introduo ao acoplamento cromatografia lquida ao acoplamento cromatografia lquida –espectrometria...

Download Introduo ao Acoplamento Cromatografia Lquida ao Acoplamento Cromatografia Lquida –Espectrometria de Massas XVII MET –Encontro Nacional sobre Metodologia e Gesto de Laboratrios

Post on 03-Apr-2018

215 views

Category:

Documents

1 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

  • Introduo ao Acoplamento Cromatografia Lquida Espectrometria de Massas

    XVII MET Encontro Nacional sobre Metodologia e Gesto de Laboratrios da Embrapa

    2012 Waters Corporation 1

    Pirassununga, 24-25 de Outubro de 2012.

    Amadeu Hoshi IglesiasEspecialista de Aplicaes em Espectrometria de Massas

    amadeu_iglesias@waters.com

  • AgendaAgenda

    Conceitos e Fundamentos de Espectrometria de Massas

    Instrumentao

    Espectrometria de Massas Sequencial

    2012 Waters Corporation 2

    Acoplamento LC MSMS

    Desenvolvimento de Mtodos Quantitativos por LC MS e LC -

    MSMS

    Screening com Tof

  • Conceitos e Fundamentos de

    2012 Waters Corporation 3

    Conceitos e Fundamentos de Espectrometria de Massas

  • EspectrometriaEspectrometria de de MassasMassas

    Tcnica analtica para:

    identificao de compostos desconhecidos

    quantificao de compostos conhecidos.

    Sensibilidade: Substncias podem ser detectadas com quantidadesmnimas de amostra (10-12 g, 10-15 mol pra um composto de massa1000 Daltons.

    2012 Waters Corporation 4

    1000 Daltons.

    Seletividade: Substncias podem ser identificadas e quantificadas emconcentraes muito baixas (uma parte em 1012) em misturascomplexas.

  • DefinioDefinio IUPACIUPAC

    Espectrometria de Massas:

    Estudo de sistemas pela formao de ons em fase gasosa, com ou sem fragmentao, que so caracterizados por suas relaes massa carga e

    abundncias relativas.

    2012 Waters Corporation 5

  • UnidadesUnidades emem um um espectroespectro de de massasmassas

    m/z = relao massa/carga

    Daltons (Da) = u = unidade de massa atmica

    Thomson (Th) = m/z 100

    2012 Waters Corporation 6

    m/z = Da/z = Th

    m/z

    Ion abundance (%)

    60

    40

    80

    20

  • EspectroEspectro de de massasmassas

    Pico base (ion 100%)Pico base (ion 100%)

    100

    Pico do on molecularPico do on molecular(Precursor)(Precursor)

    ons fragmentoons fragmento

    2012 Waters Corporation 7

    Ion abundance (%)

    m/z

    60

    40

    80

    20

    IstoposIstopos

  • IstoposIstopos

    100243.09

    Flurbiprofen (M+H)

    100292.02

    Thiomethoxam (M+H)

    2012 Waters Corporation 8

    m/z243 244 245

    %

    0

    244.09

    m/z292 293 294 295 296 297

    %

    0

    294.02

    293.03

    295.02

    C15 H13 O2 F C8 H10 N5 O3 S Cl

  • RazoRazo de de IstoposIstopos

    Elemento Isotopo Abundncia Relativa

    +1 Isotopo Abundncia Relativa

    +2 Isotopo

    Abundncia Relativa

    Carbono 12C 100 13C 1.11

    Hidrognio 1H 100 2H 0.016

    Nitrognio 14N 100 15N 0.38

    Oxigenio 16O 100 17O 0.04 18O 0.20

    Enxofre 32S 100 33S 0.78 34S 4.40

    2012 Waters Corporation 9

    Cloro 35Cl 100 37Cl 32.5

    Bromo 79Br 100 81Br 98.0

    http://www.webelements.com/

  • EspectroEspectro de de massasmassas

    H H

    O

    H = 1 Da O = 16 Da

    H2O = 18 Da

    C C

    H

    H

    HH

    H

    H

    O

    C C

    H

    H

    HH

    H

    H

    O

    H = 1 DaO = 16 Da C = 12 Da C2H6O = 46 Da

    2012 Waters Corporation 10

    46m/z

    intensidade

    18m/z

    intensidade

    18 46

    intensidade

    m/z

    Mistura gua + metanolMistura gua + metanol

    Grfico m/z x Intensidade inica

  • EspectroEspectro de de massasmassas

    NO

    O

    OO

    CH3CH3

    CH3CH3 CH3

    CH3

    N CH3

    CH2

    +

    O

    O

    CH3

    CH3

    Substncia intacta

    O

    CH3

    CH3 CH3

    CH3

    2012 Waters Corporation 11

    C+

    C

    O

    CH2

    O

    CH3

    O

    O

    CH2

    +

    CH3

    CH3

    CH3

    N CH3

    NO

    CH2

    +

    O

    CH3CH3

    3

    CH3

    N CH3

    ons precursor e fragmentos

  • ModosModos de de AquisioAquisio

    Hemoglobin

    %

    auto01 4 (0.690) Sm (SG, 1x2.00); Cm (3:4) TOF LD+ 3.17e31529.826

    1530.830

    1531.835

    Contnuo

    2012 Waters Corporation 12

    m/z1528 1529 1530 1531 1532 1533 1534 1535

    %

    19

    5

    1531.835

    1532.806

    auto01 4 (0.690) Cn (Cen,1, 80.00, Ar); Sm (SG, 1x2.00); Cm (3:4) TOF LD+ 7981529.816

    1530.824

    1531.835

    Centride

  • CromatogramaCromatograma

    Pesticide Mix

    100

    %

    0

    100

    %

    pest03 1: Scan ES+ TIC

    5.77e65.054.65

    3.820.74

    8.625.65

    8.0210.62

    12.71

    pest03 1: Scan ES+ 229

    2.08e64.65

    TIC (Total ion Chromatogram)

    Cromatograma m/z 229

    2012 Waters Corporation 13

    1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00Time0

    100

    %

    0

    100

    %

    0

    %

    pest03 1: Scan ES+ 217

    8.23e55.10

    pest03 1: Scan ES+ 199

    1.51e65.64

    Cromatograma m/z 217

    Cromatograma m/z 199

  • Principais caractersticas que devem ser consideradas em umespectrmetro de massas:

    Sensibilidade

    Exatido e preciso na medida de massas

    Resoluo

    Parmetros AnalticosParmetros Analticos

    2012 Waters Corporation 14

    Resoluo

    Faixa dinmica

    Linearidade

    Reprodutibilidade

    A importncia de cada parmetro depende da aplicao

  • SensibilidadeSensibilidade

    Medida como o valor de relao sinal/rudo para um padro especfico, em uma dada concentrao.

    2012 Waters Corporation 15

  • ResoluoResoluo

    100%

    50%

    = 500

    Largura do pico ( 50%) = 0.05Da

    Resoluo (FWHM) = 500 = 10000

    Relao massa/carga

    2012 Waters Corporation 16

    500.0 500.1499.9

    50%

    0.05 Da

    m/z

    0.05

    FWHM = Full Width Half Maximum

  • ExatidoExatido de de massamassa

    A exatido da medida calculada como a diferena (erro) entre a massa medida (experimental) e a massa terica.

    A exatido de massas medida em

    miliDaltons (1mDa = 0.001 unidades de massa)

    ou

    ppm = partes por milho = m/m x 106

    2012 Waters Corporation 17

    ppm = partes por milho = m/m x 106

    Exemplo:

    Massa real = 400.0000

    Massa medida = 400.0020

    Diferena = 0.0020 ( 2 mDa)

    0.0020.002

    400400x 106x 106Erro em ppm =Erro em ppm = = 5 ppm= 5 ppm

  • ExatidoExatido de de massamassa

    Massa nominal e massa exata de alguns elementos

    Massa Nominal Massa Exata

    Carbono 12 12.0000

    Hidrognio 1 1.0078

    Oxignio 16 15.9949

    Nitrognio 14 14.0031

    2012 Waters Corporation 18

    Nitrognio 14 14.0031

    Massa nominal e exata de algumas molculas

    Massa Nominal Massa Exata

    C8H7NO+ 133 133.05276

    C9H11N+ 133 133.06400

    C9H7N3+ 133 133.08915

  • ResoluoResoluo e e ExatidoExatido de de massamassa

    A resoluo de um quadrupolo no suficiente para diferenciar estes dois compostos.

    2012 Waters Corporation 19

    Dados de ToF com resoluo >10,000, mostra claramente dois picos distintos.

    A massa destes picos pode ser medida com exatido < 5ppm

  • ClculoClculo parapara composiocomposio elementalelemental

    Tolerncia 5 ppm Tolerncia 50 ppm

    2012 Waters Corporation 20

    Tolerncia 5 ppm Tolerncia 50 ppm

    30 possibilidades!3 possibilidades

  • LinearidadeLinearidade

    Curva de calibrao em uma faixa de 0.5 to 5000pg/L na colunaR2 = 0.9978Compound name: verapamilCorrelation coefficient: r = 0.998932, r^2 = 0.997865Calibration curve: 192.858 * x + 423.057Response type: External Std, AreaCurve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

    1005151

    2012 Waters Corporation 21

    0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500 3750 4000 4250 4500 4750 5000pg/l0

    Response

  • ReprodutibilidadeReprodutibilidade

    Robustness study of the Quattro Premier using verapamil in ESI +ve

    350000

    400000

    Injeo de 200 amostras em um perodo de 24hr

    2012 Waters Corporation 22

    0

    50000

    100000

    150000

    200000

    250000

    300000

    0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

    Number of Injections

    Peak Area CV= 3.0%

  • FaixaFaixa DinmicaDinmica

    Faixa de deteco entre o limite de deteco e a saturao do sinal.

    10000

    1000 4 ordens de magnitude (104)

    Saturao do sinal do instrumento A

    2012 Waters Corporation 23

    100

    10

    1

    2 ordens de magnitude (102)

    3 x rudo do detector (LOD)

    Saturao do sinal do instrumento B

    Instrumento A - faixa dinmica de 4 ordens de magnitude (104)Instrumento B - faixa dinmica de 2 ordens de magnitude (102)

  • 2012 Waters Corporation 24

    Instrumentao

  • Espectrmetro de MassasEspectrmetro de Massas

    Fonte de ons Analisador Detector

    Alto vcuo 10-5-10-8 mbar

    Sistema de dados

    Sistema de

    2012 Waters Corporation 25

    QuadrupoloTOFIon trapFT-ICRSetor Magntico

    FotomultiplicadorMultiplicador de eltronsMicrochannel Plate

    ESI*APCI*MALDIEICI

    *Fonte de ons a presso atmosfrica

    insero

    HPLCGCBomba seringa

  • 2012 Waters Corporation 26

    Instrumentao Fontes de Ionizao

  • FonteFonte de de onsons

    A fonte de ons gera ons em fase gasosa a partir de molculas em fase slida, lquida ou gasosa (dependendo da fonte).

    A ionizao pode gerar ons positivos e/ou negativos. As formas principais de ionizao so:

    1) Ejeo ou captura de eltrons comum nas fontes de ons EI, CI e FI

Recommended

View more >