DNA: The Molecule of Heredity

Hoofdstuk 09

2010/2011

ONTDEKKING VAN DNADeel 1

2

Geschiedenis

De ontdekking dat DNA de genetische informatiebevat:

– T.H. Morgan (1908)

– Frederick Griffith (1928)

– Avery, McCarty & MacLeod (1944)

– Erwin Chargaff (1947)

– Hershey & Chase (1952)

– Watson & Crick (1953)

– Meselson & Stahl (1958)

3

Chromosomen vs fenotype

• T.H. Morgan

– werkte met Drosophila• fruitvliegen

– associeerde het fenotype van zijn vliegen met een specifiek chromosoom• een man met witte ogen had een specifiek X

chromosoom

4

Genen liggen op chromosomen

• Morgan’s conclusie

– genen liggen op chromosomen

– maar bestaan deze genen nu uit eiwit or DNA?• aanvankelijk dacht men aan eiwit

Waarom?

5

“Transforming Principle”

• Frederick Griffith

– Streptococcus bacterie• zocht een medicijn tegen longontsteking

– onschuldige, levende bacteriën (“rough”) gemengd met dode, pathogene bacteriën (“smooth”): muis sterft

– een onbekende stof werd door dode bacteriën doorgegeven aan levende bacteriën.• “Transforming Principle”

6

“Transforming Principle”

7

DNA is het “Transforming Principle”

• Avery, McCarty & MacLeod

– isoleerden DNA & eiwit van Streptococcus bacteriën• welke van de twee zal leiden tot transformatie van de niet-

pathogenic bacterie?

– eiwit geinjecteerd in de bacteria• geen effect

– DNA geinjecteerd in de bacteria• niet-pathogene bacteriën getransformeerd in

pathogene bacteriën

8

Oswald Avery Maclyn McCarty Colin MacLeod

Avery, McCarty & MacLeod• Conclusie

– eerste experimentele bewijs dat DNA de genetischeinformatie bevat

9

Bevestiging

• Hershey & Chase

– klassieke “blender” experiment

– bacteriofaag• virus dat bacteriën infecteert

– fagen gekweekt in 2 media, radioactief gelabeld met • 35S in de eiwitten

• 32P in het DNA

– geïnfecteerde bacteriën met gelabelde fagen

10

Eiwitmantel gelabeld met 35S DNA gelabeld met 32P

bacteriofagen infecterenbacteriële cellen

T2 bacteriofagengelabeld met

radioactieve isotopenS vs. P

bacteriële cellen worden geschudom de virale eiwitmantels te verwijderen

35S radioactiviteitin the medium

32P radioactiviteitin the bacteriële cellen

Hershey & Chase

11

12

Blender experiment

• Radioactieve faag & bacterie in de blender

– 35S faag• radioactieve eiwitten alleen in het supernatant

• virale eiwitten gaan de bacterie NIET binnen

– 32P faag• radioactief DNA in de pellet

• viraal DNA gaat de bacterie WEL binnen

– Bevestiging: DNA is de “transforming factor”

13

Hershey & Chase

Alfred HersheyMartha Chase 14

Chargaff

• DNA samenstelling: “Regels van Chargaff”

– varieert tussen soorten

– 4 basen niet in gelijke hoeveelheden

– bases in karakteristieke verhouding aanwezig• mensen:

A = 30.9%

T = 29.4%

G = 19.9%

C = 19.8%

15

Structuur van DNA

• Watson & Crick

– ontwikkelden het dubbele helix model van DNA• andere wetenschappers die aan dit probleem werkten

– Rosalind Franklin

– Maurice Wilkins

– Linus Pauling

Franklin Wilkins Pauling16

Watson en Crick

17

Rosalind Franklin (1920-1958)

18

• Replicatie van DNA

– baseparing suggereert dat beide zijden van de DNA streng als template voor een nieuwe streng gebruikt kunnen worden

“It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated

immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic

material.” — Watson & Crick19

Maar hoe wordt DNA gekopieerd?

Modellen voor DNA replicatie

• Alternatieve modellen

20

conservatief semiconservatief dispersief

1

2

P

Semiconservatieve replicatie

• Meselson & Stahl– label “ouder” nucleotiden in DNA strengen met

zwaar stikstof = 15N

– label nieuwe nucleotiden met een minder zwaar isotoop= 14N

21

“The Most Beautiful Experiment in Biology”

parent replication

15N ouderstrengen

15N/15N

22

1e replicatie

conservatief

15N/15N

14N/14N

semi-conservatief

15N/14N

dispersief

15N/14N

conservatief

15N/15N

14N/14N

semi-conservatief

15N/14N

dispersief

15N/14N

2e replicatie

14N/14N

15N parent strands

15N/15N

XX XV1

2

P

Meselson & Stahl

23

Geschiedenis• De ontdekking dat DNA de genetische informatie bevat

– T.H. Morgan (1908)

• genen liggen op chromosomen

– Frederick Griffith (1928)

• een “transforming factor” kan het fenotype veranderen

– Avery, McCarty & MacLeod (1944)

• DNA is de “transforming factor”

– Erwin Chargaff (1947)

• De Regels van Chargaff: A = T, C = G

– Hershey & Chase (1952)

• bevestiging dat DNA de genetische informatie bevat

– Watson & Crick (1953)

• ontdekten de dubbele helix structuur van DNA

– Meselson & Stahl (1958)

• semi-conservatieve replicatie 24

eiwitRNA

Het “Centrale Dogma”

DNA

transcriptie translatie

replicatie

25

DNA: BOUW EN FUNCTIEDeel 2

26

Dubbele helix structuur van DNA

“It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated

immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic

material.” Watson & Crick27

3’…5’…?

• De C-atomen zijngenummerd

28OH

CH2

O

4

5

3 2

1

PO4

N base

ribose

nucleotide

De DNA “backbone”

• Opgebouwd uit de ribose en fosfaat groep

– Let op de 3 and 5!

29

OH

O

3

PO4

base

CH2

O

base

O

PO

C

O–O

CH2

1

2

4

5

1

2

3

3

4

5

5

Anti-parallele strengen

• Nucleotiden in de DNA backbone zijn verbonden via de fosfaat-groepen suiker-groep tussen de 3 & 5koolstofatomen

– DNA molecuul heeft een “richting”

– complementaire streng loopt in de tegengestelde richting

303

5

5

3

Bindingen in DNA

31

….sterke or zwakke bindingen?

Hoe is dit gerelateerd aan het kopieermechanisme van DNA?

3

5 3

5

covalente binding

waterstofbrug

Baseparen in DNA

• Purine– adenine (A)

– guanine (G)

• Pyrimidine– thymine (T)

– cytosine (C)

• Paren– A : T

• 2 bindingen

– C : G• 3 bindingen

32

Kopiëren van DNA

• Replicatie van DNA– baseparing leidt er toe dat elke

streng de template van een nieuwestreng is

– nieuwe DNA: 1/2 oude streng, 1/2 nieuwe streng• semi-conservatief

33

DNA replicatie

• Groot aantal enzymen coördineert de replicatie

34

Replicatie: 1e stap

• Openen DNA

– helicase enzym• DNA helix deels ontwinden

35

helicase

DNAPolymerase

Replicatie: 2e stap

• Bouwen van een DNA dochter streng

– voegt nieuwecomplementaire basentoe

– DNA polymerase

36

energie

ATPGTPTTPCTP

Energie voor de replicatie

Waar komt energie normaal vandaan?

37

ADPAMPGMPTMPCMP

aangepaste nucleotide

energie

Energie voor de replicatie

• De nucleotiden arriveren met hun eigen energiebronvoor het maken van de binding

– binding gemaakt door een enzym: DNA polymerase

38

ATP GTP TTP CTP

• Toevoegen van basen

– nucleotiden wordentoegevoegd aan het 3 eind van de groeiendeDNA streng

– streng groeit alleen van 53

DNAPolymerase III

DNAPolymerase III

DNAPolymerase III

DNAPolymerase III

Replicatie

3

3

5

5

39

energie

energie

energie

energie

energy

35

5

5

3

energie

energie

energie

3

geen energievoor een binding

energie

energie

energie

ligase

3 5

40

Beperkingen van DNA polymerase kan enkel op een 3 eind van een bestaande

streng verder bouwen

Leading & lagging streng

5

5

5

5

3

3

3

5

35

3 3

Leading streng

Lagging strengligase

Leading streng continue synthese

Lagging streng Okazaki fragmenten

samengevoegd door ligase

DNA polymerase

3

5

41

DNA polymerase

Replicatie

5

35

3

leading streng

lagging streng

leading streng

lagging strengleading streng

5

3

3

5

5

3

5

3

5

3 5

3

growing replication fork

growing replication fork

5

5

5

5

5

3

3

5

5lagging streng

5 3

42

Replicatie

3’

5’

3’

5’

5’

3’

3’ 5’

helicase

richting van replicatie

DNA polymerase

DNA polymerase

ligase

Okazaki fragment

leading streng

lagging streng

43

Controle DNA• 1000 bases/seconde =

veel typefouten!

• DNA polymerase

– controle & correctie fouten

– reparatie van verkeerd

gepaarde basen

– verwijdert abnormale basen

• je hele leven worden

beschadigingen gerepareerd

– verminderd het aantal fouten

van 1 op 10,000 tot

1 op 100 miljoen basen

44

Einde