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA EXPRESIÓN DE ZAP-70EN LA LEUCEMIA LINFOIDE CRÓNICA (LLC) POR CITO-METRÍA DE FLUJO (CF). Olivares N, Alonso M, Emparanza J,Trassorras M, Cuadrado E, Echániz P. Laboratorio de Inmunología.Hospital Donostia.

El curso clínico de los pacientes con LLC es heterogéneo y algu-nos requieren terapia temprana, mientras que otros no la necesitandurante años. La presencia o ausencia de mutaciones somáticas en losgenes Ig VH es un factor pronóstico considerado como «gold-standar»,pero esta técnica es cara y laboriosa. la expresión de la proteína ZAP-70 se ha propuesto como alternativa del estatus mutacional somáti-co. La interpretación de los resultados de expresión de ZAP-70 por C.F.es compleja y varía según el método de análisis.

Material y métodos. Hemos analizado la expresión de ZAP-70 en65 casos de LLC utilizando dos métodos alternativos :1) Teniendo encuenta la expresión de ZAP-70 en linfocitos T, y 2) Teniendo en cuentala ratio de intensidad media de fluorescencia (IMF) entre LLC-B/L-T.

Comparamos los resultados por tres métodos de análisis estadis-tico: 1) Valoración continuada, 2) Valoración categorizada, 3) Valora-ción de indeterminados.

Resultados. Analizando el grado de concordancia o acuerdo entre2 determinaciones a escala cuantitativa continua mediante análisis grá-fico de Bland y Altman, se aprecia una diferente coincidencia de ladeterminación en diferentes regiones de «rango de proteína» r: 0,645p< 0,001, por lo que concluimos que los dos métodos no tienen unacuerdo estadístico suficiente.

Hemos categorizado las determinaciones y determinado la kappade Cohen k:0.521 p< 0,001 lo que puede considerarse como un acuer-do moderado en la escala de Landis.

El porcentaje de indeterminados (20-30% de expresión de ZAP-70)es mayor en el método de IMF (33%) que en el método que tiene encuenta la expresión de ZAP-70 en L-T (16%).

Conclusiones. Los resultados entre ambos métodos tienen unacuerdo moderado y no son superponibles.

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El porcentaje de incertidumbre es mayor cuando se tiene en cuen-ta el método de la IMF. La significación de ambos tipos de análisis enrelación con los datos clínicos esta siendo evaluada en estos momentos.

157.VALORACION CLINICA, IDENTIFICACION Y CARACTERI-ZACION DE PROTEINAS INMUNES EN GAMMAPATIASMONOCLONALES. TALLERES DE INMUNOQUIMICA. 2004-2005. Sequí Navarro J1*, Rodríguez Molina JJ2*, Villar GuimeransLM3*, Juárez Rubio C4* y el Grupo de Trabajo de Inmunoquímica5

(M. Alsina Donadeu; E.M. Martínez Cáceres; M.J. Amengual Gue-daní; M.J. Rodrigo Anoro; C. Cámara Hijón. L. Fernández Pereira;P. Sanchez Mozo; I. Alarcón Torres; P. González Porqué; P. VarelaPeña; L. Allende Martínez; M.J. Sentchordi Izquierdo; M.J. SanchezAlonso; C. Jiménez Garófano; C. Muñoz Calleja; M. López Trasca-sa; N. Fernández Arcas; R. Álvarez López; J. Ferrer Balaguer; M.López Hoyos; L. Larrad Mur; R. Garcia Delgado y J. Yagüe Ribes).Servicios de Inmunología: 1Hospital Carlos III, Madrid; 2Hospital Gene-ral Universitario Gregorio Marañón, Madrid; 3Hospital Ramón y Cajal,Madrid; 4Hospital de Sant Pau. Barcelona; 5Grupo de Trabajo de Inmu-noquímica (Hospital Mutua de Terrassa. Terrasa. Barcelona; Hospital Uni-versitario Germans Trias i Pujol. Badalona. Barcelona; UDIAT-CD. Cor-poració Sanitaria Parc Taulí. Sabadell.Barcelona; Hospital Vall d'Hebron.Barcelona; Hospital de Cruces. Baracaldo. Bilbao; Hospital San Pedrode Alcántara. Cáceres; Complejo Hospitalario Universitario Juan Cana-lejo. La Coruña; Hospital de Gran Canaria«Dr. Negrín». Las Palmas GranCanaria; Hospital 12 de Octubre. Madrid; Hospital Central de la Defen-sa. Madrid; Hospital de la Princesa. Madrid; Hospital Universitario«La Paz». Madrid; Hospital «Carlos Haya». Málaga; Hospital VirgenArrixaca. Murcia; Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca. Baleares;Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Santander; Hospital Clí-nico Unive rsitario. Zaragoza; Fundación Jiménez Díaz . Madrid y Hos-pital Clinic. Barcelona).*Coordinadores. Taller SEI 2004 y 2005.

Los Talleres de Inmunoquímica (IQ) de la Sociedad Española deInmunología son herramientas de estandarización basados en ejerci-cios colaborativos de íntercomparación para validar los métodos ana-líticos. Sus resultados se expresan unidades homologadas por Orga-nizaciones Internacionales (Internacional Federation of Clinical Che-mistry and Laboratory Medicine.IFCC)

Las gammapatias monoclonales (GM) se definen por la presenciade uno o mas Componentes Monoclonales (CM). La prevalencía de losCM en la población sana < 60 años es un 0,2% y en los individuos > 80años se eleva a un 10%. El estudio del Perfil de Proteínas Inmunes delCM, según las recomendaciones de los Grupo Internacional de Mielo-ma y de las GM de Significado Incierto incluye las determinaciones en:1. Suero: análisis de la concentración de proteínas totales, electrofo-

resis de la muestra y concentración de la proteína monoclonal.2. Orina: determinación de la concentración de proteínas en el volu-

men de 24 horas, electroforesis y concentración de la proteínamonoclonal.

3. En suero y en orina: definición de la clase y el tipo de proteínamonoclonal.

4. En suero: determinación de la concentración de Inmunoglobuli-nas (Igs) y relación de cadenas ligeras libres (CLL) (kappa y lamb-da CLL).El objetivo primordial del estudio es confirmar la presencia del o

los CM en muestras biológicas, con criterios homogéneos, en todos loslaboratorios de Inmunología participantes.

En los Talleres de IQ (2004 y 2005) se remitieron a los responsa-bles de los laboratorios (2004, n=21), (2005, n=22) un total de 9 mues-tras para valorar el CM. En ellas se estudio el Perfil de Proteínas Inmu-nes, para ello se identifico el CM y se determino la concentración delas Igs: IgG, IgA, IgM, cadenas ligeras totales (CLT) kappa y lambda,con las técnicas habituales empleadas en la practica clínica en cada unode los laboratorios participantes.

En el Taller de IQ-2004 se analizaron 4 CM (IgG lambda, IgD lamb-da, IgM kappa e IgG kappa), y en el Taller IQ-2005 se analizaron 5muestras (cadenas pesadas mu, IgG kappa, IgG policlonal, IgA lamb-da e IgG lambda).Se evaluaron los valores medios de las cuantificacio-nes de las Igs monoclonales y el coeficiente de variación (%CV) deresultados obtenidos por los laboratorios participantes. En cuatro delas muestras el isotipo monoclonal mostró un %CV > 10 , en otras 4muestras el %CV < 10 y la muestra de la proteína IgD del CM IgD lamb-da no se cuantifico: Se observo que estas diferencias dependen delmétodo y equipo empleado ( nefelometría y turbidimetría).

La relación del estudio de las CLT kappa/ lambda ( rango 1,29-2,61) muestra predominio de cadenas kappa en los tres CM asociadosa la CL kappa, y en la muestra remitida de hipergammaglobulinemiapoliclonal. En la vertiente de las CL lambda se observa aumento en dosCM lambda, y se encuentra dentro del rango en otros dos CM lambday en la muestra de cadena pesada mu, por lo que la relación CLT kap-pa/ lambda requiere su valoración dentro del Perfil de Proteínas Inmu-nes y establecer su significado clínico.

Finalmente concluimos que en el control de calidad en las GM esaconsejable emitir un informe del Perfil de Proteínas Inmunes de losCM, con la descripción de los métodos, y equipos, para el diagnosticoy seguimiento de las distintos procesos clínicos en las neoplasias lin-foides y hematológicas

158.ACTIVIDAD ANTITUMORAL DEL ESCUALENO, COMPO-NENTE MINORITARIO DEL ACEITE DE OLIVA VIRGENEXTRA, EN DOS LÍNEAS TUMORALES DE CÁNCER DEMAMA (MDA-MB-231 Y MCF7). Ruiz-Mora J, Warleta F, Serra-no MJ, Campos M, Algarra I, Gaforio JJ. Área de Inmunología. Depar-tamento de Ciencias de la Salud. Universidad de Jaén.

Introducción. Las propiedades saludables del Aceite de OlivaVirgen Extra (AOVE) son cada vez más reconocidas. Diversos estu-dios epidemiológicos describen la correlación inversa entre el consu-mo habitual de AOVE y la aparición de determinados tipos de tumo-res. El Escualeno, componente con propiedades antioxidantes, seencuentra en grandes cantidades en la fracción insaponificable delAOVE, su rango oscila ente 136 y 708 mg/100 g. Nuestro grupo, estainteresado en estudiar la actividad antitumoral del Escualeno sobrecélulas tumorales de cáncer de mama. Como modelo experimentalutilizamos las líneas tumorales MDA-MB-231 (receptor estrogénicanegativa) y, MCF7 (receptor estrogénica positiva). Realizamos in vitroensayos de citotoxicidad, proliferación celular, ciclo celular y de apop-tosis.

Metodología. Las líneas tumorales utilizadas son MDA-MB-231 yMCF7. Utilizamos diferentes concentraciones de Escualeno para tratarlas líneas tumorales. Para realizar los estudios de citotoxicidad y proli-feración celular, utilizamos ensayos colorimétricos en placa de 96 poci-llos mediante la técnica de XTT; los estudios de apoptosis se realizancon Citometría de Flujo y mediante marcaje con Anexina V-FITC/IP;los estudios de ciclo celular se realizan mediante Citometría de Flujo

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y marcaje con Ioduro de Propídio, y completados con estudios de micros-copia confocal de fluorescencia. El tratamiento estadístico de los datosse realiza mediante cálculo de promedios y errores.

Resultados:• Citotoxicidad MDA-MB-231 (Expresada en % ± SD)

– Control 100,00 ± 0,03– ESC 1 µM 101,80 ± 0,09– ESC 10 µM 107,18 ± 0,05– ESC 100 µM 108,93 ± 0,06– ESC 1000 µM 107,50 ± 0,07

• Citotoxicidad MCF7 (Expresada en % ± SD)– Control 100,00 ± 0,05– ESC 1 µM 107,97±0,12– ESC 10 µM 111,04±0,10– ESC 100 µM 100,99±0,11– ESC 1000 µM 97,14±0,09

• Proliferación MDA-MB-231 (Expresada en % ± SD)– Control 100,00 ± 0,08– ESC 1 µM 94,71 ± 0,05– ESC 10 µM 98,64 ± 0,04– ESC 100 µM 103,55 ± 0,06– ESC 1000 µM 102,67 ± 0,09

• Proliferación MCF7(Expresada en % ± SD)– Control 100,00±0,03– ESC 1 µM 100,07±0,04– ESC 10 µM 97,35±0,03– ESC 100 µM 97,85±0,06– ESC 1000 µM 100,89±0,06

• Apoptosis mda-MB-231(Valores expresados en %)Apoptosis Necrosis

– Control 20,30 5,17– ESC 50 µM 17,14 5,16– ESC 200 µM 13,16 5,13

• Apoptosis MCF7 (Valores expresados en %)Apoptosis Necrosis

– Control 57,62 4,48– ESC 50 µM 54,07 3,83– ESC 200 µM 58,73 3,04

• Ciclo celular MDA-MB-231(Valores expresados en %)G0/G1 S G2/MG0/G1 S G2/M

– Control 61,70 18,52 15,92– ESC 50 µM 63,37 18,43 13,88 – ESC 200 µM 65,64 17,61 12,12

• Ciclo celular MCF7(Valores epresados en %)G0/G1 S G2/M

– Control 64,62 16,29 15,61– ESC 50 µM 67,07 14,76 14,77– ESC 200 µM 65,86 16,06 14,97Conclusión. Son numerosas las propiedades saludables que se

atribuyen al Aceite de Oliva, entre ellas una posible actividad antitu-moral, correlacionandose las características antioxidantes de aquel conesta actividad. Nuestros resultados in vitro con las líneas tumoralesMDA-MB-231 y MCF7, aún siendo preliminares, muestran que el Escua-leno, y a las concentraciones manejadas, no tiene efectos significativossobre la proliferación celular, ciclo celular, capacidad de inducir apop-tosis ni posee actividad citotóxica. Ello sugiere que la capacidad antio-xidante es independiente de la actividad antitumoral en este compo-nente del AOVE.

159.DIFERENCIACIÓN IN VITRO DE CÉLULAS T CD8 MART-1ESPECÍFICAS NAÏVE: CORRELACIÓN DE LA FUNCIÓNEFECTORA CON FENOTIPO Y PROLIFERACIÓN. Casado JG,DelaRosa O, Durán E, Peralbo E, Barahona F, Solana R, Tarazo-na R. Universidad de Extremadura, Departmento de Fisiología, Área deInmunología, Facultad de Veterinaria, Cáceres. Universidad de Córdo-ba, Departmento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología, Facultadde Medicina, Córdoba. Universidad de Extremadura, Unidad de Histo-logía y Anatomía Patológica, Facultad de Veterinaria, Cáceres. Univer-sidad Autónoma, Centro de Biología Molecular, Madrid.

En este trabajo se han caracterizado los lifocitos T CD8 MART-1 espe-cíficos circulantes y expandidos in vitro de donantes sanos en relacióncon su estadio de diferenciación y su capacidad citotóxica. La frecuenciade linfocitos T CD8 MART-1 específicos se ha determinado mediante pen-támeros MART-1 y la expansión in vitro de células T CD8 específicas serealizó mediante estimulación antóloga con la fracción CD8 negativaincubada con el péptido ELAGIGILTV. El fenotipo se analizó por fluo-rescencia multiparamétrica y la funcionalidad por ELISPOT y ensayosde citotoxicidad. Los resultados demostraron que los lifocitos T CD8MART-1 específicos circulantes de donantes sanos exhiben un fenotiponaïve y que el protocolo utilizado para la expansión in vitro expande efi-cientemente un alto número de CTLs MART-1 específicos. En función dela capacidad de proliferación se obtuvieron CTLs MART-1 específicosefectores/memoria (CD45RA–CCR7–) y CTLs MART-1 específicos efec-tores (CD45RA+CCR7–) que fueron no citotóxicos y citotóxicos respec-tivamente. En conclusión, la estimulación in vitro de linfocitos T CD8MART-1 específicos naïve produce CTLs MART-1 específicos con dife-rentes fenotipos activados en función de su historia replicativa.

160.LINFOMA T EN PACIENTE CON TRASPLANTE HEPÁTICO.Rodríguez-Martín E1, Martínez-Viñambres E1, Villarrubia N1, Gar-cía-Trujillo JA1, Berlinches A2, Santón A2, Coll J1, Roldán E1. 1Ser-vicio de Inmunología. 2Servicio de Anatomía Patológica. Hospital Ramóny Cajal. Madrid.

Los síndromes linfoproliferativos post-trasplante (PTLDs) se des-arrollan como consecuencia de la inmunosupresión a la que es some-tido el receptor de un órgano sólido o de médula ósea. Los PTLDs pue-den ser de naturaleza policlonal, generalmente inducidos por EBV, ode naturaleza clonal, en la mayoría de los casos linfomas (EBV posi-tivos o negativos), con un claro predominio de linfomas B con respec-to a los linfomas T. El riesgo de padecer un linfoma varía en funcióndel tipo de órgano trasplantado y del régimen de inmunosupresión.La incidencia de los PTLDs en los receptores de trasplante de órganosólido es inferior al 2%, representando el trasplante hepático un ries-go intermedio respecto al mayor riesgo que presentan los receptoresde pulmón y corazón (5%).

El caso clínico que se presenta es el de una mujer de 35 años condolor abdominal generalizado de 7 días de duración acompañado denaúseas y vómitos. La paciente refiere aumento de perímetro abdomi-nal de forma progresiva, sin aumento de edemas en miembros inferio-res. Asimismo, refiere astenia sin fiebre ni sensación distérmica. Lapaciente padece hepatitis crónica por VHB+D y recibió un trasplantehepático en 2004.

Los resultados obtenidos mostraron múltiples adenopatías medias-tínicas, mesentéricas y retroperitoneales, ascitis y hepatoesplenome-galia homogénea. En la analítica se observó leucopenia con plaque-

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topenia. Se realizaron estudios de citometría de flujo en muestras desangre periférica, aspirado de médula ósea, PAAF, líquido ascítico ylíquido pleural. En todas las muestras, salvo en el líquido pleural, sedetectó la presencia de una población tumoral de linfocitos T, con feno-tipo: CD4+, CD3+ (intensidad inferior a la habitual), CD56-, CD2+,CD5+, CD7+, TCR alfa beta+. La población linfomatosa aparecía leu-cemizada en un pequeño porcentaje (1% de los leucocitos totales ensangre periférica y 1,2% de la celularidad total medular). Mediante téc-nica de PCR se detectó un reordenamiento clonal de la región variabledel gen TCR gamma en la muestra de líquido ascítico.

Estos datos muestran, de nuevo, como la citometría de flujo escapaz de detectar procesos clonales T, incluso con un muy bajo por-centaje de células tumorales y con una única aberración fenotípica (alte-ración en la intensidad media de fluorescencia del antígeno CD3).

161.EXPRESIÓN DE LIGANDOS DE RECEPTORES ACTIVADO-RES DE LA CITOTOXICIDAD NK EN MELANOMA: ANÁ-LISIS DE LA INTERACCIÓN LIGANDO-RECEPTOR. MarínJ, Casado JG, Sánchez-Correa B, Delgado E, Durán E, Solana R,Tarazona R. Área de Inmunología, Departamento de Fisiología, Uni-versidad de Extremadura, Cáceres.

La activación de células NK depende de un complejo balance entreseñales de activación e inhibición. Para moléculas de MHC clase I sehan descrito receptores NK activadores e inhibidores de la citotoxici-dad. Por otro lado, se han descrito receptores activadores y co-recep-tores que no son específicos para moléculas MHC clase I y que inter-vienen en el reconocimiento y la eliminación de células tumorales.

En este trabajo se han estudiado líneas celulares de melanoma pro-cedentes de los proyectos europeos OISTER y ESTDAB(http://www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/index.html) para analizar la expre-sión de ligandos del receptor activador NKG2D. Los resultados mos-traron que la mayoría de las líneas de melanoma expresan MICA/B ycon menor frecuencia ULBPs. El papel de la interacción NKG2D-MICA/B en la lisis de células de melanoma ha sido evaluado utilizan-do una línea celular NK (NKL).

Los resultados obtenidos demostraron que la interacción NKG2D-MICA/B representa un mecanismo efector muy importante en el reco-nocimiento y eliminación de células de melanoma mediado por célu-las NK. Sin embargo, aunque estos resultados apoyan el papel deNKG2D en la defensa contra el melanoma, la expresión de MICA/Ben las células de melanoma no siempre se correlaciona con su suscep-tibilidad a la lisis mediada por las células NK. Así, en ausencia de seña-les inhibidoras mediadas por receptores inhibidores de la citotoxici-dad, algunas líneas de melanoma MICA/B+ son resistentes a la lisisNK sugiriendo que otras interacciones receptor activador/ligando pue-den ser requeridas.

162. INCREASED EX VIVO APOPTOSIS IN PERIPHERAL BLOODNAÏVE/EFFECTOR/MEMORY T LYMPHOCYTE SUBPOPULA-TIONS OF B-CLL PATIENTS. Chara L, Diaz D, Chevarria J, Mon-serrat J, Prieto A, Mur S, Sanchez M, Barcenilla H, Acuña L, Villa-rroel M, Alvarez-Mon M. ÁCNB-CSIC R&D Associated Unit, IMMPA,Department of Medicine, University of Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid.

Background. Dysregulation of T lymphocyte apoptosis has beendescribed in B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) patients.

We have analyzed the apoptosis in specifically definednaïve/effector/memory T lymphocyte circulating subpopulations ofB-CLL patients. OBJECTIVE: To quantify spontaneous and inducedapoptosis in lymphocytes of B-CLL patients with regard to a controlpopulation of sex and age matched healthy individuals and withregard to the zap-70 expression.

Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 7 untreated B-CLL patients diagnosed according to Binet criteria (Binet A stage, 4zap-70+ and 3 zap-70-) and 6 healthy controls were purified andcharacterized using monoclonal antibodies and annexin V by eightcolor flow cytometry in a FACSAria sorter. The apoptotic index (AI)of lymphocyte subsets were determined after 24 hour culture undertwo conditions: spontaneous apoptosis and after phytohemagglutinininduction.

Results. A marked increase in spontaneous ex vivo apoptosiswas found in peripheral blood T lymphocytes from B-CLL patientswith respect to healthy controls. This increased apoptosis wasimpressive in the naïve subset (CD45RA+CD27+) from both CD4+and CD8+ T lymphocyte subpopulations. The effector and memoryCD4+ T subsets of zap-70+ B-CLL patients presented an increasedapoptosis with regard to healthy controls. Apoptosis of CD4+ T cellsubsets were higher in zap-70+ B-CLL patients than in zap-70-patients. Similar differences in AI were found in mitogen-inducedT cell apoptosis.

Conclusions: Patients with B-CLL show an impressive increasein spontaneous and mitogen-induced apoptosis within naïve CD4+and CD8+ T-cell subsets. This increased T lymphocyte apoptosis wasspecially marked in poor prognosis zap-70+ B-CLL patients.

163.LYMPHOCYTE APOPTOSIS IS MARKEDLY INCREASED ONPATIENTS WITH METASTATIC RENAL CELL CARCINOMA.Chara L1, Diaz D1, Chevarria J1, Navas V2, Carballido J3, PrietoA1, Monserrat J1, Barcenilla H1, Sánchez M1, Acuña L1, VillarroelM, Jimenez E, Olaverria M, Álvarez-Mon M1. 1CNB-CSIC R&DAssociated Unit, IMMPA, Department of Medicine, University of Alca-lá, Alcalá de Henares, Madrid. 2Clinical Oncology Research Unit, Uni-versity Central Hospital of Asturias, Oviedo. 3Department of Urology,University Hospital «Puerta de Hierro», Madrid.

Background. There are no studies regarding the incidence of exvivo apoptosis in specific lymphocyte subpopulations obtained fromperipheral blood of patients with renal cell carcinoma. The currentlyused indicator, apoptotic index (AI), measures the presence of apoptosisin a phenotypically defined cell population quantified by flow cytometry.OBJECTIVES: To quantify spontaneous and mitogen-induced apoptosisin lymphocytes of renal carcinoma patients with regard to a controlpopulation from healthy individuals.

Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 7 patients withrenal carcinoma and 6 healthy controls were purified and characterizedin a FACSCalibur cytometer using fluorocromo-labeled monoclonalantibodies. The AI (or percentage of apoptotic cells, AI x 100) wascalculated for T-cells expressing CD3, CD4, CD8, CD56, HLA-DR, CD25and CD45RO/RA antigens and NK-cells (CD3-CD56+ or CD3-CD16+).These AI were determined after 24 hours of culture under two conditions:spontaneous apoptosis and after phytohemagglutinin induction.Comparisons between patients and healthy controls were carried outusing the non parametric Mann-Whitney test and considered significantwhen p<0.05.

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Results. A significant increase (between 2.5 and 12 folds) inspontaneous ex vivo apoptosis was found in peripheral blood lymphocytesfrom renal carcinoma patients. This increase occurred in T-cells andNK-cells. We observed in the CD4+ subpopulation for the CD45RA+and CD45RO+ subsets, as well as in the CD8+ subpopulation for theCD45RA+ and CD45RO+ subsets. An increase of apoptosis was alsoobserved in CD3-CD56+ and CD3-CD16+ NK-cells. We also foundan apoptosis increase in total T-cells, CD4+ T-cells and CD8+ T-cellsexpressing CD25 and CD3+HLA-DR+, CD3+CD8+HLA-DR+ cells.Similar increases in AI were found in mitogen induced apoptosis oflymphocyte subsets from mRCC patients.

Conclusions. We have found impressive increases of spontaneousand mitogen induced apoptosis within several T-cell subsets of renalcarcinoma patients.

164.GENERACIÓN DE AGENTES ANTIANGIOGÉNICOS MUL-TIVALENTES Y MULTIESPECÍFICOS CONSTITUIDOS PORANTICUERPOS RECOMBINANTES Y OLIGÓMEROS DECOLÁGENO XVIII. Cuesta AM1, Sánchez-Arévalo Lobo VJ1,Sanz L1, Compte M1, García P2, Prieto J2, Blanco FJ2, Álvarez-Vallina L1. 1Unidad de Inmunología Molecular, Hospital Universita-rio Puerta de Hierro, Madrid. 2Programa de Biología Estructural yComputacional, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas),Madrid.

Este proyecto pretende el diseño, construcción y caracteriza-ción de una nueva generación de agentes antiangiogénicos multi-valentes y multifuncionales, mediante la integración anticuerposmonoclonales (AcMos) en armazones proteicos derivados de lamembrana basal (MB) que contienen inhibidores endógenos deangiogénesis (IEAs).

Uno de los IEAs mejor caracterizados es la endostatina (ES) quederiva de uno de los principales componentes de la MB, el coláge-no (XV y XVIII), de donde es liberada inicialmente en forma trimé-rica (dominio NC1) y posteriormente en forma monomérica, por laacción de proteinasas específicas. En el extremo N-terminal deldominio NC1, hay un dominio de trimerización de aproximada-mente 60 residuos conectado con el módulo ES (180 aminoácidos)mediante una región bisagra flexible que contiene diversos sitiossensibles a proteinasa que liberan ES después de su procesamien-to.

Con este objetivo, hemos generado una proteína quimérica quecomprende el fragmento variable de cadena única (scFv) del AcMoanti-laminina L36, y el dominio NC1 de colágeno XVIII. Los nive-les de proteinasas están aumentados en el microambiente tumo-ral, por lo que dicha proteína de fusión liberará in situ tanto monó-meros de ES como trímeros de scFv. La PF secretada por las célu-las humanas genéticamente modificadas en forma funcionalmenteactiva.

La forma intacta tiene una masa molecular de 210 kDa aproxi-madamente, lo que indica que, en condiciones fisiológicas, las subu-nidades individuales se asocian de manera no covalente para pro-ducir una estructura trimérica. Dicha PF trimérica inhibió de mane-ra significativa la capacidad de células endoteliales de migrar enrespuesta a factores de crecimiento y para formar estructuras capi-lariformes. Asimismo, dicha proteína de fusión es procesada in vitropor diferentes proteinasas. Los datos muestran que la catepsina L,la elastasa pancreática y diversas metaloproteinasas de la matriz

(MMP) generan tanto monómeros de ES como fragmentos scFv tri-méricos.

En ensayos in vivo, la secreción in situ de PF originó una inhibiciónsignificativa del crecimiento tumoral y raras veces se ha observadoregresión tumoral. Estos resultados inician una nueva estrategia debase genética para el tratamiento del cáncer.

165.PAPEL DEL SISTEMA HLA DE CLASE I Y CLASE II EN MIE-LOMA MULTIPLE. Alcoceba M, Marín L, Balanzategui A, Mar-tín-Jiménez P, Sarasquete ME, Chillón C, Corral R, García-SanzR, González M. Departamento de Biología Molecular/Histocompa-tibilidad, Servicio de Hematología, Hospital Universitario de Salaman-ca.

Introducción. El Mieloma Múltiple (MM) es una enfermedadcaracterizada por un aumento clonal del número de células plas-máticas en medula ósea capaces de producir una paraproteína mono-clonal. Aunque la etiología de esta enfermedad es desconocida, entresus causas se considera que puedan existir factores genéticos. Elpapel del sistema HLA (Human Leukocyte Antigen) ha sido esca-samente estudiado, no encontrándose una asociación consistente.Así, el antígeno HLA-B18 se ha asociado con la presencia de mie-loma en la población negra sudafricana y el HLA-B5 en diferentespoblaciones.

Objetivo. Analizar la influencia del sistema HLA en la apariciónde MM en la población española, así como su relación con la super-vivencia global (SG) y supervivencia libre de progresión (SLP) en estegrupo de pacientes.

Métodos. El tipaje de HLA clase I y clase II se realizó en muestrasde sangre periférica de pacientes con mieloma múltiple (n= 130) y decontroles (n= 1838).

Las especificidades de HLA-clase I (-A, -B) se identificaron median-te microlinfocitotoxicidad. En caso de ambigüedades y para el tipajede HLA-clase II (-DRB1), se llevó a cabo un tipaje HLA genérico median-te PCR-SSOr y/o PCR-SSP. Las frecuencias alélicas y haplotípicas seestimaron mediante el método de máxima verosimilitud utilizando elprograma Arlequin 3.0. La comparación de las frecuencias alélicas yhaplotípicas entre pacientes y controles se realizó mediante el test exac-to de Fisher ó el test ci2. Para la estimación de la supervivencia se emple-aron las curvas de Kaplan-Meier, utilizando el paquete estadístico SPSS14.0. Valores de p< 0,05 fueron considerados como estadísticamentesignificativos.

Resultados. El análisis de las frecuencias alélicas y haplotípi-cas de HLA-A, -B, y -DR no reveló la presencia de diferencias sig-nificativas entre el grupo de pacientes y el de controles. Así, los ale-los que mostraban asociación con mieloma múltiple en publicacio-nes previas (HLA-B18 y HLA-B5) mostraron una frecuencia simi-lar en el grupo de los pacientes y en el de los controles: HLA-B18(6% en pacientes versus 9% en controles, p= 0,229), y HLA-B5 (9%vs 10% p= 0,958).

Se encontró una mejor SG a 5 años en pacientes con -A1 (77% vs63%) y -DR1, y peor con -B18 (50% vs 68%), aunque no alcanzaron valo-res estadísticamente significativos. La presencia de -B18 se asocia conpeor SLP a 5 años (23% vs 59%, p= 0,016).

Conclusiones. Este estudio sugiere que no hay asociaciones espe-cíficas entre el tipo de HLA y la aparición de mieloma múltiple. La pre-sencia del alelo HLA-B18 podría influir en la progresión de la enfer-medad.

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SESIÓN 11: CÉLULAS T

Moderadores: Rafael Bragado Herrero (Madrid), Jaime Sancho López (Granada)

166.REGULACIÓN DE LA RECOMBINACIONAL DURANTE ELDESARROLLO EN EL LOCUS DEL TCR ALFA/DELTA PORENHANCERS. Blanco B del, Halmi P, Fernández-Ibáñez AM, Her-nández-Munain C. Instituto de Parasitología y Biomedicina «López-Neyra». Granada.

El locus del receptor de linfocitos T (TCR) α/δ es un modelo muyinteresante para el estudio de la regulación V(D)J durante el desarro-llo ya que los dos genes que lo componen, el TCRα y el TCRδ, tienendiferentes programas de activación durante el desarrollo de los timo-citos. El gen del TCRδ es funcionalmente activo en timocitos doblesnegativos (DN), mientras que el gen del TCRα no es funcionalmenteactivo hasta los timocitos dobles positivos CD4+CD8+ (DP). Además,el gen del TCRδ es inactivado en la transición de timocitos DN a timo-citos DP. Más aún, la organización de este locus, con el gen del TCRδrodeado por los segmentos Vα y Jα del gen del TCRα, determina queel gen del TCRδ sea delecionado como consecuencia del reordenamien-to del gen del TCRα. Estos programas de activación están controladospor la actividad de dos enhancers: el enhancer del TCRα (Eα) y elenhancer del TCRδ (Eδ). Eδ y Eα funcionan como enhancers específi-cos de estadío de diferenciación durante el desarrollo de los linfocitosT: Eδ está activado y Eα está desactivado en timocitos DN, mientrasque Eδ está desactivado y Eα está activado en timocitos DP. La inac-tivación de Eδ durante la transición de timocitos DN a timocitos DPestá asociada con una pérdida de la ocupación de este enhancer. Sinembargo, Eα está ya ocupado en timocitos DN. Actualmente, estamosestudiando los mecanismos moleculares para la regulación de la fun-ción de estos enhancers mediante la identificación de los complejosmultiprotéicos que se ensamblan in vivo durante la diferenciación delos timocitos.

167.MARCADORES DE LINFOCITOS T COMO MARCADORESDE EVOLUCIÓN CLÍNICA EN PACIENTES CON INSUFI-CIENCIA RENAL CRÓNICA (IRC). Hernández A1, Sánchez MA1,Villarroel M1, Barcenilla H1, Díaz D1, Parra T3, Calvino M3, Arri-ba G de3, Prieto A1, Monserrat J1, Reyes E1, Álvarez de Mon M1,2.1Unidad I+D asociada UAH/CNB-CSIC, IMMPA. Dpto Medicina.UAH. 2Serv. de enfermedades del sist. inmune y oncología. HUPA.Alcalá de Henares. 3Serv. de nefrología del Hospital Univer. de Guada-lajara.

Introducción. En los pacientes con IRC el grado de afectación odaño renal se determina por estadios en base al cálculo estimadode la filtración glomerular. La clasificación de los pacientes en dichosestadios y la valoración de diferentes factores de riesgo como son losniveles de colesterol y LDL entre otros (asociados a complicacionescardiovasculares) permite la detección de pacientes de riesgo en eldesarrollo de la enfermedad y poder prevenir complicaciones esta-bleciendo un adecuado manejo terapéutico. La relación de las altera-ciones del sistema inmune en estos pacientes con la evolución de laenfermedad no ha sido suficientemente estudiada y su conocimien-to podría contribuir a la prevención de complicaciones en estos pacien-tes.

Objetivo. Estudiar el estado del sistema inmune en los pacientescon IRC según el estado de evolución de la enfermedad.

Materiales y métodos. Se realizó el estudio inmunofenotípico porcitometría de flujo de 4 colores en 29 pacientes de insuficiencia renalcrónica (IRC) de edades comprendidas entre 28-80 años, teniendo encuenta los factores de riesgo asociados a esta enfermedad (criterios deinclusión: creatinina plasmática >5mg/dl y examinados en consultaexterna). Como referencia se han usado 23 controles sanos de edad ysexo similar a los pacientes.

Resultados. Según se deteriora la función renal en los pacientescon IRC se observa un incremento significativo del porcentaje de lin-focitos CD4 y CD8 que expresan el marcador de activación CD57 y unincremento significativo del porcentaje de linfocitos CD4 que expre-san el marcador CD40L, mientras que se produce un descenso signifi-cativo del porcentaje de linfocitos CD4 y CD8 que expresan el marca-dor CD28 así como una disminución significativa de los linfocitosCD4+CD71+, CD8+CD62L+ y CD8+CCR7+. Las variaciones en estaspoblaciones linfocitarias están asociadas al grado de afectación delos pacientes y a diferentes factores de riesgo como son el nivel de coles-terol, LDL y ferritina.

Conclusiones. Los marcadores de linfocitos T CD57+, CD28+,CD62L+, CCR7+ y CD40L se asocian al empeoramiento de la IRC ypodrían utilizarse como marcadores de la evolución clínica de la insu-ficiencia renal crónica.

168.LAS ALTERACIONES DE LAS SUBPOBLACIONES LINFOCI-TARIAS DIFIEREN EN FUNCIÓN DEL ORIGEN DE LA INSU-FICIENCIA RENAL. Hernández A1, Sánchez MA1, Villarroel M1,Barcenilla H1, Díaz D1, Parra T3, Pérez J3, Arriba G de3, Prieto A1,Monserrat J1, Reyes E1, Álvarez de Mon M1,2. 1Unidad I+D asociadaUAH/CNB-CSIC, IMMPA. Dpto Medicina. UAH. 2Serv. de enferme-dades del sist. inmune y oncología. HUPA. Alcalá de Henares. 3Serv.de nefrología del Hospital Univer. de Guadalajara.

Introducción. Existen diferentes patologías que pueden desembo-car en insuficiencia renal crónica y afectan de manera diferente al esta-do inmunológico del paciente.

Objetivo. Estudiar el estado inmunológico de los pacientes segúnel origen de la insuficiencia renal crónica.

Materiales y métodos. En el estudio se han incluido un total de28 pacientes con insuficiencia renal crónica agrupados en 4 nefropa-tías de diferente origen: glomerulonefritis, nefropatía túbulo intersti-cial, nefropatía genética y nefropatía diabética. Las células mononu-cleares se obtuvieron de sangre periférica y el estudio inmunofenotí-pico se llevó a cabo por citometría de flujo de 4 colores.

Resultados. Se detectaron alteraciones inmunofenotípicas com-parando las células mononucleares sanguíneas de los pacientes conrespecto a los controles. La linfopenia más acusada la presentan lospacientes con glomerulonefritis (disminución del 61% en linfocitostotales con respecto a los controles sanos y del 50% con respecto alas otras patologías). También encontramos una disminución signi-ficativa en el número de células que expresan el marcador de acti-vación CD95 en glomerulonefritis y nefropatía túbulo intersticial,estando aumentadas en los pacientes de las otras dos nefropatíasde origen. En las nefropatías genética y diabética encontramosaumentadas de forma significativa las cifras de linfocitos CD45RO+tanto en las células T4 como en las T8, lo que hace que disminuyael ratio RA/RO, mientras que en glomerulonefritis y nefropatía

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túbulo intersticial este ratio se mantiene similar al de los controlespese a la linfopenia.

Conclusiones. Las diferentes alteraciones del sistema inmune quese producen en los pacientes con insuficiencia renal crónica dependendel origen de dicha insuficiencia. Así mientras que la nefropatía gené-tica y diabética afecta a la redistribución linfocitaria, la glomerulone-fritis produce una linfopenia marcada que afecta fundamentalmentea los linfocitos CD4+.

169.EL PAPEL DE NUMB DURANTE LA PROLIFERACION DETIMOCITOS. Aguado R, Cañelles M. Instituto de Parasitologia yBiomedicina Lopez-Neyra-CSIC.

Durante el desarrollo de los linfocitos, éstos pasan en el timopor una serie de estadios de diferenciación: doble negativo (DN) -doble positivo (DP)-simple positivo (SP). Para ello se necesita unacorrecta señalización tanto a través de pre-TCR como de TCR. Seha demostrado que alteraciones en la señalización a través de estosdos receptores resultan en defectos en el desarrollo de los linfoci-tos T. Se sabe que otros receptores transmembranales también par-ticipan en la diferenciación temprana de linfocitos, estando entreellos Notch. Nosotros estamos interesados en Numb, una proteí-na adaptadora implicada en la ruta Notch, de la cual se conocen tresfunciones:a. Endocítica, participando en procesos de internalización de nume-

rosos receptores.b. Moduladora negativa de Notch.c. Oncosupresora, ya que la pérdida de su expresión resulta en can-

cer mamario en humanos.d. También está implicada en proliferacion de precursores tempra-

nos en el sistema nervioso de ratón, aunque en este caso su papeles distinto, pues la delección condicional de Numb y Numblikeresulta en defectos proliferativos de los precursores y en gravesalteraciones en el desarrollo del cerebro.En este contexto, nos proponemos determinar el papel de Numb

durante la proliferación de precursores tempranos de linfocitos. Paraello poseemos ratones transgenicos en los cuales se ha inhibido fun-cionalmente Numb mediante un dominante negativo(dnNbTG). Estosratones presentan una celularidad total del timo disminuida, reduc-ción de la población DP, así como un bloqueo significativo en el esta-dio DN3. Hemos demostrado mediante co-cultivos de timocios feta-les sobre la linea celular OP9 que la poblacion DN de ratones dnNbTGprolifera menos con respecto a los ratones wild-type. Sospechamos quelos ratones transgenicos para dnNb pueden tener defectos en la seña-lización por pre-TCR, y como consecuencia se produciría un defectoproliferativo en el estadio DN. Estos estudios estan siendo realizadosactualmente.

170.PAPEL DE LA PROTEINA NUMB EN LA MODULACIÓN DELTCR. Martín-Blanco N, Cañelles M. Instituto de Parasitología y Bio-medina «López Neyra» CSIC.

La función mas estudiada de Numb es su función como modula-dor negativo del receptor Notch. Notch, a su vez, interviene en el des-arrollo de linfocitos deciciendo la vía de diferenciación que debe seguircada célula hija tras una división. Numb contiene en su extremo ami-no un dominio PTB, y en su extremo carboxilo motivos DPF y NPF. Se

ha visto como los dominios DPF y NPF son capaces de unirse a AP-2y a Eps15 respectivamente, proteínas que intervienen en la internali-zación y degradación de diferentes receptores. Probablemente este esel mecanismo por el que modula la actividad de Notch. Además de lade señalización a través de Notch, para la correcta diferenciación delos linfocitos es necesario una correcta señalización a través del pre-TCR y del TCR.

El TCR esta continuamente sufriendo procesos de endocitosis,degradación y recicleje. Cuando la célula es estimulada, tanto la endo-citosis como la degradación se aceleran, lo que conduce a una dismi-nución de la cantidad de TCR superficial expresado.

Nuestro trabajo en el laboratorio se centra en el estudio del papelde Numb para esto disponemos de ratones trangénicos que expresanun dominante negativo para Numb (dnNb TG), el cual inhibe fun-cionalmente a Numb. En estos ratones hemos observado un fenotipoen el que el timo se encuentra reducido, y el desarrollo de los linfoci-tos aparece parcialmente detenido en DN3 (Doble Negativo 3). Ade-más, a nivel periférico, se detecta una gran disminución de linfocitosB y T CD8+ en nódulos linfáticos. Puesto que Numb también ha sidodescrito como una proteína implicada en la endocitosis de diversoseceptores, pensamos que su inhibición puede estar afectando a la modu-lación y señalización del TCR, y por tanto al desarrollo de linfocitosy a la función de linfocitos maduros. En este aspecto, hemos observa-do que en ratones transgénicos, tras la estimulación de linfocitos T peri-féricos, la modulación del TCR lleva una dinámica diferente que enratones salvajes. Es por esto que pretendemos centrarnos en el estudiodel papel de Numb en la modulación de la señalización a través delTCR.

171.LA ESTRUCTURA CRISTALOGRÁFICA DE CD5 REVELA LAELEVADA CONSERVACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS DOMI-NIOS TIPO A Y B DE LA SUPERFAMILIA DE RECEPTORESSRCR (SCAVENGER RECEPTOR CYSTEINE-RICH). Roda-milans B1, Muñoz IG1, Sarrias MR2, Padilla O2, Bragado-NilsssonE1, Suárez B2, Blanco FJ1, Montoya G1, Lozano F2. 1Grupo de Cris-talografía Macromolecular y NMR, Centro Nacional de InvestigacionesOncológicas (CNIO), Madrid. 2Servicio de Inmunología, Hospital Clí-nico de Barcelona, Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi iSunyer (IDIBAPS), Barcelona.

Los dominios SRCR (Scavenger Receptor Cysteine-Rich) cons-tituyen un antiguo y altamente conservado módulo proteico presen-te en receptores solubles y de membrana del sistema inmunitario,tanto innato como adaptativo. En función de su contenido en resi-duos cisteína y de su organización genómica, se han definido dostipos de dominios SRCR (A y B) existiendo información estructuralsolo para uno de ellos. Se presenta aquí la resolución de la estructu-ra cristalográfica a 2.2 Å del tercer dominio extracelular de la molé-cula humana CD5 (CD5-DIII), un receptor linfocitario implicado enla modulación de las señales de activación y diferenciación media-das por el receptor antígeno específico de las células T y B. El domi-nio CD5-DIII consta de una hélice α central rodeada por dos hojasβ antiparalelas y revela la existencia un elevado grado de conserva-ción entre la estructura tridimensional de los dominios tipo A y B dela superfamilia SRCR (SF-SRCR). La resolución por vez primera dela estructura de un miembro del grupo B ha permitido asimismo lainterpretación de datos preexistentes de mutagénesis dirigida sobrela interacción de la molécula de adhesión de la SF-Ig, ALCAM/CD166

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(Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule), con su ligando CD6otro receptor linfocitario perteneciente al grupo B de la SF-SRCR alta-mente relacionado con CD5.

172.REDISTRIBUCIÓN DE LAS POBLACIONES DE CÉLULAS TNOVATAS, MEMORIA Y EFECTORAS, Y ALTERACIONES ENSU PATRÓN DE SECRECIÓN DE CITOQUINAS EN PACIEN-TES CON LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA DE CÉLULAS B(LLC-B). Sánchez MA1, Villarroel M1, Hernández A1, Mur S1, Bar-cenilla H1, Díaz D1, Prieto A1, Reyes E1, Monserrat J1, Paz R de3,Alvarez-Mon M1, 2. 1Unidad I+D asociada UAH/CNB-CSIC, IMMPA.Dpto. Medicina. UAH. 2Ser. de enfermedades del sist. inmune yoncología.HUPA.Alcalá de Henares. 3Ser. de hematología del HospitalUniversitario de La Paz, Madrid.

Introducción. Los nuevos fenotípicos para la definición de célu-las novatas, efectoras y memoria están basados en la combinación dela expresión de las isoformas del antígeno CD45 (CD45RA y CD45RO)y la de otros marcadores de diferenciación como son el CD27, CD62Ly CCR7. Utilizando estos marcadores podemos definir 4 tipos de sub-poblaciones: células T novatas, células T memoria central, células Tmemoria efectora no terminada y células T memoria efectora termina-da. La LLC-B se asocia a alteraciones inmunes que incluyen altera-ciones fenotípicas y funcionales de los linfocitos T.

Objetivo. Estudiar la distribución de los linfocitos T en pobla-ciones novatas, efectoras y memoria y su patrón de secreción de cito-quinas.

Materiales y métodos. El estudio se realizo con células mono-nucleares de sangre periférica de 4 pacientes con LLC-B y 3 controlessanos. Las células mononucleares fueron cultivadas durante 6 horasen presencia de PMA (50 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) y nomensi-na (2 μM). El estudio inmunofenotípico y de producción de citoquinasse realizo mediante citometría de flujo de 8 colores utilizando anticuer-pos frente a los antígenos de superficie CD3, CD4, CD8, CD45RA,CCR7, CD27 y anticuerpos para el marcaje intracelular de las cito-quinas INFγ, TNFα, IL-2, IL-4 e IL-10.

Resultados. En los pacientes con LLC-B se observo una disminu-ción del porcentaje de células novatas tanto en poblaciones CD4 comoCD8 con respecto de los controles. Por otra parte se observo un incre-mento en los porcentajes de de células T memoria central, células Tmemoria efectora no terminada y células T memoria efectora termina-da en poblaciones CD4 y CD8 de pacientes con LLC-B con respecto delos controles.

También se observaron diferencias en el patrón de producciónde citoquinas según el estado de activación de los linfocitos T enlos pacientes con LLC-B con respecto de los controles sanos. Conaumento en la producción de INFγ, TNFα e IL-2 en poblaciones inmu-nofenotipicamente definidas como células novatas, memoria y efec-toras.

Conclusiones. Los pacientes con LLC-B muestran un patrón deactivación aumentado en los linfocitos T de sangre periférica que afec-ta tanto a los linfocitos CD4 como CD8 y que se refleja en un aumen-to de células T memoria central, células T memoria efectora no ter-minada y terminada, y con una disminución concomitante de célulasT novatas. Se encuentra además alteraciones en la funcionalidad deestas poblaciones que se manifiestan con aumentos en la producciónde las citocinas INFγ, TNFα e IL-2 en la mayoría de las subpoblacio-nes estudiadas.

173.CONFORMATIONAL DIFFERENCES IN THE SURFACEαβTCR/CD3 COMPLEX BETWEEN CD4+ AND CD8+ TLYMPHOCYTES ARE CONSERVED IN MAMMALS ANDASSOCIATED WITH DIFFERENTIAL GLYCOSYLATION. Ros-si NE1, Meza NW2, Pineda M3, Pulgar M3, Martínez E4, Pérez L1,Ramírez C1, Swamy M5, Schamel WWA5, Risueño R3, Reiné J1,Neville D6, Karlsson A7, Bonay P3, Fernández-Malavé E3, Reguei-ro JR1. 1Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Compluten-se, Madrid. 2Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales yTecnológicas, Madrid. 3Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Con-sejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma deMadrid, Cantoblanco, Madrid. 4Zoo-Aquarium Madrid. 5Department ofMolecular Immunology, Max Planck-Institute for Immunobiology andFaculty of Biology, University of Freiburg, Freiburg, Germany. 6Labo-ratory of Molecular Biology, National Institute of Health, Bethesda, MD.USA. 7The Phagocyte Research Laboratory, Department of Rheumato-logy and Inflammation Research, Goteborg University, Sweden.

We have previously shown that the surface αβ-T-cell antigen receptor(TCR)αCD3 complex borne by human CD4+ and CD8+ T lymphocytescan be distinguished conformationally using monoclonal antibodies.Using two unrelated sets of antibodies, we have now extended thisfinding to the surface αβ-TCRαCD3 of seven additional mammalianspecies (six non-human primates and the mouse). We have also produceddata supporting that differential glycosylation of the TCRαCD3 in thetwo main T cell subsets may be involved in the observed conformationaldifferences in humans. First, we show differential lectin binding tohuman CD4+ vs CD8+ T lymphocytes, particularly with Galectin 7.Second, we show that lectin binding can compete differentially withCD3 monoclonal antibody binding to human primary CD4+ and CD8+T lymphocytes. In contrast, the multimerisation status of the TCRαCD3complex from resting CD4+ vs CD8+ T lymphocytes was similar,excluding differential clustering as the cause for differential antibodyaccessibility. We conclude that the conformational differences betweenthe surface αβ?TCRαCD3 complex of primary CD4+ and CD8+ Tlymphocytes are phylogenetically conserved and associated to differentialglycosylation. The differences may be exploited for therapeutic purposes,such as lineage-specific immunosuppression of graft rejection.

174.APOPTOTIC RATE SENSITIVITY IN THE QUANTIFICATIONOF APOPTOSIS IN MURINE CELL CULTURES. Chara L, Che-varria J, Diaz D, Monserrat J, Prieto A, Ubeda M, Muñoz L, LarioM, Nieto M, Sanchez M, Barcenilla H, Acuña L, Villarroel M, Alva-rez-Mon M. CNB-CSIC R&D Associated Unit, IMMPA, Departmentof Medicine, University of Alcalá, Alcalá de Henares, Madrid.

Background. Currently the apoptosis in culture is quantified bythe Apoptotic Index (AI), or the proportion of apoptotic cells. Theapoptotic Rate (AR), a new flow cytometry-based ratiometric indicatorextends the AI and provides a more accurately estimation of apoptoticcells from several lymphocyte subsets.

Objectives. To compare the sensitivity of AR vs AI in the quantificationof apoptosis in murine cell cultures.

Methods. Highly purified spleen lymphocytes populations wereobtained by positive fluorescence-activated cell sorting (FACSAria)from Wistar rats and C57BL/6 mice. The cells were cultured for 24hours under four conditions: without exogenous apoptosis inducersand in the presence of phytohemagglutinin (PHA), staurosporin (ST)

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or polystyrene beads coated with CD3 and CD28 antibodies (T-cellexpander). We used a flow cytometry-based ratiometric method thatuses an internal reference estandar of microbeads to determine the AR,combined with antibodies and An nexin V-FITC binding and 7-Aminoactinomycin D labeling to enumerate viable, necrotic and apoptoticcells. Differences were evaluated by the Wilcoxon test and were consideredsignificant when p<0.05.

Results. Significant differences were observed between AR andAI in CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD5+ and CD28+ mice lymphocytepopulations in all culture conditions assayed, but in staurosporinthat was only significant for the CD4+ and CD28+ populations. InAddition, the AR was always significantly more sensitive determiningapoptotic cells than AI in these culture conditions. Similar data wereobtained in rat lymphocytes.

Conclusions. The AR was more sensitive apoptosis indicator thanAI quantifying apoptosis in murine cell cultures. This reflects thatthe AR measures with more accuracy than the AI the real ocurrenteof apoptosis, because AR takes into account both the late apoptoticcells that divide into apoptotic bodies and also the apoptotic cellsthat loss their lineage antig en expression.

175.EL CONSUMO CONTINUO DE CACAO INDUCE UNAMBIENTE ANTIOXIDANTE Y PROMUEVE LA DIFEREN-CIACIÓN LINFOCITARIA EN EL TIMO DE RATAS JÓVENES.Ramiro-Puig E, Pérez-Cano FJ, Castellote C, Permanyer J, Izquier-do-Pulido M, Franch A, Castell M. Facultad de Farmacia, Universi-dad de Barcelona.

Introducción y objetivo. El cacao es un alimento rico en flavo-noides con capacidad antioxidante. Estudios in vitro han demostra-do este poder antioxidante, pero la influencia de su consumo en elorganismo no ha sido investigada en profundidad. El objetivo de esteestudio ha consistido en determinar la capacidad antioxidante deratas jóvenes sanas que han consumido una dieta rica en cacao des-de el destete y durante 3 semanas. Concretamente, la investigaciónse ha centrado en el análisis de la capacidad antioxidante total (TAC)y de los sistemas enzimáticos superóxido-dismutasa (SOD) y catala-sa (CAT) en plasma y en tejidos linfoides como bazo y timo. Dada, laelevada capacidad antioxidante detectada en el timo, se ha estudia-do también en éste, el patrón fenotípico de maduración linfocitaria.

Material y métodos. Dietas ricas en Cacao Natural Forastero (4%y 10%) fueron la base alimentaria de ratas Wistar desde las 3 a las 6semanas de edad, momento en que se obtuvieron muestras de plasmay tejidos (bazo y timo). TAC fue determinada mediante el método ABTS.La actividad de los enzimas SOD y CAT se cuantificó mediante ensa-yos colorimétricos. Estudios posteriores se encaminaron a aislar linfo-citos del timo y estudiar su fenotipo mediante triple marcaje y poste-rior análisis por citometría de flujo.

Resultados. Una dieta rica en cacao, no modifica la TAC en plas-ma, pero incrementa de forma significativa la capacidad antioxidan-te total en los tejidos analizados (p<0,05), principalmente en el timo.Además, a diferencia del bazo, en el tejido tímico de los animales ali-mentados con 4% o 10% de cacao, aumenta la actividad CAT y SOD.Por otra parte, una dieta rica en cacao induce una disminución (p<0,05)de la proporción de linfocitos en estados intermedios de desarrollo(CD4+CD8+ y TCRlow), mientras que eleva el porcentaje de timocitosmaduros CD4+CD8- y CD4-CD8+ con elevada expresión de TCRαβ,y la de precursores CD4-CD8-.

Conclusión. El consumo de cacao en rata durante la infancia poten-cia un ambiente antioxidante en el timo, influyendo en el proceso demaduración linfocitario que tiene lugar en éste. Así, una dieta rica encacao puede desempeñar un papel importante en la prevención y mejo-ra de determinadas enfermedades asociadas a una elevada producciónde radicales libres.

176.ASSESSING THE REGULATION OF T CELL FUNCTION BYDISTINCT CYTOKINE COMBINATIONS ON THE GUAVAEASYCYTE™ PLUS PLATFORM. Cappione A, Snyder-Cappio-ne J, Gillis K. Guava Technologies, Inc.

Precise regulation of effector function is critical for mounting apotent, yet specific immune response to a given antigenic challenge.It has been hypothesized that the cytokine content of secondary lymphoidorgans and at the actual site(s) of inflammation exert localized controlover immune cell populations. Distinct cytokine combinations presentwithin a given microenvironment can induce changes in the phenotypeand effector functions of immune cells that differ dramatically fromthe effects exerted by each cytokine alone. Using a multiparametricanalysis approach, we investigated the effects in culture of all possiblecombinations of as many as 6 cytokines (IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, TNF-α,and TGF-β) on the phenotype and functional capacity of CD4+ andCD8+ isolates derived from human peripheral blood. Followingstimulation, cultures were assessed for changes in maturation/activationstate (as measured by surface marker expression and phospho-proteinanalysis), as well as determining their individual proliferative capacityand viability (ViaCount®). Stimulated CD4+ and CD8+ cultures werealso subject to cytokine production profiling through intracellularstaining. The cytolytic capacity of CD8+ cultures was measured bothindirectly, through intracellular Granzyme B staining, and directlythrough killing of autologous target B cells (CellToxicity™). All sampleswere acquired and analyzed using the Guava EasyCyte Plus platform,a microcapillarybased cell cytometry system. Briefly, we found thatunique combinations of cytokines had profound and highly variedeffects on lymphocyte fate and function in vitro. Demonstrations ofsynergy, antagonism, dominance, and substitution amongst multiplecytokines in our experimental system may reflect actual paradigmsunderlying such processes as the differentiation of T cell subsets intoeffector and resting memory phenotypes in vivo.

177.LA GLIADINA INDUCE LA PRODUCCIÓN DE IL-15 Y EXPRE-SIÓN DE CD30 EN POBLACIONES LINFOCITARIAS PROVE-NIENTES DE BIOPSIAS DE PACIENTES CELIACOS Y CON-TROLES. Bernardo D1, Periolo N2, Garrote JA1,3, Riestra S4, Fer-nández-Salazar L5, Blanco A1, Cherñavsky AC2, Arranz E1. 1Labo-ratorio de Inmunología de las mucosas, Departamento de Pediatría eInmunología, IBGM-Universidad de Valladolid. 2División de Inmuno-genética, Hospital de Clínicas-Universidad de Medicina, Buenos Aires,Argentina. 3Unidad de Investigación, Hospital Clínico Universitario,Valladolid. 4Servicio de Digestivo, Hospital Universitario Central deAsturias, Oviedo. 5Departamento de Gastroenterología, Hospital Clíni-co Universitario, Valladolid.

Introducción. Actualmente se asume que la inmunidad innatajuega un papel clave en el desarrollo de la enfermedad celiaca a tra-

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vés de un mecanismo DQ2-independiente. Sin embargo, hasta elmomento no se han descrito factores diferenciales entre pacientesceliacos y no celiacos actuando en la inmunidad innata, por lo queplanteamos la hipótesis de que el gluten es capaz de inducir una res-puesta innata en todos los pacientes, tanto celiacos como no celiacos,aunque la respuesta adaptativa secundaria es específica de los pacien-tes celiacos.

Materiales y métodos. Biopsias procedentes de al menos 3pacientes celiacos en dieta sin gluten (DSG) y 3 pacientes controlesno celiacos fueron cultivadas por condición. Las biopsias se estimu-laron con gliadina, zeína o el péptido inmunodominante 33mer. Laproducción de IL-15 (Western-blot) y la inducción de mRNA demediadores adaptativos, STAT1, STAT3, IFNγ, TNFα (qPCR), sedeterminó en el extracto completo de la biopsia. Los linfocitos intrae-piteliales y de lámina propia fueron también evaluados para la expre-sión de marcadores de activación (CD30, CD45Ro, CD69) por cito-metría de flujo.

Resultados. Los péptidos de gliadina fueron capaces de inducirla producción de IL-15 y de activar las poblaciones linfocitarias intrae-piteliaeles y de lámina propia (aumento de CD30) tanto en los pacien-tes celiacos como en los controles, aunque si la estimulación se rea-lizaba sobre las poblaciones linfocitarias aisladas no se veía respues-ta en ningún caso. Es interesante que ni en los cultivos basales ni enlos estimulados con zeína se observó una respuesta. Finalmente,los niveles de mRNA de mediadores adaptativos (STAT1, STAT3 eIFNγ) se encontraban modificados sólo en los pacientes en DSG trasser estimulados con los péptidos de gliadina.

Conclusión. Los resultados obtenidos en este estudio parecenconfirmar que el gluten es capaz de inducir una respuesta innataen el intestino de todos los individuos, aunque la activación de lainmunidad específica parece ser exclusiva de los celiacos. La existen-cia no sólo del HLA-DQ2 sino de un menor umbral de respuesta paradisparar la inmunidad adaptativa en los pacientes celiacos podría serclave en la patogénesis de la EC.


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AAbadia-Molina AC, 30 76, 85, 100Abós B, 26Abud-Mendoza C, 83Aceves M, 45Acosta-Iborra A, 76, 77Acuña L, 56, 60, 90, 95, 122, 126Aguado R, 125Aguilar S, 90Aguilar-García S, 90Aguilar-Reina J, 73Aguilera I, 112Aguinaga Barrilero A, 18, 54, 115Alarcón-Riquelme ME, 21Alba A, 17Albarran F, 61, 95, 105Alcalá I, 16Alcoceba M, 123Aldama G, 111Alecsandru D, 64, 71, 98 Alemany JM, 66, 106, 107Alemany-Frances L, 91Alés I, 74Alfaro C, 48Algarra I, 54, 55, 114, 120Allende L, 36, 57, 110Allende LM, 34, 35, 58Almeida J, 54Alonso A, 73, 74, 107, 111Alonso C, 108Alonso Franch M, 46Alonso M, 63, 119Alonso N, 97Alonso Sardon M, 67Alonso-Arias R, 29Alonso-Camino V, 61Alonso-Franch M, 46Alonso-Ortiz A, 111Alsina Donadeu M, 102Alvarez A, 99Álvarez AJ, 93Álvarez de Mon M, 99, 103, 125Alvarez del Riego O, 34Alvarez Doforno R, 65Álvarez Domínguez C, 29Álvarez E, 81Álvarez I, 16, 25Álvarez -López MR, 53Alvarez R, 108Alvarez-Barrientos A, 82Álvarez-Cermeño JC, 66, 96Alvarez-Dominguez C, 29Álvarez-Lafuente R, 23Álvarez-López MR, 43, 49, 51, 53, 66, 91, 106, 107,

108, 109, 112, 115, 116, 119Alvarez-Marquez A, 112Alvarez-Mon M, 56, 60, 61, 79, 87, 90, 95, 100, 105,

122, 126Alvarez-Santana MC, 34Álvarez-Vallina L, 45, 56, 61, 123Alves D, 101Amengual Guedan MJ, 102Ampudia R, 17 Anaya-Baz B, 90Andrés A, 18Andres-Martin A, 107Anel A, 96, 113Aptsiauri N, 116, 117, 118

Aragoneses-Fenoll L, 25, 78Arenas JI, 63Arias M, 110, 111Arias M, 52Arias-Díaz J, 85Arina A, 48Armengol MP, 18Arnaiz-Villena A, 19, 23, 69, 70Arostegui JI, 91Arranz E, 127Arranz-Sanz E, 46Arriaga J, 83Arriba G de, 99, 103, 125Arribas F, 96Arribillaga L, 27Arrieta A, 78Arroyo R, 23, 74Asensi V, 29Asín L, 80Aspa J, 30Astola A, 66Astudillo A, 16Atencia R, 78Ausín F, 110, 111Ausín F, 73Azpilicueta A, 48

BBalanzategui A, 123Balibrea J, 85Ballestar E, 57Ballester S, 28, 86Ballesteros C, 31Balomenos D, 37Balsa A, 21, 22Bañares R, 106Barahona F, 121Barcenilla H, 56, 60, 79, 90, 95, 99, 100, 103, 122, 125, 126Barquinero J, 15Barreiro A, 101Barreiro E, 34, 36Barroso N, 73Barroso S, 93Bartolomé M, 74Bas J, 51Beares I, 52Bellas C, 26Benavides M, 74Bendandi M, 48Benítez-Rondán A, 55Benito JM, 31, 36, 111Benito MJ, 52Benito MS, 72Benlloch T, 94Bensussan A, 116Berasain C, 48Berlinches A, 121Bernabeu R, 47Bernad A, 56Bernal M, 94Bernal-Ramos A, 53, 91Bernardo D, 127Bernardo I, 34, 35, 68Bernardo MV, 49, 115Berruguilla E, 54, 114, 115Bestard O, 51Blanco A, 127Blanco B, 56, 124

Blanco FJ, 123 , 125Blanco J, 24, 36Blanco O, 30, 76, 85, 100Blanco RM, 112Blanco-García MR, 53, 108, 109Blanco-Gelaz MA, 19, 51Blanco-Quirós A, 46Blanquer J, 30Blazquez R, 26Bofia M, 24, 77Bonay P, 126Borràs FE, 17 , 25, 77Borrás-Cuesta F, 27, 80Boscá I, 59Botella C, 53, 66, 91, 106, 107, 108, 109Bousoño C, 94Bouza E, 26, 109Bowakin D, 75Bragado R, 59Bragado-Nilssson E, 125Bravo B, 28, 86Bravo MJ, 73, 74, 111Brieva JA, 32, 37, 49, 50, 51, 66, 71, 94, 104Briones J, 81Briones M, 30Buelta L, 37Burgui I, 79

CCaballero A, 73, 74, 111Cabezón A, 96Cabrera T, 116Cacho E, 52Cacho JL, 74, 75Cadahia A, 42Calderón E, 88Calderón EJ, 89Calle H de la, 76Calleja S, 68Calleja-Antolín S, 36Callejas JL, 39Calvino M, 103, 125Calviño R, 111Calvo P, 26Calzada JE, 72Cámara Hijón C, 102Camarero C, 18 Cambra A, 92Camiña F, 63Camino I, 26Campillo JA, 53, 106, 108, 116, 119Campillo-Marquina JA, 43Campo AB, 116, 117, 118Campos M, 55, 119, 120Campos-Caro A, 49, 50, 51, 104Campos-Esteban J, 107Canals F, 16, 25Cañelles M, 125Cano J, 107Cantó E, 81Cantón J, 54, 118Caparrós E, 77Cappione A, 127Caragol I, 91, 93, 94Carballido J, 56, 122Carbone J, 26, 31, 38, 52, 63, 91, 98, 106, 109Cárdaba B, 43, 44Cárdenes MA, 34

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