CROMATOGRAFIA

Cromatografia: insieme di tecniche che consentono di separare composti chimici, componenti in campioni complessi e miscele, ai fini di un’analisi sia qualitativa che quantitativa.

Cenni storici: nasce nel 900, grazie aL botanico di origine russa M. Tswett che coniò il termine cromatografia, dal greco “kroma”: colore, “graphein”: scrivere”. Alla lettera: “ scrittura del colore”. Riuscì infatti a separare i pigmenti fogliari mediante una colonna di vetro impaccata con una matrice solida.

campione t1 t2 t3

Sistema di rivelazione

Ripartizione differenziale tra fase mobile e fase stazionaria : K(r) = Cs/Cm

Separazione: principio di ripartizione tra due fasi ,

FASE MOBILE e fase fissa, FASE STAZIONARIA.

L’evoluzione di questa tecnologia, basata su uno schema alla base semplicissimo, ha dato origine a metodiche altamente diversificate e versatili per consentire la separazione ottimale di composti specifici o gruppi di composti, con caratteristiche chimiche vicine, contenuti nei campioni da analizzare.

Separare/identificare/quantificare molecole di varia natura e origine in campioni biologici, fluidi corporei o cellule, estratti di plasma, siero

e tissutali - miscele molto complesse

CROMATOGRAFIA E CHIMICA CLINICA

•endogene: neurotrasmettitori, ormoni, metaboliti; ex.: catecolamine(noradrenalina, dopamina, etc..); ormoni steroidei (ex. neurosteroidi) ; metaboliti (ex. amino acidi, basi azotate e nucleotidi, colesterolo); peptidi; ex.: neuropeptidi (vasopressina, ossitocina, etc..); glutatione (tripeptidi).. •esogene: farmaci, sostanze tossiche, inquinanti organici, nutrienti, ex: antidepressivi, antitumorali – monitoraggio terapeutico; pesticidi, ftalati – tossicologia; vitamine, luteina –monitoraggio stato nutrizionale.

Molecole a basso PM: ~ ≤ 1500 Da:

Molecole a moderato PM: ~ 2000 ≤ PM ≤ 5000 Da

•endogene: peptidi antimicrobici – difese innate (ex. defensine); peptidi intestinali e dell’appetito (NPY, etc..) ; polisaccaridi a medio PM; lipidi •esogene: peptidi microbici o di origine infettiva –microbiologia ; beta-glucani - nutrizione

Molecole ad alto PM: > 5000 Da

endogene: macromolecole , proteine, acidi nucleici, zuccheri in fluidi corporei e tessuti etc.. - ricerca clinica esogene: macromolecole di origine esogena – ricerca clinica

Classificazione della CROMATOGRAFIA: in base alla forma del supporto cromatografico che contiene la

fase stazionaria e in base allo stato fisico della fase mobile

Cromatografia su colonna - stato fisico fase mobile: •Cromatografia Liquida (Liquid Chromatography , LC) •Gas cromatografia (Gas Chromatography, GC) •Cromatografia Supercritica (Supercritical Fluid Chromatography, SFC)

Supporto cromatografico – fase stazionaria: •Cromatografia planare: su strato sottile, su gel o su carta (Thin-Layer Chromatography, TLC; Paper Chromatography); •Cromatografia su colonna: colonna contenente la fase stazionaria, una matrice di varia natura in base al tipo di cromatografia

-Adsorbimento - ripartizione Siti attivi sulla fase stazionaria, trattenimento selettivo delle molecole da separare nel campione o nella miscela. Idrofobicità-polarità delle molecole da separare, della fase mobile e della fase stazionaria. Fase normale – fase inversa.

-Scambio ionico Presenza di cariche sulla fase stazionaria e competizione tra molecole ioniche del campione da separare e della fase mobile . Forze elettrostatiche – resine a scambio ionico/cationico e anionico.

-Esclusione Gel filtrazione, permeazione. Matrice inerte. Separazione in base al peso molecolare.

-Affinità fase stazionaria inerte coniugata con molecole-ligandi che legano in modo specifico le molecole da separare. Ex.: Reazione Antigene- anticorpo. Separazione e purificazione di macromolecole biologiche.

Cromatografia Liquida su colonna : classificazione

Applicazioni prevalenti in base al PM e polarità o carica degli analiti da separare

Cromatografia preparativa ; cromatografia analitica

Idrofobici Idrofilici

Apolari Ionici

Polari non ionici

adsorbimento

ripartizione

scambio ionico

fase inversa C4-C18

fase normale

esclusione

gel permeazione gel filtrazione

102

103

104

105

106

Polarità

affinità

Distinzione in base al meccanismo di separazione :

Pes

o m

ole

cola

re (

Da)

CROMATOGRAFIA SU COLONNA a pressione atm

Raccolta di frazioni, rivelatore

Lavorando a pressioni molto più elevate della pressione atmosferica, ex. 1200 psi , ha migliorato la prestazione della cromatografia e la quantificazione di molte sostanze in tempi molto più brevi.

HPLC

Sign

al

Time, min 1 2 3 4 5 6 7 8

3000

2500

2000

1500

1000

500

0

Ap TR

T’R

Linea di base

TM

H

WH

Wb Fs

H/2

IL CROMATOGRAMMA E IL PICCO ANALITICO Caratteristiche salienti

del picco analitico

Ap= Apice del picco;

H= Altezza del picco, distanza tra la linea di base e A; H/2: metà

altezza del picco; segnale del rivelatore

W1/2: Ampiezza del picco

(min), presa a H/2; Wb: Ampiezza alla base

del picco (min), presa alle tangenti dei punti di

flesso alla base dl picco.

Caratteristiche del cromatogramma: Fs = Fronte del solvente; TM: o t0, definizione: tempo morto o tempo necessario affinché una molecola non trattenuta dalla fase stazionaria attraversi V0= volume morto della colonna; TR: tempo di ritenzione della sostanza (analita): TM + T’R = TR, dove T’R = distanza tra Fs e punto intersezione della perpendicolare da Ap sulla linea di base.

BASI TEORICHE: equazioni che definiscono le caratteristiche di ELUIZIONE, RISOLUZIONE e SIMMETRIA dei picchi degli analiti.

Efficienza della colonna analitica: Piatto teorico: sezione di colonna che è in grado di creare un

equilibrio di ripartizione tra le due fasi degli analiti . Ampiezza del picco Wb e TR : N= 16 (TR/Wb), dove N= numero di piatti teorici , espresso anche come altezza del piatto teorico H =

L/N, con L = lunghezza della colonna (cm); da cui: N= L/H Neff = 16 (T’R/Wb)2 , formula del numero di piatti teorici effettivi.

Formula considerando W1/2 Neff = 5.55 (W1/2/ T’R)2

Altezza di un piatto teorico effettivo: H = L/Neff o L/16 (Wb/T’R)2 più è piccola, più i picchi sono

stretti e meglio risolti. Equazione che definisce i piatti teorici in funzione dei tempi di rit.

CARATTERISTICHE DI ELUIZIONE E RISOLUZIONE

Fattore di capacità: K’ = (V – V0/V0) oppure (t-t0/t0), dato dal grado di ripartizione tra fase stazionaria e fase mobile

Equazione di Van Deemter (LC/HPLC): allargamento del picco

H= A/(1 + Cm/u1/2) + B/u + Csu + Cmu1/2 H = altezza piatto teorico ed efficienza colonna; più H è un valore

basso tanto più l’efficienza della colonna è elevata

A = Diffusione di Eddy o diffusione “erratica” : delle molecole trasportate nella fase mobile; queste possono seguire percorsi diversi, ex. lineari o tortuosi; B= Diffusione longitudinale; dispersione delle molecole rispetto al flusso della fase mobile; a bassi flussi ha un peso nell’equazione: B/u; Cs , Cm = Diffusione data dall’affinità differenziale di una molecola per la fase mobile o per la fase stazionaria; effetto maggiore quanto più è veloce il flusso della fase mobile: Csu e Cmu1/2, specie per Csu. Cs= d2 spessore/Ds; Cm= d2impaccamento/Dm

u= velocità lineare della fase mobile; A, B e C: fattori che concorrono all’allargamento del picco e alla diminuzione dei piatti teorici;

B/u

Csu

Risoluzione dei picchi e selettività:

Fattore di asimmetria - Tailing factor:

Risoluzione =

(Δtr/Wm) = 0.589 Δtr/Wm1/2

Fattore di asimmetria

≥ 1.5

TF = AB/2AC

fronting

tailing

5%H . . . A B C

Picchi simmetrici

H/2

H

min min

min

≈ 1.0

CARATTERISTICHE DI SIMMETRIA

Alta velocità, alta produzione , alta risoluzione analitica

Colonne analitiche e sistemi U(H)PLC e nano-HPLC:

Potenziamento tecnologico del sistema

Colonne analitiche con caratteristiche chimico-fisiche peculiari

Rivelatori ad alte prestazioni

High Performance/Pressure - Liquid Chromatography cromatografia liquida ad alta prestazione/pressione

Principali tipi di rivelatore:

Waste

U(H)PLC Nano-HPLC

colonne

HPLC Column

Colonna analitica per nano-HPLC

Pre-colonna in linea

Pompa

Colonne analitiche:

Cromatografia di ripartizione in fase normale o inversa:

RP-LC: Reversed-phase Liquid Chromatography U(H)PLC: ultra performance

HPLC

Analisi isocratica

Analisi in gradiente (eluizione binaria, etc.)

Degasatore

Miscelazione ad alta e bassa pressione

Termostato colonne

HPLC: SISTEMA MODULARE

Bottiglie con eluenti

Valvola d’iniezione

Siringa HPLC

Ultravioletto (UV), UV-PDA, Fluorimetro, detector elettrochimico, Spettrometro di

Massa

RIVELATORI

UV-PDA

Fluorimetro

Elettrochimico HPLC con spettrometro di massa

Hyphenated HPLC: più rivelatori in serie

TECNICHE ESTRATTIVE:

Estrazione in fase solida: cartucce contenenti materiale solido di varia natura, cartucce estrattive con caratteristiche vicine a quelle della colonna analitica (ex. C18) –cartucce a ritenzione per sostanze più o meno polari, resine a scambio ionico.

Alta influenza sulla riuscita dell’analisi cromatografica

Matrici biologiche complesse: ex. urine, siero/plasma, saliva, ago aspirato, cellule Devono essere pulite il più possibile da contaminanti e interferenti analitici.

Workstations- automatizzazione

Potenziamento delle tecniche estrattive

Estrazione in fase liquida e solida ottimizzate – fase solida

Estrazione in fase organica: Fase acquosa (campione) e fase organica – solvente estrattivo. Anche su colonna. Solventi: Acetonitrile, Metanolo, n-esano/eptano o miscele di questi, in condizioni acide o base

Uso di standard(s) interno/i (SI): (Area o Altezza)analita/(Area o Altezza )SI

Per separare e quantificare piccole molecole - Deproteinizzazione: precipitazione preliminare acida, TFA, TCA, H2SO4, HClO4

Tecniche di preparazione del campione per biopolimeri e macromolecole- Proteine

Tecniche di ultrafiltrazione

Tecniche di precipitazione frazionata salting out: solubilità delle proteine o al punto isoelettrico

Tecniche elettroforetiche

-Matrice biologica: a) extracelllulare: sangue, urine, plasma, siero, liquor, liquido sinoviale , liquido amniotico, mezzi di coltura ,etc.. ; b) intracellulare: tessuti, colture cellulari, omogenati etc..

-Estrazione degli analiti dalla matrice: preparazione del campione da iniettare per l’analisi – eliminare interferenze, “pulire” il cromatogramma da composti interferenti; procedura che deve garantire: integrità analita/i , giusta concentrazione finale nella soluzione d’iniezione (in genere fase mobile) – se si sceglie di lavorare con SI , aggiunta alla matrice prima o dopo l’estrazione – di solito conviene prima

-HPLC dell’estratto : iniezione del campione estratto e analisi cromatografica con il metodo preliminarmente messo a punto per l’analisi dell’analita/i. Scelta di: colonna, fase mobile, rivelatore e condizioni cromatografiche (flusso/pressione, temperatura), modalità isocratica o in gradiente. Interpretazione del cromatogramma; analisi dei picchi; confronto con gli standards.

COME SI LAVORA:

Analisi qualitatitiva: identificazione del picco - si possono ottenere informazioni sull’identità del picco cromatografico sia dal tempo di ritenzione che dalle caratteristiche del rivelatore.

Riconoscimento in base al tempo di ritenzione: uso di standards; confronto tra i tR dei picchi dello standards e quelli del campione;

Riconoscimento mediante il detector: ex. Il detector UV-fotodiodi (PDA o DAD) fornisce l’analisi spettrale UV – confronto tra spettro UV del picco dello standard e spettro del picco nel cromatogramma allo stesso tempo di ritenzione. Visualizza sostanze che assorbono in UV. Uso di doppio detector in linea: ex. Fluorimetrico ed elettrochimico; Detector in spettrometria di massa.

Analisi quantitativa: una volta identificato il picco o i picchi d’interesse si può procedere all’analisi quantitativa. Il picco analitico può essere quantificato o misurandone l’altezza H oppure integrandone l’area A. Se si usa lo standard interno (SI), si deve utilizzare anche l’H o l’A dello SI.

Rette di calibrazione: utilizzando gli STDs dell’analita: iniezione di concentrazioni crescenti dello standards aggiunte nella matrice biologica, es. plasma; estrazione e cromatografia.

Rette di calibrazione con lo SI: si procede come sopra ma si aggiunge ad ogni punto di concentrazione una concentrazione fissa di SI; estrazione e cromatografia.

C= (Aa/ASI) x + b o C= (Ha/HSI)x + b

C= Aa x + b o C = Hax + b

ESERCITAZIONE: HPLC – Cromatografia ad esclusione molecolare con rivelazione fluorimetrica:

separazione di proteine da estratto di saliva umana

Size exclusion chromatography

Gel permeation chromatography

(GPC)

Gel filtration Chromatography

(GFC)

Condizioni cromatografiche: corsa isocratica, flusso 0.5 ml min-1,,temperatura: 25 °C; colonna Zenix Sec100 (300 mm x 7.8 mm, 3 mm dpi); precolonna Zenix ; Detector fluorescenza: λex: 496 nm – λem: 518 nm. Composizione fase mobile: 97% soluzione NaH2PO4 150 mM, NaCl 200 mM, pH=7; 3% ACN (acetonitrile) – 97:3 (v:v) fase acquosa:fase organica.

Prelievo di saliva

Trattamento del campione, tecniche di estrazione come altre matrici biologiche. Fluidificazione.

Elettroforesi di proteine e separazione di frazioni specifiche.

Frazioni raccolte, derivatizzate con molecola fluorescente e iniettate come segue