MAKALAH

MIKROBIOLOGI FARMASI DAN TERAPAN

METODE KLT BIOAUTOGRAFI

OLEH :

Kelompok 12 Farmasi A

Ferdi Angriawan M (70100107098)

Febriyanti Hasdan Saleh (70100111026)

Armaila (70100111011)

Mardia (70100111042)

SAMATA-GOWA

2013

KATA PENGANTAR

Assalamu alaikum warhmatullahi wabarakatu.

Puji syukur kita panjatkan kehadirat Allah swt yang telah memberikan

rahmat dan hidayah-nya sehingga penyusun dapat menyelesaikan makalah

mikrobiologi farmasi terapan metode KLT bioautografi ini meskipun masih

banyak memiliki kekurangan. Salam dan salawat semoga tetap tercurah kepada

baginda rasulullah saw yang membawa kita dari alam gelap gulita yang penuh

kejahiliaan menuju alam yang terang benderang dengan cahaya islam.

Dalam penyelesaian makalah ini, penyusun mendapat berbagai bantuan

dari pihat, baik berupa saran, dukungan yang mana semuanya itu merupakan

bahan pertimbangan dalam penyelesaian makalah ini, penyusun ingin

mengucapkan banyak terima kasih kepada :

1. Allah swt, karena berkat rahmat dan hidayahnya-lah penyusun dapat

menyelesaikan makalah ini

2. Teriamah kasih kepada orang tua penyusun yang telah memberikan

banyak dukungan berupa materi yang merupakan bukti kecintaan mereka

pada sang buah hatinya

3. Buat teman-teman yang telah membantu dalam penyelesaian makalah ini.

Penyusun menyadari bahwa makalah ini masih memiliki banyak

kekurangan. Oleh karena itu, penyusun mengharapkan kritik dan saran yang

bersifat membangun dari para pembaca sehingga menjadi bahan pertimbangan

penyusun dalam makalah berikutnya.

Akhir kata, semoga makalah ini dibuat dapat bermanfaat bagi kita semua.

Sekaligus insya Allah bernilai ibadah disisi-nya

Wassalamu’alikum warahmatullahi wabarakatuh.

Samata-gowa,15 juni 2013

Penyusun

DAFTAR ISI

I. Kata Pengantar

II. Daftar Isi

1. Bab I Pendahuluan

A. Latar belakang

B. Rumusan masalah

C. tujuan

2. Bab II Pembahasan

A. Pengertian bioautografi

B. Macam-macam metode KLT bioautografi

C. Keuntungan dan kerugian metode KLT bioautografi

D. Skema kerja metode KLT bioautografi

3. Bab III Penutup

A. Kesimpulan

4. Daftar Pustaka

BAB 1

PENDAHULUAN

a. Latar belakang

Mikroo rgan i sme yang i ng in k i t a t umbuhkan , yang

pe r t ama ha rus d i l akukan adalah memahami kebutuhan dasarnya

kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan

digunakan. Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal

sebagaikomponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien

ke dalam sel

. K e b a n y a k a n a n a l i s i s m e l i p u t i p e n g a m b i l a n

c u p l i k a n , p e m i s a h a n s e n y a w a  pengganggu, isolasi

senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu

sebelumidentifikasi dan pengukuran serta teknik pemisahan yang

digunakan, namun kromatografi m e r u p a k a n t e k n i k p a l i n g

b a n y a k d i g u n a k a n . P e m i s a h a n m e n g g u n a k a n

t e k n i k   kromatografi relatif murah dengan peralatan yang relatif

sederhana

. Dalam mendeteksi campuran bakteri yang berupa bercak pada

KLT ada 2 metodeyang dipakai untuk mendeteksi bercak atau

komponen yang aktif sebagai anti bakteri.Kedua metode tersebut

adalah:

1 .De t eks i m ik rob io log i ( b ioau tog ra f i )

2. Deteksi senyawa kimia dengan reaksi warna spesifik.

Bioautografi merupakan metode yang spesifik untuk

mendeteksi bercak pada kromatogram hasil kromatografi lapis

tipis atau kromatografi kertas yang mempunyaiaktivitas sebagai

antibakteri, antibiotic, anti fungi dan anti viral. Bioautografi juga

dapat juga digunakan untuk mendeteksi senyawa antibitik yang

belum diketahui yang manadengan pereaksi warna spesifik

digunakan sebagai pembanding bioautografi sehinggakedua

metode tersebut saling melengkapi.

Biautografi digunakan bertujuan untuk mendeteksi bercak atau komponen

zat aktif sebagai antibakteri.

Ada 3 metode bioautografi yaitu:

1.      Bioautografi langsung/direct adalah Mikroorganisme tumbuh secara

langsung di atas lempeng KLT.

2.      Bioautografi kontak/contact adalah Senyawa dipindahkan dari

lempeng KLT ke medium.

3.      Bioautografi pencelupan/overlay

b. Rumusan masalah

1. Apa defenisi dari biautografi ?

2. Jenis- jenis biautografi

3. Keuntungan dan kelemahan metode biautografi

4. Skema kerja dalam biautografi

c. Tujuan

1. Untuk mengetahui defenisi dari biautografi

2. Untuk mengetahui jenis-jenis biautografi

3. Untuk mengetahui keuntungan dan kelemahan dari metode biautografi

4. Untuk mengetahui skema atau cara kerja dalam biautografi

BAB II

PEMBAHASAN

A. Pengertian Bioautografi

Menurut Betina (1972) bioautografi adalah suatu metode pendeteksian

untuk menemukan suatu senyawa antimikroba yang belum teridentifikasi

dengan cara melokalisir aktivitas antimikroba tersebut pada suatu

kromatogram. Metode ini memanfaatkan pengerjaan Kromatografi Lapis

Tipis (KLT). Pada bioautogafi ini didasarkan atas efek biologi berupa

antibakteri, antiprotozoa, antitumor dan lain-lain dari substansi yang diteliti.

Ciri khas dari prosedur bioautografi adalah didasarkan atas teknik difusi agar,

dimana senyawa antimikrobanya dipindahkan dari lapisan KLT ke medium

agar yang telah diinokulasikan dengan merata bakteri uji yang peka. Dari

hasil inkubasi pada suhu dan waktu tertentu akan terlihat zona hambatan di

sekeliling spot dari KLT yang telah ditempelkan pada media nagar. Zona

hambatan ditampakkan oleh aktivitas senyawa aktif yang terdapat di dalam

bahan yang diperiksa terhadap pertumbuhan mikroorganisme uji. Biautografi

dapat dipertimbangkan karena paling efisien untuk mendetekski komponen

antimikroba, sebab dapat melokalisir aktivitas meskipun dalam senyawa aktif

tersebut terdapat dalam bentuk senyawa kompleks dan dapat pula diisolasi

langsung dari komponen yang aktif.

Metode yang spesifik untuk mendeteksi bercak pada kromatogram

hasil kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kertas yang mempunyai

aktivitas sebagai antibakteri, antifungi, antibiotik dan antiviral disebut

bioautografi. Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu kromatografi

yang berdasarkan proses adsorpsi. Fase diam dapat menggunakan silika atau

alumina yang dilapiskan pada lempeng kaca atau aluminium. Fasa bergerak

(fase mobil) atau larutan pengembang biasanya digunakan pelarut campuran

organik atau bisa juga campuran pelarut organik-anorganik 5.

Kebanyakan analisis meliputi pengambilan cuplikan, pemisahan

senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih

dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran serta teknik pemisahan yang

digunakan, namun kromatografi merupakan teknik paling banyak digunakan.

Pemisahan menggunakan teknik kromatografi relatif murah dengan peralatan

yang relatif sederhana 5.

Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi adsorpsi dan

adsorben (silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oxide), kieselguhr

(diatomeous earth), dan selulosa) bertindak sebagai fase stasioner. Dalam

kromatografi lapis tipis, bahan penyalut yang digunakan beraneka macam.

Silika gel yang paling banyak dipakai 

B. Macam-macam Metode KLT Bioautografi

1. Bioautografi Langsung

Bioautografi langsung, yaitu dimana mikroorganismenya tumbuh

secara langsung di atas lempeng Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Prinsip

kerja dari metode ini adalah suspensi mikroorganisme uji yang peka dalam

medium cair disemprotkan pada permukaan Kromatografi Lapis Tipis

(KLT) yang telah dihilangkan sisa-sisa eluen yang menempel pada

lempeng kromatogram. Setelah itu dilakukan inkubasi pada suhu dan

waktu tertentu. Pengeringan Kromatogram dilakukan secara hati-hati

dengan menggunakan hair dryer untuk menghiangkan sisa eluen. Senyawa

alam lempeng kromatogram dideteksi dengan menggunakan sinar UV

pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Setelah diketahui letak dan

jumlah senyawa aktif yang terpisah atau terisolasi, dengan timbulnya noda

(spot) pada lempeng KLT, selanjutnya disemprotkan suspense bakteri uji

sebanyak 5-6 ml di atas permukaan lempeng KLT tadi secara merata.

Besarnya lempeng KLT yang sering digunakan adalah 20x20 cm dan

untuk meratakan suspensi bakteri yang telah disemprotkan dapat

menggunakan alat putar atau roller yang dilapisi dengan kertas

kromatogram (Whatman, Clipton). Lempeng KLT diinkubasi semalam

(1x24 jam) dalam box plastik dan dilapisi dengan kertas, kemudian

disemprot dengan 5 ml larutan TTC (20 mg/ml) atau INT (5 mg/ml),

INTB (5 mg/ml) serta MTT (2,5 mg/ml) dan selanjutnya diinkubasi

kembali selama 4 jam pada suhu 370C.

2. Bioautografi Kontak

Bioautografi kontak, dimana senyawa antimikroba dipindahkan

dari lempeng KLT ke medium agar yang telah diinokulasikan bakteri uji

yang peka secara merata dan melakukan kontak langsung. Metode ini

didasarkan atas difusi dari senyawa yang telah dipisahkan dengan

Kromatogafi Lapis Tipis (KLT) atau kromatografi kertas. Lempeng

kromatografi tersebut ditempatkan di atas permukaan Nutrien Agar yang

telah diinokulasikan dengan mikroorganisme yang sensitif terhadap

senyawa antimikroba yang dianalisis. Setelah 15-30 menit, lempeng

kromatografi tersebut dipindahkan dari permukaan medium. Senyawa

antimikroba yang telah berdifusi dari lempeng kromatogram ke dalam

media agar akan menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi

pada waktu dan suhu yang tepat sampai noda yang menghambat

pertumbuhan mikroorganisme uji tampak pada permukaan membentuk

zona yang jernih. Untuk memperjelas digunakan indicator aktivitas

dehidrogenase.

3. Bioautografi pencelupan

Bioautografi pencelupan, dimana medium agar telah

diinokulasikan dengan suspensi bakteri dituang di atas lempeng

Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Pada prakteknya metode ini dilakukan

sebagai berikut yaitu bahwa lempeng kromatografi yang telah dielusi

diletakkan dalam cawan petri, sehingga permukaan tertutup oleh medium

agar yang berfungsi sebagai base layer. Setelah base layernya memadat,

dituangkan medium yang telah disuspensikan mikroba uji yang berfungsi

sebagai seed layer. Kemudian diinkubasi pada suhu dan waktu yang

sesuai.

C. Keuntungan dan Kerugian Metode KLT Bioautografi

Metode bioautografi dalam mendeteksi komponen yang aktif sebagai

antibakteri memiliki beberapa keuntungan dan kerugian :

Keuntungan :

Dapat mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT yang mempunyai

aktivitas sebaga antibakteri, antifungi, antibiotik, dan antiviral.

Dapat digunakan untuk mendeteksi antibiotik yang belum diketahui

mekanismenya.

Merupakan metode yang sederhana dan mudah dilakukan.

Cepat dalam pengerjaannya 4.

Kerugian:

Tidak bisa digunakan untuk senyawa yang tidak mempunyai aktivitas

membunuh ataupun menghambat mikroorganisme.

Hasil tidak valid karena kemungkinan adanya kontaminan dari luar atau

karena zat yang diidentifikasikan tidak mengandung khasiat bakteri

antibakteri.

Mempunyai faktor kesalahan yang besar 4.

Metode kromatografi lapis tipis mempunyai beberapa keuntungan

yaitu diperoleh waktu yang lebih cepat dan hasil pemisahan yang baik. Waktu

rata-rata untuk kromatografi lapisan tipis dengan panjang silica sekitar 10 cm

adalah sekitar 20-30 menit (tergantung sifat dari fase gerak). Dalam

kromatografi lapisan tipis hanya membutuhkan penyerap dan cuplikan dalam

jumlah yang sedikit dan noda-noda yang dipisahkan dilokalisir pada plat

seperti pada lembarab kertas. Setelah pemisahan mudah diperoleh senyawa-

senyawa yang terpisah secara individu yaitu dengan cara mengeruknya dan

mengumpulkan tiap-tiap lapisan di mana lapisan itu diserap. Identifikasi dari

senyawa-senyawa yang diserap pada lapisn tipis lebih baik digunakan atau

dikerjakan dengan pereaksi kimia dan reaksi-reaksi warna, tetapi lazimnya

untuk identifikasi menggunakan harga Rf yang didefinisikan sebagai berikut:

Harga Rf         =    Jarak yang ditempuh senyawa           

                            Jarak yang ditempuh pelarut

Harga Rf dari senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga Rf standard.

Perlu diperhatikan bahwa harga Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk

campuran tertentu dari pelarut dan penyarap yang digunakan, meskipun

demikian daftar dari harga Rf untuk berbagai pelarut dan penyerap dapat

diperoleh 7.

D. Skema Kerja Metode KLT Bioautografi

Medium (NA) sebanyak 10 ml

Inokulasi dengan bakteri sebanyak 0,5 ml

Masukan

lempeng KLT yang telah dielusi diletakkan diatas permukaan medium agar

Setelah 30 menit, lempeng tersebut dipindahkan

Diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam

Amati zona hambat

BAB III

PENUTUP

A. Kesimpulan

Beberapa prosedur yang dikemukakan di atas masing-masing

memiliki kelebihan dan kekurangan. Menurut Horman dan Fuchs,

bioautografi kontak merupakan tipe yang paling sering digunakan. Masalah

perbedaan difusi dari senyawa-senyawa dari kromatogram ke plat agar

dipermudah dengan deteksi bioautografi secara langsung, tetapi metode ini

membutuhkan peralatan mikrobiologi yang cukup rumit. Sedangkan Land

dan Lyon, menyatakan bioautografi secara langsung, untuk aktivitas

antibakteri sangat sensitif dan melokalisir senyawa-senyawa yang aktif, tetapi

mempunyai kekurangan karena keterbatasan mikroorganisme yang dapat

tumbuh secara langsung diatas lapisan kromatografi. Ketersebaran bakteri

pada lempeng dan memungkinkan terjadi kontaminasi. Sedang metode

bioautografi pencelupan merupakan metode yang paling tepat sebab tidak

dipengaruhi oleh kemungkinan adanya kontaminasi. Tetapi metode

bioautografi kontak adalah yang paling umum digunakan karena mudah dan

sederhana dalam pengerjaannya.

Daftar Pustaka

Djide, M. N. 2003. Mikrobiologi Farmasi. Jurusan Farmasi UNHAS,

Makassar.

Djide, Natsir dan Sartini.\2008. Analisis Mikrobiologi Farmasi. Jurusan

Farmasi UNHAS, Makassar

Mulyaningsih, S., 2004, Analisis Mikrobiologi, Farmasi FMIPA UII,

Yogyakarta

Sastrohamidjojo, 2002, Kromatografi, UGM-press, Yogyakarta