hastane enfeksiyonları ve moleküler...

Hastane enfeksiyonları ve moleküler epidemiyoloji:

Hastane infeksiyonlarının gerçek-zamanlı takibi ve enfeksiyon

oranlarına etkisi

Barış Otlu

İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

“Hasta oluyordum ve sen hemen geldin

Yanında yüz öğrenciyle, oh Simmakus

Yüz soğuk el bana dokundu

Hiç ateşim yoktu, oh Simmakus, şimdi var”

Hastane İnfeksiyonları Tarihi

Kurtuluş Töreci, Hastane İnfeksiyonlarının tarihçesi

Hastane İnfeksiyonları Kirabı, 2003

3. Yüzyıl Roma Şiiri, Bir hastanın Dr. Simmakus’a seslenişi


• Hastane kavramı ile hastane infeksiyonları kavramının birlikte geliştiği

düşünülebilir.

18.yy’ da Hotel Dieu;

ampütasyonlardan ölüm oranı %60 ,

salgın sırasında lohusalık hummasından ölüm oranı 19/20


• 1840 Hastane İnfeksiyonlarının tespiti ve önlenmesi

ile ilgili ilk bilimsel yaklaşım. El hijyenin önemi

Ignaz Semmelweis

from Notes on Hospitals published in 1863


Yoğun Bakımlar

• 1952

Yoğun Bakım ve Salgınlar

imipenem (MK0787)

PubMed’de son 35 yılda 200 den fazla Acinetobacter spp.

salgını yayın haline gelmiş !!!

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 341980 1985 1990 1995 2000 2005 2010 2013

Son dört ayda 112 Hastane Salgın

Hastane İnfeksiyonları ve direnç problemi

FDA ve EMA tarafından onaylanan yeni antibiyotik sayısı

Hastane İnfeksiyonları-Sınıflandırma

• Endemik Hastane İnfeksiyonları

Bir hastalığın belirli bir yerde (örneğin bir hastanede) her zaman

beklenen görülme düzeyi.

Hastane İnfeksiyonlarının %90-95

• Epidemik Hastane İnfeksiyonları

Hastane infeksiyonların yaklaşık %5-10

Görülme sıklığı: 1/10.000 yatış

Epidemik Hastane İnfeksiyonları-Salgınlar

vaka

say

ısı

zaman

• Kaos ve kargaşa başlar.

• Komplo teorileri üretilir ve gerçeklerden daha çok bu bilgilere inanılır.

• Suçlamalar başlar

Epidemik Hastane İnfeksiyonları-Salgınlar

Hastane İnfeksiyonları ve Mikrobiyoloji Laboratuvarı

• İnfeksiyona neden olan etkenin belirlenmesi

• İzolatlar arasındaki klonal ilişkinin ve bulaş kaynağının araştırılması

₋ Etkenin hızla tespiti

₋ Antimikrobiyal duyarlılığın belirlenmesi

₋ Antibiyotik direnç genlerinin tespit edilmesi

₋ Virülans genlerinin belirlenmesi

₋ Hastane salgınlarının araştırılması

₋ Salgının kaynağının belirlenmesi

₋ Dirençli bakterilerin izlenmesi

₋ Re-aktivasyonun yeni bulaştan ayırt edilmesi

₋ Hastane ve toplum kaynaklı infeksiyonların ayırt edilmesi

₋ Endojen-ekzojen kaynaklı infeksiyonların ayrımı

Hastane İnfeksiyonlarının Hızla Belirlenmesi

Moleküler Epidemiyoloji

“Moleküler Epidemiyoloji 21. yüzyılın

en önemli ve heyecan verici

araştırma alanlarından biridir”

Hasnain SE. Molecular epidemiology of infectious diseases: a case for increased surveillance. Bull World Health Organ. 2003;81(7): 474.


• Bugün için ise moleküler epidemiyoloji terimi;

genellikle “moleküler biyolojik yöntemlerle suş tiplendirme”

çalışmalarına verilen ortak bir isim gibi kullanılmaktadır.


Moleküler epidemiyolojinin sınırlarını;

- etken mikroorganizmanın tespiti

- bulaşma yollarının araştırılması

- virülanslarından sorumlu genlerin belirlenmesi ve

- izolatlar arası klonal ilişkilerin araştırılmasını

kapsayan geniş bir yelpazede çizilmiştir.

Ne ?

Nezam

an

?

Niçin?

Nasıl?

Moleküler

Epidemiyoloji


• Etkenin belirlenmesi ve izolatların moleküler karekterizasyonu

• İzolatlar arasındaki klonal ilişkinin araştırılması


İzolatların Moleküler Karakterizasyonu

• İzole edilen mikroorganizmaların;

• antimikrobiyal direnç genleri

• virülans genleri

• mobil genetik elemanları

plazmid

transpozon

İntegron

• hücre duvar yapıları araştırılmalıdır.


• Yoğun bakım ünitesinden izole edilen;

zaman ve mekan açısından kümeleşme gösteren

27 P. aeruginasa izolatı.


• Karbapenem dirençli 16 P. aeruginasa izolatında (karbapenemaz +)

karbapenem ile ilişkili olduğu bildirilen direnç genleri in-house PCR ile

araştırıldı.

- OXA-48 - OXA-23 - OXA-2 - VIM - KPC

- NDM - GES - SMP - GIM - SIM

- OXA-10 +


• Orijinal OXA-10 gen ürünün alfa yapısı beta’ya döndüğünde OXA-48

benzeri karbapenemaz benzeri etkin gösteriyor.


16 izolatta

• OXA-10 geninin PCR ile gösterilmesi ve dizi analizi


• Class I İntegron üzerinde taşınıyor.


• Class I İntegronun karakterizasyonu


• Class I Integronun karakterizasyonu


• Karbapenemaz aktivitesinin araştırılması

• Karbapenemaz (-)


• Karbapenem direncinin nedeni OXA-10 olamaz!

• Hücre duvarından karbapenem geçişini etkileyecek bir değişim var mı?


• Karbapenem direncinin tek nedeni bu olabilir mi?

• Hücre duvarından karbapenem geçişini etkileyecek bir değişim var mı?

CR-Pa CR-Pa


• OXA-10 taşıyan Class I İntegrona sahip izolatlarda

47 kDa OMP eksiklik var.

Class I İntegron

bakteri genomu

OM

P

CR-Pa


• Neden sadece OXA-10 taşıyan izolatlar karbapenem direncine sahip?

Class I İntegron

genomda hemen her zaman aynı yere

insersiye oluyor

karbapenem geçini sağlayacak dış membran

proteinin sentezini önlüyor (47 kDa)


• Nedensadece OXA-10 taşıyan izolatlar karbapenem direncine sahip?

Class I İntegron


• Suşla ilgi tüm veriler ve sekans bilgisinin GenBank kaydı yapıldı.

İzolatlar Arasındaki Klonal İlişkilerin Araştırılması

PFGE

AP-PCR

MLST

RFLP AFLP

RAPD

Dizi analizi

- Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)

- PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)

- Random amplified polymorphic DNA (RAPD)

- Arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR)

- Repetitive extragenic palindromic element-PCR (rep-PCR)

- Amplified ribozomal DNA restriction analysis (ARDRA)

Moleküler epidemiyoloji için yöntemler

• Sağlık bakımı ile ilişkili mikroorganizmaların moleküler tiplendirilmesinde;

kromozomal DNA polimorfizmine dayalı olan yöntemler, hızlı ve güvenilir olmalarıyla ön

plana çıkmaktadırlar.

Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)

• Bir çok mikroorganizma için halen «altın standart»

genotiplendirme yöntemidir.

Infect Genet Evol. 2010 Oct;10(7):866-75. Epub 2010 Aug 6.


• Kromozomal DNA polimorfizmine dayalı,

tüm genomu hedef alan genotiplendirme yöntemidir.

• Sağlık bakımı ile ilişkili salgınların araştırılması ve bulaş kaynağının belirlenmesinde

• Bu yöntemlerle izolatlar arasındaki ilişkilerin belirlenmesinde;

− bant paternlerinin benzerlik yüzdesine ya da

− bant sayısı ve büyüklüğündeki farklılıklara göre değerlendirme yapılır.

Pulsed Field Gel Electrophoresis

Bakterilerin Parçalanması ve diyaliz

Elektroforez

• Yöntemin ana basamakları

Bakteri Kalıplarının hazırlanması

10 m

m

Sonuçların Analiz

RE ile kesim

En iyi ihtimalle 2-3 ya da üç gün

• Görüntüleme

− Fotoğraflar dijital kamerayla ve programların çoğunun kabul ettiği TIFF formatında

çekilmelidir. İyi görüntülenememiş tiplendirme sonucu veri olarak değer

kazanmamaktadır.


• Sonuçların analizi ve yorumlanması



• İlk defa Tenover ve arkadaşları 1995 yılında PFGE sonuçlarının

yorumlanması için belirli kriterler önermişlerdir.

“aynı” “yakın ilişkili” “muhtemel ilişkili” “ilişkisiz”


Pulsed Field Gel Electrophoresis



• Bu amaçla en çok kullanılan bilgisayar programları;

- Gel-Compar (Applied Maths, Kortfijk, Belgium)

- Dendron (Solltech, Oakdale, Iowa)

- Diversity Database Fingerprinting Software (Bio-Rad)

- Gene Profiler (Scanlytics, Fairfaz, Va)

- Phoretix 1-D (Nonlinear USA, Durham, N.C.)

- Quantar Pro (KeyGene Producrts, Wageningen, Netherlands)

- Taxotron (Taxolab, Institut Pasteur, Paris, France)


http://www.meyerinst.com/html/mediacy/gp.htm

Genotip P-VIII -Suşlar anestezi-reanimasyon

yoğun bakım ünitesinden, beş

aylık bir dönemde izole

edilmiştir.



Arbitrarily Primed- PCR (AP-PCR)

• Moleküler epidemiyolojik çalışmalar için kullanılan bir hızlı

DNA fingerprinting yöntemidir.

• Kısa primerler kullanılarak

DNA’daki benzer bölgelerin amplifikasyonu yapılır.

ürün 2 ürün 1 ürün 3 ürün 4

ürün 5 ürün 6

PCR Reaksiyonu


Otlu B, Durmaz R. Farklı bakteri ve maya türlerinin alttiplendirilmesinde için ortak bir “arbitrary primed” polimeraz zincirleme reaksiyon (AP-PZR) protokolü. Durmaz R (editör). Uygulamalı Moleküler Mikrobiyoloj. 2. Baskı. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri, 2001:208-213

• Bu yöntemin başarısı ;

- kullanılan primerlere

- amplifikasyon karışımının içeriğine

- ısı döngülerine

- elektroforez koşullarına

- ve sonuçların yorumlanmasında kullanılan kriterlerden önemli ölçüde

etkilenmektedir.

• Standardizasyon zor


Rep-PCR

• Hastane salgınlarının hızlı tespiti için geliştirilmiş olan Diversilab

Sistemi (Biomerieux, Fransa) Rep-PCR tabanlı otomatize bir

tiplendirme sistemidir.

• Tekrarlanan gen bölgelerini hedef alır.

― REP-PCR (DiversiLab Sistemi)

― REP-PCR (DiversiLab Sistemi)

• Hızlı

• Tekrarlanabilirliği yüksek

• Amplifikasyon ve elektroforez aşamaları

standardizde edilmiş

• Bant pattern analizleri için yazılama sahip

Rep-PCR

Moleküler Epidemiyolojiye Başlarken

• İzolatlar tür düzeyinde doğru olarak tanımlanmalı

• Klasik epidemiyolojik veriler eksiksiz olarak toplanmalı

• En uygun yöntemler seçilmeli

- Hızlı

- Uygulaması kolay

- Ayrım gücü ve tekrarlanabilirliliği yüksek

- Sonuçları kolay yorumlanabilmeli

• Çalışılacak mikroorganizmanın genom özellikleri iyi bilinmeli.


• Yoğun bakımdaki 4 hastanın trakeal aspiratından ve 5 hastanın

balgamında S. maltophilia üretildi

• Çevre kültürlerinden, 1 nebulizatörde aynı organizma üretildi.

• Çalışılacak mikroorganizmanın genom özellikleri iyi bilinmeli.


• S. maltophilia suşları hiper mutasyona sahip


• S. maltophilia suşları hiper mutasyona sahip.

• Aynı suşun seri pasajları;

500 bp


• S. maltophilia suşlarının moleküler karakterizasyonu.

Class I Integron

Class I integron PCR Miniprep ile Plazmid DNA ekstraksiyonu

Plazmid profil analizine ihtiyaç var

Moleküler Epidemiyoloji Ne Zaman Kullanılmalı ?

• Her zaman


• Real-time monitorization of nosocomial infections in intensive care units with

molecular epidemiologic tools: Impact on infection rate.

Real- memonitoriza onofnosocomialinfec onsinintensivecareunitswith

molecularepidemiologictools:Impactoninfec onrate.

RESULTS

INTRODUCTION

Ac vesurveillanceprogramsarerequiredforrapiddetec onofoutbreaksandtransmissionsourcestoreducenosocomialinfec onrates.Molecularepidemiologicalinves ga onshaveplayedanimportantpartin

exposingtherela onshipbetweencausa veagents(1).However,theretrospec venatureofsuchstudieslimittheirrelevanceinrou neclinicalprac ce.Ouraimistodeterminetheclonalrela onshipbetween

nosocomialinfec onagentsisolatedfromourhospital'sIntensiveCareUnit(ICU)inreal me(onthedayofisola on)andtoinformtheHospitalInfec onControlCommi ee(HICC)topromptlytakenecessary

precau onsandac ons.Thepreliminaryresultsofthefirstninemonthsarepresented.

MATERIAL AND METHOD

Only clonally similar strains with rep-PCR genotyping were confirmed with pulsed-field gel

electrophoresis(PFGE)followingarapidPFGEprotocoldescribedpreviouslywithminormodifica on

(3).Briefly,bacterialcoloniesgrowninthenutrientagarwerecollectedandsuspendedin1mlcell

suspensionbuffer,andthenre-suspendedin2%low-mel ngpointagarose(GibcoBRL,Paisley,UK)

plugs,andwerelyzedinthecelllysissolu on-1andcelllysissolu on-2.A.baumannii,P.aeruginosa,E.

coliandK.pneumoniaDNAwasdigestedrespec velywithusingApaI,SpeIandXBAIenzyme(Promega

Corpora on,US).FragmentedDNAwaselectrophoresedin1%pulsed-fieldcer fiedagarose(Bio-Rad

Laboratories,US)byusingwithaCHEF-DRIIsystem(Bio-RadLaboratories,Belgium).TheDNAbandson

thegelwerevisualizedundertheUVlight,photographedusingtheGelLogic2200imagingsystem

(Kodak,USA),andthebandprofileswereanalyzedusingtheGelCompareso ware(AppliedMaths,

Belgium).DendogramsofthePFGEbandingpa ernswerecreatedbyusingDicesimilaritycoefficient

and“Unweightedpairgroupmethodwithmathema calaveraging(UPGMA)”andclusteranalysiswas

performed.TheisolateswithDicesimilaritycoefficient≥90%(toleranceof1%inbandposi on)were

designatedas“clonallyrelated”8whiletheywereclassifiedasindis nguishable,closelyrelatedand

possiblyrelatedwhentheyhadDicesimilaritycoefficientvaluesof100%,95-100%and90-95%,

respec vely.

Duringthestudyperiod,atotalof5340pa entsand33410pa entsdaysweremonitoredinICU's.In

251ofthesepa ents,310(5.8%)hospital-onsetinfec onsweredetected,reflec ngadecreaseof

2.6%comparedtothepreviousyear(p=0,006).Eighty-fourA.baumanniiisolateswereassignedto34

differentsetswithaclusteringrateof67.8%.For32P.aeruginosa,23E.coliand29K.

pneumoniaeisolates,theclusteringratewascalculatedrespec velyas6.5%,25%and13%.When

comparingtheinfec onrateswiththepreviousyearanincreasewasobservedfrom8to10per1000

pa entdaysinthefirstquarter.However,inthesecondquarter,theinfec onratedecreasedfrom

12.2to7.9,andfrom11to9.7per1000pa entdaysinthethirdquarter.Thetotalinfec onratefrom

10.7to9.2per1000pa entdayscomparedtothepreviousyear(Z=1.8p=0,036).

ThisstudywascarriedoutinInonuUniversityTurgutOzalMedicalCenterwithacapacityof255ICU

beds out of 1140 total beds. Isolated A. baumannii, P. aeruginosa, E. coli or K.

pneumoniamicroorganismsfromICU'shavebeensubjectedtotheRep-PCR-basedDiversiLab®system

formoleculartypinginreal mesinceJanuary1st,2013.Briefly,theDNAoftheisolateswasextracted

usingtheUltraCleanMicrobialDNAIsola onkit(MoBioLaboratories,SolanaBeach,CA,USA)kits,

then,therep-PCRwasperformedusingGeneampPCRSystem9700thermocycler(AppliedBiosystems,

FosterCity,CA,USA)andDiversiLabKit.Theamplifiedfragments,ranging100-1000bpinsize,were

separatedelectrophore callywiththemicrofiluidlabchip.Electrophorogramsweredownloadedand

automa callyanalyzedbytheDiversiLab(version3.4).Finally,theso warecreatedacustomized

reportpresen ngadendogram,electrophorograms,virtualgelimages,andsca erplots.Clonal

rela onshipsoftheisolatesweredeterminedaccordingtopreviouslydescribedcriteria(2).Eachnewly

typedisolatewasinves gatedforclonalrela onshipbetweenthepreviouslytypedisolatesusing

DiversiLabso ware,andHICCwasinformedwhenanewisolatewasincludedinanycluster.The

epidemiologicallinksbetweenclonallyrelatedstrainswereanalyzedbyHICC,routesoftransmission

inves gated,precau onstakenandmee ngsappointedasrequired.

CONCLUSION

Baris Otlu1, Yasemin Ersoy2, Çigdem Kuzucu1, Yasar Bayindir2, Uner Kayabas2, Funda Yetkin2, Emine Tunc1, Nalan Parmaksiz3, Canan Kizilkaya4, Yusuf Yakupogullari1

1Medical Microbiology, Inonu University Faculty of Medicine, Malatya, Turkey. 2Infectious Diseases and Clinical Microbiology, Inonu University Faculty of Medicine, Malatya, Turkey.

3Infection Control Nurse, Inonu University Faculty of Medicine, Malatya, Turkey. 4Medical Microbiology, Ankara University Faculty of Medicine, Ankara, Turkey.

Togetherwiththeaddi onalac onsheld,annualinfec onratedecreasedtofrom10.7to9.2per1000pa entdayscomparedtothepreviousyear.Molecularepidemiologicaldatahasbecomeaconvincing

evidencetoencouragethecliniciantoembracetheprecau onstobetakentowardsanoutbreak.

Ourresultsshowsthatmoleculartypingwouldshortenorevenpreventanepidemicandthereducetheincidenceofnosocomialinfec ons.Inourhospitalintensivecareunits,themostfrequentisolatedspecies

wasA.baumannii.Theseisolatesalsodisplayedsignificantlyhigherclusteringra o.WewerenotabletoameliorateA.baumaniiinfec onratestodesiredlevels,opposedtootherpathogenswhichsharesimilar

transmissionroutes.Therefore,thesefindingssuggestthepossibilityofalterna vetransmissionroutesforA.baumaniiwai ngtobeunveiled.

Ourresultsemphasizethat,rapidmoleculartypingofmicroorganismsinhospitalswithmolecularepidemiologytoolsshouldbeoneoftheessen alcomponentsofacomprehensiveinfec oncontrolprogram.

Obviously,epidemiologicalandmoleculartypingdatashouldbeevaluatedtogethertodevelopeffec veinfec onpreven onstrategy.

REFERENCES

1-SabatAJ,BudimirA,NashevD,Sá-LeãoR,vanDijlJm,LaurentF,GrundmannH,FriedrichAW;ESCMIDStudyGroupofEpidemiologicalMarkers(ESGEM).Overviewof

moleculartypingmethodsforoutbreakdetec onandepidemiologicalsurveillance.EuroSurveill.2013Jan24;18(4):20380.

2-ArianeDeplano,OlivierDenis,HectorRodriguez-Villalobos,RafDeRyck,MarcJ.Struelens,MarieHallin.ControlledPerformanceEvalua onoftheDiversiLabRepe ve-Sequence-BasedGenotypingSystemfor

TypingMul drug-ResistantHealthCare-AssociatedBacterialPathogens.JClinMicrobiol.2011October;49(10):3616–3620.

3-DurmazR,OtluB,KoksalF,HosogluS,OzturkR,ErsoyY,AktasE,GursoyNC,CaliskanA.Theop miza onofarapidpulsed-fieldgelelectrophoresisprotocolforthetypingofAcinetobacterbaumannii,

EscherichiacoliandKlebsiellaspp.JpnJInfectDis2009;62(5):372-7.

cluster5

cluster6

cluster5a

DiversiLabTyping Confirma onwithPFGE

Figure1.A)rep-PCR-baseddendogramandvirtualgelimagefingerprintsobtainedfromA.baumanniistrainswithusingtheDiversiLabsystem.

B)FoundsimilarwithDiversilabofstrainsconfirmedbyPFGE.

similarityline%95

A B

Gen

otype10

Gen

otype15

similarityline%90

A B

Figure1.A)rep-PCR-baseddendogramandvirtualgelimagefingerprintsobtainedfromE.colistrainsusingtheDiversiLabsystem.B)

FoundsimilarwithDiversilabofstrainsconfirmedbyPFGE.

• Yoğun bakımlardan izole edilen sağlık

bakımı ilişkili tüm etkenleri aynı gün Rep-

PCR ile tiplendirdik.

• Klonal ilişki konusunda HİKK ne hızla bilgi

verip, ilişkili bulunan suşları PFGE ile

doğrulama çalışmaları başlatıldı.

• Dirençli izolatların moleküler

karakterizasyonları yapıldı.


Yoğun bakım hastaları kültürde üreme ve identifikasyon

Rep-PCR ile tiplendirme ve izolatlarla karşılatırma

Komiteye bilgi ver ve ilişkiyi PFGE ile

doğrula

Karbapenemaz aktiviteisi

Direnç genlerini OXA-48, NDM1, VIM, IMP, GES

Mobil genetik elementler

Hastane infeksiyon kontrol komitesi

Hastane infeksiyonu

İzolatın moleküler karakterizayonu İzolatın genotiplendirilmesi

Kümeleşme yok İzolatlar “ayrı”

Kümeleşme var İzolatlar “benzer”


• Hastane infeksiyon kontrol komitesinin haftalık toplantılarına katıldık.

• Yoğun bakımlarda salgınlardan etkilenen hasta sayısı artmadan

müdahale edilmesine katkıda bulunduk.

• Vaka sayısının arttığı ancak

klonal ilişkili bulunmayan durumlarda HİKK farklı yollar izledi

• Örneğin;

*DEĞER+,1

21,41

15,98

14,23

11,01 9,3 9

8,34

0

5

10

15

20

25

30

2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015

Hasta günü Hastane İnfeksiyonu Hızı %


• Hastane infeksiyon kontrol komitesinin çalışmaları ve aldığı önlemler ile;

Eldeki tüm imkanlar kullanılmalı

Ne yapmak gerekiyor ?

• Hastane İnfeksiyonları,

sık görülen komplikasyonlar olduğundan bu enfeksiyonlar sürekli olarak takip edilmeli

ve salgınların önlenmesi için stratejiler geliştirilmelidir.

hastane enfeksiyonları ve moleküler...

Documents