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Download Cromatografia lquida de alta eficincia -   LQUIDA PLANAR CCD CP CONVENCIONAL COLUNA HPLC ADOSRO PARTIO INICA EXCLUSO Tipos de cromatografia lquida:

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  • Cromatografia lquida

    de alta eficincia

  • O que cromatografia lquida?

    A cromatografia fundamenta-se na migrao

    diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido

    a diferentes interaes entre duas fases imiscveis, sendo uma

    fase fixa que tem uma grande rea superficial chamada fase

    estacionria, e a outra um fluido que se move atravs da fase

    estacionria sendo chamada de fase mvel. Na cromatografia

    lquida a fase mvel lquida! (LANAS, 1993; DEGANI; CASS;

    VIEIRA, 1998).

  • Principio da cromatografia lquida

    Tempo

    AMOSTRA

    Coluna

    contendo fase

    estacionria.

    SOLVENTE

    Ao da

    gravidade!

  • CROMATOGRAFIA LQUIDA

    PLANAR

    CCD CP CONVENCIONAL

    COLUNA

    HPLC

    ADOSRO PARTIO INICA EXCLUSO

    Tipos de cromatografia lquida:

  • Primeiro, o que HPLC?

    HPLC uma abreviao do nome em ingls : High Performance (Pressure)

    Liquid Cromatography.

    Historia da HPLC:

    - Dcada de 60 : O comeo da HPLC como High pressure LC!

    - Dcada de 70 : Com a melhora do material da coluna e da

    instrumentao, HPLC passa a ser High Performance LC!

    - Dcada de 80: A partir dessa dcada houve um boom do HPLC

    - 2006- Evoluo da tcnica: UPLC, RRLC, UFLC...

  • Vantagens da HPLC

    FE utilizada inmeras vezes.

    Versatilidade: nico requisito a solubilidade na FM.

    Tempo reduzido de anlise.

    Alta resoluo.

    Anlise qualitativa: tR , espectro de absoro no UV (DAD), MS.

    Anlise quantitativa: desvios menores do que 5%.

    Boa detectabilidade:

    Absoro de UV-Vis de comprimento de onda varivel 10-10 g;

    Fluorescncia: 10-12 g;

    Automatizao

  • Limitaes da HPLC

    Alto custo do instrumento

    Alto custo de manuteno

    Alto custo de operao

    Falta de detector universal sensvel

    ndice de refrao: baixa detectabilidade (10-6 g), pouco estvel.

    Espectrmetro de massas: ~US$ 150.000,00

    Necessidade de experincia no seu manuseio

  • Como um HPLC comercial?

    Reservatrios dos

    solventes e

    sistema de

    degaseificao.

    Bomba.

    Injetor.

    Coluna.

    Detector.

  • Instrumentao para HPLC

  • Instrumentao para HPLC

  • Reservatrio para a fase mvel

    Filtro do reservatrio :

    Captar a fase mvel e evitar que partculas suspensas na FM obstruam

    os capilares ou contaminem a bomba.

    Filtros de 10 a 40 um

    Limpeza peridica!!

  • Caractersticas da fase mvel

    Ser de alto grau de pureza ou fcil purificao

    Dissolver a amostra sem decompor seus componentes

    No decompor ou dissolver a fase estacionria

    Ter baixa viscosidade

    Compatvel com o tipo de detector

    Polaridade adequada para permitir a separao dos componentes da amostra.

    Degaseificao da FM:

    Garanti a reprodutibilidade da vazo

    Estabilidade da linha base.

  • Mtodos de degaseificao

    Ultrassom: Muito lento, pouco eficiente, requer agitao, em geral o pior mtodo quando usado sozinho

    Vcuo + ultrassom: Rpido, eficiente, refazer a cada 12 hrs.

    Purga com Hlio: Contnuo, hlio razoavelmente caro, leva a

    aumento de vazamentos, maior custo operacional.

    Degaseificador on-line: Contnuo, remove o ar logo antes de entrar na bomba, investimento alto inicial (melhor opo a longo prazo)

  • Instrumentao para HPLC

  • Sistema de bombeamento

    Tm por finalidade enviar um fluxo constante e reprodutvel de FM para o

    sistema cromatogrfico

    REQUISITOS:

    Ser de material inerte

    Presses de at 6000 psi (~400 atm)

    Vazo contnua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos)

    Vazes de 0,1 a 10 ml/min (aplicaes analticas)

    Controle de vazo e reprodutibilidade melhor que 1 %

  • Sistema de bombeamento

    Tipos de bombas:

    Pneumtica

    Deslocamento

    Recproca

  • Bomba pneumtica

    Vantagens:

    Baixo custo

    Livre de pulsaes

    Desvantagens:

    Baixa presso (at 2000 psi)

    Baixo volume

    No permite gradiente

    Vazo depende da presso de retorno e viscosidade da fase mvel

  • Bomba de deslocamento

    Vantagens:

    Vazo independe da presso de retorno e viscosidade da fase mvel

    Livre de pulsaes

    Desvantagens:

    Baixo volume

    No permite gradiente

  • Bomba recproca

    Vantagens:

    Presso elevada (at 10 000 psi)

    Pequeno volume interno (35 a 400 L)

    Permite gradiente

    Desvantagem:

    Fluxo pulsado

    Alto custo

  • Sistema de bombeamento

    Isocrtico :

    + A composio da fase mvel permanece constante ao longo da

    anlise.

    + Capaz de separa um nmero limitado de analitos.

    Gradiente

    + A composio da fase mvel varia durante a anlise.

    + Sistema aplicado com a polaridade dos compostos presentes

    na amostra , muito diferente.

    + Separao de amostras complexas.

  • Separao isocrtica e por gradiente

    A eluio isocrtica feita com um nico solvente (ou mistura de

    solventes). Se um solvente no propiciar uma eluio suficientemente

    rpida de todos os componentes, ento pode ser utilizada uma eluio

    por gradiente.

  • Com base nas eluies isocrticas foi elaborado o gradiente a seguir.

  • Instrumentao para HPLC

  • INJEO MANUAL

    - As amostras so introduzidas com seringas.

    - Aps virar a ala, a amostra carregada pela fase mvel at o incio

    da coluna.

    AMOSTRADOR AUTOMTICO

    - As amostras so postas em um frasco localizado

    dentro do amostrador.

    - O amostrador automtico :

    1- Mede o volume correto para injeo.

    2- Injeta a amostra.

    3 Prepara o injetor para uma prxima amostra

    Sistema de Injeo

  • Sistema de Injeo Injetor Rheodyne Diagrama de fluxo

    Bomba

    Coluna

    Bomba

    Coluna

    LO

    AD

  • Sobrecarga de Volume da amostra

    Para aproveitar de todos os pratos que uma

    colina possui, no se deve injetar um volume

    maior que 1% do volume da coluna vazia.

    (L)=(raio)2(comprimento)(0,01)

  • Instrumentao para HPLC

  • Coluna Geralmente em ao inox ( mais popular, maior presso)

    + Coluna de vidro reforado (at 600 psi, utilizada para biomoleculas)

    + PEEK polmero ( biocompatvel e quimicamente inerte com a maioria

    dos solventes)

    + Preo: > US$ 200.00

    Tipos de colunas

    + Analticas : dimetro interno (i.d) 1,0-4,6 mm, comprimento 15 - 250

    mm.

    + Preparativas: i.d 4,6 mm, comprimento 50 -250 mm.

    A escolha de uma coluna apropriada o ponto crtico para o sucesso

    da anlise.

  • Pr-coluna

    Localizada entre o injetor e a coluna

    Colunas de 2 a 5 cm, i.d igual ao da coluna.

    Mesma FE da coluna de separao.

    Protege a coluna

    Custo reduzido

    Pr-coluna!

  • Fase estacionria.

    + As colunas so recheadas com partculas porosas com dimetro de 1,8 5 m.

    + Estas partculas porosas na coluna tm geralmente uma fase ligada

    quimicamente sobre a sua superfcie, que interage com os componentes da

    amostra para separ-los um do outro.

    Coluna

  • Condicionamento da Coluna

    Necessrio para que haja um perfeito equilbrio

    da FM e da FE.

    Coluna nova: 4- 8 horas

    Coluna parada h alguns dias: 2 horas

    Coluna de uso dirio: 15 minutos.

    Lembre-se: a coluna deve ser

    guardada em solvente orgnico.

  • LC com fase quimicamente ligada

  • Sntese da FE.

  • Modos de HPLC

    HPLC

    Partio Inica Excluso Adsoro

  • Tipos de cromatografia lquida:

    Adsoro:

    O mecanismo de separao: competio entre molculas da

    amostra e da fase mvel em ocupar os stios ativos da fase estacionria,

    slido. (Slica)

    Fase estacionria (polar) afetada com frequncia pela

    reteno de molculas de alta polaridade como lcoois, gua.

    Partio: (CLL ou CFL)

    CLL: O mecanismo de separao: baseia-se nas diferentes

    solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase

    mvel e na fase estacionria.(slica purificada)

    O maior inconveniente desta tcnica a solubilidade da fase

    estacionria na fase mvel.

    CFL: A fase estacionria est imobilizada por meio de ligaes

    qumicas. (Normal ou Reversa)

  • Fase normal x Fase reversa

    Fase normal:

    fase estacionria polar;

    fase mvel apolar (n-alcanos, clorofrmio, acetato de etila);

    solutos neutros;

    polaridade soluto t. reteno;

    mecanismo reteno: adsoro

    Fase reversa:

    fase estacionria apolar;

    fase mvel polar (tampes, gua, metanol, acetonitrila, THF);

    solutos apolares, no-inicos;

    polaridade f. mvel t. reteno;

    mecanismo reteno:

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