pola ekspresi gen enhanced green fluorescent … · 2020. 1. 13. · sperma yang telah...

POLA EKSPRESI GEN ENHANCED GREEN FLUORESCENT PROTEINPADA EMBRIO DAN LARVA IKAN PATIN SIAM

(Pangasianodon hypophthalmus)

Raden Roro Sri Pudji Sinarni Dewi*), Alimuddin**), Agus Oman Sudrajat**),Komar Sumantadinata**), dan Erma Primanita Hayuningtyas *)

*) Balai Penelitian Pemuliaan IkanJl. Raya 2 Sukamandi, Subang 41256

E-mail: [email protected]

**) Departemen Budidaya Perairan, FPIK-Institut Pertanian BogorJl. Rasamala, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680

(Naskah diterima: 9 April 2013; Disetujui publikasi: 12 September 2013)

ABSTRAK

Penelitian ekspresi sementara (transient expression) dari transgen secara in vivomenggunakan gen reporter berguna untuk mendesain konstruksi gen yang akandigunakan pada penelitian transgenesis. Gen reporter yang umum digunakan dalampenelitian ekspresi sementara transgen adalah gen GFP (green fluorescent protein).Pengamatan gen EGFP (enhanced green fluorescent protein) pada embrio dan larvaikan patin siam (Pangasianodon hypophthalmus) ditujukan untuk mendapatkan infor-masi mengenai kemampuan promoter -aktin ikan mas dalam mengendalikan ekspresigen EGFP. Gen EGFP diintroduksikan ke dalam sperma ikan patin siam menggunakanmetode elektroporasi. Sperma yang telah dielektroporasi digunakan untuk membuahisel telur ikan patin siam. Pengamatan ekspresi gen EGFP dilakukan setiap enam jamdimulai dari embrio fase 2 sel sampai larva. Berdasarkan hasil penelitian, gen EGFP ter-ekspresi pada fase embrio dan larva ikan patin siam. Puncak ekspresi gen EGFP terjadipada fase neurula dan menurun pada fase larva. Berdasarkan penelitian ini maka ikanpatin siam transgenik telah berhasil dibentuk dan promoter -aktin ikan mas terbuktiaktif dalam mengarahkan ekspresi gen asing (GFP) di dalam tubuh ikan patin siam.

KATA KUNCI: ikan patin siam, ekpresi gen, EGFP

ABSTRACT: Enhanced green fluorescent protein gene expression patternin embryo and larvae of stripped catfish (Pangasianodonhypophthalmus). By: Raden Roro Sri Pudji Sinarni Dewi,Alimuddin, Agus Oman Sudrajat, Komar Sumantadinata, andErma Primanita Hayuningtyas

Experiment about transient expression of the transgene in vivo using reporter genesis useful for designing gene constructs to be used in transgenesis research. Reportergenes commonly used in the study of gene expression is GFP (green fluorescentprotein). Observation of EGFP gene (enhanced green fluorescent protein) expressionin embryos and larvae of stripped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) isintended to obtain information about the ability of carp -actin promoter in controllingEGFP expression. EGFP gene was introduced into the stripped catfish sperm usingelectroporation method. Electroporated sperm was used to fertilize stripped catfisheggs. EGFP expression was observed every six hours starting from phase 2 cells ofthe embryo to larva. Based on the results, EGFP was expressed in embryonic andlarval of stripped catfish. EGFP expression peak occurs at neurula stage and decreased

Pola ekspresi gen enhanced green fluorescent ..... (Raden Roro Sri Pudji Sinarni Dewi)

339

in the larval phase. Based on this study, it is concluded that transgenic strippedcatfish have been successfully generated and carp -actin promoter was actively incontrolling the expression of foreign gene (GFP) in stripped catfish.

KEYWORDS: stripped catfish, gene expression, EGFP

PENDAHULUAN

Ikan patin siam merupakan spesies ikanbudidaya yang populer di Indonesia. Ber-dasarkan Rencana Strategis KementerianKelautan dan Perikanan 2010-2014, ikan patinmenjadi salah satu spesies budidaya yangdiprioritaskan untuk ditingkatkan produksi-nya. Peningkatan produksi ikan patin diperlu-kan untuk mendukung program industrialisasiikan patin. Strategi peningkatan produksi ikanpatin siam dapat ditempuh melalui produksiinduk/benih unggul. Teknologi transgenesisterbukti mampu meningkatkan karakter-karakter unggul pada ikan budidaya sepertipertumbuhan, resistensi terhadap penyakit,resistensi terhadap kondisi lingkungan ekstrim(suhu dingin), deteksi pencemaran logamberat, warna, dan sebagainya. Penelitian trans-fer gen telah dilakukan pada sejumlah ikanantara lain pada ikan-ikan konsumsi (nila, mas,salmon, mud loach, lele, dan sebagainya) danikan-ikan model (mas koki, zebra, medaka, dansebagainya) yang umumnya digunakan dalampenelitian dasar.

Langkah awal produksi ikan transgenikdengan karakter unggul yang diinginkanadalah pembuatan konstruksi gen. Gen asing(transgen) yang diintroduksikan ke dalam selinang diharapkan dapat terintegrasi danterekspresi dalam tubuh inang. Penelitian pro-duksi ikan-ikan transgenik umumnya diawalidengan pengamatan tingkat integrasi danekspresi transgen yang disisipkan. Gen yangumum digunakan dalam pengamatan ekspresitransgen adalah gen-gen reporter (reportergene). Penelitian ekspresi sementara (tran-sient expression) dari transgen secara in vivomenggunakan gen reporter berguna untukmendesain konstruksi gen yang akan digu-nakan pada penelitian transgenesis (Hackett,1993). Seleksi gen reporter untuk mengamatiekspresi sementara transgen secara in vivomemerlukan aktivitas reporter yang secaramudah dapat dideteksi, dan memiliki sensi-tivitas, serta spesifisitas yang tinggi. Beberapagen reporter yang umum digunakan dalampengamatan ekspresi sementara transgenantara lain gen lacZ (E. coli -galactosidase),

CAT (chloramphenicol acetyl transferase),HBsAg (hepatitis B surface antigen), dan GFP(green fluorescent protein) (Guillen et al., 1996).Gen lacZ yang berasal dari bakteri E. colimerupakan salah satu gen reporter yangsangat berguna karena memiliki sensitivitasyang baik dan dapat dengan cepat terdeteksi.Pewarnaan histokimia menggunakan X-galmemudahkan deteksi enzim ini pada sel danjaringan. Gen CAT banyak digunakan sebagaigen reporter pada penelitian-penelitian in vivodan in vitro. HBsAg digunakan karena memilikispesifisitas dan sensitivitas pada sistem ana-lisis ELISA dan umumnya digunakan untukpenentuan antigen. GFP banyak digunakanuntuk mengamati ekspresi sementara transgenpada ikan hidup (disarikan dari Guillen et al.,1996). Morales et al. (2001) melaporkan bahwapada ikan zebra yang diinjeksi gen GFP dibawah kontrol promoter -aktin ikan masmenunjukkan gen GFP terekspresi padaseluruh bagian embrio transgenik. Hal inimenunjukkan bahwa semua tipe sel mampumengekspresikan GFP, sehingga memperluaspenggunaan gen GFP sebagai gen reporteruntuk studi pola ekspresi gen.

Efektivitas transfer gen pada ikan patinsiam diamati dengan menggunakan konstruksigen yang tersusun dari promoter -aktin ikanmas (pCcBA) dan gen EGFP (enhanced greenfluorescent protein). Penelitian ini dilakukanuntuk mendapatkan informasi mengenai ke-mampuan promoter -aktin ikan mas dalammengarahkan ekspresi gen EGFP dan polaekspresi sementara gen EGFP pada fase embriodan larva ikan patin siam. Informasi ini selan-jutnya akan dijadikan acuan untuk membuatkonstruksi gen sebagai langkah awal dalamproses transgenesis untuk memproduksi ikanpatin siam dengan karakter unggul yang di-inginkan.

BAHAN DAN METODE

Koleksi Gamet

Induk jantan dan betina yang digunakanadalah induk ikan patin siam berukuran 2-4 kgyang diperoleh dari Balai Penelitian Pemuliaan

340

J. Ris. Akuakultur Vol. 8 No. 3 Tahun 2013: 339-346

Ikan Sukamandi, Subang, Jawa Barat. Indukdiseleksi berdasarkan tingkat kematangangonad. Induk yang telah matang gonad di-pindahkan ke dalam bak pemijahan. Kesera-gaman kematangan telur dan ovulasi diinduksimelalui penyuntikan hormon. Induk betinadiberi suntikan pertama berupa HCG dengandosis 500 IU/kg bobot. Suntikan keduadiberikan dengan selang waktu 24 jam berupaovaprim dengan dosis 0,6 mL/kg bobot. Strip-ping untuk mendapatkan sel telur dilakukan9-12 jam dari penyuntikan kedua. Induk jantandiinduksi melalui penyuntikan ovaprim dengandosis 0,2-0,3 mL/kg bobot. Stripping untukmendapatkan sperma dilakukan 9-12 jamsetelah penyuntikan.

Konstruksi Plasmid

Konstruksi gen pCcBA-EGFP (Hidayani,2009) yang digunakan tersusun dari promoter-aktin ikan mas (pCcBA) dan gen enhancedgreen fluorescent protein (EGFP) dimodifikasidari vektor ekspresi pEGFP-NI (Clontech).Vektor pEGFP-N1 (panjang 4,7 kb) dipotong(digesti) menggunakan enzim restriksi Kpn Idan Apa I sebelum disambungkan (diligasi)dengan sekuens promoter pCcBA (panjang 1,9kb). Proses digesti dilakukan dengan me-larutkan 5 µL pEGFP-N1; 2,5 µL 10xK buffer; 5µL BSA; 1 µL enzim Kpn I; 1 µL enzim Apa I; dan35,5 µL SDW (steril distilated water). Reaksidigesti diinkubasi selama satu jam pada suhu37oC.

Proses ligasi (penyambungan) dilakukandengan mencampurkan 1 µL pCcBA; 6,5 µL 2xbuffer ligasi; 1 µL enzim T4 DNA ligase; dan4,5 µL plasmid pEGFP-NI yang telah dipotong.

Inkubasi dilakukan selama dua jam pada suhuruang dan dilanjutkan semalam di dalam re-frigerator (suhu sekitar 4oC). Peta konstruksigen pCcBA-EGFP (6,0 kb) dapat dilihat padaGambar 1.

Elektroporasi Sperma

Elektroporasi sperma dilakukan denganmenggunakan mesin Gene Pulser II (Biorad,USA). Sperma diencerkan dengan mengguna-kan larutan fisiologis (1:7) sebelum dicampurdengan plasmid. Elektroporasi dilakukandengan tipe kejutan square wave denganpanjang kejutan (pulse length) 30 milidetik, kuatmedan listrik (electric field strength) 125 V/cm, jumlah kejutan (pulse number) tiga kali, daninterval kejutan (pulse interval) 0,1 detik (Dewiet al., 2010). Konsentrasi DNA plasmid yangdigunakan adalah 10 µg/mL dalam TE buffer.

Parameter yang Diamati

Derajat Pembuahan dan DerajatPenetasan

Derajat pembuahan menunjukkan kemam-puan sperma dalam membuahi sel telur. Adapunderajat penetasan menunjukkan keberhasilanperkembangan sel telur sampai menetasmenjadi larva. Derajat pembuahan dan derajatpenetasan dihitung dengan menggunakanrumus sebagai berikut:

Derajat pembuahan = Jumlah telur yang dibuahiJumlah total telur

x 100 %

Derajat penetasan = Jumlah telur yang menetasJumlah telur yang dibuahi

x 100 %

Gambar 1. Peta konstruksi gen pCcBA-EGFP (6,0 kb), pCcBA = promoter -aktinikan mas; EGFP = enhanced green fluorescent protein; Poly A =poliadenilasi; Kpn I, Apa I, Age I, Not I = enzim restriksi

Figure 1. Gene construction of pCcBA-EGFP (6.0 kb), pCcBA = carp -actinpromoter; EGFP = enhanced green fluorescent protein; Poly A =polyadenilation; Kpn I, Apa I, Age I, Not I = restriction enzyme

Kpn I

pCcBA-EGFP (6,0 kb)

pCcBA EGFP Poly A

Age I Not IApa I


341

Ekspresi Gen EGFP pada Embrio dan LarvaIkan Patin Siam

Ekstraksi RNA. RNA total diisolasi dari 50butir embrio atau 50 ekor larva. Sampel di-simpan dalam botol sampel yang telah berisiisogen sebanyak 200 µL. Sampel dihancurkanoleh penggerus yang sebelumnya telah di-sterilkan dengan DEPC 1%. Ke dalam eppendorfditambahkan larutan isogen sampai mencapaivolume akhir 800 µL. Chloroform p.a. sebanyak200 µL ditambahkan ke dalam eppendorf danlarutan disentrifugasi pada kecepatan 12.000rpm selama lima menit pada suhu ruang.Supernatan yang terbentuk dipindahkan kedalam eppendorf baru yang telah berisi 400µL isopropanol. Larutan disentrifugasi padakecepatan 12.000 rpm selama 15 menit padasuhu 4oC. Pada eppendorf akan terbentukpelet RNA, dan cairan yang terdapat padaeppendorf dibuang. Ke dalam eppendorf di-tambahkan 1 mL alkohol 70% (dingin) kemudiansentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpmselama 15 menit. Pelet RNA dikeringkandengan cara membuang larutan yang terda-pat pada eppendorf. Sampel RNA disimpandengan cara menambahkan 30 µL DEPC 1%.Konsentrasi RNA total hasil isolasi diukurmenggunakan alat pengukur konsentrasi RNA/DNA (GeneQuant). Absorbansi diukur padapanjang gelombang 260 dan 280 nm.

Sintesis cDNA. Sintesis complementaryDNA (cDNA) menggunakan kit Ready-To-GoYou-Prime First Strand Beads (Amershampharmacia biotech, USA). Konsentrasi RNAdibuat 3 µg dalam 30 µL DEPC. Larutan RNAdiinkubasi pada suhu 65oC selama sepuluhmenit dan kemudian disimpan di atas es.Sampel RNA dipindahkan ke dalam tube FSRMB(First strand reaction mix beads) dan ditam-bahkan 3 µL primer ’dT3’RACE-VECT” (5’-GTAATA CGA ATA ACT ATA GGG CAC GCG TGG TCGACG GCC CGG GCT GGT TTT TTT TTT TTT TTTT-3’) dengan konsentrasi 1 µg/3 µL. Larutandihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37oCselama satu jam. cDNA yang terbentuk di-tambahkan 30 µL SDW steril dan disimpandalam refrigerator.

Analisis Ekspresi EGFP. Ekspresi EGFPpada embrio dan larva diamati setiap enam jamdengan metode RT-PCR (reverse transcription- polymerase chain reaction). PCR dilakukandengan menggunakan primer GFPr (5’-ACG AACTCC AGC AGG ACC AT-3’) dan GFPf (5’-GGT CGAGCT GGA CGG CGA CG-3’). PCR dilakukandengan program: 94oC selama tiga menit; (94oC

selama 30 detik; 62oC selama 30 detik; 72oCselama satu menit) sebanyak 25 siklus; 72oCselama tiga menit; dan 4oC (tak hingga).Pengecekan hasil amplifikasi PCR dilakukandengan elektroforesis menggunakan gelagarosa 0,7%. Produk amplifikasi gen EGFPberada pada ukuran sekitar 600 bp. Sebagaikontrol internal digunakan gen -aktin. Deteksigen -aktin dilakukan dengan menggunakanmetode PCR. Primer yang digunakan adalahbact-F (5’-TAT GAA GGT TAT GCT CTG CCC-3’)dan bact-R (5’-CAT ACC CAG GAA AGA TGG CTG-3’). PCR dilakukan dengan program: 94oCselama tiga menit; (94oC selama 30 detik;58oC selama 30 detik; 72oC selama 30 detik)sebanyak 30 siklus; 72oC selama tiga menit;dan 4oC (tak hingga). Pengecekan hasil ampli-fikasi PCR dilakukan dengan elektroforesismenggunakan gel agarosa 1%. Gen -aktin ikanpatin siam berada pada ukuran sekitar 300 bp.Pengukuran level ekspresi gen EGFP dilakukandengan mengukur ketebalan pita DNA hasilelektroforesis menggunakan software UN-SCAN-IT gel 6.1. Hasil pengukuran levelekspresi gen EGFP dibandingkan dengan gen-aktin yang berfungsi sebagai kontrol load-ing RNA.

HASIL DAN BAHASAN

Derajat Pembuahan dan DerajatPenetasan

Pemberian kejutan listrik pada sperma padasaat dielektroporasi bertujuan untuk mem-berikan peluang gen eksogen masuk ke dalamsitoplasma melalui pori-pori membran sel yangterbuka. Pemberian kejutan listrik akanmemengaruhi kualitas dan kuantitas sperma(Dewi et al., 2010). Berdasarkan data padaTabel 1, sperma yang dielektroporasi memilikikemampuan membuahi sel telur yang lebihrendah dan menghasilkan jumlah larva yanglebih sedikit dibandingkan kontrol (spermanon-elektroporasi).

Kondisi sperma ikan akan menentukankeberhasilan pembuahannya. Sperma yangbaik dapat membuahi sel telur dengan baik.Terjadinya perubahan pada sperma akanmemengaruhi kerja sperma. Perubahan disiniadalah dalam hal pergerakan (motilitas) danketahanan hidupnya. Semen yang memenuhisyarat untuk proses pembuahan mengandungsperma yang hidup dan bergerak aktif ke de-pan (progresif). Dalam penelitian ini, derajatpembuahan dan derajat penetasan telur yangdibuahi oleh sperma yang dielektroporasi lebih

342


bervariasi dan lebih rendah, masing-masing39,66% dan 57,14%, dibandingkan dengankontrol. Hal ini menunjukkan bahwa pemberiankejutan listrik pada sperma melalui elektro-porasi menyebabkan penurunan kualitassperma untuk membuahi sel telur dan meng-hasilkan larva.

Pola Ekspresi Gen EGFP

Kemampuan promoter -aktin ikan masdalam mengarahkan ekspresi gen EGFP di-amati pada embrio dan larva ikan patin siam.Pengamatan pola ekspresi gen EGFP dilakukansetiap enam jam sampai embrio menetas men-jadi larva. Tahapan perkembangan embriosetiap enam jam dapat dilihat pada Gambar 2.Pada penelitian ini, gen EGFP yang ditransferpada sperma ikan patin siam melalui metodeelektroporasi terbukti mampu terekspresi padafase embrio sampai menjadi larva (Gambar 3).Gen EGFP mulai terekspresi pada jam ke-0 (fase2-8 sel) dan mencapai puncaknya pada jamke-12 yaitu pada fase neurula. Ekspresi genEGFP menurun pada jam ke-30 yaitu pada faselarva (Gambar 4).

Gen asing yang diintroduksi ke ikan harusdapat ditranskripsi dan ditranslasi secara aku-rat dalam ikan resipien. Salah satu komponendari konstruksi gen yang berperan dalammengatur ekspresi gen adalah promoter. Pro-moter merupakan bagian dari DNA di mana RNApolimerase menempel. Promoter berfungsiuntuk mengarahkan RNA polimerase sehinggatranskripsi terjadi (Glick & Pasternak, 2003).Promoter merupakan salah satu penentuekspresi gen sehingga promoter bisa di-analogikan sebagai switch suatu gen (Hacket,1993). Berdasarkan hasil pengamatan, ekspresimRNA EGFP teramati pada embrio dan larvaikan patin siam. Hal ini membuktikan bahwa

promoter -aktin ikan mas mampu mengarah-kan ekspresi gen EGFP pada ikan patin siam.Hal ini serupa dengan penelitian Morales etal. (2001) yang melaporkan bahwa promoter-aktin ikan mas terbukti mampu mengendali-kan ekspresi gen GFP pada ikan zebra.

Ekspresi gen asing yang diintroduksikanke dalam sel inang umumnya memiliki polaekspresi yang serupa. Pada ikan patin siam,puncak ekspresi gen EGFP terjadi pada jam ke-12 yaitu pada fase neurula. Puncak ekspresiDNA eksogen diduga lebih berkaitan denganperkembangan embrio dibandingkan waktu.Pada ikan zebra (Danio rerio), puncak ekspresiDNA eksogen terjadi pada awal gastrula (Stuartet al., 1988). Pada ikan medaka terjadi padastadia gastrula/neurula (Chong & Vielkiend,1989). Pada loach (Misgurnus sp.) terjadi padastadia akhir gastrula (MacLean et al., 1987),dan pada lele Afrika (Clarias gariepinus) terjadipada awal gastrula (awal epiboli) (Volckaert etal., 1994). Puncak replikasi DNA ini terjadi padaXenopus pada akhir proses pembelahan yangcepat (mid-blastula terdiri dari 4.000 sel, tujuhjam setelah fertilisasi). Pada ikan medaka, awaltranskripsi gen endogen terjadi pada stadiamid-blastula (Winkler et al., 1992).

Ekspresi dari gen asing dimulai setelah fasemid-blastula dan level-nya meningkat selamaembriogenesis, dan selanjutnya menurunsetelah menetas (Gong & Hew, 1993; Liu etal., 1990). Hal ini serupa dengan yang terjadipada ikan patin siam. Pada ikan patin siam,ekspresi gen EGFP mengalami penurunan padafase larva. Kejadian ini disebut sebagai eks-presi sementara, yang mungkin disebabkanoleh replikasi ekstrakromosomal DNA asing.Level ekspresi selanjutnya akan menurun yangdiikuti dengan degradasi dari ekstrakromo-somal DNA. Akibatnya, level ekspresi gen yang

Tabel 1. Derajat pembuahan dan penetasan telur ikan patin siam, P. hypophthalmus

Table 1. Fertilization rate and hatching rate of stripped catfish (P. hypophthalmus)eggs

Kont rol Control

Perlakuan Treatments

Kont rol Control

Perlakuan Treatments

1 83.59 56.90 74.80 1002 85.26 22.41 93.42 14.29

Rataan ± sem 84.42±0.84 39.66±17.25 84.11±9.31 57.14±42.86

Ulangan Replica t ion

Derajat pembuahan Fert iliza t ion ra te (%)

Derajat penetasan Hatching ra te (%)


343

Gambar 3. Pola ekspresi gen EGFP yang diamati selama perkembangan embrio sampai larva ikanpatin siam P. hypophthalmus; M = marker; angka 0, 6, 12, 18 menunjukkan jampengamatan sampel; L = larva; BA = -aktin (kontrol internal) EGFP = enhanced greenfluorescent protein. Tanda kepala panah menunjukkan keberadaan DNA target

Figure 3. EGFP expression pattern that was observed in embryo and larvae of stripped catfishP. hypophthalmus; M = marker; number of 0, 6, 12, 18 are observation time (hour);L = larvae; BA = -actin (internal control); EGFP = enhanced green fluorescent protein;head arrow showed targeted DNA

EGFP

M

kb

0.5

0.1

3.0

0 6 12 18 L

600 bp

BA

M

kb

0.5

0.1

3.0

0 6 12 18 L

300 bp

Jam ke-6/6 hours(Fase gastrula/gastrula)

Jam ke-12/12 hours(Fase neurula/neurula)

Jam ke-0/0 hour(Fase 2-8 sel/2-8 cells)

Gambar 2. Fase perkembangan embrio ikan patin siam P. hypophthalmus yang diamati setiapenam jam sekali.

Figure 2. Embriogenesis of stripped catfish P. hypophthalmus that was observed every sixhours

Jam ke-18/18 hours; (Fase orga-nogenesis/organogenesis)

Jam ke-30/30 hours(Fase larva/larvae)

344


terintegrasi ke kromosom resipien tidak se-tinggi dengan ekspresi sementara.

Keberhasilan promoter -aktif ikan masdalam mengarahkan ekspresi gen EGFP padaembrio dan larva ikan patin siam menunjukkanbahwa promoter -aktif ikan mas aktif dalammengawali proses transkripsi gen asing padaikan patin siam. Hasil penelitian ini dapatdigunakan sebagai dasar untuk membuatkonstruksi gen lainnya yang tersusun dari pro-moter -aktin ikan mas yang digabungkandengan gen target dengan tujuan untukmendapatkan ikan patin siam dengan karakterunggul yang diinginkan.

KESIMPULAN

Promoter -aktin ikan mas mampu menga-rahkan ekspresi gen EGFP pada ikan patin siam.Gen EGFP mulai terekspresi pada fase 2 sel,mencapai puncaknya pada fase neurula danmenurun pada fase larva. Keberhasilan inimembuka kesempatan untuk membuat kon-struksi gen dengan menggunakan promoter-aktin ikan mas dalam rangka memproduksiikan patin siam dengan karakteristik yang di-inginkan melalui penggunaan metode trans-genesis.

DAFTAR ACUAN

Chong, S.S.C. & Vielkind, J.R. 1989. Expressionand fate of CAT reporter gene microin-

jected into fertilized medaka (Oryziaslatipes) eggs in the form of plasmid DNA,recombinant phage particles and its DNA.Theor. Appl. Genet., 78: 369-380.

Dewi, R.R.S.P.S., Alimuddin, Sudrajat, A.O.,Sumantadinata, K., & Sularto. 2010. Opti-mal electroporation condition for spermmediated gene transfer in stripped catfish(Pangasionodon hypophthalmus). Indone-sian Aquaculture J., 5(1): 1-10.

Glick, B.R. & Pasternak, J.J. 2003. Molecular bio-technology: principles and applications ofrecombinant DNA. Third ed. ASM Press.Washington D.C., p. 110-115.

Gong, Z. & Hew, C.L. 1993. Promoter analysisof fish antifreeze protein genes, In P.W.Hochachka and T.P. Mommsen (Eds.), “Mo-lecular Biology Frontier”. Elsevier, NewYork, p. 307-324.

Guillen, I., Lleonart, R., del Barco, D.G., Martinez,R., Herrera, F., Morales, A., Herrera, M.T.,Morales, R., & de la Fuente, J. 1996. Reportsgenes for transgenic fish experiments.Biotecnologia Aplicada, 13: 279-283.

Hackett, P.B. 1993. The molecular biology oftransgenic fish. In Hochachka, P.W. &Mommsen, T.P. (Eds.), Biochemistry and Mo-lecular Biology of Fishes, Vol. 2. ElsevierScience, Amsterdam, p. 207-240.

Hidayani, A. 2009. Isolasi dan efektivitas pro-moter beta actin dalam mengarahkanekspresi gen target pada transgenesis ikan

Gambar 4. Level ekspresi gen EGFP pada embrio dan larva ikan patin siam P.hypophthalmus

Figure 4. EGFP level expression in stripped catfish P. hypophthalmus embryoand larvae

mRN

A EG

FP/

-akt

inm

RN

A E

GFP

/-a

ctin

(%)

Stadia perkembangan embrioEmbryonic development stage

2-8 sel

100

0Gastrula

90

Neurula

10

Organogenesis Larva

20304050607080


345

mas. Tesis. Program Pascasarjana, InstitutPertanian Bogor. Bogor, 35 hlm.

Liu, Z., Moav, B., Faras, A.J., Guise, K.S.,Kapuscinski, A.R., & Hackett, P.B. 1990. De-velopment of expression vectors fortransgenic fish. Mol. Cell. Biol., 10: 3,432-3,440.

MacLean, N., Penman, D., & Zhu, Z. 1987. Intro-duction of novel genes into fish. Biotech-nology, 5: 257-261.

Morales, R., Herrera, M.T., Arenal, A., Cruz, A.,Hernandez, O., Pimentel, R., Guillen, I.,Martinez, R., & Estrada, M.P. 2001. Tilapiachromosomal growth hormone gene ex-pression accelerates growth in transgeniczebrafish (Danio rerio). Electronic Journalof Biotechnology, 4: 52-58.

Stuart, G.W., McMurray, J.V., & Westerfield, M.1988. Replication, integration, and stable

germ line transmission of foreign se-quences injected into early zebrafish em-bryos. Development, 103: 403-412.

Volckaert, F.A., Hellemans, B.A., Galbusera, P.,Ollevier, F., Sekkali, B., & Belayew, A. 1994.Replication, expression, and fate of fo-reign DNA during embryonic and larval de-velopment of the African catfish (Clariasgariepinus). Mol. Mar. Biol. Biotechnol., 3:57-69.

Winkler, C., Hong, Y., Wittbrodt, J., & Schartl, M.1992. Analysis of heterologous and ho-mologous promoters and enhancers invitro and in vivo by gene transfer intoJapanese medaka (Oryzias latipes) andXiphophorus. Mol. Mar. Biol. Biotechnol., 1:326-337.

346


pola ekspresi gen enhanced green fluorescent … · 2020. 1. 13. · sperma yang telah...

Documents