introduo ao acoplamento cromatografia lquida ao acoplamento cromatografia lquida –espectrometria...

Introduo ao Acoplamento Cromatografia Lquida Espectrometria de Massas

XVII MET Encontro Nacional sobre Metodologia e Gesto de Laboratrios da Embrapa

2012 Waters Corporation 1

Pirassununga, 24-25 de Outubro de 2012.

Amadeu Hoshi IglesiasEspecialista de Aplicaes em Espectrometria de Massas

amadeu_iglesias@waters.com

AgendaAgenda

Conceitos e Fundamentos de Espectrometria de Massas

Instrumentao

Espectrometria de Massas Sequencial

2012 Waters Corporation 2

Acoplamento LC MSMS

Desenvolvimento de Mtodos Quantitativos por LC MS e LC -

MSMS

Screening com Tof

Conceitos e Fundamentos de

2012 Waters Corporation 3

Conceitos e Fundamentos de Espectrometria de Massas

EspectrometriaEspectrometria de de MassasMassas

Tcnica analtica para:

identificao de compostos desconhecidos

quantificao de compostos conhecidos.

Sensibilidade: Substncias podem ser detectadas com quantidadesmnimas de amostra (10-12 g, 10-15 mol pra um composto de massa1000 Daltons.

2012 Waters Corporation 4

1000 Daltons.

Seletividade: Substncias podem ser identificadas e quantificadas emconcentraes muito baixas (uma parte em 1012) em misturascomplexas.

DefinioDefinio IUPACIUPAC

Espectrometria de Massas:

Estudo de sistemas pela formao de ons em fase gasosa, com ou sem fragmentao, que so caracterizados por suas relaes massa carga e

abundncias relativas.

2012 Waters Corporation 5

UnidadesUnidades emem um um espectroespectro de de massasmassas

m/z = relao massa/carga

Daltons (Da) = u = unidade de massa atmica

Thomson (Th) = m/z 100

2012 Waters Corporation 6

m/z = Da/z = Th

m/z

Ion abundance (%)

60

40

80

20

EspectroEspectro de de massasmassas

Pico base (ion 100%)Pico base (ion 100%)

100

Pico do on molecularPico do on molecular(Precursor)(Precursor)

ons fragmentoons fragmento

2012 Waters Corporation 7

Ion abundance (%)

m/z

60

40

80

20

IstoposIstopos

IstoposIstopos

100243.09

Flurbiprofen (M+H)

100292.02

Thiomethoxam (M+H)

2012 Waters Corporation 8

m/z243 244 245

%

0

244.09

m/z292 293 294 295 296 297

%

0

294.02

293.03

295.02

C15 H13 O2 F C8 H10 N5 O3 S Cl

RazoRazo de de IstoposIstopos

Elemento Isotopo Abundncia Relativa

+1 Isotopo Abundncia Relativa

+2 Isotopo

Abundncia Relativa

Carbono 12C 100 13C 1.11

Hidrognio 1H 100 2H 0.016

Nitrognio 14N 100 15N 0.38

Oxigenio 16O 100 17O 0.04 18O 0.20

Enxofre 32S 100 33S 0.78 34S 4.40

2012 Waters Corporation 9

Cloro 35Cl 100 37Cl 32.5

Bromo 79Br 100 81Br 98.0

http://www.webelements.com/

EspectroEspectro de de massasmassas

H H

O

H = 1 Da O = 16 Da

H2O = 18 Da

C C

H

H

HH

H

H

O

C C

H

H

HH

H

H

O

H = 1 DaO = 16 Da C = 12 Da C2H6O = 46 Da

2012 Waters Corporation 10

46m/z

intensidade

18m/z

intensidade

18 46

intensidade

m/z

Mistura gua + metanolMistura gua + metanol

Grfico m/z x Intensidade inica

EspectroEspectro de de massasmassas

NO

O

OO

CH3CH3

CH3CH3 CH3

CH3

N CH3

CH2

+

O

O

CH3

CH3

Substncia intacta

O

CH3

CH3 CH3

CH3

2012 Waters Corporation 11

C+

C

O

CH2

O

CH3

O

O

CH2

+

CH3

CH3

CH3

N CH3

NO

CH2

+

O

CH3CH3

3

CH3

N CH3

ons precursor e fragmentos

ModosModos de de AquisioAquisio

Hemoglobin

%

auto01 4 (0.690) Sm (SG, 1x2.00); Cm (3:4) TOF LD+ 3.17e31529.826

1530.830

1531.835

Contnuo

2012 Waters Corporation 12

m/z1528 1529 1530 1531 1532 1533 1534 1535

%

19

5

1531.835

1532.806

auto01 4 (0.690) Cn (Cen,1, 80.00, Ar); Sm (SG, 1x2.00); Cm (3:4) TOF LD+ 7981529.816

1530.824

1531.835

Centride

CromatogramaCromatograma

Pesticide Mix

100

%

0

100

%

pest03 1: Scan ES+ TIC

5.77e65.054.65

3.820.74

8.625.65

8.0210.62

12.71

pest03 1: Scan ES+ 229

2.08e64.65

TIC (Total ion Chromatogram)

Cromatograma m/z 229

2012 Waters Corporation 13

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00Time0

100

%

0

100

%

0

%

pest03 1: Scan ES+ 217

8.23e55.10

pest03 1: Scan ES+ 199

1.51e65.64

Cromatograma m/z 217

Cromatograma m/z 199

Principais caractersticas que devem ser consideradas em umespectrmetro de massas:

Sensibilidade

Exatido e preciso na medida de massas

Resoluo

Parmetros AnalticosParmetros Analticos

2012 Waters Corporation 14

Resoluo

Faixa dinmica

Linearidade

Reprodutibilidade

A importncia de cada parmetro depende da aplicao

SensibilidadeSensibilidade

Medida como o valor de relao sinal/rudo para um padro especfico, em uma dada concentrao.

2012 Waters Corporation 15

ResoluoResoluo

100%

50%

= 500

Largura do pico ( 50%) = 0.05Da

Resoluo (FWHM) = 500 = 10000

Relao massa/carga

2012 Waters Corporation 16

500.0 500.1499.9

50%

0.05 Da

m/z

0.05

FWHM = Full Width Half Maximum

ExatidoExatido de de massamassa

A exatido da medida calculada como a diferena (erro) entre a massa medida (experimental) e a massa terica.

A exatido de massas medida em

miliDaltons (1mDa = 0.001 unidades de massa)

ou

ppm = partes por milho = m/m x 106

2012 Waters Corporation 17

ppm = partes por milho = m/m x 106

Exemplo:

Massa real = 400.0000

Massa medida = 400.0020

Diferena = 0.0020 ( 2 mDa)

0.0020.002

400400x 106x 106Erro em ppm =Erro em ppm = = 5 ppm= 5 ppm

ExatidoExatido de de massamassa

Massa nominal e massa exata de alguns elementos

Massa Nominal Massa Exata

Carbono 12 12.0000

Hidrognio 1 1.0078

Oxignio 16 15.9949

Nitrognio 14 14.0031

2012 Waters Corporation 18

Nitrognio 14 14.0031

Massa nominal e exata de algumas molculas

Massa Nominal Massa Exata

C8H7NO+ 133 133.05276

C9H11N+ 133 133.06400

C9H7N3+ 133 133.08915

ResoluoResoluo e e ExatidoExatido de de massamassa

A resoluo de um quadrupolo no suficiente para diferenciar estes dois compostos.

2012 Waters Corporation 19

Dados de ToF com resoluo >10,000, mostra claramente dois picos distintos.

A massa destes picos pode ser medida com exatido < 5ppm

ClculoClculo parapara composiocomposio elementalelemental

Tolerncia 5 ppm Tolerncia 50 ppm

2012 Waters Corporation 20

Tolerncia 5 ppm Tolerncia 50 ppm

30 possibilidades!3 possibilidades

LinearidadeLinearidade

Curva de calibrao em uma faixa de 0.5 to 5000pg/L na colunaR2 = 0.9978Compound name: verapamilCorrelation coefficient: r = 0.998932, r^2 = 0.997865Calibration curve: 192.858 * x + 423.057Response type: External Std, AreaCurve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

1005151

2012 Waters Corporation 21

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500 3750 4000 4250 4500 4750 5000pg/l0

Response

ReprodutibilidadeReprodutibilidade

Robustness study of the Quattro Premier using verapamil in ESI +ve

350000

400000

Injeo de 200 amostras em um perodo de 24hr

2012 Waters Corporation 22

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Number of Injections

Peak Area CV= 3.0%

FaixaFaixa DinmicaDinmica

Faixa de deteco entre o limite de deteco e a saturao do sinal.

10000

1000 4 ordens de magnitude (104)

Saturao do sinal do instrumento A

2012 Waters Corporation 23

100

10

1

2 ordens de magnitude (102)

3 x rudo do detector (LOD)

Saturao do sinal do instrumento B

Instrumento A - faixa dinmica de 4 ordens de magnitude (104)Instrumento B - faixa dinmica de 2 ordens de magnitude (102)

2012 Waters Corporation 24

Instrumentao

Espectrmetro de MassasEspectrmetro de Massas

Fonte de ons Analisador Detector

Alto vcuo 10-5-10-8 mbar

Sistema de dados

Sistema de

2012 Waters Corporation 25

QuadrupoloTOFIon trapFT-ICRSetor Magntico

FotomultiplicadorMultiplicador de eltronsMicrochannel Plate

ESI*APCI*MALDIEICI

*Fonte de ons a presso atmosfrica

insero

HPLCGCBomba seringa

2012 Waters Corporation 26

Instrumentao Fontes de Ionizao

FonteFonte de de onsons

A fonte de ons gera ons em fase gasosa a partir de molculas em fase slida, lquida ou gasosa (dependendo da fonte).

A ionizao pode gerar ons positivos e/ou negativos. As formas principais de ionizao so:

1) Ejeo ou captura de eltrons comum nas fontes de ons EI, CI e FI