Conhecimentos bsicos sobre HPLCProf. Mrcio FerrariniProf. Svio Fujita Barbosa

H - HighP - PerformanceL - LiquidC - Cromatograph

C CromatografiaL LquidaA AltaE Eficincia

Mtodos de anlise disponveis atualmenteSeletivosMtodos de anlisePouco EspecficosSeparao de potenciaisinterferentes e molculasde interesse - analitoAnalito

Introduo s Separaes CromatogrficasSeparao de potenciaisInterferentes ou substncias semelhantesAmostrasMulticomponentesComplexas

AplicaesSeparao de cidos NuclicosPoluentesTxicosControle de QualidadeBioequivalnciaIdentificao deMetablitosPesticidasSeparao decompostos

Separao de substncias de interesse e produtos de degradaoguaCH3COOH

Pesquisa de ImpurezasLEVOTIROXINALIOTIRONINA - 20 x mais potente

Introduo s Separaes CromatogrficasSeparao de clorofila e xantofilaColuna de vidro Empacotada com carbonato de clcio finamente divididoEspcies separadas formao de bandas coloridasOrigem ao nomeChroma corGraphein escrever

Mikhail Tswett

O que Cromatografia?Tcnica fsico-qumica de separao!Migrao diferencial dos componentes de uma mistura de acordo com a partio de suas molculas em duas fases de diferentes caractersticas.

O que partio?PartioDistribuio das molculas de uma substncia entre 2 fases com caractersticas diferentes

LEOGUA

Fases na cromatografiaFase mvelLquida Cromatografia lquidaGasosa Cromatografia gasosaFase estacionriaColunaCamada DelgadaAmostraDistribu-se entre as fases

Separaes cromatogrficasTransportada por uma FASE MVELLquido ou gsForada atravs de uma FASE ESTACIONRIAImiscvel e FixaCromatografia liquidaCromatografia gasosaAmostraColunaCamada Delgada

Cromatografia Em Camada Delgadahttp://www.uni-regensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D-TLC_lipophilic_dyes-e.htm

Cromatografia Lquidahttp://orgchem.colorado.edu/hndbksupport/colchrom/colchromprocmicroflash.html

Mecanismo de separaes cromatogrficas

Cromatografia LquidaPrimeiros trabalhosColunas de vidro 50 a 500 cmPartculas da fase estacionria 150 a 200 mAssegurar vazes razoveisTempo de separaoLongo Vrias horasMelhorar o processoAplicao de bombas de vcuoBombeamentoPerda da eficincia

Cromatografia Lquida de Alta EficinciaAumento da eficincia:Diminuio dos tamanhos das partculas da fase estacionriaFinal 1960 Partculas 3 a 10 mEsta tecnologia exigiuEquipamentos sofisticados operando a altas pressesDiferentes das colunas de vidroFluxo por gravidadeHPLCHigh Performance Liquid Cromatography

Escopo do HPLCHPLC ou CLAETcnica analtica de separao mais utilizada 1bilho de dlares anuaisShimadzuR$ 169.500,00

Escopo do HPLCPopularidadeSensibilidadeDeterminao quantitativa acuradaSeparao de espcies no volteisSeparao de espcies termolbeis

Classificao dos MtodosDuas classificaes:Meio fsico na qual as fases estacionria e a fase mvel entram em contatoCromatografia em colunaCromatografia planarCCL- cromatografia de camada delgadaBaseia-se Fase mvel Fase estacionriaTipos de equilbrio

Classificao dos Mtodos

Cromatografia de fase ligadaBaseia-se:Distribuio das molculas do analitoEntre 2 fases uma lquida e a outra slidaDe acordo com a afinidade relativaFase estacionria quimicamente ligada a superfcie do suporteSlica rgida

Cromatografia de fase ligadaDividida de acordo com as polaridades das fases estacionrias e mvelFase normalFase reversa

Fase normalFase estacionria Altamente polarSlicaFase mvel ApolarHexanoClorofrmioter isoproplico

Fase reversaFase estacionria Apolar Slica + HidrocarbonetosFase mvel PolarguaMetanolAcetonitrilaAplicao Universal de todos os teste de HPLCQuase todas as molculas orgnicas possuem regies hidrofbicas e por isto interagem com a fase estacionria.

Fase normal X Fase ReversaFase normalComponente menos polar eluido primeiro por ser mais solvel na fase mvelAumento da polaridade na fase mvel diminui o tempo de eluioFase reversaComponente mais polar eluido primeiroDiminuio da polaridade da fase mvel diminui o tempo de eluio

Cromatografia de partioCromatografia de par inico (pareamento de ons)Separao de espcies inicasFase mvelTampo aquosoSolvente orgnico (metanol ou acetonitrila)Composto inicoContra on de carga oposta a do analitoFormao de um par inicoEspcie neutra retida na coluna de fase reversaEx: CoranteContra on (C4H9)4N+

Cromatografia com Fases Estacionrias QuiraisSeparar ismeros opticamente ativosEnantimerosColunaSuporte de slica gelIsmeroOpticamente ativoLigado por um polmero.

Cromatografia de AdsoroCromatografia lquido-slidoFase estacionriaAdsorvente slido finamente divididoAluminaCarvoSlica

Cromatografia de AdsoroFase mvelQuanto mais forte for a interao entre fase mvel e estacionria, mais fraca ser a adsoro do analito.

Cromatografia de troca inicaSeparao e determinao de ons com base em resinas trocadorasProcesso de troca inicaEquilbrio de troca entre ons em soluo e ons de sinal oposto na superfcie de um slido.Trocadores de ons naturaisArgila e zelitasResinas trocadoras sintticas

Cromatografia de troca inicaStios ativos mais comunsResinas trocadoras de ctionsSO3- H+ grupo cido sulfnicoCOO- H+ grupo cido carboxlicoResinas trocadoras de nionsN(CH3)3+ OH- grupo de aminas terciriasNH3+ OH- grupo de aminas primrias

Cromatografia de troca inicaPoliestirenoxRSO3-H+ + M x+(RSO3-)x Mx+ + xH+SlidosSlidosSoluoSoluo

Cromatografia por Excluso de TamanhoPermeao em gel ou filtrao em gelAplicada a espcies de alto peso molecularSeparao por peso molecularColunaPartculas pequenas 10m de slica ou de polmeroPoros uniformes nos quais molculas de soluto e solvente se difundem

Cromatografia por Excluso de Tamanho

Mas qual o significado de HPLC?

HPLC ou CLAE um equipamento altamente sofisticado e automatizado e para que possamos entender um pouco mais sobre ele de extrema importncia sabermos quais so os princpios qumicos que norteiam seu funcionamento.O principal fundamento qumico a cromatografia lquida

Por que atualmente nas reas de pesquisa bioqumica, biotecnologia, biomedicina, alimentcia, nas empresas farmacuticas e cosmticas exigem o conhecimento sobre HPLCAtualmente a grande maioria dos mtodos analticos disponveis so altamente Seletivos apresentam seletividade para analisar determinada substncias (protena, alcalides, princpio ativo)Pouco especficos apesar de serem seletivos sofrem interferncia de outras substncias.A grande questo que grande parte das analises realizadas nestes campos so feitas em amostras que no so puras ou que so formadas por diversas substncias (Veneno de cobra, componentes de um extrato de uma planta, o princpio ativo de um comprimido ou de um creme produtos de degradao). Desta forma, existe a grande necessidade de separar do seu analito as outras substncias que so potenciais interferentes ou as quais apresentamos interesse.

Dentre os diversos mtodos de separao disponveis atualmente a cromatografia considerado o mtodo mais eficiente.Permitem separar componentes semelhantes de mistura complexaSeparaes impossveis por outros meiosBioqumica separao de cidos nuclicosQumica separao de compostosFarmacutica controle de qualidade/bioequivalncia Botnica identificao de metablitosAlimentcia extrao de leos essenciaisAmbientais poluentesForense txicos e doping

Incio do sc 20Separao de clorofila e xantofilaColuna de vidro empacotada com carbonato de clcio finamente divididoEspcies separadas formao de bandas coloridasOrigem ao nomeChrona corGraphein escrever

AmostraTransportada por uma fase mvelLquido solventes aquosos ou orgnicosGs inerte H, N e hlioForada atravs de uma fase estacionriaImiscvel e fixaColuna/Superfcie slida

Componentes da amostra se distribuam entre as fases mvel e estacionria em vrios grausComponentes fortemente retidos na fase estacionria Movem-se muito lentamente no fluxo da fase mvelComponentes que se ligam fracamente a fase estacionriaMovem-se mais rapidamenteConseqncia dessas diferenas na mobilidade:Os componentes da amostra se separam em bandas ou zonas que podem ser analisadas qualitativa e ou quantitativamente

Tipo de cromatografia de partio por fase reversaAs molculas da fase mvel competem pelos stios de adsoro polar da fase estacionria com as molculas do analito