hplc – cromatografia líquida de alta eficiência pronta

HPLC – CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

DQI - Química Analítica Instrumental II

LAVRAS 2013

Alexandre Alves de CastroMaisa Carla Ragozoni Pereira

Introdução

Nas indústrias químicas,

farmacêuticas, alimentícias,

refinarias, petroquímicas,

laboratórios de análises

clínicas, ambiental e forense;

Frequentemente é necessário

separar, isolar, purificar,

identificar e quantificar os

componentes de misturas

muitas vezes bastante

complexas.

Introdução

Definição de cromatografia:

Conjunto de técnicas de separação cujo

princípio depende da distribuição diferenciada

de um dos componentes de uma mistura entre

duas fases, uma considerada estacionária, e a

outra, móvel;

A natureza química e física dos componentes da

mistura definem o grau de afinidade entre as

duas fases, acontecendo o fenomeno de

migração diferencial.

Introdução

HPLC

Do ingles HPLC- High Performance Liquid

Chromatography. É também conhecida como:

Cromatografia Líquida de Alta Performance, de

Alta Pressão ou de Alto Desempenho;

É uma técnica ultra-microanalise podendo,

dependendo da substância e do detector

empregado, quantificar massas inferiores a 10-18

g.

Descrição Geral da HPLC

A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatográfica preenchida com a fase estacionária (FE);

Um solvente (FM) é bombeado com vazão constante e desloca os componentes da mistura através da coluna;

Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma.

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Conceitos Fundamentais da HPLC

Operação pela qual uma mistura é dividida em pelo menos duas frações com diferentes composições;

É obtida por meios físicos embora reações químicas possam ser envolvidas no processo;

Os métodos físico-químicos de separação são baseados na utilização de alguma propriedade física das substâncias a serem separadas.

Conceitos Fundamentais da HPLC

Importância da cromatografia: Velocidade; Poder de resolução; Manuseio de pequenas quantidades de amostra (10-9

– 10-15g); Simplicidade da técnica.

Objetivo: Separar individualmente os diversos constituintes de

uma mistura de substâncias seja para identificação, quantificação ou obtenção da substância pura para os mais diversos fins.

Instrumentação em HPLC

Fase Móvel

A fase móvel não pode conter partículas para evitar danos à bomba, injetor e coluna;

A escolha do filtro é função da natureza da fase móvel;

A fase móvel deve ser degaseificada;

As técnicas de degaseificação são: refluxo com resistência de aquecimento; vácuo (trompa d’água); purga com hélio; uso de membrana semipermeável.

Fase Estácionária

Basicamente são dois tipo de FE: Pelicular:Consiste de leito de polímero ou vidro não-

poroso,esférico, com diâmetros típicos da ordem

de 30 a 40mm, recoberto com uma camada fina e

porosa de: Sílica; Alumina; Resina de poliestireno-divinil-benzeno; Resina catadora de íons.

Fase Estácionaria

Partícula Porosa: Consiste em micropartículas porosas com

diametros de 3 a 10 mm. As partículas são constítuidas dos mesmos materias do recobrimento pelicular;

Quanto MENOR for a partícula, MAIOR será a eficiência na separação.

Partículas menores reduzem a distancia de contato do soluto com as FE e FM, facilitando o equilíbrio, e consequentemente melhorando a eficiência da coluna.

Fase Estácionaria

De acordo com as fases móvel e estacionária pode-se classificar o processo basicamente como:

Cromatografia em fase normal: a fase estacionária utilizada é polar e a fase móvel é apolar, em relação a eluição, os solutos mais apolares são eluídos primeiramente, enquanto que os polares são retidos pela fase estácionaria e são eluídos depois;

Cromatografia em fase reversa (FR): a fase estacionária é apolar e a fase móvel polar, portanto os compostos polares são eluídos primeiro e os mais apolares eluídos posteriormente.

Bomba

Principais características da

bomba: Leva a fase móvel desde o

reservatório até a coluna; Deve operar a pressões de até

500 atm com a mesma precisão e exatidão de operações a pressão quase ambiente;

Devem ser constituídas de material inerte;

Alta resistência à corrosão – inércia química a solventes comuns;

As vazões normalmente empregadas vão de 0,005 até no máximo 4 ou 5ml/min.

Bombeamento por Gradiente

Alteração da composição da fase móvel, sem alteração da vazão total;

O bombeamento por gradiente pode ocorrer à baixa pressão ou a alta pressão;

Bombeamento por gradiente baixa pressão:

Bombeamento por Gradiente

Bombeamento por gradiente alta pressão:

Injetor

Uso de válvulas especiais que permitem introdução com grande precisão e exatidão de volumes que variam, em geral, de 5 a 20µl;

A amostra é introduzida na válvula com auxílio de uma microseringa com agulha sem ponta;

A injeção é efetuada pela rotação da válvula da posição de carga para a posição de injeção.

Colunas Cromatográficas

Na HPLC podem ser usados três tipos de colunas:


Coluna de saturação: É colocada entre a bomba e o

injetor sendo usada para condicionar a fase estácionaria;

Empregada com finalidade de saturar a FM com o líquido da FE.


Coluna de guarda: É colocada entre o injetor e a

coluna analítica, esta possui de 2 a 5 cm;

É utilizada para prevenir impurezas e compostos fortemente retidos;

Satura rapidamente; Aumenta o tempo de vida útil

da coluna analítica; O custo das diversas trocas

dessas coluna ainda é menor do que uma nova coluna analítica.


Coluna de separação: Responsável pela separação dos componentes da

amostra. Podem ser separadas em colunas analíticas e colunas preparativas.


Coluna preparativa: Cromatografia de filtração em gel- separação,

isolamento e purificação de proteínas.

Coluna analítica: Permitem a separação de pequenas quantidades

do material a ser analisado; São constituí das de um tubo de algum material

inerte. O aço inoxidável é o material mais frequentemente utlizado;


Os tubos das colunas são preenchidos com a fase estacionária conveniente, geralmente sílica ou seus derivados;

Tem diâmetro interno uniforme, capaz de resistir às pressões em que será usada;

São normalmente retas, pois apresentam perda na eficiência quando são dobradas.

A coluna deve ser guardada em solvente orgânico ou FM.

Detector

Dispositivos que examinam continuamente o material elúido, gerando sinal quando da passagem de substâncias;

Um detector ideal deve possuir as seguintes características:

Alta sensibilidade; Estabilidade; Reprodutibilidade; Resposta linear; Resposta rápida aos analíticos; Não contribuir para o alargamento do pico; Confiabilidade

Detector

Falicidade do manuseio; Não destrutivo; Seletividade.

Tipos de detectores:

Os principais detectores utilizados em HPLC são: Índice de refração; Espectrofotometira UV-Visível; Fluorescência; Eletroquímico; Espectrometria de massa LC/MS.

Aquisição de dados

Atualmente utilizam-se softwares que permitem: Processar os dados de cromatograma;

Armazenar e registrar;

Controlar a composição da fase móvel (isocrática e por gradiente), vazão da bomba,amostrador automático, temperatura da coluna;

Realizar cálculos para “System Suitability Test” (SST).

Vantagens e Desvantagens

Vantagens: Não necessita que a amostra seja volátil

( requisito da CG); Tempo reduzido da análise; Alta resolução; Boa detectabilidade e bons resultados quali e

quantitativos.

Desvantagens: Alto custo do equipamento e manutenção; Não existe um detector universal com boa

detectabilidade e baixo custo: Índice de refração: baixa detectabilidade(10 -6 g), pouco

estável.

Espectrômetro de massas: ~ US$ 150.000

Aplicabilidade

Dicas do que não fazer em HPLC Lavar um sistema com tampão usando orgânico

puro: precitiação; Injetar amostras que podem precipitar a fase

móvel: testar miscibilidade; Usar HCl, H2SO4 CCl3 em sistema de aço inox:

corrosão do sistema; Usar fita Teflon para vedar as conexões: sem

efeito e pode causa entupimento; Deixar o sistema parado com a fase móvel

contendo tampão ou acidos/bases fortes: cristalização= danificação dos selos da bomba, injetor, entupimento do detector.

Referências

HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis – George Lunn – Norman Schmulf – Wiley Interscience – 1997 (1632 pag.) – ISBN 0471181765.

HPLC Methods for Recently Approved Pharmaceuticals – George Lunn – Wiley 2005 (717 pag.) – ISBN 9780471669418.

HPLC for Pharmaceutical Scientists – Yuri Kazakevich – Rosario Lobrutto –Wiley Jan 2007(1104 pag.) – ISBN 9780471681625.

HPLC Made to Measure – Stravos Kromidas – Wiley – 2006 –ISBN 352731377X.

Validation Chromatographic Methods – A Practical Guide – David M. Bliesner Wiley 2006 – (304 pag.) – ISBN 9780471741473.

HPLC Practical and Industrial Applications – Joel Swadesh. Modern HPLC for practicing scientists – Michael W.Dong – Wiley Interscience –

2006. HPLC – A practical user’s guide – Marvin C. McMaster – John Wiley & Sons –

2007. Fundamentos da Cromatografia a líquido de alto desempenho – REMOLO

CIOLA-, ed. Edgard Blucher, 1998, 1ª Ed. The Reporter, Optimizing HPLC Separations

http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.htl

Pharmaceutical Technology, ed. Brasileira, vol. 2, número 3, junho 1998, Validação de métodos cromatográficos, pág. 12.

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