High Performance Liquid High Performance Liquid ChromatographyChromatography

CLAE

Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência

HPLCHPLC

1. Introdução1. Introdução

CROMATOGRAFIA = método físico de separação no qual os constituintes de uma amostra a serem separados são distribuídos entre 2 fases:

estacionáriaestacionária: geralmente de grande área, sólida ou líquida

móvel: um fluido insolúvel que percola através da primeira

FASE MÓVEL

injeção separação eluição

Fase estacionária

DETECTOR

FONTE: LOUGH & WAINER, 1997.

LCCromatografia a

Líquido

SFCCromatografia a

Fluido Supercrítico

GCCromatografia a

Gás

LCPlanar

LCColuna

CromatografiaPapel

CCDCromatografia

Camada Delgada

ColunaEmpacotada

Coluna "Open Tubular" Capilar

dc < 350 um

Coluna Capilarempacotadadc <= 350 um

Coluna Microbore

350 um < dc < 1 mm

Coluna "Analítica"

1 mm < dc < 8 mm

Coluna Preparativadc >= 8 mm

CROMATOGRAFIA

LC ClássicaLC Clássica

Fluxo por gravidade

HPLC Moderna*HPLC Moderna*

Partículas da fase estacionária extremamente pequenas (diâmetro < 10 m) bombas para operações a altas pressões (até 500 atm) e baixas vazões (0,01 a 2-3 mL / min) ........High Pressure LC

Solventes especiais e ultra-puros

Detectores seletivos e super-sensíveis, com tamanho de célula de detecção < 10 L

DetectorSistema de Tratamento

de Dados

Bomba HPLC

Injetor

Precoluna

Coluna Analitica

Filtro em linha Scavenger

Reservatórios para os solventes

HPLC Moderna*HPLC Moderna*

Substâncias não analisáveis por GC:

compostos iônicos sais inorgânicos e orgânicos aminoácidos puros compostos polares de alto PM polímeros compostos termicamente instáveis corantes salinos etc.

Aplicações HPLCAplicações HPLCSubstâncias químicasSubstâncias químicas

Proteínas Ácidos nucleicos Aminoácidos Corantes Polissacarídeos Pigmentos plantas Metabólitos

plantas Produtos

farmacêuticos

Compostos iônicos Íons metálicos Cátions e ânions Lipídeos polares Complexos metais

pesados Explosivos Polímeros

sintéticos

Vantagens da HPLCVantagens da HPLC Sensível a diversas amostras, incluindo orgânicas,

biomoléculas e íons - Pode-se analisar > 60% de todos os componentes contra uns 15% para GC

Alta resolução resolve (separa) centenas de componentes em

amostras complexas Detecção de alta sensibilidade

detecta nos limites de pg - ng Análises rápidas e precisas

análises de 1 - 60 min, precição de 1% RSD Análises automatizadas

usando autosampler e sistema de tratamento de dados

4. Modos de Separação4. Modos de Separação

Cromatografia de adsorção (sólido-líquido)

Cromatografia de partição (líquido-líquido)

Cromatografia de troca iônica

Cromatografia por exclusão de tamanho

Sólida Apresenta na superfície cargas iônicas ou polares.

Exemplos: Sílica gel Alumina Florisil Carvão Carbonato de cálcio

Fase EstacionáriaFase Estacionária

Hexano Isooctano Cloreto de butila Clorofórmio Diclorometano Tetraidrofurano Acetonitrila Iso e n-propanol Metanol Água

Fase MóvelFase Móvel

Cromatografia de Cromatografia de AdsorçãoAdsorção

apolar

Flu

xo

FASE ESTACIONÁRIA Fina camada de líquido que cobre as partículas de um

suporte sólido Este líquido pode ser:

polar: polietilenoglicol, ODPN (, ´-oxidipropionitrila) apolar: hexano

FASE MÓVEL Sempre de polaridade contrária Baixa estabilidade

Cromatografia de partição clássicaCromatografia de partição clássica

FASE ESTACIONÁRIA Líquido é quimicamente ligado ao suporte

sólido.

FASE MÓVEL Sempre de polaridade contrária Alta estabilidade

Cromatografia de partição com fases Cromatografia de partição com fases quimicamente ligadasquimicamente ligadas

Fases polares quimicamente ligadas Fases polares quimicamente ligadas frequentemente utilizadasfrequentemente utilizadas

MODO GRUPO FUNCIONAL

ESTRUTURA DO GRUPO LIGADO

Amino NH2

Ciano (nitrila) CN

Diol

Si O CH2 CH CH2OH

OHO

Si O CH2 CH CH2OH

OHO

FASE NORMAL

Fases apolares quimicamente ligadas Fases apolares quimicamente ligadas freqüentemente utilizadasfreqüentemente utilizadas

MODO GRUPO FUNCIONAL

ESTRUTURA DO GRUPO LIGADO

FASE REVERSA

Dimetil silil SiCH3

CH3

Octil silil Si CH2 (CH2)6 CH3

Octadecil silil Si CH2 (CH2)16 CH3

Fenil silil Si OH

Cromatografia de PartiçãoCromatografia de Partição

apolar

Flu

xo

polar

polar

Classificação baseada na Natureza da Fase Móvel

NPC Fase móvel Apolar hexano, isooctano Fase estacionária Polar sílica, alumina

RPC Fase móvel Polar metanol, água Fase estacionária Apolar C8, C18

Cromatografia Fase Normal (NPC)Cromatografia Fase Normal (NPC) x x

Cromatografia Fase Reversa (RPC)Cromatografia Fase Reversa (RPC)

GERALMENTE:

NPC Cromatografia Adsorção

RPC Cromatografia Partição

Portanto..........

4.3. Cromatografia de troca iônica4.3. Cromatografia de troca iônica

FASE ESTACIONÁRIA = grupos iônicos quimicamente ligados a um suporte (sílica ou polímeros de alto PM). Pode ser: trocadora de cátions: grupo iônico = sulfonato trocadora de ânions: grupo iônico = amônia quaternária

FASE MÓVEL = soluções tampões (controle pH). Por exemplo: ácido cítrico, fosfato amônia, acetato sódio, borato sódio, etc.

APLICAÇÕES = compostos iônicos, aminoácidos, proteínas/peptídeos, etc

Cromatografia de troca iônicaCromatografia de troca iônica

+-

SO Na3+

SO Na3

pH

SuportePoliméricoou de Silica

-

Flu

xo

4.4. Cromatografia por exclusão de 4.4. Cromatografia por exclusão de tamanhotamanho

A separação é baseada no tamanho da molécula e não em fenômenos de interações físicas ou químicas

FASE ESTACIONÁRIA = partículas com diâmetro médio de poro fabricado sob medida. Assim, algumas moléculas (menores) podem entrar nos poros pequenos, outras nos poros médios, ou seja, são permeadas seletivamente. As moléculas grandes são excluídas exclusão tamanho.

Cromatografia por exclusão de Cromatografia por exclusão de tamanhotamanho

FLUXO

Poro

Gel

Resolução (RsResolução (Rs)Rs = tr1 - tr2 / wb Rs = separação real dos picosRs = 0 (sem separação), Rs = 1 (separação parcial), Rs = 1.5 (separação da linha base)

InjeçãoW W

t

1. Colunas1. Colunas Sistema separação (adsorção, partição, etc) Comprimento (10-25 cm)

cromatografia rápida 3 cm Diâmetro interno* Tipo de suporte (sílica gel ou polímeros) Grupos quimicamente ligados (amino, ciano, C8,

C18, sulfonato) Tamanho da partícula (3-20 m) Tamanho do poro (60-300 Å)

Diâmetro da coluna Diâmetro da coluna

Tipo de Coluna i.d.(mm)

Capacidade de amostra

(mg)

Velocidadede Fluxo(mL/min)

Semi-preparativa 8-20 10-50 5-30

Analítica 4.6 1 1

Narrowbore 2.0 0.2 0.2

Microbore 1.0 0.05 0.05

2. Bombas / Fase Móvel2. Bombas / Fase Móvel

Velocidade fluxo 0,1-3,0 mL/mim para colunas analíticas > 5,0 mL/min para colunas preparativas

Pressão operação 500-2000 psi para colunas analíticas

Eluição Isocrática / Eluição Isocrática / GradienteGradiente

ISOCRÁTICA = a composição da fase móvel não muda durante a corrida.

GRADIENTE = a composição da fase móvel varia de acordo com a polaridade dos analitos. Bomba binária/quaternária.

3. Injeção da Amostra3. Injeção da Amostra INJETOR MANUAL

Amostra da seringa

Da bomba

Para coluna

Descarte

Loop Loop

Da bomba

Para coluna

3. Injeção da Amostra3. Injeção da Amostra AUTOSAMPLER

SolventeCorpodaSeringa

Amostragemda Seringa

Válvula deinjeção

Frasco de lavagem

Vials na bandeja

4. Detectores4. Detectores Equipamento com uma pequena célula de

fluxo conectado na saída da coluna e que monitora a concentração dos analitos.

Detectores mais comuns: UV/Vis (absorvância) Fluorescência Índice de Refração Outros: Eletroquímico, Condutividade,

Infravermelho, etc.

4.1. Detectores UV/Vis e Rede de 4.1. Detectores UV/Vis e Rede de Diodos (DAD)Diodos (DAD) PRINCÍPIO: quando vários grupos funcionais são

expostos à radiação, sofrem excitação eletrônica a qual resulta na absorção de energia em comprimentos de onda específicos para os grupos.

Comprimento onda: 210-380 nm UV Comprimento onda: 380-800 nm Visível

90% compostos orgânicos absorvem luz em algum lugar da região UV-Vis

65% das amostras analisadas por LC absorvem luz na região de compr. Onda = 254 nm

Detector de Absorvância UV/Vis Detector de Absorvância UV/Vis

Detector de Rede de Diodos (DAD) Detector de Rede de Diodos (DAD)

4.2. Detectores de Fluorescência4.2. Detectores de Fluorescência

Detectam compostos com fluorescência natural (aflatoxinas) ou que se tornam fluorescentes após reação de derivação (cloreto dansyl, fluoresceína, OPA)

4.3. Detectores de Índice de Refração (IR)4.3. Detectores de Índice de Refração (IR)

PRINCÍPIO: mede a mudança do índice de refração

dos efluentes das colunas

IR : característica física de cada composto

IR da substância analisada IR da fase móvel

Análise isocrática, controle temperatura

Detector universal, não seletivo e pouco sensível

Aplicações: separações preparativas, cromatografia

polímeros (exclusão tamanho), açúcares, etc.

Detector de Índice de Refração (IR)Detector de Índice de Refração (IR)

DetectoresDetectores SENSIBILIDADE

Fluorescência: 1.000 vezes mais sensível que UV-Vis

UV-Vis: 1.000 vezes mais sensível que IR

ESPECIFICIDADE Aumenta com a sensibilidade

FIM !!!!!!!!!