disertacion - sites.google.com
TRANSCRIPT
REPUBLIKA E SHQIPËRISË
UNIVERSITETI I TIRANËS
FAKULTETI I SHKENCAVE TË NATYRËS
DEPARTAMENTI I BIOTEKNOLOGJISË
PROGRAMI I STUDIMIT BIOTEKNOLOGJI BIMORE
DISERTACION
Për marrjen e gradës: ”DOKTOR I SHKENCAVE”
“VLERËSIMI I SHUMËLLOJSHMËRISË SË GJENEVE KODUESE TË MONOTERPEN SINTETAZAVE DHE
PRODUKTEVE ENZIMATIKE TË TYRE TEK POPULLATA
TË SHERBELËS TË SHQIPËRISË SË VERIUT”
Udhëheqës shkencor: Kandidati:
M.Sc. STELA PAPA Prof. Dr. Ariola Bacu
Tiranë 2017
i
REPUBLIKA E SHQIPËRISË
UNIVERSITETI I TIRANËS
FAKULTETI I SHKENCAVE TË NATYRËS
DEPARTAMENTI I BIOTEKNOLOGJISË
PROGRAMI I STUDIMIT BIOTEKNOLOGJI BIMORE
DISERTACION
Paraqitur nga
M.Sc.STELA PAPA
Udhëhequr nga
Prof. Dr. Ariola Bacu
Për marrjen e gradës
DOKTOR I SHKENCAVE
Tema: “VLERËSIMI I SHUMËLLOJSHMËRISË SË GJENEVE KODUESE TË MONOTERPEN SINTETAZAVE DHE
PRODUKTEVE ENZIMATIKE TË TYRE TEK POPULLATA
TË SHERBELËS TË SHQIPËRISË SË VERIUT”
Mbrohet më datë,_______/_______,2017 para Jurisë
1.______________________________________Kryetar
2._____________________________________Anëtar ( Oponent )
3._____________________________________Anëtar ( Oponent )
4._____________________________________Anëtar
5._____________________________________Anëtar
ii
Dedikuar familjes sime!
iii
FALENDERIME
Të gjesh fjalët e duhura për të shprehur mirënjohjen dhe falënderime është shumë e
vështirë. Por unë do doja të veçoja ata persona të cilët kanë luajtur një rol të
rëndësishëm në realizimin e këtij punimi dhe në vazhdimësinë e punës sime ndër vite.
Në rradhë të parë dua të falënderoj udhëheqësen time Prof. Dr. Ariola Bacu për
durimin, inkurajimin, këshillat dhe kohën e gjatë që më ka kushtuar gjatë gjithë
periudhës si studente e saj. Kam qenë me fat të kisha një supervizore që interesohej
maksimalisht për këtë kërkim duke më frymëzuar me pikëpamjet pozitive, motivimin e
vazhdueshëm dhe besimin në hulumtimet e mia. Gjithashtu shpreh me bindje
mirënjohjen për kontributin e saj maksimal në rrjedhën e ngjarjeve të karrierës sime.
Mirënjohja ime e thellë i drejtohet edhe përgjegjëses së Departamentit të
Bioteknologjisë, Prof. Dr. Klementina Puto, për përkrahjen, dashamirësinë, këshillat,
besimin që më ka deleguar në çdo ditë duke më dhënë forcë dhe kurajo për të ecur
përpara. Gjithashtu, do doja ta falënderoja për sugjerimet dhe komentet brilante, pa
të cilat kjo tezë nuk do të kishte marrë këtë formë.
Falenderime dhe mirënjohje për të gjithë kolegët e mi në Departamentin e
Bioteknologjisë për dashamirësinë dhe pozitivitetin e tyre. Me sinqeritetin më të madh
dëshiroj të falënderoj Efterpin dhe Mirën, për ndihmën dhe këshillat në laborator
gjatë realizimit të eksperimenteve.
Falenderime pa fund për eksperiencën e vlefshme dhe ndihmën profesionale për
realizimin e analizave gaz-kromatografike Prof. Asoc. Dr. Aurel Nuro, në
laboratorin e Analizës organike instrumentale, Departamenti i Kimisë, FSHN, UT.
Gjithashtu dua të falënderoj kolegët dhe përgjegjësin e Laboratorit të Gjenetikës
molekulare, Prof. Asoc. Dr. Lucian D. Gorgan në Fakultetin e Biologjisë,
Universitetin “Alexandru Ioan Cuza”, Iasi, Rumani të cilët më kanë ndihmuar me
eksperiencën e tyre të vyer si dhe duke më krijuar kushte të përshtatshme për
realizimin e një pjese të eksperimenteve.
Falenderoj dy koleget dhe mikeshat e mia, Valbonën dhe Lindën për këshillat,
mbështetjen, inkurajimin dhe çdo ndihmesë gjatë kohës të realizimit të këtij punimi.
Dhe së fundmi por jo nga rëndësia falënderimet e gjithë botës i meritojnë familjarët e
mi, të cilët kanë përjetuar me mua uljet dhe ngritjet vit pas viti.
Falënderoj bashkëshortin tim dhe i jam shumë mirënjohëse për dashurinë, durimin,
mbështetjen dhe inkurajimin e vazhdueshëm gjatë gjithë kësaj kohe, duke ma bërë
edhe më të lehtë këtë rrugëtim.
Falënderoj prindërit e mi të shtrenjtë dhe vëllain tim të dashur që më kanë ofruar
mbështetje dhe dashuri në çdo moment. Pa insistimin dhe inkurajimin tuaj karriera
ime nuk do të kishte marrë kurrë këtë kthesë dhe as do të arrija këtu ku jam sot.
Jam me fat që ju kam!
Ju faleminderit nga zemra!
STELA
iv
PASQYRA E LËNDËS
FALENDERIME........................................................................................................ iii
LISTA E SHKURTIMEVE ...................................................................................... vii
LISTA E TABELAVE ................................................................................................ ix
LISTA E FIGURAVE.................................................................................................. x
HYRJE ........................................................................................................................ xii
QËLLIMI DHE OBJEKTIVAT ............................................................................... xv
1. KONSIDERATA TEORIKE ............................................................................... 1
1.1. Përshkrim i përgjithshëm i sherbelës (Salvia officinalis) ................................ 1
1.2. Speciet e familjes Lamiaceae të rritura në Shqipëri ........................................ 2
1.3. Përhapja gjeografike e sherbelës ..................................................................... 3
1.4. Kushtet klimatike – tokësore të favorshme për rritjen e sherbelës ................. 4
1.5. Kultivimi i sherbelës në Shqipëri .................................................................... 6
1.6. Përdorimet e sherbelës në mjekësi .................................................................. 7
1.6.1. Përdorimet e bimës .................................................................................... 7
1.6.2. Përdorimet e vajrave esenciale të specieve të ndryshme të gjinisë Salvia 8
1.7. Vajrat esencialë të sherbelës ........................................................................... 9
1.7.1. Variacioni i përbërësve të vajrave esenciale ............................................ 9
1.7.2. Faktorët që ndikojnë në variacionin e vajrave esenciale ....................... 10
1.8. Terpenet si përbërësit kryesore të vajrave esenciale ..................................... 12
1.8.1. Veçoritë e përgjithshme të terpeneve ..................................................... 12
1.8.2. Biosinteza dhe kompartmentalizimi i terpeneve .................................... 13
1.9. Terpen-sintetazat përgjigjëse për prodhimin e terpeneve ............................. 16
1.10. Sinteza e monoterpeneve nga Salvia officinalis ........................................ 18
1.10.1. Ruajtja dhe sekretimi i monoterpeneve .................................................. 20
1.10.2. Rregullimi i biosintezës të monoterpeneve ............................................ 20
1.10.3. Ndikimi i fazës vegjetative në prodhimin e monoterpeneve ................. 21
1.10.4. Kontrolli i prodhimit të monoterpeneve bazuar në parimin e
transkriptimit ........................................................................................................ 21
1.11. Gjenet koduese të monoterpen-sintetazave në bimë ....................................... 22
1.12. Klonimi i fragmenteve të ADN-Parimi ..................................................... 26
1.12.1. Libraritë gjenomike dhe Libraritë e c-ADN-ve ..................................... 27
1.12.2. Izolimi i gjeneve me anë të PCR ............................................................ 28
v
1.13. Përdorimi i cpADN-së për të vlerësuar diversitetin gjenetik në popullata të
sherbelës ................................................................................................................... 29
1.13.1. Veçori të gjenomës kloroplastike ........................................................... 29
1.13.2. Përdorimi i cpADN-së për të vlerësuar diversitetin gjenetik në popullata
të sherbelës ........................................................................................................... 29
1.14. Analiza RFLP ............................................................................................ 30
1.14.1. Enzimat prerëse të ADN ........................................................................ 31
1.15. Teknologjia e prodhimit të esencave në rrugë gjysmë industriale ............ 32
1.15.1. Trajtimi i materialit bimor para përpunimit ........................................... 32
1.15.2. Gaz-kromatografia e Vajrave Esencialë ................................................ 33
1.15.2.1. Parimi i ndarjeve kromatografike ................................................... 34
1.15.2.2. Analiza gaz-kromatografike .......................................................... 34
1.15.2.3. Aparatura e gaz-kromatografit ........................................................ 35
2. MATERIALE DHE METODA ......................................................................... 37
2.1. Materialet ...................................................................................................... 37
2.2. Metodat e bazuara në acidet nukleike ............................................................... 37
2.2.1 Ekstraktimi i ADN-së gjenomike ................................................................ 37
2.2.2. Vlerësimi sasior dhe cilësor i ADN-së ....................................................... 39
2.2.3. Protokolli i ekstraktimit të ARN totale ....................................................... 40
2.2.4. Matja e sasisë dhe cilësisë së ARN totale .................................................. 41
2.2.5. Vlerësimi i diversitetit të rajonit intergjenik trn të cp-ADN të popullatave
të Salvia officinalis bazuar në PCR-RFLP ........................................................... 41
2.2.5.1. Prerja me enzima restriktive e produkteve të PCR .............................. 42
2.2.6. Shumëfishimi i fragmenteve gjenike të monoterpen-sintetazave nga gADN
dhe ARN totale e popullatave të Salvia officinalis ............................................... 43
2.2.6.1. Amplifikimi i rajonit qëndror të gjeneve koduese të MTP-ve nga ADN
gjenomike .......................................................................................................... 44
2.2.6.2. Amplifikimi i rajonit qendror të gjeneve koduese të MTP-ve nga ARN
totale me anë të RT-PCR .................................................................................. 44
2.2.7. Purifikimi nga xheli i fragmenteve të shumëfishuara me PCR me përmasat
e pritshme ............................................................................................................. 46
2.2.8. Klonimi i ADN-së së purifikuar nga xheli në plazmidet pTOPO 2.1 të Kitit
TA Cloning Kit (pCR 2.1 K2060-40) ................................................................... 47
2.2.9. Analizimi i transformantëve me anë të analizës restriktive ........................ 48
2.2.9.1. Ekstraktimi i ADN-së plazmidike nga klone të përzgjedhura të
baktereve transformante .................................................................................... 48
2.2.9.2 Prerja e plazmideve me enzimat e restriksionit EcoRI dhe TaqI .......... 49
2.3. Vlerësimi i përmbajtjes së monoterpeneve në vajrat esenciale të popullatave të
Salvia officinalis me anë të GC ................................................................................ 49
vi
2.3.1. Izolimi i vajrave esencialë për Salvia officinalis ........................................ 49
2.3.2. Aparatura dhe analiza gaz-kromatografike ................................................. 49
2.3.3. Analiza statistikore e rezultateve ................................................................ 50
3. REZULTATE DHE DISKUTIME ................................................................... 51
3.1 Stabilizimi i metodikave të ekstraktimit të ADN-së gjenomike dhe ARN-së
totale ......................................................................................................................... 51
3.2 Vlerësimi i diversitetit të rajonit intergjenik trn të cp-ADN-së të popullatave të
Salvia officinalis bazuar në PCR-RFLP ................................................................... 54
3.3 Vlerësimi i fragmenteve gjenike të MTP nga popullatat e Salvia officinalis të
Shqipërisë së veriut. ................................................................................................. 61
3.3.2. Analizimi i plazmideve rekombinante me anë të analizës restriktive ........ 62
3.4 Vlerësimi i diversitetit të popullatave të sherbelës së Shqipërisë së veriut
bazuar në përmbajtjen e MTP në vajrat esenciale .................................................... 65
3.4.1. Rezultatet të Gaz-kromatografisë për popullatat e Salvia officinalis ........ 65
3.4.2. Shkalla e ngjashmërisë ndërmjet popullatave bazuar në përmbajtjen e
vajrave esenciale ................................................................................................... 73
PËRFUNDIME .......................................................................................................... 76
BIBLIOGRAFIA........................................................................................................ 78
ANEKS I ..................................................................................................................... 92
ANEKS II .................................................................................................................... 93
ANEKS III .................................................................................................................. 94
PËRMBLEDHJE ..................................................................................................... 118
ABSTRACT .............................................................................................................. 118
vii
LISTA E SHKURTIMEVE
(Co)A Acetil-koenzima
ADN Acidi dezoksiribonukleik
ARN Acidi ribonukleik
BS Bornil difosfat sintetaza
c-ADN ADN komplementare
cpADN ADN kloroplastike
CPP Ent-copalil difosfat
CS Cineol sintetaza
CTAB Cetil-tri-metil-amonium-bromid
DMAPP Dimetilalil difosfat
DMAPP Dimetilalil difosfati
dNTPs Deoksinukleotid trifosfatet
DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
DXPS Rruga jo mevalonike në plaste
E.coli Escheriscia coli
EDTA Etilen Dinitrilo Acetic Acid
ER Rrjeti endoplazmatik
EtOH Etanol
FID Detektor me jonizim me flakë
FPP Farnesyl diphosphate
FSHN Fakulteti i Shkencave të Natyrës
GA Giberelina
GC Gas chromatography
GGPP Geranylgeranyl diphosphate (GGPP)
GPP Geranil difosfati
GPP Geranil pirofosfat
GPP Geranyl diphosphate
HIV-1 Virusi i imunodefiçencës humane
HMG-CoA 3-hidroksi-3-metilglutaryl CoA
HMGR Enzima HMG-CoA reduktazë
IPP izopentenil difosfat
LiCl Klorur litiumi
m-ARN ARN mesazhere
MeJA Metil jasmonati
MEP Methylerythritol phosphate
MgCl Klorur magneziumi
MTPs Monoterpen sintetazat
MVA Rrugëkalimi mevalonik
NaCl Klorur natriumi
OD Densiteti Optik në 260/280 nm
PCoA Principle component analysis
PCR Polymerase Chain Reaction
viii
PTGS Heshtja e gjeneve tek transgjenikët
PTR-MS Mass spectrometry
qPCR Quantitative PCR
rARN ARN ribozomale
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms
RT-qPCR Reverse transcriptase qPCR
Rrezatim UV Rrezatim ultraviolet
SBS Sage bornyl dipfospfate
SCS Sage 1,8-cineole synthase
SS Sabiene sintetaza
SSS Sage sabiene synthase
TAE Tris Acetat EDTA
Taq pol- Thermus aquaticus polymerase
TPS Terpen-sintetazat
ix
LISTA E TABELAVE
Tabela 1.1. Lista e specieve kryesore të sherbelës ........................................................ 2
Tabela 1.2. Grumbullimi i gjetheve të sherbelës .......................................................... 3
Tabela 1.3. Sipërfaqja (ha) dhe potenciali prodhues (në ton) i sherbelës në Shqipëri .. 6
Tabela 1.4. Përdorimet e vajrave esencialë të llojeve të sherbelës ............................... 8
Tabela 2.1. Popullata e sherbelës së Shqipërisë së veriut prej nga u izolua ADN
gjenomike & ARN totale ............................................................................................. 40
Tabela 2.2. Sekuencat e çiftit të primerave të përdorur për amplifimin e rajonit
specifik inter-gjenik nga cp-ADN e popullatave të sherbelës ..................................... 42
Tabela 2.3. Gjenotipet për secilën popullatë të sherbelës së Shqipërisë së veriut të
analizuara me PCR-RFLP ............................................................................................ 42
Tabela 2.4. Përzierja e reaksionit të fazës së parë të RT-PCR .................................... 44
Tabela 2.5. Përbërja e reaksionit të RT-PCR .............................................................. 45
Tabela 2.6. Kushtet e ciklimit te RT-PCR .................................................................. 46
Tabela 2.7. Përbërësit e reaksionit të klonimit ............................................................ 47
Tabela 3.1. Rezultatet e matjeve spektrofotometrike të sasisë dhe cilësisë së ADN
gjenomike sipas Doyle & Doyle (1987) i modifikuar ................................................. 51
Tabela 3.2. Rezultatet e matjeve spektrofotometrike të sasisë dhe cilësisë së ADN
gjenomike sipas GenElute TM Plant Genomic DNA Kit (SIGMA) G2N-70 ............. 52
Tabela 3.3. Rezultatet spektrofotometrike të cilësisë dhe sasisë së ARN totale të
ekstraktuar sipas Young et al. 2007 ............................................................................. 53
Tabela 3.4. Përbërja e vajrave esenciale të popullatave të Shqiperisë së veriut
(monoterpenet dhe seskuiterpenet kryesore) ............................................................... 72
x
LISTA E FIGURAVE
Figura 1.1. Sherbela të llojeve të ndryshme.................................................................. 1
Figura 1.2. Sherbela të llojeve të ndryshme.................................................................. 2
Figura 1.3. Hartë shpjeguese e përhapjes së sherbelës në botë. (Allen 2014) .............. 4
Figura 1.4. Biosinteza e IPP dhe DMAPP në rrugëkalimin mevalonik (majtas) dhe në
atë jo-mevalonik (djathtas) .......................................................................................... 14
Figura 1.5. Përshkrim skematik i biosintezës së klasave të ndryshme të terpeneve ... 15
Figura 1.6. Përzgjedhja e monoterpeneve të përftuar nga geranyl difosfati (GPP). ... 16
Figura 1.7. Paraqitje skematike e veprimit të klasave të ndryshme të terpen-
sintetazave .................................................................................................................... 18
Figura 1.8. Protokoll përgjithësues për klonimin e gjeneve dhe krijimin e librarive
gjenomike (sipas T.A.Brown, 2010 ) ........................................................................... 27
Figura 1.9. Skemë e përgjithshme mbi metodat e klonimit të ADN gjenomike
(A.Bacu, 2012) ............................................................................................................. 28
Figura 1.10. Aparati i Gaz-Kromatografit .................................................................. 36
Figura 2.1. Momente pune nga marrja e mostrave ..................................................... 37
Figura 2.2. Pamje nga puna për ekstraktimin e acideve nukleike dhe dokumentimi i të
dhënave ........................................................................................................................ 39
Figura 2.3. Harta e popullatave të Shqipërisë të veriut të marra në studim ................ 39
Figura 2.4. Nga puna në laboratorëte Bioteknologjisë Molekulare, FSHN, UT dhe
pranë Universitetit “Ioan Cusa”, Rumani .................................................................... 41
Figura 3.1. Krahasimi i cilësisë së ADN-së të sherbelës së ekstraktuar duke përdorur
të dy metodat ................................................................................................................ 52
Figura 3.2. Krahasimi i sasisë së ADN-së të sherbelës së ekstraktuar duke përdorur të
dy metodat .................................................................................................................... 53
Figura 3.3. Produktet e shumëfishimit të cpADN nga 13 popullatat e sherbelës së
Shqipërisë së veriut ( 43 gjenotipe) me çiftin e primerave trnL-trnF .......................... 54
Figura3.4.(A) Produktet e marra nga prerja e amplikoneve të PCR me primerat trnL-
trnF me enzimën prerëse TaqI për 43 gjenotipe të Salvia officinalis .......................... 55
Figura3.4.(B) Produktet e marra nga prerja e amplikoneve të PCR me primerat trnL-
trnF me enzimën prerëse AluI për 43 gjenotipe të Salvia officinalis ......................... 56
Figura 3.5.(A) Dendrograma e afërisë për 43 gjenotipe (13 popullata) të sherbelës
bazuar në përmasat e produkteve të prerjes restriktive të fragmenteve të cp-ADN
(Enzima AluI) .............................................................................................................. 56
Figura 3.5.(B) Dendrograma e afërisë për 43 gjenotipe (13 popullata) të sherbelës
bazuar në përmasat e produkteve të prerjes restriktive të fragmenteve të cp-ADN
(Enzima TaqI) .............................................................................................................. 56
Figura 3.6.A/B Kontributi i enzimave prerëse AluI dhe TaqI në zbulimin e diversitetit
gjenetik ndërmjet fragmenteve të cp-ADN për popullatat e sherbelës të Shqipërisë së
veriut ............................................................................................................................ 58
Figura 3.7. Shpërndarja grafike e kontributit të dy enzimave AluI dhe TaqI në
diskriminimin e individëve. ........................................................................................ 59
Figura 3.8. Dendrograma e ndërtuar mbi bazën e të dhënave të PCR-RFLP mbi
cpADN e 43 gjenotipeve të sherbelës së veriut të Shqipërisë, të marra nga të dy
enzimat TaqI dhe AluI ................................................................................................. 60
Figura 3.9. Afëria ndërmjet popullatave sipas të dhënave të PCR- RFLP mbi cpADN
...................................................................................................................................... 60
Figura 3.10. Produktet e shumëfishimit të templatit ADN gjenomike dhe ARN totale
për 13 popullatat me anë të Sbs350/Sbs1010 .............................................................. 61
xi
Figura 3.11. Produktet e shumëfishimit me anë të Sbs350/Sbs1010 nga templat ARN
-je ................................................................................................................................. 62
Figura 3.12. Profilet e prerjes restriktive për popullatën e Krujës .............................. 63
Figura 3.13. Profilet e prerjes restriktive për popullatën e Postribës .......................... 63
Figura 3.14. Profilet e prerjes restriktive për popullatën e Torovicës ........................ 63
Figura 3.15. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Shkodrës ....................................................................................................................... 65
Figura 3.16. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Malësisë së Madhe (Grishaj) ....................................................................................... 66
Figura 3.17. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Torovicës...................................................................................................................... 66
Figura 3.18. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Rubikut ......................................................................................................................... 66
Figura 3.19. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Krujës ........................................................................................................................... 67
Figura 3.20. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Balldrenit...................................................................................................................... 67
Figura 3.21. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Fushë Milot-it............................................................................................................... 67
Figura3.22. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Lezhës .......................................................................................................................... 68
Figura 3.23. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Lohes ............................................................................................................................ 68
Figura 3.24. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Postribës ....................................................................................................................... 69
Figura 3.25. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Shëngjinit ..................................................................................................................... 69
Figura 3.26. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Ulzës ............................................................................................................................ 70
Figura 3.27. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Valbonës ...................................................................................................................... 70
Figura 3.28. Përmbajtja në kategoritë kryesore të monoterpeneve dhe sesquiterpeneve
në popullatat e Shqipërisë së veriut ............................................................................. 73
Figura 3.29. PCA-Biplot i grupon popullatat në studim në varësi të përmbajtjes së
vajrave esenciale .......................................................................................................... 74
Figura 3.30. Paraqitja grafike e kontributit të çdo përbërësi të vajrave esenciale tek
popullatat e sherbelës së Shqipërisë së veriut në raport me njëri-tjetrin ...................... 74
xii
HYRJE
Gjinia Salvia përfaqësohet nga mbi 950 specie të shpërndara në të gjitha kontinentet,
të karakterizuara me ndryshueshmëri të mëdha morfo-biologjike e me interes të madh
tregtar e ornamental. Ndër to, Salvia officinalis L. është ndër më të vlerësuarat për
përmbajtjen e vajrave esenciale, të cilat së bashku me pjesët vegjetative të bimës
gjejnë përdorime të shumta në mjekësi dhe kulinari.
Përbërësit kryesorë të identifikueshëm në vajrat esencialë të sherbelës janë 40, ndër të
cilët terpenet e llojeve si α- dhe β-tujoni, kamfor, 1,8-cineol, humulene, acetat bornil,
limonene, viridiflorol, karafileni, manool (Asllani, 2000; Velickovic et al., 2003;
Grausgruber-Gröger et al., 2012; Said-Al Ahl et al., 2015; Couladis et al., 2012, etj).
Megjithatë, raportime nga vende të ndryshme të botës tregojnë variabilitet në
përbërjen e vajrave esenciale.
Terpenet janë grupi më i madh i produkteve natyrore bimore, i cili përfshin së paku
30,000 përbërës (Connolly & Hill, 1991). Sot njihen skeletet karbonike të qindra
terpeneve të ndryshme (Aubourg et al., 2002; Dudareva et al., 2003; Tholl, 2006a);
monoterpeneve (C10) (Dewick, 1999), sesquiterpeneve (C15) (Fraga, 2006),
diterpeneve (C20) (Hanson, 2000) dhe triterpeneve (C30) (Connolly & Hill, 2005).
Ata janë kontribuesit kryesorë të arsenalit kimik të bimëve dhe mikroorganiznave, me
rol kryesor në ruajtjen kundër dëmtuesve, tërheqjen e inekteve për kryerjen e
pllenimit dhe sinjalizimit të bimëve të tjera. Në një luftë konstante midis presë dhe
grabitqarëve, profili kimik i terpenoideve të prodhuara nga një organizëm duhet të
evolojë dhe përshtatet në mënyrë të shpejtë në atë që quhet gara e bashkë-evolucionit
(Ehrich and Raven, 1964; Harborne, 1993). Prandaj terpen-sintetazat, enzimat kyçe në
biosintezën e terpenoideve, janë një model tërheqës për studimin e evolucionit të
funksionit të enzimave.
Bazuar në sekuencat e aminoacideve, TPS ndahen në gjashtë nënfamilje, TPS-a deri
TPS-f dhe kanë origjinë evolucionare nga një substrat i vetëm (Bohlmann et al.,
1998). Këta katalizatorë konvertojnë prenil difosfatet aciklike dhe skualenet në forma
të ndryshme ciklike dhe aciklike. Biosinteza e terpeneve (Wise & Croteau, 1999;
Cane, 1999) dhe në veçanti e monterpeneve (Davis & Croteau, 2000; Tholl, 2006;
Christianson, 2006) është studiuar në detaje tashmë, por ende vijon puna për të
kuptuar kujt i dedikohet larmia e këtyre produkteve.
Monoterpenet janë klasa më e thjeshtë e terpenoideve, të cilat e kanë prejardhjen nga
difosfati i izopentenilit (IPP) dhe izomerit alelik të dimetilalil di fosfatit (DMAPP).
Tek bimët, ky prekursor qëndror sintetizohet në plaste. Monoterpenet dhe diterpenet
biosintetizohen në plaste (kloroplaste, kromoplaste, leukoplaste), ndërsa sekuiterpenet
në citoplazmë (Crozier et al., 2006).
Monoterpene sintetazat (ciklazat) janë enzimat kyçe në biosintezën e monoterpeneve
(Croteau,1987) pasi ato kanalizojnë ciklimin e geranil difosfat (GPP/GDP), i cili është
ndërmjetësi i biosintezës së izoprenoideve universale aciklike (C10) në skeletet
specifike të monoterpeneve (El Tamer et al., 2003; Schwab et al., 2001).
Me sa duket, numri i madh i TP i dedikohet jo vetëm shumëllojshmërisë së enzimave
përgjegjëse për biosintezën e tyre, por edhe aftësisë së këtyre katalizatorëve për të
formuar produkte shumëfishe nga një substrat i vetëm. Kjo tregon se kjo klasë
enzimash mund të ketë mekanizma unike për të kontrolluar ciklet e karbokationeve.
xiii
Monterpen-sintetazat janë të tretshme, dhe gjenden në plaste në kushte in vivo
(Bohlmann et al., 1997). Analizat e sekuencave koduese të tyre në bimë të ndryshme
kanë treguar rajone të konservuara dhe karakteristika strukturore, numër të barabartë
intronesh dhe përmasa të ngjashme të ekzoneve, si dhe pozicion të njëjtë të tyre
(Bohlmann et al., 1998).
Raportimet mbi kapacitetin e një terpen-sintetaze të vetme për të prodhuar produkte
shumëfishe shpesh lidhen me veçoritë e gjeneve të tyre koduese. Vitet e fundit një
numër gjenesh të këtij lloji janë klonuar dhe karakterizuar nga specie të kategorive të
gjimnospermëve dhe angjiospermëve, sherebela (Wise et al., 1998), koniferet (Abies
grandis dhe Taxus brevifolia) (Trapp & Croteau, 2001), hardhia (Vitis vinifera)
(Martin dhe Bohlmann, 2004), çaji (Melaleuca alternifolia) (Shelton et al., 2004),
mandarina (Citrus unshiu) (Shimada et al., 2004; Shimada et al., 2005), etj.
Një bimë, e cila prodhon një gamë të gjerë monoterpenesh është Salvia officinalis.
Zakonisht speciet e Salvia officinalis prodhojnë kategori të ndryshme të metabolitëve
sekondarë, shumë prej të cilave janë studiuar për rolin dhe përfitimet e tyre në
funksione të ndryshme biologjike (Balandrin et al., 1985). Kjo klasë e metabolitëve
sekondarë në bimët e larta prodhohen nëpërmjet një rruge konvencionale të acidit
acetat-mevalonik, e cila operon kryesisht në citoplazmë dhe mitokondri dhe sintetizon
kryesisht sterole, seskuiterpene dhe ubikinone.
Në plaste, ndodh rruga e acidit jo-mevalonik dhe sintetizon hemi-, mono-, sesqui-,
dhe diterpenet bashkë me karotenoidet dhe bishtat fitolikë të klorofilave (Singh &
Sharma, 2015).
Popullatat eSalvia officinalis L. të Shqipërisë janë studiuar për një kohë të gjatë për
qëllime tregtare por kohët e fundit kanë qenë objekt studimi i diversitetit gjenetik të
tyre kryesisht në popullatat e Shqipërisë qëndrore dhe jugore (Bacu et al., 2003, 2004,
2005; 2011, etc).
Ky punim konsideron popullatat e Shqipërisë të veriut, të cilat përgjithësisht shfaqin
një diversitet të ulët morfologjik. Duke e konsideruar biodiversitetin e popullatave
natyrale të sherbelës si një pasuri kombëtare, për vlerat e veçanta që ofron përdorimi i
bimës dhe i vajrave esenciale, ky punim synoi të qartësonte shumëllojshmërinë e
gjeneve koduese për monoterpen-sintetazat, një nga grupet kryesore të enzimave që
kontrollojnë prodhimin e monoterpeneve, dhe lidhjen e rezultateve me përbërjen në
monoterpene të vajrave esenciale të tyre.
Monoterpenet janë ndër përbërësit më të vlefshëm të vajrave esenciale të sherbelës
dhe të gjithë bimëve aromatike-mjekësore dhe nivelet e tyre mendohet se mund të
kontrollen bazuar në principin e transkriptimit (Dudareva et al., 1996; McConkey et
al., 2000; Mahmoud and Croteau, 2003; Mahmoud et al., 2004; Xie et al., 2008; Lane
et al., 2010; Schmiderer et al., 2010). Megjithatë, jo të gjitha monoterpenet
kontrollohen në këtë nivel (Xie et al., 2008; Schmiderer et al., 2010).
Metodologjia e ndjekur në këtë studim u bazua në shumëfishimin me PCR të një
fragmenti gjenik qëndror të MTP nga ADN gjenomike dhe ARN totale për të
verifikuar praninë e introneve. Fragmentet e shumëfishuara me përmasat e pritshme u
klonuan dhe rekombinantët u identifikuan sipas parimit të ngjyrimit të kolonive
bakteriale në prani te X-Gal (Kiti i Iinvitrogen) sipas strategjisë të klonimit të
Sambrook (1989).
xiv
Meqënëse, përmasat e MTP-ve të shumëfishuara nga modele të gADN dhe ARN
totale ishin identike, çka do të thotë se rajoni i shumëfishuar ishte kodues në të gjitha
popullatat, u vendos të përzgjidhen për studim të mëtejshëm popullatat më të veçanta.
Monoterpen-sintetazat kanë origjine plastidike, ndaj u vendos që të izolohej cp-ADN
nga të trembëdhjetë popullatat dhe me anën e primerave intergjenike (trnL/F) (sipas
Walker, 2004) u vlerësua bazuar në PCR-RFLP diversiteti i rajonit të shumëfishuar.
Fenomeni i konservimit të gjenomave organelare është studiuar ndër vite për të
dizenjuar primera universalë, të përshtatshëm për të shumëfishuar rajone jo-koduese
polimorfike të cpADN-së të disa algave, briofiteve, pteridofiteve, gjimnospermeve
dhe angjiospermëve (Taberlet et al., 1991; Ibrahim et al., 2012), rajone jo-koduese të
mitokondrive dhe cpADN-ve (Demesure et al., 1995), rajone koduese të cpADN-ve
(Badenes and Parfit, 1995; Tsumura et al., 1996) si dhe gjithë gjenomën kloroplastike
(Dhingra and Folta 2005; Ibrahim et al., 2007; Rashid et al., 2012).
Rajoni inter-gjenik trnL-F dhe sekuencat e gjenit rbcL të cpADN-së janë përdorur për
të studiuar Salvian dhe llojet e përafërta (Walker, 2004; Ibrahim, 2012; Li, 2013) për
të përshkruar lidhjet filogjenetike tek Lamiaceae. Speciet e Salvia të grupuara bazuar
në origjinë (Clebsch, 2003) treguan se rezultati ishte në përputhje me studimin e
Walker (2004), pavarësisht se në studim u perdorën pjesë të ndryshme te cpADN. Po
ashtu, të gjitha speciet e Salvia të përfshira në studimin e Ibrahim (2010) dhe Walker
(2004) u grupuan sipas origjinës.
Në studimin tonë, paralelisht me vlerësimin e diversitetit gjenetik të gjeneve MTP,
nga popullatat u izoluan vajrat esenciale dhe me anë të GC u përcaktua përmbajtja e
monoterpeneve në to.
Rezultatet e metodave të vlerësimit të bazuara në cp-ADN dhe gaz-kromatografi,
treguan se popullatat mund të grupoheshin duke veçuar si më uniket popullatat e
Krujës, Torovicës dhe Postribës.
Vlerësimi i mëtejshëm i shumëllojshmërise të fragmenteve të klonuara në këto tre
popullata me anë të prerjes me enzima restriktive, tregoi se ato janë të ndryshme edhe
në nivel gjenik.
Në këtë mënyrë, ky punim për herë të parë vlerësoi diversitetin e gjeneve koduese të
MTP të trembëdhjetë popullatave të Shqipërisë së veriut dhe produkteve enzimatike të
tyre, monoterpeneve, dhe tregoi se grupimi i popullatave bazuar në të dyja këto
kategori të dhënash si edhe në variacionin e një rajoni (intergjenik) të cp-ADN
korrelon.
xv
QËLLIMI DHE OBJEKTIVAT
Qëllimi i këtij punimi është:
Vlerësimi i shumëllojshmërisë së gjeneve koduese të monoterpen-sintetazave dhe
produkteve enzimatike të tyre tek popullata të sherbelës të Shqipërisë së veriut.
Objektivat specifikë të këtij punimi janë:
Izolimi i gjeneve/fragmenteve gjenike koduese të monoterpen-sintetazave me
anë të shumëfishimit të bazuar në homologjinë e gjeneve koduesë të TPs me
anë të PCR (nga gADN dhe ARN totale), klonimin e produkteve (në
plazmidin pTOPO2.1), krijimin e librarive përkatëse në E.coli dhe verifikimin
me anë të prerjes restrikive të diversitetit të fragmenteve të klonuara.
Përcaktimi i produkteve enzimatike finale të gjeneve koduese të MTP me anë të
gaz-kromatografisë (GC) dhe krahasimi sasior e cilësor ndërmjet popullatave.
Analizimi i të dhënave dhe arritja e konkluzioneve mbi ngjashmërinë ndërmjet
popullatave, bazuar në të dhënat e profileve kimike të monoterpeneve dhe
rajoneve specifike të cp-ADNsë së popullatave, me synim të kuptuarit e thelluar
të shprehjes së gjeneve koduese të monoterpen sintetazave.
KONSIDERATA TEORIKE
1
1. KONSIDERATA TEORIKE
1.1. Përshkrim i përgjithshëm i sherbelës (Salvia officinalis)
Sherbela është ndër bimët e njohura qysh nga koha e Romës antike. Sherbela rritet
natyralisht përgjatë rajonit të Mesdheut dhe rajoneve të Europës jug-lindore
(Ballkanike). Sipas klasifikimit botanik ajo i përket familjes Lamiaceae, subfamiljes
Nepetoideae, dhe gjinisë Salvia (Papadhopuli et al., 1976). Emri shkencor i sherbelës
është Salvia officinalis. Emri Salvia rrjedh nga fjala latine "salvere", që do të thotë
"për të shpëtuar" për shkak të aftësive të saj mjekësore (Dweck, 2000). Sherbela rritet
mirë në toka ranore, alkaline në kushte të caktuara të rrezatimit diellor.
Ato mund të jenë bimë shumëvjeçare, dyvjeçare ose vjetore, në varësi të kushteve
gjeografike-klimatike. Rritet deri në 170 cm në gjatësi dhe ka rrënjë karakteristike të
drunjta.Gjethet aromatike kanë ngjyrë jeshile në gri dhe sipërfaqe të butë me push.
Gjatë verës çelin lule me ngjyrë blu në vjollcë nga 2-8 të vendosura në aksin vertikal,
që tërheqin bletët ose insekte të tjera, të cilat mundësojnë pllenimin e mëtejshëm të
bimës (Hedge,1972).
Nisur nga forma dhe madhësia e gjetheve dallohen katër lloje të sherbelës: sherbela
me gjethe tre-segmentëshe, sherbela me gjethe halore, sherbela blu, sherbela clary.
Madhësia dhe forma e gjetheve ndikojnë në përdorimet e ndryshme të saj. Sherbela
me gjethe tre-segmentëshe (S.fruticosa ose S.triloba), ka gjethe të rrumbullakëta, rritet
në rajonin e Mesdheut dhe përdoret gjerësisht për përgatitjen e çajit të sherbelës.
Sherbela me gjethe halore, si të pishës (S.rutilans) ka gjethe të freskëta dhe përdoret
për ti shtuar aromë ëmbëlsirave dhe pijeve.
Figura 1.1. Sherbela të llojeve të ndryshme
A) Sherbela me gjethe si të pishës (S.rutilans). B) Sherbela me gjethe tri-segmentëshe
(S.triloba) (Hedge,1972)
Sherbela clary (S.sclarea) ka gjethe shumë aromatike, përdoret për infuzione fyti,
gargara si dhe në parfumeri. Sherbela blu (S.azurea) është bimë e madhe me lule blu,
e cila njihet në Meksikë si një ilaç çudibërës mjekësor (Bailey, 1924).
KONSIDERATA TEORIKE
2
Figura 1.2. Sherbela të llojeve të ndryshme
C) Pamje e sherbelës blu (S.azurea), D) Pamje e sherbelës Clary (S.sclarea) Bailey,
1924
Në familjen e Lamiaceae-ve, gjinia Salvia është më e pasura në specie (mbi 950), të
shpërndara në të gjitha kontinentet dhe të karakterizuara me ndryshueshmëri të mëdha
morfo-biologjike shumë prej të cilave paraqesin interes të madh tregtar e ornamental.
Më kryesoret renditen si më poshtë:
Tabela 1.1. Lista e specieve kryesore të sherbelës
Nr. Gjinia Nr. Gjinia
1. Salvia apiana 19. Salvia leucantha
2. Salvia argentea 20. Salvia leucophylla
3. Salvia arizonica 21. Salvia lyrata
4. Salvia austriaca 22. Salvia mexicana
5. Salvia azurea 23. Salvia mohavensis
6. Salvia clevelandii 24. Salvia microphylla
7. Salvia coccinea 25. Salvia miltiorrhiza
8. Salvia columbariae 26. Salvia nemorosa
9. Salvia divinorum 27. Salvia officinalis
10. Salvia dorrii – Ute 28. Salvia patens
11. Salvia elegans 29. Salvia pratensis
12. Salvia farinacea 30. Salvia sclarea
13. Salvia fruticosa 31. Salvia spathacea
14. Salvia fulgens 32. Salvia splendens
15. Salvia glutinosa 33. Salvia uliginosa
16. Salvia greggii 34. Salvia verbenaca
17. Salvia guaranitica 35. Salvia verticillata
18. Salvia hispanica 36. Salvia viridis
1.2. Speciet e familjes Lamiaceae të rritura në Shqipëri
Sherbela është një bimë që njihet gjerësisht në vendin tonë. Për shkak të vlerave të saj
mjekësore, aromatike, ekonomike, ekologjike dhe estetike, ajo kultivohet me sukses
në disa rajone. Fakti që disa anëtarë të gjinisë Salvia klasifikohen si specie në rrezik,
është i lidhur me rëndësinë ekonomike të tyre. Të tilla janë Salvia officinalis L. (Sin.
Salvia auriculata Ten), Salvia schlarea L., Salvia triloba L. (Sin. Salvia pomifera),
Salvia pratensis L., Salvia glutinosa L., Salvia hormium L., Salvia verticallata, etj.
KONSIDERATA TEORIKE
3
Për këtë arsye, këto specie janë studiuar për të vlerësuar diversitetin brënda llojor
(ekotipe të ndryshme) bazuar në përmbajtjen kimike të vajrave esenciale (U.Asllani
2000, 2004; Babani, 2005; etj) dhe në nivel molekular (Bacu et al., 2005). Emërtimi
popullor i bimës varion nga rajoni në rajon të Shqipërisë si sherbelë, bedunicë,
delenicë, stërbelë, susbelë, cfagë etj.
Grumbullimi i sherbelës (në ton) sipas KEA (2003) ka qënë si vijon:
Tabela 1.2. Grumbullimi i gjetheve të sherbelës
Bimë 1965 1980 1985 1989 2000 2010
Fletë sherbele 3000 2630 2842 456 1700 2500
Në vitet 2003-2005, me financimin e Bankës Botërore, përmes Projektit të
Shërbimeve Bujqësore (ASP) u bë e mundur mbështetja dhe financimi i Programit të
Koleksionimit dhe Vlerësimit të Gjermoplazmës së bimëve aromatike dhe/ose
mjekësore.
Përmes këtij programi u kryen disa misione për koleksionimin e 11 bimëve kryesore
aromatike dhe/ose mjekësore, ku peshën më të madhe të punës e zinte bima me
rëndësi të madhe ekonomike por e rrezikuar e sherbelës me 116 pika eksplorimi. Këto
kishin një shtrirje nga jugu në veri, kryesisht në rrethet Sarandë, Delvinë, Gjirokastër,
Vlorë, Tepelenë, Përmet, Skrapar, Berat, Elbasan, Tiranë, Krujë, Mat, Lezhë.
1.3. Përhapja gjeografike e sherbelës
Ka mbi 900 lloje të Salvia-s në mbarë botën, gjysma e tyre janë të shpërndara
gjerësisht në Amerikën Qendrore dhe Jugore (500 lloje), ndërsa të tjerët janë në Azinë
Qendrore dhe të Mesdheut (250 lloje), Azinë Lindore (90 specie) dhe në rajonin e
Afrikës së Jugut (30 lloje) (Walker et al., 2004). Gjithashtu sherbela është e
shpërndarë gjerësisht në Europë, në zonën jug-lindore e mesdhetare (Walker et al.,
2004).
Është bimë natyrore në Shqipëri; Bosnjë dhe Herzegovinë; Kroaci; Francë (Korsikë
dhe Franca qendrore); Greqi (Ishujt lindorë të Egianit; Greqia qendrore, Kretë; ); Itali
(Italia qendrore, Sardenja, Siçili); Maqedoni, Mali i Zi, Serbi, Kosovë, Slloveni;
Spanjë (Baleares, Spanja qendrore).
Dhe e huazuar në Andorra; Austri; Belgjikë; Bullgari; Republikën Çeke; Danimarkë;
Gjermani; Irlandë; Luxemburg; Maltë; Moldavi; Norvegji; Poloni; Rumani; Rusi
(Rusia Europiane); Sllovaki; Suedi; Zvicër; Turqi (Turqia Europiane); Ukrainë;
Mbretëri e Bashkuar (Britania e Madhe); sipas Allen 2014 (Fig 1.3)
KONSIDERATA TEORIKE
4
Figura 1.3. Hartë shpjeguese e përhapjes së sherbelës në botë. (Allen 2014)
1.4. Kushtet klimatike – tokësore të favorshme për rritjen e sherbelës
Toka dhe klima
Sherbela është bimë me kërkesa të pakta për tokën. Ajo përshtatet në çdo lloj toke,
sidomos ato malore, shkëmbore e gurishtore. Më mirë zhvillohet në toka gëlqerore, në
vende të ngrohta e të mbrojtura nga erërat. Preferon klimën mesdhetare, kodrinore dhe
malore.
KONSIDERATA TEORIKE
5
Sherbela është një bimë tipike mesdhetare termofile dhe eliofile (temperaturë dhe
dritë dashëse). Ajo përballon klimën kryesisht kontinentale me luhatje të mëdha të
temperaturave, përballon temperaturën e ulët të dimrit dhe lagështirën minimale të
ajrit dhe eviton tokat që mbulohen për një kohë të gjatë nga retë. Sherbela vegjeton
normalisht deri në 700 m mbi nivelin e detit, por arrin të rritet deri në 900 m mbi
nivelin e detit. Ajo mund të adaptohet edhe në toka të tjera nëse toka është e mirë-
drenazhuar dhe me ph mbi 6. Ajo është specie e ndjeshme nga të ftohtit (T < - 10 °C)
dhe toleron pak periudhën me lagështirë të tejzgjatur.
Periudhat e thata të tejzgjatura (Maj–Shtator) të shoqëruara me temperatura të larta
bëhen vdekjeprurëse për 10-20 % të bimëve. Edhe pse sherbela është rezistente ndaj
thatësirës, prania e ujit e rrit prodhimin dhe në ambiente të karakterizuara nga
thatësira verore, lejon një vjelje të dytë vjeshtore. Sipas të dhënave të kohës, janë të
përshtatshme 5-9 ndërhyrje ujore me një volum prej 300 m3/ ha secila. Gjithsesi, ajo
është më e përshtatur me thatësirën sesa me lagështirën e tepërt si të tokës ashtu dhe të
ajrit dhe për një kohë të gjatë, gjë e cila, bëhet vdekjeprurëse për të (Papadhopuli et
al., 1976).
Përbërja e tokës ndryshon natyrën dhe sasinë e lëndëve vepruese të bimëve, gjë e cila
lidhet dhe me rritjen dhe përhapjen e llojeve të bimëve. Përshkueshmëria, lagështira,
kapilariteti si dhe poroziteti ndikojnë në pjellorinë e tokës dhe rendimentin e
prodhimtarisë së saj. Sherbela ka kërkesa për rritje në toka argjilore-gëlqerore
(sherbela) (Papadhopuli et al.,1976).
Klima është ndër faktorët jetik të biodiversitetit. Faktorët që ndikojnë në formimin e
klimës janë gjerësia gjeografike, lartësia mbi nivelin e detit, ekspozicioni i diellit,
afërsia e deteve apo liqeneve etj. Zhvillimi dhe përmbajtja e lëndëve vepruese të
bimëve varet shumë nga temperatura mesatare, pasi e njëjta lloj bime mund të gjendet
në zona të ndryshme klimatike, si rrjedhojë sjellja e saj është e ndryshme
(Papadhopuli et al.,1976).
Ndikimi i kultivimit, moshës dhe plehërimit janë faktorë të tjerë që ndikojnë në
përhapjen dhe vetitë e bimëve mjekësore dhe aromatike. Kultivimi i bimëve ndikon
në vlerat dhe rendimentin e tyre. Në qoftë se bima kultivohet në kushte të njëjta ose të
përafërta klimatiko-tokësore, me ato në gjendje të egër, atëherë ajo mund të rrisë
sasinë e lëndëve vepruese, duke çuar dhe në rritjen e rendimentit, por në të kundërt
ndodh që kultivimi mund të ulë përqindjen e lëndës vepruese.
Ndikimi veprues i bimës varet nga mosha e saj në varësi të pjesës së përdorshme të
bimës. Kur mosha e bimës është e re, vetitë e saj vepruese janë më të ulta, duke
përjashtuar rastet kur bimës i përdoret lëvorja dhe rrënjët. Kur mosha e bimës ka
arritur periudhën e pjekurisë, vetitë e saj janë më të larta (në rastet kur i përdoren
frutat e saj). Pra pjesët e ndryshme të bimës kanë veti të ndryshme në varësi të moshës
në të cilën mblidhet bima.
Ndërsa plehërimi është një indikator pozitiv në vlerat e kësaj bime, nëse ai përdoret
rregullisht dhe duke u përgatitur sipas teknologjisë përkatëse dhe masës së duhur
(Papadhopuli et al.,1976).
KONSIDERATA TEORIKE
6
1.5. Kultivimi i sherbelës në Shqipëri
Pas rënies së sasisë së sherbelës së egër dhe rrezikut për zhdukje në disa zona të
vendit tonë, u nxit kultivimi i kësaj bime mjekësore. Sipërfaqet e mbjella me sherbelë,
janë të ndryshme në zona të ndryshme të Shqipërisë, gjithashtu edhe sasia që vilet.
Pas viteve 1990, kulturës së bimëve aromatike mjekësore ju kushtua rëndësi edhe nga
shteti duke subvencionuar dhe inkurajuar kultivimin e tyre nga popullsia, pavarësisht
se nga tregu i huaj lloji i sherbelës që pëlqehet dhe synohet më shumë është sherbela e
egër. Më poshtë paraqitet një tabelë përmbledhëse e rajoneve të vendit tonë ku
kultivohet sherbela.
Tabela 1.3. Sipërfaqja (ha) dhe potenciali prodhues (në ton) i sherbelës në Shqipëri
Nr Emërtimi i qarkut Sip. (ha) Sasia (ton)
1. Berat (Berat, Skrapar, Kuçovë) 1256 522
2. Dibër (Dibër, Bulqizë, Burrel) 1037 54
3. Durrës (Durrës, Krujë) 140 21
4. Elbasan (Elbasan, Librazhd, Gramsh, Peqin) 116 43
5. Shkodër (Shkodër, M.Madhe, Pukë) 5773 1189
6. Gjirokastër (Gjirokastër, Përmet, Tepelenë) 9232 1174
7. Korçë (Korçë, Pogradec, Devoll, Kolonjë) 260 97
8. Kukës (Kukës, Has, Tropojë) 783 192
9. Lezhë (Lezhë Kurbin, Mirditë) 1599 451
10. Tiranë (Tiranë, Kavajë) 36 3
11. Vlorë (Vlorë, Sarandë, Delvinë) 6178 1000
Burimi: Instituti i Kërkimeve Biologjike, Akademia e Shkencave. (Kathe et al. 2000)
Nga të dhënat, llogaritet që sipërfaqja e kultivuar në vitin 2000 ka qenë 26 377 ha,
ndërsa sasia totale 5 346 ton. Sipërfaqet më të mëdha me sherbelë të kultivuar janë
në qarkun e Gjirokastrës, i cili është edhe një ndër qarqet që jep sasinë më të lartë të
sherbelës në treg, ndërsa qarku që prodhon sasinë më të madhe të kësaj bime është ai i
Shkodrës (Instituti i Kërkimeve Biologjike, Akademia e Shkencave).Industria e bimëve
mjekësore dhe aromatike në vitet 2000u shndërrua në një nga industritë kryesore
agrobujqësore në Shqipëri duke zënë mbi 50% të eksporteve bujqësore, duke bërë që
Shqipëria të konsiderohej si eksportuesja e dytë më e madhe e BMA-ve në Europën
JL pas Bullgarisë (Kathe et al., 2000).
KONSIDERATA TEORIKE
7
1.6. Përdorimet e sherbelës në mjekësi
Në mjekësi sherbela përdoret në dy versione bazë, si bimë (gjethe ose çaj) dhe në
formën e vajrave esenciale.
1.6.1. Përdorimet e bimës
Sherbela ka një nga historitë më të gjata në përdorimin në mjekësi dhe në kuzhinë.
Egjiptianët e lashtë e përdornin si ilaç për kurimin e fertilitetit (Bown, 1995). Në
shekullin e parë fizikanti grek Dioscorides raportoi se tretësira ujore që përftohej pas
zierjes së sherbelës, ndihmonte në ndalimin e hemoragjisë së plagëve, pastronte
ulçerën dhe kolitin. Ai gjithashtu, rekomandoi shurupin e sherbelës në ujë të ngrohtë
për kurimin e kollitjes dhe ngjirjen e zërit. Ajo është përdorur nga herbalistët për të
trajtuar reumatizmën, gjakderdhjet e tepërta menstruale, si dhe tharjen e qumështit të
nënës. Veçanërisht është e njohur për efektin që ka në forcimin e sistemit nervor,
përmirësimin e kujtesës dhe mprehjen e shqisave. Sherbela u rendit në Farmokopenë e
Shteteve të Bashkuara të Amerikës nga viti 1840 në vitin 1900.
Rrënjët e S. miltiorrhiza Bunge (Danshen) janë përdorur në mjekësinë tradicionale
kineze për të trajtuar sëmundjet koronare të zemrës, sëmundjet cerebrovaskulare, lloje
të ndryshme të hepatitit, mosfunksionimit kronik të veshkave si dhe për të stimuluar
qarkullimin e gjakut (Jiang et al., 2005; Li et al., 2008).
Lloje të ndryshme të sherbelës turke janë përdorur si kura për stomakun, por edhe si
diuretike, antiseptike, hemostatike, spasmolitike, gjithashtu edhe si kura kundër
infeksioneve të gojës, përfshirë edhe ftohjet (Topcu et al., 2008). Sherbela greke (S.
fruticosa Miller) është e njohur për përdorimin si erëz ose si përbërës i mjekimeve
popullore kundër dhimbjeve të dhëmbit dhe të zorrëve (Karousou et al., 2000).
Efektet pozitive të përdorimit të sherbelës njihen edhe në Afrikën e Jugut, ku përdoret
për trajtimin e ftohjeve, kollës, dhimbjeve të barkut, diarresë, disepsisë dhe
infeksioneve bakteriale (Kamatou et al., 2008).
Ҫaji i sherbelës ose tretësira e sherbelës është një agjent i vlefshëm në rastet e
gjëndjes së pavetëdijshme dhe temperaturave të larta si dhe në sëmundjet nervore. Ai
është gjerësisht i njohur si ilaç, që jepet në doza të vogla dhe të përsëritura. Përdoret
shumë si tonik stimulues për dobësitë e stomakut, sistemit nervor si dhe
mosfunksionimit të duhur të aparatit tretës në përgjithësi. Ai është konsideruar si një
ilaç i dobishëm në ethet e tifos dhe për disa sëmundje të mëlçisë, probleme të
veshkave, hemoragji të mushkërive ose të stomakut, për ftohjet në kokë, si dhe
dhimbjet e fytit, bajameve, fruthit, për dhimbjet në nyje, letargji dhe paralizë.
Ajo është përdorur për të kontrolluar djersitjet e tepruara në rastet e tuberkulozit të
mushkërive. Një filxhan tretësirë e fortë është e mirë për lehtësimin e dhimbjeve
nervore.Baricevic and Bartol (2000) e kanë vlerësuar S. officinalis sinjë bimë të
rëndësishme mjekësore dhe aromatike, e cila shfaq aftësi biologjike antioksidante,
antimikrobiale dhe antifungale, si dhe mjekësore (antiseptike, antispazmoike dhe
antihidrotike).
Në Gjermani, çaji i sherbelës është përdorur në trajtimin e inflamacioneve. Ekstraktet,
tretësirat dhe vajrat esenciale të sherbelës janë përdorur në ilaçe të përgatitura për gojë
dhe fyt si dhe për lëngjet gastrointestinale. Ato mund të jepen në formë të lëngët ose
në doza të ngurta (Leung dhe Foster, 1996; Wichtl 2004). Sherbela është përdorur në
KONSIDERATA TEORIKE
8
mënyrë efektive për kurimin e infeksioneve të grykës, infeksioneve dentare, mishrave
të infektuara dhe ulçerës së gojës.
Acidet fenolike të sherbelës janë veçanërisht të fuqishëm kundër Staphylococcus
aureus.In vitro, vaji i sherbelës ka treguar të jetë efektiv kundër të dy llojeve të
Escherichia coli dhe Salmonellës, dhe kërpudhave filamentoze dhe majave të tilla si
Candida albicans. Sherbela ka një përmbajtje relativisht të lartë të taninave, për këtë
arsye përdoret edhe për kurimin e diarresë te fëmijët. Sherbela ka një veprim anti-
spasmatik që redukton tensionin në muskujt e butë dhe mund të përdoret në sulmet e
astmës duke mbajtur fytyrën në avullin e ujit të nxehtë ku është zierë sherbela. Kjo
është një zgjidhje e shkëlqyer për të shmangur bllokimet e mukozës së rrugëve të
frymëmarrjes, si dhe për të kontrolluar ose parandaluar infeksionet dytësore.
Sherbela mund të përdoret për kurimin e shtrëngimit dhe simptomave të tjera të
disepsisë, dhe është gjithashtu me vlerë në trajtimin e dismenorreas. Komponenti i saj
i hidhur stimulon disa sekrecione që ndihmojnë në tretjen e ushqimit, lëvizshmërinë e
zorrëve, rrjedhjen biliare dhe funksionimin e pankreasit. Gjithashtu ka efekte
relaksuese gjë që e bën këtë bimë të përshtatshme për trajtimin e nervozizmit, ankthit
dhe marramendjeve. Mendohet se sherbela është e ngjashme me rozmarinën në
aftësinë e saj për të përmirësuar funksionin e trurit dhe kujtesës. Ndërkohë aktiviteti i
sherbelës dhe përbërësve të saj, janë studiuar në kërkim të barnave të reja për trajtimin
e sëmundjes së Alzhaimer, të cilat si duket mund të japin rezultate premtuese
(ESCOP, 1997).
1.6.2. Përdorimet e vajrave esenciale të specieve të ndryshme të gjinisë
Salvia
Vajrat esenciale të specieve të ndryshme të gjininsë Salvia kanë aktivitete biologjike
të jashtëzakonshme dhe veçori të ndryshme farmakologjike, të cilat paraqiten në
tabelën e mëposhtme (Tabela 1.4). Midis tyre përmendim aktivitetin mikrobial,
antioksidant, antikolinesterazë, rregullimin e performancës njohëse dhe gjendjes
shpirtërore, reduktimin e stresit lidhur me punën, aktivitetin antimutagjenik,
antikancerogjen, anti-inflamator, koloretik si dhe dallohen për veçoritë e tyre
toksikologjike.
Tabela 1.4. Përdorimet e vajrave esencialë të llojeve të sherbelës
Aktivitetet
farmakologjike
Gjinia Salvia Vajrat
esencialë
Referenca
Aktiviteti mikrobial
S.officinalis,
S.chloroleuca,
S.przewalskii,
S.santolinifolia,
S.hydrangea,
S. mirzayanii,
S. fruticosa,
S. tomentosa
S.recognita
S.macrochlamys
S.lavandulifolia
1, 8-cineole;
α- pinene;
β-pinene,
β-karafilen;
carvacrol;
1,8- cineoli
dhe kamfori
Bouaziz et al., 2009
Yousefzadi et al.,
2007
Sonboli et al.,2006
C. Rota et al., 2004
Pitarokili et al.,2003
Sarac et al., 2008
KONSIDERATA TEORIKE
9
Aktiviteti antioksidant
S.lanigera Poi,
S.officinalis
S.euphratica
S. fruticosa
S.eremophila
Karvakrol
dhe timol
Stagos et al., 2012
Tenore et al., 2011
Farhat G.N et al.,2001
Yumrutas O et
al.,2012
Papageorgiou et
al.,2008
Ebrahimabadi et
al.,2010
Aktiviteti
antikolinesterazë
S.lavandulaefolia
S. officinalis
S. fruticosa
1,8- cineoli dhe
α-pineni
Kennedy et al.,2011
Perry NS et al.,2000
Perry et al., 2002
Ilkay et al., 2008
Senol et al., 2011
Rregullimi i
performancës njohëse
dhe gjendjes shpirtërore
S.officinalis
S.lavandulaefolia
Kamfori;
Tujonet;
limonen
dhe acetat
bornili.
Moss et al.,2010
Tildesley et al.,2005
Kennedy et al., 2011
Reduktimi i stresit lidhur
me punën
S. sclaria Sabinen;
Kamfen dhe
miriceni
Pemberton et al.,2008
Buckle et al.,2003
Aktiviteti
antimutagjenik
S. officinalis α-/β-tujone;
cineol dhe
kamfor
B. Vukovic´-Gacˇic´ et
al., 2006
Aktiviteti
antikancerogjen
S.officinalis
S.libanotica
S.leriifolia
S.acetabulosa
Linalyl acetate;
terpineol dhe
kamfor
Loizzo et al., 2007;
2010
Itani WS et al., 2008
Aktiviteti anti-
inflamator
S. officinalis Borneol Juhás et al., 2008
Aktiviteti koleretik S. desoleana Β-pinen; p-
cimen; linalool
Peana et al., 1994
Veçoritë toksikologjike S. officinalis dhe S.
libanotica
kamforit, α, β-
tujone dhe
kamfen
Lima et al., 2004
Farhat et al., 2001
1.7. Vajrat esencialë të sherbelës
Termi “vaj esencial” u përdor për herë të parë nga Paracelsus von Hohenheim në
shekullin e 16 për të emërtuar përbërësit efektive të drogës „Quinta essential‟
(Guenther, 1950). Këto përzierje komplekse përbëheshin nga hidrokarbone
terpenoidesh, terpene të oksigjenuar dhe seskuiterpene, të cilat e kishin origjinën nga
metabolizmi sekondar i bimës dhe përftoheshin me distilim dhe ekstraktim (Chamoro
et al., 2011).
1.7.1. Variacioni i përbërësve të vajrave esenciale
Përbërësit madhorë të identifikueshëm në vajrat esencialë të sherbelës janë 40, ku ata
që gjenden zakonisht janë α- dhe β-tujoni, kamfor, 1,8-cineol, humulene, acetat
bornil, limonene, viridiflorol, karafileni, manool (Asllani, 2000; Velickovic et al.,
KONSIDERATA TEORIKE
10
2003; Grausgruber-Gröger et al., 2012; Said-Al Ahl et al., 2015; Couladis et al.,
2012, etc).
Megjithatë, raportime nga vende të ndryshme të botës tregojnë variabilitet në
përbërjen e vajrave esenciale. Kështu, sherbela nga Lituania ka vajrat esenciale të
pasura me manool (20.9%) (Bernotiene et al., 2007) me përbërës dominat 1,8 cineolin
dhe cis-tujonet.
Sherbela nga Brazili ka si përbërës kryesorë α-tujonet, kamfor, α-pinene and β-tujone
(Porte et al., 2013). Mostra të ndryshme nga Egjipti treguan prezencë të kamforit,α -
tujonit, sclareol, β-tujonit, 1,8-cineoli, γ-selinene, α-humulene, karafileni, borneol,
limoneni dhe humulenit (Said-Al Ahl et al., 2015). Sipas Couladis 2002, përbërësit
kryesorë në mostra të ndryshme të Serbisë ishin monoterpene të oksigjenuar si α-
tujoni, β-tujoni, 1.8-cineol, kamfor, borneol dhe acetat bornili.
Midis seskuiterpeneve dominonin α-humuleni, viridiflorol dhe manool. Midis 40
përbërësve të identifikuar në mostrat e Malit të Zi (Stesevic et al., 2014), ato më të
dallueshme ishin cis-tujonet, kamfor, 1,8-cineol, trans-tujonet, kamfeni, borneol,
viridiflorol, limoneni, α-pinene, and α-humuleni. Në të gjitha mostrat e analizuara në
Italinë qendrore (Menghini et al., 2012) 1,8-cineoli është prezent në nivel konstant,
ndërsa ndryshime të mëdha gjenden në përbërësit e α-pinenit dhe α-tujoni i cili mbetet
gjithmonë përbërësi kryesor.
Jug-Dujakovic´ et al, (2012), ka raportuar se midis 62 përbërësve të detektuar në
Bosnjë-Herzegovinë, tetë prej tyre (cis-tujone, kamfor, trans-tujone, 1,8-cineoli, β-
pinene, kamfeni, borneol, dhe acetat bornili) zinin 78.13-87.33% të vajrave esencialë
të popullatave individuale.
Gjithashtu është studiuar përbërja kimike e vajrave esenciale nga sherbela e
Shqipërisë dhe në to u detektuan mbi 40 përbërës, nga të cilat afërsisht 30 mund të
identifikoheshin.
Përbërësit kryesorë të identifikueshëm ishin α-tujoni, β-tujoni, kamfor dhe 1,8-cineoli
(Asllani, 2000; Kongjika et al., 2005; Bacu et al., 2005; Babani et al., 2005).
Në një raport në 2015, Cvektovikj tregoi se në Europën jug-lindore midis 80
përbërësve të detektuar tek sherbela, ata me sasi më të madhe ishin β-pineni, 1,8-
cineoli, cis-tujoni, trans-tujoni, kamfor, borneol, trans-karafileni, α-humuleni,
viridiflorol, dhe manool, të cilat përfaqësonin 42.60 deri 85.70% të përbërësve të
vajrave esencialë të analizuar.
Në ditët e sotme, ISO 9909 dhe German Drug Codex rregullojnë sasitë e përbërësve
në vajrat esencialë për qëllime tregtare. Codex rregullon sasitë e pesë përbërësve,
ndërsa ISO 9909 të 11 përbërësve. Limiti i kufirit të poshtëm të kamforit në German
Drug Codex është 3 herë më i ulët ndërsa limiti i kufirit të sipërm është 1.5 herë më i
lartë se rekomandimet e ISO 9909.
1.7.2. Faktorët që ndikojnë në variacionin e vajrave esenciale
Faza vegjetative
Sasia e monoterpeneve e prodhuar zakonisht lidhet me moshën dhe përmasën e
gjëndrës ose me densitetin e gjëndrave për sipërfaqe të indit bimor. Tek mentja,
monoterpen sinteza dhe akumulimi kontrollohen nga zhvillimi i gjëndrave të vajit
KONSIDERATA TEORIKE
11
gjatë rritjes sezonale. Sasia e monoterpeneve rritet në mënyrë të qëndrueshme kur
gjëndra rritet në numër, për shembull, kur gjëndrat kalojnë një, dy, katër dhe tetë
stadet qelizore të zhvillimit të tyre (Turner et al., 2000a). Sasia e monoterpeneve
gjithashtu rritet gjatë sezoneve. Gjithashtu nga studimet është konsistuar se numri
total i gjëndrave peltate rritet ndjeshëm gjatë fazës vegjetative, gjethet e para të
prodhuara në një sezon kanë 2000 gjëndra secila; ndërsa gjethe të përmasave të
ngjashme më të vonshme në sezon kishin deri në 17.000 gjëndra secila për çdo gjethe
(Colson et al., 1993). Si rrjedhim sasia e vajit esencial rritet me rritjen e numrit të
gjëndrave të vajit në gjethe.
Stinët
Kushtet mjedisore si temperatura, gjatësia e ditës dhe drita influencojnë përbëresit
sasiore të vajrave esenciale (Figueiredo et al., 2008). Këto kushte ndryshojnë në
mënyrë të konsiderueshme (temperatura të larta dhe zgjatja e ditës në muajt e verës,
etj) duke çuar në një model të variacionit sezonal te metabolitëve bimorë, i cili
përsëritet çdo vit.
Shumë kultura bujqësore mblidhen vetëm një herë në vit, ose në fund të zhvillimit të
tyre ose në stadin e prodhueshmërisë më të lartë. Megjithatë, kur mblidhen bimë si
sherbela, situata ndryshon, për shkak se në kushte klimatike të favorshme, mund të
përftohen disa të korrura të ndryshme. Prandaj, rekomandohen njohuritë bazë mbi
influencën sezonale në përbërësit e metabolizmit sekondar të bimës për të përcaktuar
kohën optimale për mbledhjen e saj, me një cilësi të mirë të prodhimit bimor.
Monoterpenet kryesore, cineoli, kamfor dhe α-/β-tujonet tregojnë dinamika të
theksuara gjatë ciklit vegjetativ që është konfirmuar nën kushte gjeografike të
ndryshme (Pitarevic et al., 1984; Putievsky et al., 1986; Belhattab et al., 2005; Maric
et al., 2006). Cineoli në mënyrë të qëndrueshme ulet gjatë periudhave vegjetative
(përafërsisht Maj-Qershor), kamfori arrin pikun në mes të periudhës vegjetative dhe
α-/β-tujonet rriten ndjeshëm gjatë periudhës vegjetative.
Pozicioni gjeografik/klima/pedologjia
Një drejtim i rëndësishëm në lidhje me monoterpen sintetazat është edhe studimi i
faktorëve që ndikojnë në shprehjen e këtyre enzimave. Është supozuar që shumë
faktorë të jashtëm mjedisorë dhe të brendshëm hormonalë ndikojnë në aktivitetin dhe
rendimentin e monoterpen sintetazave, enzimave përgjegjëse për hapin e parë të
reaksioneve të shndërrimit të geranildifosfatit GPP në produkte si tujonet, 1,8-cineoli,
kamfeni etj.
Faktorët mjedisore si temperatura, gjatësia e ditës, dhe drita kanë një influencë të
konsiderueshme në sasinë e kompozimeve që prodhohen nga bimët aromatike
mjekësore si lëndët volatile dhe vajrat esenciale (Figueiredo et al., 2008).
Këto kushte ndryshojnë ndjeshëm dhe në mënyrë të parashikueshme gjatë periudhave
të vegjetacionit (temperatura më të ngrohta dhe gjatësi dite më të gjatë gjatë muajve të
verës, etj), çka ndikon në proçeset metabolike të bimëve në mënyrë të përsëritur çdo
vit. Për këtë qëllim janë kryer disa studime për të kuptuar se si ndikojnë faktorët
mjedisorë në aktivitetin e disa sintetazave duke studiuar në mënyrë të drejtëpërdrejtë
produktet e tyre respektive si sabiene, α-tujon dhe β-tujon, kamfor, dhe bornilacetat.
KONSIDERATA TEORIKE
12
Hormonet bimore
Është provuar tashmë që hormonet bimore luajnë një rol të rëndësishëm në shumë
proçese fiziologjike bimore. Giberelinat rregullojnë proçese fiziologjike të ndryshme
si ndarja e qelizave, mbirja e farave dhe zgjatja e rrënjëve (MacMillan, 2001;
Rademacher, 2000).
Për shkak të efektit të rregullatorëve të rritjes si GA3 dhe daminozidet është studiuar
ndikimi i tyre në shprehjen e gjeneve që kodojnë për monoterpen-sintetazat, si dhe
ndikimi i tyre në morfologjinë e gjetheve dhe në formimin e vajrave esenciale
(Steinborn et al., 2011). Giberelinat (GAs) janë hormone të rëndësishme të bimëve
vaskulare, kërpudhave dhe baktereve, të cilat përmbajnë më shumë se 125
komponime me strukturë të ngjashme. Duke u nisur nga ndikimi i gjerë i këtyre
rregullatorëve bimorë, u studiua efekti i tyre në shprehjen e gjeneve të monoterpen-
sintetazave duke u bazuar në sasinë e produkteve finale që prodhohen kur në bimët e
marra në studim janë aplikuar rregullatorë të jashtëm si GA3 dhe bimë defiçente me
GA, të trajtuara me daminozide të cilat janë bllokues të jashtëm të GA3 .
Nga rezultatet është konkluduarse morfologjia (gjatësia, pesha e thatë, pesha e njomë,
sipërfaqja) e gjetheve dhe përmbajtja e vajrave esenciale për njësi peshe dhe njësi
sipërfaqeje, varet nga mosha e gjetheve po aq sa ndikimi i GA3 dhe inhibitorit të
GA3, daminozidës.
Ndryshimet morfologjike kanë çuar edhe në ndryshime të transkriptimit të tre
monoterpen-sintetazave. Veprimi i një sasie optimale të GA3 (sepse në sasi më të
lartë kishte efekt të kundët), ka sjellë rritje të transkriptimit të të tre monoterpen-
sintetazave, ndërsa veprimi i inhibitorit të GA3, daminozides ka sjellë ulje të niveleve
të transkriptimit të tyre. Rritja e transkripteve të monoterpen-sintetazave nga veprimi i
niveleve optimale të GA3 mund të kenë rezultuar nga dy efekte të mundshme të GA3
aktive: (i) rritje e numrit të trikomave dhe (ii) rritja e rendimentit të prodhimit të
qelizave (Steinborn et al., 2011).
1.8. Terpenet si përbërësit kryesore të vajrave esenciale
Terpenet janë një klasë komponimesh natyrale, pjesa më e madhe me origjinë bimore.
Sipas përkufizimit modern, terpenet janë hidrokarbure me origjinë bimore, me
formulë të përgjithshme (C5H8)n. Ato formojnë më tej derivate të oksigjenuara, të
hidrogjenizuara dhe dehidrogjenizuara.
1.8.1. Veçoritë e përgjithshme të terpeneve
Terpenet janë hidrokarbone organike natyrore të njohura si izoprenoide ose terpenoide
pas oksidimit ose rirregullimit të skeletit karbonik. Të gjitha terpenet e kanë
prejardhjen nga kondensimi i njësisë karbonike izopentenil difosfat (IPP) dhe izomerit
të tij dimetilalil difosfat (DMAPP). Në varësi të njësive të izopreneve të lidhura
bashkë, terpenet klasifikohen në hemiterpene (C5), monoterpene (C10), seskuiterpene
(C15), diterpene (C20), sesterpene (C25), triterpene (C30) dhe tetraterpene (C40).
Pjesa më e madhe e terpenoideve janë pa ngjyrë, lëngje aromatike më të lehta se uji
dhe të avullueshme. Disa prej tyre janë solide p.sh. kamfori. Të gjithë janë të tretshëm
në tretës organike dhe zakonisht të patretshëm në ujë. Shumica e tyre janë optikisht
aktive. Janë molekula me zinxhir të hapur ose komponime ciklike të pangopura, që
KONSIDERATA TEORIKE
13
kanë një ose më shumë lidhje dyfishe. Rrjedhimisht ato i nënshtrohen reaksioneve të
shtimit të hidrogjenit, halogjeneve, acideve etj.
Një numër i produkteve plotësuese kanë veti antiseptike. Ata i nënshtrohen
polimerizimit dhe dehidrogjenizimit. Ata i nënshtrohen lehtësisht oksigjenimit nga
agjentët oksidues dhe në dekompozimet termike, shumica e terpenoideve japin si
produkt isoprenet.
Monoterpenet njihen si përbërës të vajrave të bimëve mjekësore, që përftohen nga
gjethet, lulet dhe frutat dhe se bashku me sesquiterpenet janë përbërësit kryesorë të
vajrave esenciale. Monoterpenet dhe diterpenet biosintetizohen në plaste (kloroplaste,
kromoplaste, leukoplaste), ndërsa sekuiterpenet në citoplazmë) (Crozier et al., 2006).
Monoterpenet janë disa llojesh si:
a) Monoterpene aciklikë që derivojnë nga 2,6-dimethyloctane si nerol, linalool
etj. Roli i monoterpeneve të thjeshta evidentohet më së shumti në komponimet
ku bëjnë pjesë, si psh linalool dhe ocimen, të cilët prodhohen në rastet e
dëmtimit të bimëve nga insektet (Paré W et al.,1997).
b) Monoterpene monociklike që derivojnë nga ciklohekzanet. Një ndër më të
rëndësishmit është limoneni, nje monoterpen, i cili përdoret për prodhimin e
produkteve të tjera optikisht aktive (Schwab et al., 2013).
c) Monoterpene biciklike. Në këtë klasë bëjnë pjesë komponime si sabineni,
kamfori, tujonet, etj. Tujonet përdoren në pije dhe ushqime, ndaj në shumë
vende sasia e lejuar për përdorim është e rregulluar me ligj (Paré et al., 1997).
1.8.2. Biosinteza dhe kompartmentalizimi i terpeneve
Prej shumë vitesh, supozohej se IPP dhe DMAPP sintetizoheshin ekskluzivisht nga
mevalonati në citosol nëpërmjet të ashtuquajturës rrugëkalimi mevalonik (MVA). Në
hapin e parë të kësaj rruge, tre molekula të acetik-koenzimës (Co)A bashkoheshin për
të përftuar
3-hidroksi-3-metilglutaryl CoA (HMG-CoA), e cila më pas reduktohet nga enzima
HMG-CoA reduktazë (HMGR) për të përftuar acidin mevalonik (MVA).
Në dy hapat pasardhës, mevalonat kinaza dhe mevalonat 5-fosfat kinaza fosforilojnë
MVA për të formuar mevalonat 5-difosfatin, i cili më pas dekarboksilohet për të
përftuar IPP (Figura 1.4) (Liu et al., 2005). Fluksi i kësaj rruge rregullohet nga
aktiviteti i HMGR tek gjitarët dhe kërpudhat (Chappell et al., 1995). Studime të
ndryshme të kryera për të provuar rolin rregullator të HMGR-së tek bimët, në
përgjithësi kanë treguar rezultate të diskutueshme.
Vite më vonë për të shuar këto polemika u zbulua një rrugë e re e pavarur nga
mevalonati për sintezën e IPP tek bimët (Rodriguez-Concepcion and Boronat, 2002)
dhe bakteret (Rohmer et al., 1993) (Liu et al., 2005). (Figura 1.4)
KONSIDERATA TEORIKE
14
Figura 1.4. Biosinteza e IPP dhe DMAPP në rrugëkalimin mevalonik (majtas) dhe në atë jo-
mevalonik (djathtas)
Tek bimët e larta, ky rrugëkalim lokalizohet në plastide ku është dhe burimi kryesor
për prekursorët e hemiterpeneve, monoterpeneve, diterpeneve dhe karotenoideve.
Ndërsa prekursorët për sterolet, seskuiterpenet dhe ubikinonet e kanë prejardhjen nga
rruga mevalonike, që realizohet në citoplazmë dhe mitokondri (Lichtenthaler, 1999).
Sipas Estevez (2001) dhe Rodriguez-Concepcion (2001) DXPS është një nga hapat
kufizues në prodhimin e IPP në plaste. Në mënyrë të ngjashme, shprehja ektopike e
DXR-së tek mentja shkakton një rritje në prodhimin e monoterpeneve me 40-60%
(Mahmoud and Croteau, 2001).
Informacioni mbi rregullimin e bashkëveprimit të dy rrugëve MVA dhe DXP është i
pakët (Bouvier et al., 2005, Eisenreich et al., 2004, Rodriguez-Concepcion et al.,
2004). Megjithatë, është vërtetuar shkëmbimi i metabolitëve midis këtyre 2 rrugëve
në studime të ndryshme (Bick and Lange, 2003, Laule et al., 2003, Schuhr et al.,
2003, Dudareva et al., 2005, Hampel et al., 2005, Hemmerlin et al.,2003; Cusidó et
al., 2007).
KONSIDERATA TEORIKE
15
Figura 1.5. Përshkrim skematik i biosintezës së klasave të ndryshme të terpeneve
McCaskill (1995) dhe Laule (2003) demonstruan se ndërmjetësit e gjeneruar në
rrugën DXP kompensojnë fluksin e reduktuar nëpërmjet rrugës mevalonike
(McCaskill and Croteau, 1995; Laule et al., 2003), dhe mbishprehja e HMGR rrit
nivelin e steroleve dhe njëkohësisht të mono dhe seskuiterpeneve. Pra, monoterpenet
(ashtu si hemiterpenet, diterpenet dhe karotenoidet) nuk prodhohen detyrimisht
nëpërmjet rrugës DXP. Megjithatë, natyra e këtij shkëmbimi metabolitesh dhe
rregullimi i tij nuk është përcaktuar ende.
FPP është prekursori për seskuiterpenet (Figura 1.5) në citoplazmë. Terpenet e larta
sintetizohen nga një vazhdim i këtij zinxhiri proçesesh, ose nëpërmjet shtimit të IPP-
së në GGPP për të përftuar sesterpenet (C25) (në plaste) ose nëpërmjet kondensimit të
dy FPP-ve ose dy GGPP-ve për të përftuar triterpenet (C30) në citozol, ose për të
përftuar tetraterpenet (C40) në plaste (Liu et al., 2005).
Një gamë e gjerë terpenesh e gjetur në vajrat esenciale, terpentinat dhe rezinat e
bimëve, prodhohen nga ciklimi i GPP-së, FPP-së ose GGPP-së, dhe gjithashtu nga
KONSIDERATA TEORIKE
16
transformimi i vazhdueshëm i këtyre skeleteve primare nga një seri reaksionesh
izomerike redox dhe lidhjeje.
Shumë monoterpene rezultojnë nga prejardhja e GPP-së dhe rirregullimi i skeleteve
primare të monoterpeneve (Figura 1.6). Meqënëse monoterpenet përfaqësojnë
përbërësit kryesorë të vajrave esencialë tek Salvia officinalis, vetëm sinteza e tyre
sqarohet më në detaje si më poshtë.
Figura 1.6. Përzgjedhja e monoterpeneve të përftuar nga geranyl difosfati (GPP).
Shigjetat me ndërprerje tregojnë rrugët me mundësi ndërveprimesh të shumëfishta
(Wise et al. 1998)
1.9. Terpen-sintetazat përgjigjëse për prodhimin e terpeneve
Sherbela (Salvia officinalis) prodhon një numër të gjërë monoterpenesh ndër të cilat
vendin kryesor e zënë (1)- dhe (2)-α-pineni, (1)- dhe (2)- β-pineni, (1)- dhe (2)-
kamfeni, (1)-sabineni, (1)- dhe (2)- limoneni, mirceni, 1,8-cineoli, dhe (1)-bornil
difosfati. Për këtë arsye, kjo bimë ofron një sistem ideal për studimin e
shumëllojshmërisë së sintetazave terpenoidike, të cilat duke përdorur të njëjtin
substrat prodhojnë produkte të ndryshme, falë ndryshimeve në mekanizmat e
reaksioneve.
Në listën e enzimave më shpesh të gjendura përmendim bornil difosfat-sintetazën
(enzima që prodhon prekursorin e kamforit), 1,8-cineol-sintetazën, sabinen-sintetazën
(enzima që prodhon prekursorin e 3-izotujonit), dhe një numër pinen-sintetazash.
Studimet kanë treguar që një enzimë e vetme, pinen-sintetaza (ciklaza I) është
përgjegjëse për sintezën α-pinenit dhe kamfenit, dhe në sasi më të vogla edhe për
limonenin dhe mircenin. Po ashtu, pinen-sintetaza (ciklaza II) është provuar që
KONSIDERATA TEORIKE
17
prodhon α-pinen, β-pinen, kamfen, dhe në sasira më të vogla edhe limonen, terpinolen
dhe mircen (Gambliel et al., 1984). Së fundmi, një sintetazë e tretë nga sherbela,
ciklaza III, duket se prodhon një përzierje të α-pinenit dhe β-pinenit dhe në sasira më
të vogla mircen. Provat që këto reaksione janë katalizuar nga enzima multifunksionale
individuale, janë përftuar nga purifikimi dhe studime të inhibimit diferencues
(Wagschal et al.,1994).
Krahasimi i madhësive, arkitekturës së nënnjësive dhe shpërndarjes së produkteve të
këtyre enzimave, qartëson funksionet katalitike specifike të monoterpen-sintetazave.
Krahasimi i strukturave primare të monoterpen-sintetazave, që kanë mekanizma të
ndryshme veprimi brenda të njëjtës bimë, lejon arritjen e konkluzioneve mbi
ndërveprimet e siteve aktive dhe krijon mundësi për studime edhe më të detajuara të
lidhjeve strukturë-funksion (Wise et al., 1998)
Shprehja e sintetazave heterogjene prodhon bornil difosfat, 1,8-cineol dhe 1-sabinen
nisur nga geranil difosfati. Bornildifosfat-sintetaza prodhon a-pinen, kamfen dhe
limonen. 1,8-cineol-sintetaza prodhon 1- dhe 2-α-pinen, 1- dhe 2-β-pinen, mircen dhe
sabinen-sintetaza prodhon Ɣ-terpinen dhe terpinelol. Të tre enzimat e mësipërme
translatohen si preproteina. Analizat e sekuencave dhe veçimi sipas masës me anë të
kromatografisë, kanë treguar që bornildifosfat-sintetaza është një homodimer, ndërsa
dy enzimat e tjera janë monomerike (Wise et al., 1998).
GPP, FPP, dhe GGPP sintetizohen nga preniltransferazat, të cilat fuzionojnë DMAPP
me një numër të ndryshëm të njësive izopentenike (IPP). Reaksionet enzimatike të të
gjitha terpen-sintetazave të klasës së pare (I) përfshijnë një faze fillestare gjatë së cilës
substrati prenil-difosfat jonizohet. Klasa II, diterpen-sintetazat, si ent-copalil difosfat
(CPP) sintetaza, katalizojnë një ciklizim të substratit GGPP në CPP.
Terpen-sintetazat bifunksionale (klasa I/klasa II), si abietadien sintetaza, katalizojnë
një ciklizim fillestar të GGPP me CPP, të pasuar nga ciklizimi i CPP dhe një sërë
hapash shtesë drejt formimit të abietadienit. Diterpen-sintetazat e Klasës I i krijojnë
produktet nga CPP ose GGPP. Të gjitha produktet e terpen-sintetazave mund të jenë
objekt i transformimeve të mëtejshme sekondare (Wise et al., 1998).
Monoterpen-sintetazat janë izoluar dhe klonuar nga shumë bimë duke përfshirë këtu
menten, limonin, livandën, Arabidopsis dhe gjimnosperme si fieri (Alonso et al.,
1992; Colby et al., 1993; Wise et al., 1998; Bohlmann et al., 1999; Bohlmann et al.,
2000; Lucker et al., 2002; Dudareva et al., 2003).
Një tipar i përbashkët i monoterpen-sintetazave është dhënia e produkteve të
shumëfishta. Për shembull, limonen-sintetaza prodhon kryesisht limonen por
gjithashtu sasi të vogla të mircenit dhe α-/β-pinenit (McGarvey and Croteau, 1995).
Ky diversitet produktesh flet për origjinën e përbashkët të terpen-sintetazave bimore.
Të gjitha kanë veçori të ngjashme si masa molekulare, që varion nga 50-100kDa
(monomerike ose dimerike), kërkesa për jonin metal divalent si ko-faktor (zakonisht
Mg2+
ose Mn2+
për angjiospermet, K+, Mn
2+, Fe
2+ për gjimnospermet) dhe për pH
optimal thuajse neutral (Bohlmann et al., 1998b).
Monoterpen-sintetazat janë të tretshme, dhe gjenden në plaste në kushte in vivo
(Bohlmann et al., 1997). Analizat e sekuencave koduese të tyre në bimë të ndryshme
kanë treguar rajone të konservuara dhe karakteristika strukturore, numër të barabartë
KONSIDERATA TEORIKE
18
intronesh dhe përmasa të ngjashme të ekzoneve, si dhe pozicion të njëjtë të tyre
(Bohlmann et al., 1998b).
Wise (1998) në një studim mbi 33 monoterpen-sintetaza të përzgjedhura nga specie të
ndryshme bimore (angjiosperme dhe gjimnosperme) tregoi 4 motive të ruajtura
aminoacidesh (McGeady and Croteau, 1995, Wise et al., 1998). Motivet janë
përgjegjëse për aktivitetin enzimatik, koordinimin e kationeve divalente dhe si pasojë
përgjegjëse për lidhjen e substratit dhe jonizimin, respektivisht (Whittington et al.,
2002, Christianson, 2006). Analizat filogjenetike i kategorizojnë terpen-sintetazat
(TPS) në 6 nënfamilje gjenike (të emërtuara TPSa-TPSf). Shumë prej tyre, përfshirë
nga familja Lamiaceae, i përkasin nënfamiljes TPSb (Bohlmann et al., 1998b, Trapp
and Croteau, 2001).
Figura 1.7. Paraqitje skematike e veprimit të klasave të ndryshme të terpen-sintetazave
1.10. Sinteza e monoterpeneve nga Salvia officinalis
Ciklimi i prekursorit universal geranil difosfati për të formuar monoterpene
monociklike dhe biciklike katalizohet nga një grup enzimash të quajtura monoterpen-
sintaza ose ciklaza. Transformimi biokimik i geranil difosfatit në produkte ciklike
është studiuar duke përdorur enzima nga bimë të ndryshme, përfshirë këtu
angjiospermet (Croteau 1987) dhe gjimnospermet (Lewinsohn et al., 1992; Savage et
al., 1994, 1995) dhe është përcaktuar një mekanizëm për këto transformime (Skema
1) (Croteau et al., 1987.; Lewinsohn et al., 1992.; Savage et al., 1994.; Savage et al.
1995.; Wise and Croteau 1998 ). Edhe pse janë sqaruar tashmë një numër i
KONSIDERATA TEORIKE
19
konsiderueshëm reaksionesh ciklimi të monoterpeneve, mekanizmi molekular përmes
të cilit enzimat i kryejnë këto transformime nuk kuptohet ende mirë.
Sherbela prodhon një numër monoterpenesh, duke përfshirë α-pinen, β-pinen, kamfen,
sabinen, limonen, mircen, 1,8- cineol dhe bornil difosfatin (Skema 1) (Croteau, 1987).
Për shkak se sherbela prodhon këtë gamë të gjerë të monoterpeneve aciklike,
monociklike dhe biciklike, duke përfshirë izomerë të ndryshëm olefinash, estere
ciklike dhe estere difosfatike, kjo bimë përbën një sistem ideal për studimin e shumë
sintetazave, ku të gjitha përdorin të njëjtin substrat por prodhojnë produkte të
ndryshme nga variacione mbi një mekanizën të vetëm reaksioni (Croteau 1987; Wise
and Croteau, 1998). Këto përfshijnë bornil difosfat sintetazën (enzimën që prodhon
prekursin e kamforit (Croteau, 1979), 1,8–cineol sintetazën, sabinen-sintetazën
(enzimën që prodhon prekursorët e -3-izotujoneve (Croteau, 1992.; Wise and Croteau,
1998) dhe shumë pinen-sintetaza (Gambliel et al. 1982; Gambliel and Croteau, 1984;
Wagschal et al.,1994; Pyun et al., 1994).
Siç është tipike për ciklazat monoterpenoidike (Wise and Croteau, 1998; Wagschal et
al., 1991), shumë prej këtyre enzimave të sherbelës prodhojnë produkte të
shumëfishta nga geranil difosfati.
Ekzistojnë prova se këto reaksione katalizohen nga enzima individuale
multifunksionale, (Gambliel and Croteau 1984). Pavarësisht përpjekjeve të
konsiderueshme, pinen-sintetaza nuk është ndarë asnjëherë me kromatografi nga
bornil difosfat-sintetaza (McGeady et al., 1995), dhe as pinen-sintetaza nuk është
shkëputur asnjëherë nga 1,8-cineol-sintetaza, edhe pse konsiderata të ndryshme
stereokimike tregojnë se të dyja mund të jenë lloje të ndryshme enzimash (Croteau et
al., 1994).
Terpen-sintetazat janë një familje enzimash, që kodohen nga një klasë gjenike, te cilat
në mënyrë indirekte janë përgjegjëse për katalizën e reaksioneve komplekse
shumëfazëshe, duke prodhuar dhe gjeneruar qindra komponime me struktura të
ndryshme me rëndësi biologjike dhe komerciale (Bryan et al.,2006). Është interesant
fakti që terpen-sintetaza të gjallesave taksonomikisht të largëta (nga kërpudhat te
bimët), të gjitha kanë një rajon tri-dimensional të pandryshuar dhe krahasimi
molekular i siteve aktive të tyre, tregon që ata pasurohen me mbetje aminoacidike
relativisht inerte, që nuk ndikojnë në mënyrë të drejtëpërdrejtë në reaksionet e
ndërmjetme. Mendohet që specifiteti katalitik lidhet me konturet dhe dinamizmin e
siteve aktive (Kampranis et al., 2007).
Pavarësisht nga shkalla e lartë e ngjashmërisë dhe lidhjes së terpen-sintetazave,
studime të mëparshme tregojnë se nuk mund të deshifrohet lehtë lidhja midis
organizimit filogjenik dhe specificitetit katalitik. Duke u bazuar në identifikimin
sistematik dhe zëvendësimet mutacionale të zonave brenda dhe jashtë siteve aktive,
është bërë e mundur të raportohet një ndërkonvertim reciprok midis dy sintetazave me
prejardhje evolutive të njëjtë.
Për më tepër, është zbuluar aktivitet biosintetik gjatë ndërkonvertimit, aktivitet që
mund të ketë qenë i pranishëm tek një paraardhës i përbashkët i këtyre dy sintetazave
shumë të lidhura.
Këto rezultate sigurojnë një mënyrë të thjeshtëzuar për hartimin e karakteristikave
strukturore, që janë përgjegjëse për vetitë funksionale të këtyre sintetazave dhe
KONSIDERATA TEORIKE
20
mundësojnë një strategji për identifikimin e grupeve që çojnë në ndryshimet e
veçorive biosintetike të terpeneve me lidhje filogjenetike.
1.10.1. Ruajtja dhe sekretimi i monoterpeneve
Aty ku sasi të mëdha të terpenoideve hidrofobikë prodhohen dhe akumulohen,
kërkohen zakonisht struktura sekretuese të specializuara. Terpenet ndonjëherë
prodhohen dhe ruhen afër vendeve të dëmtuara ose në afërsi të ndonjë plage
(McGarvey and Croteau, 1995). Të tjera ndodhen në formën e pikëzave në
citoplazmën e qelizave epidermale dhe qelizave të mesofilit të sepaleve (Pichersky et
al., 1994; McGarvey and Croteau, 1995).
Tek Lamiaceae-t prodhimi i vajrave esenciale dhe sekretimi i tyre lokalizohet në
trikomat e specializuara gjëndrore (Fahn, 1988). Keto të fundit janë qime epidermale
të modifikuara që mbulojnë gjethet, kërcejtë dhe pjesë të luleve. Dallohen dy forma të
trikomave të granulave.
Më e vogla, trikoma granulare në formë koke konsiston në një qelizë bazike, një
kërcell të shkurtër dhe një deri në dy qeliza të kokës (Fahn, 1988). Ndërsa trikomat e
granulave peltate janë më komplekse. Ato janë të përbëra nga 8 qeliza sekretuese
(qeliza në formë disku), një kërcell dhe një qelizë bazike, që mbajnë të lidhur
trikomën në epidermë (Fahn, 1988). Sipërfaqja e jashtme e çdo gjëndre mbulohet me
kutikula.
Vaji esencial akumulohet në hapësirat nën-kutikulare, të cilat formohen nga ndarja e
kutikulave prej murit apikal të qelizave sekretuese. Sekretimi i përbërësve të vajit
esencial mendohet se arrihet me anë të difuzionit të volatilëve nëpërmjet kutikulave
ose nga thyerja e kutikulave (Fahn, 1988).
Tiparet ultrastrukturore të trikomave të mentes sugjerojnë se sinteza e monoterpeneve
realizohet në leukoplaste të specializuara brenda tyre. Qeliza sekretuese mature të
trikomave granulare peltate karakterizohen nga leukoplaste të zmadhuara të rrethuara
nga një rrjet endoplazmatik i lëmuar. Këto qeliza kanë mungesë të kloroplasteve,
granave dhe kokrrave të niseshtesë, një tipar që i bën inaktive për fotosintezë (Turner
et al., 2000a), por i ndihmon të realizojnë funksionin e tyre si vende të sintezës të
terpeneve.
Megjithatë, enzimat e përfshira në biosintezën e monoterpeneve nuk gjenden vetem
në leukoplaste. Keshtu, lokalizimi i enzimave të rrugës biosintetike të mentolit tek
mentja tregoi se sintazat e përfshira në hapat e hershme (sinteza e GPP) u lokalizuan
në leukoplaste, por më tej u gjendën në citoplazmë (pulegon reduktaza) ose në
mitokondri (izopiperitinol dehidrogjenaza) (Turner and Croteau, 2004).
Këto zbulime u shpjeguan në një model të propozuar nga Turner (2004), në të cilin
monoterpenet primare, p.sh. limoneni, sintetizohen në plaste, e më pas transportohen
përmes ER për tu modifikuar më tej (Turner et al., 2000a, Turner and Croteau, 2004).
1.10.2. Rregullimi i biosintezës të monoterpeneve
Metabolitët sekondarë, si monoterpenet, kanë një varietet funksionesh ekologjike dhe
rregullohen nga mjedisi ku gjallojnë. Lulet prodhojnë sasitë më të mëdha dhe më të
shumëllojshme të monoterpneve pak para se sythet e luleve të hapen, domethënë kur
KONSIDERATA TEORIKE
21
lulja është gati për pjalmim. Volatilët e çliruar shërbejnë si tërheqës pjalmimi (Raguso
and Pichersky, 1999).
Terpenet gjithashtu funksionojnë si pengues patogjenësh. Mbrojtja indirekte e bimëve
ndaj herbivorëve shpesh përfshin emetimin e induktuar të terpenoideve volatile.
Monoterpenet veprojnë si mbrojtës kundër stresit të temperaturave të larta (Velikova
et al., 2006) dhe emetimi i tyre rregullohet nga niveli i rrezatimit diellor në disa specie
bimore (Staudt and Seufert, 1995).
Tek mentja, e ngjashme me sherbelën, rritja e bimës dhe përftimi i vajrave ndikohen
nga fotoperioda, ditët e shkurtra rezultonin në bimë të kërrusura, me gjethe të vogla
dhe shumë stolone, ndërsa ditët e gjata, densiteti i lartë i fluksit të fotoneve dhe
temperatura e lartë e natës favorizonin drejtimin e bimës, gjethe dhe lule të mëdha dhe
përftim të lartë të vajrave esenciale. Intensiteti i dritës, zgjatja e ditës dhe temperatura
e ambientit gjithashtu ndikonin përbërësit e vajrave esencialë. Ditët e gjata, fluksi i
lartë i fotoneve dhe netët e freskëta favorizojnë akumulimin e më shumë
monoterpeneve të oksiduara si 1,8-cineoli dhe menthoni (Clark and Menary, 1980).
1.10.3. Ndikimi i fazës vegjetative në prodhimin e monoterpeneve
Profili i monoterpeneve të një bime ndryshon gjatë stadeve të ndryshme të zhvillimit
bimor. Dudareva (2003) tregoi se emetimi i β-ocimenit dhe mircenit nga lulet e
Antirrhinum kontrollohej nga gjëndja e zhvillimit: emetimi i monoterpeneve ishte
pothuajse i pakapshëm në lulet e pahapura në ditën e parë, ndërsa rritej ndjeshëm në
ditën e dytë, dhe arrinte kulmin 5-7 ditë pas lulëzimit.
Tek mentja, sasia e monoterpeneve lidhej me stadet e zhvillimit të gjetheve. Ajo ishte
shumë e ulët në gjethet e sapodala, por rritej ndjeshëm pasi gjethja zgjerohej. Kulmi i
biosintezës të monoterpeneve arrinte midis 12-24 ditë pas hapjes të gjethes, dhe në
mënyrë shumë të shpejtë binte kur gjethja arrinte hapjen e plotë (Turner et al., 2000).
Duke konsideruar rëndësinë farmaceutike të çdo përbërësi të vajrave esenciale, shumë
studime konsideronin vlerësimin e variacionit të tyre përgjatë periudhave fenologjike.
Koha më e mirë për marrjen e materialit është periudha fillestare e lulëzimit, nëse
objektivi është përftimi i lartë i α-tujonit dhe gjatë lulëzimit të plotë nëse objektivi
është një nivel i lartë i çdo përbërësi të vajrave esenciale sipas (Arraiza 2002 ).
Studime të tjera konsiderojnë influencën sezonale në formimin e monoterpeneve
kryesore dhe konkludonin se të gjitha monoterpen sintezat influencoheshin nga
kultivarët dhe stina (Grausgruber-Gröger et al., 2012).
1.10.4. Kontrolli i prodhimit të monoterpeneve bazuar në parimin e
transkriptimit
Monoterpenet dhe derivatet e tyre duhet të jenë të disponueshme në çdo kohë, kushte
mjedisore dhe stade zhvillimi, dhe të përmirësojnë mbijetesën e bimës. Ndaj
biosinteza e monoterpeneve dhe emetimi i tyre duhet të jetë gjithmonë sipas
kërkesave të bimës.
Nivelet e monoterpeneve mendohet se mund të kontrollohen bazuar në principin e
transkriptimit (Dudareva et al., 1996; McConkey et al., 2000; Mahmoud and Croteau,
2003; Mahmoud et al., 2004; Xie et al., 2008; Lane et al., 2010; Schmiderer et al.,
KONSIDERATA TEORIKE
22
2010). Megjithatë, jo të gjitha monoterpenet kontrollohen në këtë nivel (Xie et al.,
2008; Schmiderer et al., 2010).
Në këtë studim u vrojtua variacioni sezonal në shprehjen e klasës së gjeneve që
kodojnë për enzimat përgjegjëse për hapin e parë të formimit të monoterpeneve te
sherbela. Shprehja e gjeneve u mat me numrin absolut të kopjeve të transkripteve, pra
të mARN.
Monoterpenet në këto bimë prodhohen dhe akumulohen në trikomat epidermale, ku
sasia më e lartë e akumulimit të monoterpeneve është në gjendrat e indeve të gjetheve
të njoma. Për këtë qëllim, analizat e studimeve zakonisht synojnë përdorimin e
gjetheve të reja për eksperiment, duke qenë se shprehja e gjeneve të monoterpen
sintetazave dhe si rrjedhojë fomimi i tyre është maksimal.
1.11. Gjenet koduese të monoterpen-sintetazave në bimë
S.officinalis prodhon një varietet strukturor të monoterpeneve, ndaj kjo specie është
përdorur gjerësisht për studime në enzimologji, stereokimi dhe reaksione të
mekanizmit të ciklimit të monoterpeneve (Croteau, 1987; Wise and Croteau,1998).
Wise (1998) përshkroi i pari klonimin bazuar në homologji, sekuencimin dhe
shprehjen heterologe të tre monoterpen-sintazave nga gjene të ADN-së të sherbelës,
enzimat rekombinante të të cilave prodhojnë tre tipe monoterpenesh ciklike, sabinenin
(olefine biciklike), 1,8-cineolin (eter biciklik) dhe bornil difosfatin (ester biciklik
difosfatik), respektivisht (Skema 1).
Analizat strukturore të monoterpen-sintazave dhe studime më të detajuara të
mekanizmave të ciklizimit kërkojnë izolimin e cADN-së që kodon këto enzima.
Purifikimi i proteinave nga sherbela, si baza për izolimin e cADN-së, ka pasur pak
sukses (McGeady et al., 1995) për shkak të numrit të sintetazave prezente dhe
ngjashmërisë së tyre në veçori fizike (Alonso et al. 1993).
Si një alternativë e mundshme e klonimit të bazuar në proteina (terpen-sintetaza), u
përdor një strategji e bazuar në PCR (Steel et al., 1995), që u zhvillua nga krahasimi i
sekuencave të cADN që kodonin për një monoterpen sintetazë (Colby et al., 1993),
një seskuiterpen sintetazë (Wise et al., 1998) dhe një diterpen sintetazë (Wise et al.,
1998) të specieve angjiosperme me distanca filogjenetike. U identifikuan tre rajone të
sekuencave të dobishme për hartimin e primerave të PCR-së. Dy nga këto primera
amplifikuan një fragment 600 çb duke përdorur cADN-në e gjetheve të sherbelës si
templat.
Klonimi dhe sekuencimi treguan se produkti i amplifikuar korrespondonte me dy
grupe sekuencash, që tregonin të dyja ngjashmëri me sekuencat e kloneve të terpen-
sintazave, por vetëm një prej tyre hibridizonte një target 2kbp me analizën Northern
blot të mARN-së të sherbelës. Ky prob efikas u përdor për të ngritur librarinë e
cADN-së të gjetheve të sherbelës. Ato u shprehën në terren XL1-Blue me qeliza
E.coli dhe ekstraktet e përftuara u analizuan për aktivitetin funksional të monoterpene
sintazave duke monitoruar konvertimin e [1-3H] geranil difosfatit në monoterpene
oleina, monoterpene të oksigjenuara dhe estere monoterpenildifosfatike.
Një numër publikimesh në vazhdim provuan sukses në izolimin e gjeneve koduese të
MTP në bimë të ndryshme. Kështu, për të karakterizuar gjenet koduese të
monoterpen-sintetazave tek sherbela Mitchel (1998) hartoi një strategji të bazuar në
KONSIDERATA TEORIKE
23
PCR për të izoluar gjenet përgjegjëse. U vu re se cADN-ja kodonte për disa enzima
njëherësh.
Kur ky fragment shprehej tek Eschericia coli, prodhonte një grup enzimash si bornil
difosfati përgjegjës për sintezën e 1,8-kubikinonit dhe sabinenit, α-pienenit, kamfenit
dhe limonenit; Ndërsa 1,8-cineol-sintetaza prodhonte sasi të njëjta të (+) dhe (-)
αpinenit, (+) dhe (-)β pinenit, mikrenit dhe sabinenit; Sabinen-sintetaza prodhonte sasi
të barabarta të γ-terpenit dhe terpinolenit. Të tre këto enzima kodohen nga e njëjta
sekuencë cADN-je e inxhinieruar në E. coli, por dikur e pranishme në bimë.
Bohlmann (1988) përdori primera të dizenjuar bazuar mbi rajone koduese të
monoterpen sintetazave tek bredhi (Abies grandis). Amplikoni prej 300çb u përdor si
prob hibridizues, i cili çoi në 4 fragmente të ndryshme cADN-je nga qelizat e bredhit.
Libraria e cADN-së, e krijuar në këtë mënyrë, kodonte për katër monoterpen-sintetaza
të ndryshme. Shprehja në Escheria coli e ndjekur nga analiza enzimatike në prani të
geranil difosfatit (C10), farnesil difosfatit (C15), dhe geranilgeranildifosfatit (C20)
dhe rezultatet e GC dhe MS, konfirmuan se këto sekuenca kodojnë për katër
monoterpen sintetaza të reja, (-)-kamphen sintetazën, (-) beta- felandren sintetazën,
terpinolen-sintetazën dhe një enzimë, e cila prodhon (-)-limonenin dhe (-)-alpha-
pinenin.
Analizat e sekuencave aminoacidike treguan se këto enzima, të cilat përmbajnë 618
deri në 637 aminoacide (71-73 kDa) dhe translatohen si pre-proteina, përmbajnë një
aminoacid terminal plastidial (plastid targeting sequence 50-60 U). Largimi i një
fragmenti të shkurtër nga cADN-ja u vu re se lejonte shprehjen e formave
“pseudomature”. Nga krahasimi i sekuencave u vu re se këto monoterpen-sintetaza të
reja, tek bredhi janë anëtare të subfamiljes Tps-d dhe ngjajnë me seskuiterpen
sintetazën (C15) dhe diterpen sintetazën (C20) e konifereve.
Në vitin 2011, Falara në studimin e saj për Solanum lycopersicum vërtetoi se gjenoma
e domates ka 44 gjene përgjegjesë për terpen sintetazat (TPS), nga të cilat 29 janë
funksionalë. Nga këto 26 shprehen në të paktën disa organe ose inde të bimës.
Gjenet koduese për MTP veçohen nga ato të terpenoideve të tjera dhe ndahen në tre
klasa: TPS-b, TPS-g dhe TPS-e/f. Soja është një tjetër bimë e pasur me MTP. Man
Zhang (2013) raportoi identifikimin e një gjeni të ri (GmNES) kloroplastik nga farat e
sojës, i cili kodon për nerol-sintetazën.
Izolimi i monoterpen-sintetazave (MTP) si klasë e terpen-ciklazave është studiuar nga
autorë të ndryshëm. E para monoterpen-sintetazë e prodhuar in vitro ka qenë limonen-
sintetaza tek Mentha spicata, e klonuar dhe sekuencuar në nivel gjenik nga Savage,
(1993). Më pas (Savage, 1994) studioi Pinus contorta për identifikimin e enzimës dhe
përbërjen e aminoacideve. Një ekstrakt “cell free” nga ksilema e Pinus contorta u
evidentua sekatalizonte shndërrimin e geranil pirofosfatit në një monoterpen alkalin (i
pranishëm në oleoresinën e pishës).
Më pas, u kuptua se enzima përgjegjëse vepronte në mënyrë të ngjashme me
terpenoid-ciklazat e bredhit (Abies grandis) dhe të bimëve të larta. Megjithatë,
antitrupat specifikë për limonen-sintetazën e angiospermëve, nuk dedektuan praninë e
limonen-sintetazës në këtë ekstrakt, as tek pisha edhe as tek bredhi. Mendohet se
monoterpen-sintetazat e izoluara nga koniferet mund të kenë renditje aminoacidesh të
ndryshme edhe në sitet aktive, krahasuar me ato të angiospermëve.
KONSIDERATA TEORIKE
24
Një evolucion të mirëfilltë solli analizimi në 1999, i monoterpeneve tek Quercus ilex
L. dhe bimët transgjenike të Betula pendula Roth, nga Bohlmann. Izopreni (C5) është
elementi më i emetuar nga bimët, i pasuar nga monoterpenet (C10). Disa specie
bimore i ruajnë monoterpenet në struktura të specializuara (koniferet, Lamiaceae), të
tjera si p.sh lisi (Quercus ilex L.) nuk kanë struktura për ruajtje. Bohlmann (1999)
izoloi dhe karakterizoi monoterpen sintetaza nga Quercus ilex L. 24 cADN u
analizuan me RFLP dhe u klasifikuan në 5 grupe bazuar në hartën restriktive.
Dy prej kloneve të izoluara u shprehën tek E. coli nga ku u vu re se njëri kodonte për
multiprodukt të panjohur të kategorisë së monoterpen-sintetazave, i cili katalizonte
formimin e α-pinenit (41.2 %), sabinenit (34.3 %) dhe β-pinenit (24.5 %)); ndërsa
kloni i dytë i emërtuar QiPINS përbënte një sekuencë të plotë koduese, e cila është
paraqitur në EMBL me kodin AM283099. Bazuar në sekuencën e tij QiPINS u
klasifikua në subfamiljen Tps-b (Bohlmann et al., 1998). Kjo enzimë përmban rajonet
e pranishme në shumicën e monoterpen-sintetazave, të cilat janë mbetjet e argininave
dyfishe (RRX8E) në fundin N-terminal dhe të pasura me aspartat (DDXXD) në
qendrën aktive. Lucker et al., (2002) studioi monoterpen-sintetazat tek limoni (Citrus
limon), meqënëse ai përmban një numër të madh MTP të gjendura sidomos në lëvore.
Gjenet përgjegjëse për prodhimin e monoterpen- sintetazave u izoluan, sekuencuan
dhe cADN u shprehën në mënyrë funksionale tek E. coli. Produktet kryesore të
enzimave në testet me geranil difosfatin si substrat ishin limonen sintetaza, beta-pinen
sintetaza dhe gamma terpinenin sintetaza. Të katërta llojet e enzimave për prodhimin
e 10-17 monoterpeneve zakonisht të vëzhguara tek limoni, korrespondojnë me më
shumë se 90% të produkteve të pranishme (Lücker,et al., 2002).
Në 2004, Shelton studioi monoterpen-sintetazat tek Melaleuca alternifolia, një pemë
australiane e njohur për vajin e pasur me MTP. Ai krijoi një librari klonale cADN-je
dhe 500 sekuenca të shprehura (ESTs) u sekuencuan. Shprehja heterologe e gjeneve
tek E.coli dhe analiza e sekuencave dhe enzimave rekombinante nuk dha si produkt
terpinen-4-ol-it, pjesa më e madhe përbërëse e vajit të kësaj peme, ndaj u gjykua se
nisur nga natyra racemike linalooli mund të mos kishte orgjinë enzimatike.
Në vitin 2004 Shimada T. izoloi katër cADN tek mandarina (Citrus unshiu Marc), të
cilat përmbanin gjenet për monoterpen sintetazat (CitMTSE1, CitMTS3, CitMTS61,
dhe CitMTS62). Nga testet in vitro u demonstrua se ato kodonin për d-lemonen
sintetazën, gama-terpen sintetazën, ɣ- terpen sintetazën dhe β-pinen sintetazën,
përkatësisht. Shprehja e mARN e shumicës së kloneve ishte aktive në fazat e para të
zhvillimit të frutit. CitMTSE1 dhe CitMTS3 u shprehën gjithashtu edhe gjatë
periudhës së lulëzimit duke treguar se kishin një mekanizëm rregullimi të ndryshëm.
Fahnrich (2011) studioi MTP tek speciet Nicotiana, meqë ato kanë karakteristikë të
emetojnë komponentë aromatikë bimorë të të ashtuquajturës “Cineole cassette”, që
përbëhen nga 1,8- cineoli, limoneni, myrceni, α-pineni, β-pineni, sabineni dhe α-
terpineoli. U izoluan gjenettekNicotiana alatadheNicotiana langsdorfiisë bashku me
enzimat koduese, të cilat prodhonin monoterpene karakteristike.
Në familjen Lamiaceae (Labiatae) gjenden disa monoterpen-sinteza përfshirë linalool
dhe limonen sintetazën, të cilat janë klonuar dhe përcaktuar funksionalisht në disa
bimë të familjes Labiatae. Saeidnia (2014) përcaktoi praninë e linaloolit dhe limonen-
sintetazës në katër specie të familjes Labiatae përfshirë Nepeta cataria, Lavandula
angustifolia, Hyssopus officinalis dhe Salvia schlarea duke përdorur teknika të
KONSIDERATA TEORIKE
25
bioteknologjisë molekulare së bashku me analizat “Head space SPME-GC-MS” për të
përcaktuar aromën e këtyre specieve.
Monoterpenet si produkte të metabolizmit sekondar kanë për funksion mbrotjen e
bimës nga dëmtimet mekanike dhe insektet invazive, ndaj transkriptimi dhe
translatimi i gjeneve përgjegjës për to rritet sidomos pas dëmtimeve mekanike.
Gjithashtu, monterpen sintetazat janë rregullatorë të transkriptimit për gjene të tjerë, si
gjenet përgjegjës për sintezën e seskuiterpeneve apo diterpeneve.
Steele (1998) studioi kontrollin e transkriptimit të monoterpen sintetazave tek Abies
Grandis në nivel gjenik duke përdorur probe të shënuara. Në pamje të parë, dukej se
sinteza e të gjitha klasave të sintetazave ndodhte njëkohësisht. Sidoqoftë, pas
studimeve të mëtejshme u vu re se monoterpen- sintetazat sintetizohen më herët, rreth
6 deri në 48 orë.
Terra (2013) përshkroi shprehjen dhe karakterizimin funksional të cADN-së koduese
për monoterpen-sintetazat tek Coffea arabica. Përbërja kimike e pijes së kafes është
mjaft komplekse duke qënë se është e përbërë nga qindra komponentë volatilë dhe jo
volatilë shumica e të cilëve formohen gjatë proçesit të pjekjes. ARN-ja u ekstraktua
nga lulet, farat dhe frutat e C. arabica (cv. Cutai Red) në katër fazat e pjekjes. U
analizua shprehja e gjeneve në inde të ndryshme dhe në faza të ndryshme të zhvillimit
dhe pas shprehjes heterologe të këtyre proteinave në E. coli, u krye analizimi i
aktivitetit enzimatik në kultura in vitro, duke inkubuar proteinat rekombinante me
geranil pirofosfat (GPP), geranilgeranil pirofosfat (GGPP) dhe farnesil pirofosfat
(FPP), prekursorë respektivisht të mono-, di- dhe seskuiterpeneve.
Një aspekt tjetër shumë i rëndësishëm është se monoterpenet bimore janë pjesë e
metabolitëve sekondarë, që ndërmjetësojnë ndërveprimet biotike dhe abiotike duke
dhënë efekt të drejtpërdrejtë në përshtatjen e bimës. Për të vërtetuar këtë dhe
hipotezën se diversiteti i monoterpeneve është i lidhur me diversitetin funksional për
shkak të dublikimit të gjeneve, u kryen studime nga Zapata (2013).
Ai rindërtoi historinë evolutive të monoterpen sintetazave (TPSb) tek speciet Protium,
si edhe ndryshimet taksonomike e kimike në gjininë e pemëve tropikale. U izoluan
kopje shumëfishe të gjeneve TPS-b nga specie Protium dhe u rikrijua filogjeneza e
kësaj familje gjenike. Studimi rezultoi në gjetjen e provave se për një specie të lashtë
dhe për një të vonët, ngjaret e dublikimit kanë çuar në formimin e 3 deri në 5 kopje të
gjeneve TPSb tanimë të pranishëm në Protium.
Në 2014, midis studimeve mbi MTP-të spikatën dy, njëri mbi Eleutherococcus
trifaliatus ngaKulheim dhe tjetri mbixhenxhefilin (Zingiber montanum (Koenig) Link
ex Dietr nga Saoealuck Bua-in. U përcaktua një fragment përgjegjës për monoterpen
sintetazën tek E. trifoliatus duke përdorur një çift primerash degjenerativë
(C. Külheim, 2014). Pas amplifikimit të fundeve të cADN-së (5‟-3‟RACE) u
përcaktua vargu i plotë i ADN-së. Gjeni i zbuluar EtLIM përmban një ORF prej 1752
bp me një masë molekulare 67.3 kDa dhe shprehet në gjethet e reja, trupin e bimës
dhe në frut. Produkti i gjenit EtLIM është identifikuar me gas-kromatografi/ mass
spektrometri (GC/MS) si limonen.
Xhenxhefili është një tjetër bimë me përmbajtje të lartë të terpenoideve në vajin e tij.
Për këtë arsye është studiuar shprehja e gjeneve për MTP dhe mënyra sesi dëmtimet
mekanike mund të influencojnë në transkriptimin e tyre. Një transkript i ZMM1 u
detektua pothuajse vetëm në gjethe dhe çlirohej mbas dëmtimit të tyre.
KONSIDERATA TEORIKE
26
Salvia officinalis, një nga bimët më të rëndësishme për industrinë farmaceutike është
e pasur në vajra esenciale të prodhuara nga gjethet e reja, që përbëhen nga
monoterpenet 1,8 kineol, α- thujoni, β-thujoni dhe kamfuri (produkte të 1,8- kinol
sintetazës, (+) - sabinen sintetazës dhe (+) – bronil difosfat sintetazës, përkatësisht)
(Mitchel et al., 1998). Studime të kryera tek Salvia officinalis nga Grausgruber-
Gröger (2012) për ndikimin sezonal në shprehjen e gjeneve koduese te monoterpen-
sintetazave tregojnë se prania dhe sasia vareshin nga kultivari dhe koha e vlerësimit.
Në nivel transkriptimi terpen-sintetazat tregonin një maksimum në mes të periudhës
vegjetative dhe më pas rënie;
Studimi i biosintezës dhe emetimit të monoterpeneve nga stimulimi prej të ushqyerit
të herbivorëve, ishte një tjetër drejtim i rëndësishëm studimor për njohjen e faktorëve,
që ndikojnë në sintezën e monoterpeneve. Eksperimentet e kryera në kushte të
kontrolluara në laborator, në sera dhe në fushë, për të testuar se si metil jasmonati
(MeJA) ose dëmtimet do të ndikonin në shprehjen e gjeneve koduese të MTPS dhe
përqëndrimin dhe emetimin e MTP, treguan se MeJA luan rolin e represorit tek
Quercus ilex L.
Meqënëse bredhi përbën një sistem model për studimin e dëmtimeve të induktuara tek
koniferët, si për shembull përgjigjen ndaj sulmit të insekteve, kjo specie vijoi të
studiohej nga një numër kërkuesish ndër vite. Oleorezina, e cila është një përzierje
terpenesh (85% monoterpene, 15% seskuiterpene) dhe rosine (diterpen dhe resinë), që
çlirohet gjatë dëmtimeve është toksike për insektet invaduese dhe në këtë mënyrë
shmang efektin e tyre patogjenik. Përpjekje të ndryshme janë bërë për të rritur
prodhimin terpenoidik përmes inxhinierimit të metabolitëve (Cheng et al., 2007).
Studime të tilla datojnë që në 1998 (Bohlmann) kur Bentula pendula Roth një
emetues i dobët i monoterpeneve u tranformua me një fragment kodues (QiMYRS) të
mikren sintetazës i marrë nga Quercus ilex L. Linjat transgjenike u rigjeneruan dhe u
testuan në nivel ADN-je dhe ARN-je. Mungesa e transkriptimit të QiMYRS u
vëzhgua në linjat transgjenike, ndërkohë që transkriptimi i gjenit nptII sillte
inaktivizimin e transgjenit.
Dy ishin arsyet e supozuara të këtij inaktivizimi, njëra mundësia e metilimit të
promotorit 35S dhe tjetra e lidhur me rajonin N-terminal. Kur transgjenikët u testuan
me mass spectrometry (PTR-MS) u vu re se nuk shfaqnin emetim monoterpenesh.
Fenomeni i heshtjes së gjeneve tek transgjenikët, i njohur si PTGS ose RNAi është i
njohur, dhe i raportuar në mjaft publikime që spjegojnë mekanizma të mundshëm të
heshtjes bazuar në aktivizimin e sistemit enzimatik që përdor siARN. Për këtë arsye,
suksesi në prodhimin e transgjenikëve për metabolitë të kategorisë së TPS mbetet një
sfidë e rëndësishme e bioteknologjisë së bimëve.
1.12. Klonimi i fragmenteve të ADN-Parimi
Çdo procedurë për klonimin e ADN ka katër faza kryesore:
Përcaktimin e një metodë për krijimin e fragmenteve të ADN
Reaksionet që bashkojnë ADN-në e huaj me vektorin
Metodën e futjes së rekombinantit artificial në një qelizë mbartëse ku mund të
replikohet
KONSIDERATA TEORIKE
27
Metodën për selektimin e qelizave marrëse që e kanë pranuar rekombinantin
(Figura 1.8).
1.12.1. Libraritë gjenomike dhe Libraritë e c-ADN-ve
Për të kuptuar ekzaktësisht sesi klonimi mund të ofrojë një mostër të pastër të një
gjeni, mbani parasysh se fragmenti i ADN-së që do të klonohet është pjesë e një
përzierjeje të shumë fragmenteve të ndryshme, secili mbartës i një gjeni të vetëm ose
pjese të një gjeni.
Figura 1.8. Protokoll përgjithësues për klonimin e gjeneve dhe krijimin e librarive
gjenomike (sipas T.A.Brown, 2010 )
Kjo përzierje në fakt mund të përfaqësojë gjithë përmbajtjen e një gjenome të një
organizmi, njeriut për shembull. Çdonjëri nga këto fragmente futet në një molekulë
vektoriale më vete për të prodhuar një familje molekulash të ADN-së rekombinante,
njëra nga të cilat përmban gjenin me interes. Zakonisht vetëm një molekulë
rekombinante ADN-je transportohet në një qelizë strehuese të caktuar, kështu që
ndonëse grupi përfundimtar i kloneve mund të përmbajë shumë molekula
rekombinante të ndryshme, çdo klon individual përmban kopje të shumëfishta të të
njëjtës molekulë.
Fragmenti gjenik tashmë mund të veçohet nga të tjerët dhe karakteristikat e tij
specifike mund të studiohen në detaje. Në praktikë, çelësi i suksesit apo dështimit në
një eksperiment për klonimin e gjeneve, është aftësia për të identifikuar gjenin me
interes ndërmjet shumë gjeneve të tjera.
Megjithatë, për të siguruar përftimin e gjenit të duhur me anë të klonimit, mund të
përdoren një numër strategjish. Disa prej tyre përmbajnë modifikime të procedurës
bazë të klonimit, kështu që vetëm qelizat që përmbajnë molekulën e dëshiruar
rekombinante mund të ndahen, dhe kloni me interes për ne seleksionohet
automatikisht.
KONSIDERATA TEORIKE
28
Megjithatë, për të siguruar përftimin e gjenit të duhur me anë të klonimit, mund të
përdoren një numër strategjish (Figura 1.9).
Figura 1.9. Skemë e përgjithshme mbi metodat e klonimit të ADN gjenomike (A.Bacu, 2012)
Disa prej tyre përmbajnë modifikime të procedurës bazë të klonimit, kështu që vetëm
qelizat që përmbajnë molekulën e dëshiruar rekombinante mund të ndahen, dhe kloni
me interes për ne seleksionohet automatikisht. Metoda të tjera përfshijnë metoda që
mundësojnë identifikimin e klonit të dëshiruar nga një përzierje klonesh të ndryshme.
Pas izolimit të klonit, praktikisht nuk ka më kufizim të informacionit që mund të
merret mbi strukturën dhe shprehjen e tij. Posedimi i materialit të klonuar ka nxitur
zhvillimin e metodave analitike të studimit të gjeneve, të pasuruara nga teknika të reja
në vazhdimësi.
1.12.2. Izolimi i gjeneve me anë të PCR
Reaksioni i shumëfishimit zinxhir mund të përdoret për të përftuar një mostër të
pastër të një fragmenti gjenik. Kjo, pasi rajoni që kopjohet gjatë PCR është segmenti
kufijtë e të cilit janë shënuar nga pozicionet e lidhjes së dy primerave
oligonukleotidikë. Nëse primerat lidhen në të dy skajet e gjenit me interes, mund të
sintetizohen shumë kopje të atij gjeni.
KONSIDERATA TEORIKE
29
Rezultati do jetë i njëjtë me atë të eksperimentit të klonimit të gjeneve, megjithëse
problemi i seleksionimit nuk ekziston pasi gjeni i dëshiruar seleksionohet
automatikisht si rezultat i pozicioneve në të cilat lidhen primerat.
1.13. Përdorimi i cpADN-së për të vlerësuar diversitetin gjenetik në popullata të
sherbelës
1.13.1. Veçori të gjenomës kloroplastike
Gjenoma e kloroplasteve (cpADN) trashëgohet nga nëna në shumicën e specieve
angiospeme dhe nga babai në shumicën e gjimnospermëve. Gjendet me shumicë në
gjethe dhe është e mundur të izolohet. Sekuenca e plotë gjenike kloroplastike njihet
vetëm tek disa specie dhe duket se është shumë e ruajtur për sa i përket përmasave,
strukturës, përmbajtjes së gjeneve dhe renditjes së tyre. Egzistojnë primera që mund të
përdoren për studimin e biodiversitetit në të gjithë nivelet taksonomike (Demesure et
al. 1995;
Sekuencat e cpADN-ve dihet se zhvendosen me raste në bërthamë (Baldauf and
Palmer, 1990; Baldauf et al.,1990; Gantt et al., 1991), dhe në fakt egziston një
mbështetje indirekte e konsiderueshme mbi mundësinë e shkëmbimeve ndërmjet
gjenomave të mtADN-së, cpADN-së, dhe nADN-së (Nugent and Palmer, 1991).
Molekula varion në përmasa nga rreth 120 në 217 kb në bimët tokësore fotosintetike,
kryesisht për shkak të tolerancës së rishfaqjes të një rajoni përsëritës, që përfshin
gjenet për nënnjësitë e rARN-së (Zurawski and Clegg, 1987).
Shpejtësia e evoluimit të cpADN-ve përgjithësisht shfaqet e ulët si në terma të
sekuencave nukleotidike primare dhe në terma të rirregullimit gjenik ”gene
rearrangement” (Curtis and Clegg, 1984; Palmer,1990; Ritland and Clegg,1987). Për
shkak të përmasave të mëdha të ADN-së kloroplastike dhe evoluimit të saj të
ngadaltë, shumica e trajtimeve sistematike kanë përfshirë përcaktime të siteve
restriktive ose sekuencave për gjene të veçanta, ose kanë monitoruar shpërndarjet
taksonomike të karakteristikave strukturale unike të cpADN në bimët e taksoneve të
larta (Downie and Palmer, 1992; Walker, 2004; Ibrahim 2012).
Sidoqoftë, egzistojnë edhe disa studime që japin variacione intraspecifike të
pashpjeguara të cpADN-ve (D.E.Soltis et al., 1992).
1.13.2. Përdorimi i cpADN-së për të vlerësuar diversitetin gjenetik në popullata
të sherbelës
Një numër studimesh mbi cpADN-në bimore kanë treguar se rajonet jo-koduese të saj
shfaqin frekuencë më të lartë të mutacioneve, kështu që shumëfishimi dhe sekuencimi
i këtyre rajoneve mund të ofrojë të dhëna me vlerë për tu përdorur në studime
evolucionare dhe për identifikimin e markerëve gjenetikë intraspecifikë (Taberlet et
al., 1991; Walker, 2004; Ibrahim 2012; Li, 2013).
Fenomeni i konservimit të gjenomave organelare është studiuar për të dizenjuar
primera universalë, të përshtatshëm për të shumëfishuar rajone jo-koduese
polimorfike të cpADN-së të disa algave, briofiteve, pteridofiteve, gjimnospermeve
dhe angjiospermëve (Taberlet et al., 1991; Ibrahim et al., 2012), rajone jo-koduese të
mitokondrive dhe cpADN-të (Demesure et al., 1995), rajone koduese të cpADN-ve
KONSIDERATA TEORIKE
30
(Badenes and Parfit, 1995; Tsumura et al., 1996) si dhe gjithë gjenomën kloroplastike
(Dhingra and Folta 2005; Ibrahim et al., 2007; Rashid et al., 2012).
Analiza restriktive e fragmenteve të shumëfishuar me primera universalë është
përdorur në studime për identifikim speciesh, studime të diversitetit gjenetik dhe ato
filogjenetike (Gielly and Taberlet 1994; Badenes and Parfitt et al. 1995; Demesure et
al., 1996; Tsumura et al., 1996; Parducci and Szmidt 1999; Huang and Sun 2000;
Parani et al., 2000, 2001; Wang et al., 2000; Xu et al., 2001).
Shumëfishimi me PCR i rajoneve të cpADN-ve të veçanta dhe rajoneve të mtADN-
ve, të ndjekura nga analiza restriktive (PCR-RFLP) është përdorur gjerësisht për të
analizuar variacione në gjenomën intraspecifike të organeleve në disa specie
(Boscherini et al., 1994; Dumolin et al., 1995; Vicario et al., 1995; Demesure et
al.,1996; Parducci and Szmidt, 1999; Parani et al., 2000, 2001; Xu et al., 2001).
Shkalla e polimorfizmit mund të variojë ndjeshëm përgjatë gjenomës kloroplastike
për shkak të pranisë së ri-rregullimeve mikro dhe makro-strukturale, insertimeve
dhe/ose delecioneve, zëvendësimeve dhe translokacioneve, si edhe inversioneve të
mëdha si në rastin e Oenothera elata dhe Lotus japonicus.
Walker (2004) përdori rajonin inter-gjenik trnL-F dhe sekuencat e gjenit rbcL të
cpADN-së për të studiuar Salvian dhe llojet e përafërta. Gjithashtu Ibrahim (2012;
2006) sekuencoi një rajon 15kbp të cpADN-së të sherbelës. Rajone kloroplastike
(rbcL, matK dhe trnH-psbA) u përdorën nga Li (2013) për të përshkruar lidhjet
filogjenetike tek Lamiaceae në Kinë.
Speciet e Salvia u grupuan bazuar në origjinë (Clebsch, 2003) dhe u pa se rezultati
ishte në përputhje me studimin e Walker (2004) pavarësisht se në studim u perdorën
pjesë të ndryshme të cpADN-së. Të gjitha speciet e Salvia të përfshira në studimin e
Ibrahim (2010) dhe Walker (2004) u grupuan sipas origjinës.
Zhang (2013), në një studim që konfirmon rolin ekologjik të terpeneve dhe na
informon për inxhinierimin metabolik të tyre në bimët transgjenike, karakterizoi një
gjen të ri kodues të nerol-sintetazës të lokalizur në kloroplastet e sojës.
1.14. Analiza RFLP
Përdorimi i Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs) si markerë
gjenetikë u propozua fillimisht në kontekstin e gjenetikës humane dhe i takon kësaj
fushe përdorimi më i shumtë i kësaj ideje. Lidhja e RFLP-ve me lokuse të sëmundjeve
të trashëgueshme është demonstruar në një sërë rastesh dhe përdorimi i tyre si
markerë molekularë në këto kushte është gjithashtu i testuar.
RFLP është një mjet i fuqishëm dhe i besueshëm i përdorur për studime filogjenetike,
për identifikimin e gjenotipeve të veçanta brenda një popullate, për „‟mapping‟‟ e një
popullate dhe kryqëzimet. Për këtë arsye analiza RFLP është me interes të madh për
tu përdorur në programe të përmirësimit të specieve bujqësore.
Me ndikimin më të madh ndër metodat e përdorimit të eseve të ADN-së kanë qenë
hibridizimi ADN-ADN, analizat e RFLP dhe sekuencimi. Secila prej këtyre metodave
aplikohet në mënyrë të suksesshme në klasa të veçanta gjenesh, ose produktesh të
tyre.
KONSIDERATA TEORIKE
31
RFLPs janë përdorur me sukses në një sërë sistemesh gjenetike përfshirë ADN-
mitokondriale, ADN- kloroplastike, ADN- bërthamore, gjenet që kodojnë për rARN,
dhe një sërë kategorish elementesh përsëritës.
Në një laborator të gjenetikës molekulare, enzimat restriktive gjejnë aplikime të
shumta në esetë e ashtuquajtura Restriction Fragment Length Polymorphisms
(RFLPs). Gjithë RFLP-të përfshijnë prerjen e ADN-së me një ose më shumë
endonukleaza, veçimin e fragmenteve rezultuese sipas masës së tyre molekulare me
anë të elektroforezës, dhe vizualizimin e tyre. Dallimet ndërmjet individëve në këto
”profile prerjesh” mund të rezultojnë nga zëvëndësimet e bazave brenda zonave të
prerjeve, shtimeve apo prerjeve të ADN-së, ose ripërshtatjeve të sekuencave, gjatë të
cilave prodhohen ndryshime karakteristike të bandave.
Tre janë parametrat e ndryshueshëm në esetë RFLP, lloji i metodës elektroforetike të
zgjedhur, mënyra e vizualizimit të fragmenteve dhe zgjedhja e ADN-së që do të
analizohet.
Përgjithësisht, fragmentet e ADN-së në xhel denatyrohen në një solucion bazik dhe
transferohen si vargje njëfishe (me anë të kapilaritetit) në një membranë najloni ose
nitroceluloze. Membrana inkubohet me një “prob”(ADN e izoluar dhe purifikuara më
parë), në kushte të tilla që çdo varg në mëmbranë që është komplementar me vargun e
prob-it, hibridizohet me të duke dhënë duplekse radioaktive.
Kështu, probet në fakt “kapin” sekuencat komplementare dhe ato homologe ndër
mijëra ose miliona fragmente të padiktuara, që gjithashtu kanë migruar në xhel. Këto
fragmente me ngjashmëri ndaj probit, më pas janë bërë të dukshme me anë të
autoradiografisë (Southern blot). Probi në hibridizimet Southern identifikon në këtë
mënyrë ADN-në e studiuar në një drejtim specifik.
Ky prob mund të përbëjë për shembull, një fragment gjenik të gjenomit bërthamor apo
citoplazmik, një fragment jo-kodues të një sekuence ADN-je, ose të një ADN-je
mitokondriale të një individi. Nëse probi përmban ADN komplementare me gjene të
shumëfishta, Southern blot ofron fragmente nga gjithë anëtarët e familjes me të cilët
ky prob u hibridizua. Në raste të tilla, Southern blot mund të ofrojnë profile prerjesh
shumë komplekse, në të cilat pothuaj gjithë individët dallohen nga fingerprintet e tyre.
Probet mund të përgatiten me metoda fizike (psh ADN mitokondriale e izoluar me
anë të centrifugimit me bazë gradientin e CsCl), ose normalisht përmes klonimit të
gjeneve të veçanta në vektorë biologjikë (John C.Avise, 1994). Për sekuenca që
evolojnë me lehtësi, përdorimi i probeve mund të shndërrohet në metodë vlerësimi të
diversitetit ndërmjet ose brenda speciesh të afërta, ndërsa për sekuenca që evolojnë
ngadalë probet mund të ruajnë përdorimin në grumbullime taksonomike më të gjera.
Një nga versionet më të përdorura të RFLP është PCR-RFLP, gjatë të cilit produkte
specifike të shumëfishuara me PCR i nënshtrohen prerjes me emzima restriktive, për
të dalluar variacionin në përmbajtje. Pikërisht ky version është përdorur në një sërë
studimesh mbi diversitetin e gjenomave kloroplastike të referuara në nënkapitullin
1.13.2
1.14.1. Enzimat prerëse të ADN-së
Klonimi i gjeneve kërkon që molekulat e ADN-së të priten në mënyre precize dhe të
riprodhueshme. Vëzhgimi fillestar që çoi në zbulimin e endonukleazave restriktive u
KONSIDERATA TEORIKE
32
krye në vitet 50, kur u u vu re se disa baktere janë të imunizuara ndaj infeksioneve
fagale, një fenomen ky i njohur si prerja e kontrolluar nga strehuesi (host-controlled
restriction). Prerja ndodh pasi bakteret prodhojnë një enzimë që degradon ADN-në
fagale para se kjo e fundit të replikohet dhe ti nënshtrohet sintezës së grimcave të reja
fagale.
Enzimat prerëse mund të grupohen në tre klasa kryesore, që dallojnë nga mënyra e
veprimit. Tipet I dhe II janë më komplekse dhe kanë përdorim të kufizuar në
bioteknologji. Tipit të II-të i përkasin ato që i konsiderojmë enzima prerëse me
përdorim të domosdoshëm në klonimin e gjeneve. Karakteristika bazë e
endonukleazave prerëse të tipit të II-të është se çdonjëra ka një sekuencë të njohur
specifike tek ADN-ja ku pret.
Një enzimë e caktuar e pret një molekulë ADN-je në sekuencën e njohjes dhe askund
tjetër. Shumë prej këtyre enzimave njohin zona hegzanukleotidike (të përbëra nga
gjashtë nukleotide), por të tjera presin në zona me gjatësi katërshe, pesëshe, tetëshe
ose edhe më të gjata. Njihen gjithashtu rastet e enzimave me zona njohjeje
degjenerative, dmth që e presin ADN-në në një familje zonash njohjeje. Natyra e
saktë e prerjeve të krijuara nga endonukleazat restriktive është me shumë rëndësi në
hartimin e një eksperimenti për klonimin e gjeneve.
Shumica e enzimave bëjnë një prerje të të dy vargjeve të molekulës së ADN-së, duke
dhënë të ashtuquajturat funde blunt (blunt ends). Të tjera enzima presin të dy vargjet e
ADN-së por jo në të njëjtin pozicion, kështu fragmentet rezultuese të ADN-së kanë
zgjatime njëvargore të shkurtra në secilin nga fundet. Këto funde njihen si funde
ngjitëse (sticky ends), meqënese çiftimi i bazave të tyre mund të riformojë molekulën
e prerë sërish. Një veçori me rëndësi e këtyre enzimave është se endonukleaza
restriktive me sekuenca njohjeje të ndryshme mund të prodhojnë të njëjtat funde
ngjitëse.
1.15. Teknologjia e prodhimit të esencave në rrugë gjysmë industriale
Teknologjia e prodhimit të esencave kalon në disa faza duke filluar me trajtimin e
materialit bimor, përpunimin e tij dhe kromatografinë e gaztë të përbërësve të vajrave
esenciale të renditura si vijon më poshtë.
1.15.1. Trajtimi i materialit bimor para përpunimit
Pavarësisht nga teknologjia e prodhimit të esencave bimore, del e nevojshme që
materiali bimor të parapërgatitet me qëllimin që prej tij të nxirret sa më shumë esencë
me cilësi sa më të mirë dhe me sa më pak shpenzime. Për këtë qëllim, materiali bimor
veçohet, copëtohet, thërmohet (bluhet) apo edhe njomet (sipas rasteve). (Nuro et al.,
2015).
Veçimi kryhet sepse jo të gjithë organet e një bime përmbajnë esencë në sasinë dhe
cilësinë e duhur. Kështu p.sh kërcejtë e thatë të mentes nuk përmbajnë pothuajse fare
vajra eterikë.
Copëtimi përfshin proçesin e prerjes së rizomeve apo të kërcenjve të bimëve që
përmbajnë esencë edhe në kërcej, gjë që bën të mundur ekspozimin e një sipërfaqeje
sa më të gjerë të materialit bimor në proçesin e përpunimit.
KONSIDERATA TEORIKE
33
Thërmimi (bluarja).Ky proçes nuk kryhet në të gjitha rastet sepse gjethet, lulet apo
materiale të tjerë të imët, jo shumë të fortë, distilohen pa qenë nevoja të copëtohen.
Mirëpo ka ograne si p.sh farat e disa bimëve që përmbajnë esencë, të cilët duhen
thërmuar plotësisht që të thyhen sa më shumë muret ndarës të qelizave, gjë që bën të
mundur të nxirret vaji esencial. Rrënjët, kërcejtë si dhe gjithë materialet e tjera të
drunjëzuara duhen prerë në pjesë të shkurtra.
Njomja e materialit bimor para përpunimit ka për qellim zbutjen e membranave
qelizore në mënyrë që gjatë distilimit të shkëputet më me lehtësi vaji esencial. Ky
proçes kryhet p.sh. për farat e anisit, koriandrit etj. por këtu duhet treguar kujdes sepse
materiali bimor që njomet është e mira të kalojë menjëherë për distilim, në të kundërt,
për shkak të avullimit ulet në mënyrë të ndjeshme rrezja e esencës. Gjithashtu
ndodhin edhe ndryshime kimike sepse një pjesë e përbërësve të këtyre esencave kanë
pikë vlimi të ulët dhe si rrjedhim avullohen shumë shpejtë.
Ruajtja dhe magazinimi i materialit bimor para përpunimit kryhet në varësi të
kërkesave të çdo bime dhe ndikon drejtëpërdrejtë në sasinë dhe cilësinë e vajit eterik i
cili nxirret. Në përgjithësi materiali bimor para përpunimit ruhet në ambiente pa
lagështi, në temperatura të ulëta dhe pa qarkullim ajri.
Humbja e vajit eterik para distilatit. Vaji eterik (esenca) që përqëndrohet në indet
bimore, pas vjeljes deri në kohën e përpunimit, për shkak të avullimit, të oksidimit
apo të proçeseve të tjerë kimike largohet në sasi të ndryshme.
Masa e njomë e mentes si dhe gjithë materialet e tjera bimore, me përmbajtje të lartë
lagështie, nuk mund të distilohen plotësisht deri në fund ashtu në gjendje të njomë si
edhe janë. Distilimi i plotë i masës së njomë arrihet me vështirësi të mëdha edhe pas
disa orësh distilimi. Duke e distiluar një pjesë mente në gjendje të njomë (menjëherë
pas korrjes) dhe një pjesë tjetër në gjendje të vyshkur, gati të tharë, del se materiali i
njomë përmban më shumë vaj esencial por për të vazhduar deri në fund distilimin e tij
është shumë më e vështirë.Humbjet e vajit esencial janë më të mëdha gjatë periudhës
nga vjelja deri në magazinim, sesa gjatë magazinimit deri në përpunim. Ky ndryshim
shpjegohet me faktin se gjatë periudhës së parë të vyshkjes dhe tharjes, materiali
bimor përmban një sasi të madhe lagështie, e cila bën që vaji esencial të dërgohet në
sipërfaqen e qelizave mbajtëse dhe kështu ato avullojnë (Nuro et al., 2015). Ndërsa
humbjet e vajit eterik gjatë ruajtjes varen nga mënyra e ruajtjes, kohëzgjatja në
magazinë si dhe shume faktorë të tjerë. Si rregull i përgjithshëm, me pak përjashtime,
lulet, gjethet dhe materialet e tjera bimore delikate nuk durojnë të mbahen gjatë nëpër
magazina, ndërsa farat, rrënjët, rizomat dhe pjesët e drunjëzuara kanë tendencë ti
mbajnë vajrat eterikë për kohë më të gjatë. Mirëpo edhe në këto raste rol të
rëndësishëm luan mënyra e ruajtjes, sasia e lagështisë, temperatura e mjedisit ku
magazinohet materiali bimor e të tjera arsye si këto. Humbja më e madhe e vajit eterik
nga avullimi apo oksidimi ndodh në materialin bimor të thërmuar (të bluar) para
distilimit.
1.15.2. Gaz-kromatografia e Vajrave Esencialë
Kromatografia e gaztë është metoda analitike me përdorim më të gjerë nga metodat e
tjera të ndarjes. Me anë të saj bëhet ndarja e përzierjeve të ndërlikuara në fazë të gaztë
të komponentëve përbërës. Këta analitë të gaztë kalojnë në një kollonë të
përshtatshme dhe shtyhen përgjatë saj nga një eluent në fazë të gaztë. Me anën e kësaj
KONSIDERATA TEORIKE
34
teknike kryhet analiza cilësore dhe sasiore e tyre sepse komponentët përfundojnë të
ndarë nga njëri-tjetri tek një dedektor i përshtatshëm.
1.15.2.1. Parimi i ndarjeve kromatografike
Në qoftë se një përzierje substancash injektohet në kreun e një kolone kromatografike
(në një sistem të hapur apo të mbyllur) qysh në momentin e parë përbërësit e
ndryshëm shpërndahen në mënyra të ndryshme midis fazës stacionare dhe asaj të
lëvizshme (Nuro et al., 2016) Shpërndarja për secilin komponim jepet nga Ligji i
Shpërndarjes:
Ki=Cip/Cil
Ki-Koefiçienti i shpërndarjes për përbërësin i
Cip-përqëndrimi i komponimeve në fazën e palëvizshme
Cil- përqëndrimi i komponimeve në fazën e lëvizshme
Kur koefiçientët e shpërndarjes janë të ndryshëm atëherë ndryshon edhe shpejtësia e
shtegtimit të tyre. Në përqëndrime të vogla të zakonshme për kromatografinë vlerat e
kostanteve të shpërndarjes nuk varen nga përqëndrimet. Proçesi i shpëlarjes nga një
mjet eluues (zakonisht një gaz inert, një solvent apo përzierje e tyre) bën që përbërësit
me K më të madhe pra me tretshmëri të lartë në fazën e palëvizshme lëvizin ngadalë
dhe e kundërta.
1.15.2.2. Analiza gaz-kromatografike
Në kromatografinë e gaztë komponentet e mostrës ndahen nga njëri-tjetri si rrjedhojë
e shpërndarjes së tyre ndërmjet një faze të gaztë të lëvizshme dhe një faze të
palëvizshme që ndodhet në kolonë. Kur faza e palëvizshme është e ngurtë, proçeset e
shpërndarjes bazohen në ekuilibrat e ndajthithjes, kur faza e palëvizshme është një
lëng (që mbartet nga një lëndë e ngurtë inerte), proçeset e shpërndarjes bazohen në
ekuilibrat gaz-lëng dhe mbi këto ekuilibra bazohet dhe metoda e kromatografisë së
gaztë (Nuro et al., 2015).
Ndarja kromatografike bazohet në lëvizjen me shpejtësi të ndryshme në fazën
stacionare të eluuar nga faza e lëvizshme të komponimeve në varësi të koefiçienteve
të shpërndarjes. Aftësia ndarëse e sistemit gazkromatografik shprehet me lartësinë
ekuivalente të pjatës teorike dhe matematikisht jepet nga ekuacioni i Van Demterit:
H = 2λdp + [2γDm / Um] + [8K’ef2 / π
2(1+K’)2Df]Umku:
λ-parametër pa dimension ku merret parasysh çrregullsia e mbushjes së kolonës
dp-diametri mesatar i mbushësit të kollonës
Dm-koefiçienti i difuzionit molekular në fazën e gaztë
Um-shpejtësia lineare e gazit mbartës K’ = K*Fs / F1koeficienti i shpërndarjes
ef-trashësia mesatare efazës stacionare
Df-koefiçienti i difuzionit molekular në fazën stacionare.
Ky ekuacion paraqitet në formë të thjeshtuar:
H = A + B / Um + CUm
KONSIDERATA TEORIKE
35
ku:
A = 2λdp
B = 2γDm
C = [8K’ef2 / π
2(1+K’)2Df]Um
Në qoftë se A,B dhe C do të merren konstante atëhere LEPT do të varej nga shpejtësia
e gazit mbartës dhe kjo do të jetë hiperbolike siç edhe tregohet në figurën 3.1.
Në këtë diagram mund të shihet ndikimi që ushtrojnë termat A,B dhe C në lartësinë
ekuivalente të pjatës teorike:
Termi “A” lidhet me difuzionin turbulent. Sikurëse shihet ky term mbetet konstant
dhe me ndryshimin e shpejtësisë së gazit gjë që flet për një lëvizje laminare të gazeve
nëpër kolonat gazkromatografike panvarsisht nga shpejtësi të ndryshme që ai mund të
ketë. Ky term zvogëlohet me zvogëlimin e diametrit të kokërrizave. Kjo e fundit është
e kufizuar, sepse për kokërriza me diametër shumë të vogël diferenca e presioneve në
hyrje dhe në dalje të kollonës (raporti Pd/Ph) bëhet shumë i madh që nuk merret
parasysh nga Ekuacioni i Van Demterit dhe rrjedhimisht vështirësohet shumë puna në
aparat.
Termi “B”. Për shpejtësi të vogla të gazit vlerat e këtij termi janë mjaft të larta, sepse
në këto kushte difuzioni molekular është relativisht i madh kundrejt shpejtësisë
lineare të gazit. Ky term zvogëlohet me rritjen e shpejtësisë lineare të gazit. Vlera e
këtij termi varet nga lloji i gazit . Për gazet me densitet të lartë si argon dhe azot është
i vogël por zakonisht përdoret helium ose hidrogjen (Nuro et al., 2015). Ndërkaq ulja
e difuzionit molekular ndikon negativisht në proçesin e shkëmbimit të masës.
Termi “C” lidhet me shkëmbimin e masës dmth me koefiçientin e shpërndarjes si dhe
ndikohet drejpërsëderjti nga trashësia e fazës stacionare. Sa më e hollë të jetë kjo
shtresë aq më i madh bëhet koeficienti i difuzionit në fazën stacionare.
1.15.2.3. Aparatura e gaz-kromatografit
Teknika e gaz-kromatografisë është mjaft e rëndësishme dhe me zbatim mjaft të gjerë
ndër teknikat e ndarjes dhe analizën e rendeve mikrogjyrmë. Funksionimi i kësaj
teknike nuk do të ishte aspak i mundur pa aparaturën e gaz kromatografit. Njohja e
kësaj aparature është e rëndësishme sepse na lejon që të sqarojmë bazën teorike dhe
më tej manipulimet e mundshme për ndarje dhe identifikim sa më të mirë të
përzierjeve të komponimeve qoftë dhe në matrica të ndërlikuara (Nuro et al., 2016).
Aparati përbëhet nga këto pjesë kryesore:
Injektori
Kollona kapilare
Furra
Dedektori
Qarku elektronik
Temperatura në teknikën gaz kromatografike luan një rol të rëndësishëm dhe të
veçantë. Ajo duhet të jetë e kontrolluar dhe me stade të përcaktuara qartë. Kjo zgjidh
jo vetëm problemin e të qënit të komponimeve që do të analizohen në fazë të gaztë
KONSIDERATA TEORIKE
36
por edhe në koefiçientin e mbajtjes së komponimeve të ndryshme dhe për rrjedhojë në
shtegëtimin e secilit komponim në kollonë.
Pararqitje skematike e aparatit të gaz kromatografit
Figura 1.10. Aparati i Gaz-Kromatografit
Gazi
mbartës
Injektori Dedektori
Kollona kapilare
Furra
Zona me temperaturë të kontrolluar
Sistemi i të dhënave
Aparati i Gaz Kromatografit
MATERIALE DHE METODA
37
2. MATERIALE DHE METODA
2.1. Materialet
Materiali bimor i analizuar në këtë studim ishte i kategorisë gjethe të njoma (për
analizat e bazuara në acide nukleike) dhe gjethe të thata (për analizat e bazuara në
gaz-kromatografi) të sherbelës (Salvia officinalis L.) nga popullata të Shqipërisë së
veriut. Listat e popullatave dhe gjenotipeve të analizuara paraqiten në seksionet në
vazhdim (Figura 2.1).
Figura 2.1. Momente pune nga marrja e mostrave
Materialet dhe pajisjet laboratorike në dispozicion janë pjesë e Laboratorit të
Bioteknologjisë Molekulare, FSHN, UT.
2.2. Metodat e bazuara në acidet nukleike
Në këtë studim metodat e bazuara në acidet nukleike përfshijnë: ekstraktimin e ADN-
së gjenomike, ekstraktimine ARN-së totale, vlerësimin sasior dhe cilësor të tyre,
vlerësimin e diversitetit të rajonit intergjenik trn të cpADN-së bazuar në PCR-RFLP,
shumëfishimin e fragmenteve gjenike të MTPs nga gADN dhe ARN, klonimin dhe
vlerësimin e përmbajtjes së MTP-ve të vajrave esenciale me anë të GC.
2.2.1 Ekstraktimi i ADN-së gjenomike
Me synim përzgjedhjen e një protokolli të përshtatshëm për akstraktimin e ADN-së
gjenomike, u përdorën dy protokolle, sipas Doyle & Doyle, 1987 dhe GenElute TM
Plant Genomic DNA Kit (SIGMA) G2N-70. ADN gjenomike u ekstraktua nga 65
gjenotipe që u përkisnin 13 popullatave të sherbelës së Shqipërisë së veriut. (Tabela
2.1)
Protokolli Doyle & Doyle (1987)
10mg nga çdo mostër e gjetheve të freskëta homogjenizohet në azot të lëngët
deri në pluhurizim.
MATERIALE DHE METODA
38
pluhuri hidhet në mikrotuba 1.5ml që përmbajnë 700ml të buferit të
ekstraktimi CTAB (20 mM EDTA, 0.1 M Tris-HCl ph 8.0, 1.4M NaCl, 2%
CTAB, dhe 0.4% β-mercaptoethanol të shtuar përpara përdorimit);
inkubohet përzierja në 650C për 45 minuta, duke u përzier lehtë me inversion
çdo 15 minuta; më pas shtohet 500ml kloroform-isoamilalkool (24:1) dhe
përzihet lehtë për 1 min.
mostrat centrifugohen për 10 min në 12.000rpm.
600 µl supernatant transferohet në tuba të pastër ku shtohet 500µl kloroform-
isoamilalkol (24:1); përsëritet kjo procedurë 2 herë;
500µl nga supernatanti transferohet në tuba të rinj që përmbajnë 700µl
isopropanol të ftohtë (-20°C); mostrat përzihen me inversion dhe
centrifugohen në 12.000 rpm për 10 min;
Pelleti i ADN-së shpëlahet me 700µl etanol 70% dhe lejohet të thahet në
temperaturë dhome.
Tretet pelleti në 50µl bufer TE ku shtohet 5µl ribonukleazë.
Tretësira inkubohet në 37°C për 1orë dhe më pas ruhet në -20
°C.
Përmbajtja e buferit të ekstraktimit jepet e detajuar në Aneksin I.
Protokolli sipas GenElute TM Plant Genomic DNA Kit (SIGMA) protocol G2N-
70
1. Pluhurizohet 100mg ind bimor në azot të lëngët.
2. Lizohet me 350µl të Solucionit Lizues (Part A) dhe 50 µl të Solucionit Lizues
(Part B).
Shtohet 13µl Solucion Precipitimi. Mbetjet bien në trajtë pelleti dhe supernatanti
transferohet në kolonën me filtër blu.
3. Shtohet 500µl Solucion përgatitës i kolonës tek kolona lidhëse.
4. Shtohet 700µl Solucion lidhës në filtrat. Transferohet 700µl përzierje në
kolonën lidhëse. Pasi përsëritet ky hap transferohet kolona në një tub të ri
kolektori.
5. Shtohet 500µl Solucion larës në kolonë. Pas centrifugimit përsëritet kjo fazë.
6. Transferohet kolona në një tub të ri kolektori. Shtohet 100µl Solucion tretës (i
ngrohur në 650C) në kolonë.
Pas procedurës të ekstraktimit e përshkruar në protokollin e Plant Genomic DNA Kit
(SIGMA) u krye një procedurë e dytë purifikimi sipas Sambrook et al., 1989.
MATERIALE DHE METODA
39
Figura 2.2. Pamje nga puna për ekstraktimin e acideve nukleike dhe dokumentimi i të
dhënave
2.2.2. Vlerësimi sasior dhe cilësor i ADN-së
Vlerësimi i cilësisë dhe sasisë së ADN gjenomike u krye sipas Sambrook et al., 1989
dhe me anë të një procedure PCR standard sipas Demesure et al., 1995 me anë të kitit
Phire Plant Direct Kit F-130.
Amplifikimi i fragmentit kontroll të ADN-së sipas Demesure et al., 1995.
50ng ADN gjenomike u përdor si templat për shumëfishim me anë të PCR të një
fragmenti të pritshëm prej 300çb. Reaksioni i shumëfishimit u krye në një volum të
përgjithshëm prej 20µl, i cili përmbante 10µl bufer PCR 2X Phire Plant (me dNTPs
dhe MgCl2), 25µM Primer mix kontroll, 0.4µl Phire Hot start II ADN Polimerazë dhe
7.2 µl ddH2O.
Kushtet e ciklimit: 5 min në 98°C, e ndjekur nga 5 sekonda denatyrim në 98
°C- 5
sekonda në 62°C - 20 sekonda zgjatje në 72
°C, e përsëritur për 40 cikle dhe 1 minutë
në 72°C.
Më poshtë paraqitet harta e popullatave të Shqipërisë të veriut (Figura 2.3) nga ku u
morën mostra për izolimin e ADN-së gjenomike dhe ARN-së totale. Gjithashtu në
tabelën e mëposhtme (Tabela 2.1) paraqiten 13 popullatat e marra në studim me nga 5
gjenotipe për secilën prej tyre si dhe koordinatat respektive.
Figura 2.3. Harta e popullatave të Shqipërisë të veriut të marra në studim
MATERIALE DHE METODA
40
Tabela 2.1. Popullata e sherbelës së Shqipërisë së veriut prej nga u izolua ADN gjenomike &
ARN totale
Nr
Popullatat
Gjerësi
Gjatësi
Koordinatat GPS
1-5 Krujë 41.493402 19.771796 41° 29' 36.2472'' N19° 46'
18.4656'' E
6-10 Torovica 41.892877 19.530494 41° 53' 34.3572'' N19° 31'
49.7784'' E
11-15 Shkodër (
Shirokë)
42.066447 19.428860 42° 3' 59.2092'' N19° 25'
43.896'' E
16-20 Rubik
(A dhe B)
41.766822 19.777343 41° 46' 0.5592'' N19° 46'
38.4348'' E
21-25 M.Madhe
(Grishaj)
42.281956 19.453365 42° 16' 55.0416'' N19° 27'
12.114'' E
26-30 Balldren 41.799867 19.630841 41° 47' 59.5212'' N19° 37'
51.0276'' E
31-35 Lohe 42.273489 19.536202 42° 16' 24.5604'' N19° 32'
10.3272'' E
36-40 F.Milot 41.700425 19.725456 41° 42' 1.53'' N19° 43'
31.6416'' E
41-45 Postribë 42.145131 19.592587 42° 8' 42.4716'' N19° 35'
33.3132'' E
46-50 Shëngjin 41.824211 19.577079 41° 49' 27.1596'' N19° 34'
37.4844'' E
51-55 Valbona 42.441253 19.883999 42° 26' 28.5108'' N19° 53'
2.3964'' E
56-60 Ulza 41.677475 19.864193 41° 40' 38.91'' N19° 51'
51.0948'' E
61-65 Lezhë 41.777724 19.658028 41° 46' 39.8064'' N19° 39'
28.9008'' E
2.2.3. Protokolli i ekstraktimit të ARN totale
ARN totale u ekstraktua nga të njëjtat popullata si dhe ADN gjenomike sipas
protokollit të Young et al., 2007 (Tabela 2.1).
1. Homogjenizohen në azot të lëngët 0.25 g gjethe të freskëta.
2. Transferohet homogjenati në një mikrotub ku shtohet 1.5 ml bufer ekstraktimi
dhe 0.250 ml fenol i saturuar me ujë (pH=4).
3. Centrifugohen mostrat për 15 min në 8 000 rpm.
4. Transferohet supernatanti në mikrotuba që përmbajnë 0.250 ml fenol të ftohtë
të saturuar me ujë dhe 0.250 ml klorophorm : izoamil alkool (24:1).
5. Centrifugohen 1 min në 8 000 rpm.
MATERIALE DHE METODA
41
6. Transferohen supernatantet në tuba të rinj që përmbajnë 500 µl etanol 100% të
ftohtë, inkubohen për 15 min në -20°C.
7. Centrifugohen për 1 min në 8 000rpm.
8. Derdhet supernatanti dhe shtohet 0.5 µl etanol 70% i ftohtë.
9. Centrifugohet në 8 000rpm. Përsëritet hapi 8 edhe një herë.
10. Pelleti thahet në temperaturë dhome dhe tretet në 50 µl ddH2O të trajtuar me
DEPC.
*Përmbajtja e buferit të ekstraktimit jepet e detajuar në Aneksin II.
2.2.4. Matja e sasisë dhe cilësisë së ARN totale
U krye sipas protokollit standart sipas Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989.
Figura 2.4. Nga puna në laboratorët e Bioteknologjisë Molekulare, FSHN, UT dhe pranë
Universitetit “Ioan Cusa”, Rumani
2.2.5. Vlerësimi i diversitetit të rajonit intergjenik trn të cp-ADN të popullatave
të Salvia officinalis bazuar në PCR-RFLP
Nisur nga fakti se përbërësit monoterpenoidike të vajrave esenciale të bimëve është
provuar se sintetizohen përmes një rrugëkalimi jo-mevalonik (Eisenreich, 1997), dhe
se origjina e monoterpen-sintetazave e kompartmentalizimi i tyre ka të bëjë me
kloroplastet dhe leukoplastet e qelizave të parenkimës fotosintetizuese (Bouvier,
2005), në këtë punim fillimisht u vlerësua diversiteti i rajonit intergjenik trn të ADNsë
kloroplastike, i cili rezulton të jetë përdorur me sukses për të zbuluar diversitetin e
popullatave të Salvia officinalis.
ADN gjenomike (Tab 1) u përdor për të shumëfishuar rajonin specifik intergjenik trn
të cpADN me anë të setit të primerave trnL-trnF sipas Taberlet (1991).
Shumëfishimi me PCR i fragmenteve trn u krye në një volum total prej 25 µl që
përmbante 30 ng ADN gjenomike. Programi i ciklimit: 3 minutash në 940C, i ndjekur
nga 35 cikle për 30 sekonda në 940C, 30 sekonda në 54
0C, 1 minutë në 72
0C dhe 10
minuta zgjatje përfundimtare në 720C u realizua sipas Ibrahim et al., 2012.
MATERIALE DHE METODA
42
Suksesi i çdo reaksioni PCR-je u verifikua me anë të elektroforezës në xhele agaroze
1% në bufer TBE-10X, të ngjyrosur me bromur etidiumi (0.5 µg/ml) dhe u bë i
dukshëm nën rrezatimin UV.
Seti i primerave
Sekuenca e primerave të përdorur për shumëfishimin e rajonit trn të cp-ADN paraqitet
në Tabelën 2.2.
Tabela 2.2. Sekuencat e çiftit të primerave të përdorur për amplifimin e rajonit specifik inter-
gjenik nga cp-ADN e popullatave të sherbelës
Çifti i
primerave
Sekuenca Tipi Referenca
trnL-trnF 5‟-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3‟
5‟-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3‟
cpDNA Taberlet et al., 1991
2.2.5.1. Prerja me enzima restriktive e produkteve të PCR
Pas amplifikimit, 15 µl të çdo amplikoni u prenë me dy enzima restriksioni AluI dhe
TaqI (Promega). Në një volum total të reaksionit të prerjes prej 25 µl përmbahej 2.5
µl bufer (10mM Tris-HCl (pH 7.4), 100mM sodium citrate, 0.1mM EDTA, 1mM
DTT, 0.5mg/ml BSA, 50% glycerol), 0.2 µl nga çdo enzimë (AluI; TaqI, 10U/µl) dhe
15.3 ddH2O bazuar në protokollin respektiv të enzimave të Promega.
Mostrat u inkubuan në 37°C për 15 minuta dhe më pas në 65°C për 20 minuta. Pas
inkubimeve produktet e prerjes u analizuan me anë të elektroforezës në xhel agaroze
2,5% në 10X TBE, dhe përmasat e tyre u vlerësuan përkundrejt markerit standart
1kbp. Xhelet u vizualizuan dhe fotografuan nën rrezatimin UV.
Në tabelën e mëposhtme paraqiten gjenotipet për secilën popullatë të sherbelës së
Shqipërisë së veriut të analizuara me PCR-RFLP. Tek të dy kolonat pasqyrohen
gjenotipet sipas prerjeve me enzimat AluI dhe TaqI respektivisht.
Tabela 2.3. Gjenotipet për secilën popullatë të sherbelës së Shqipërisë së veriut të analizuara
me PCR-RFLP
Nr
(sipas prerjes
me Alu1)
Gjenotipet Nr
(sipas prerjes me
Taq1)
Gjenotipet
1 Postriba 1 1 Lohe 1
2 Postriba 2 2 Lohe 2
3 Postriba 3 3 Lohe 3
4 Postriba 4 4 Lohe 4
5 Postriba 5 5 Lohe 5
6 Rubik(A) 1 6 Balldren 1
7 Rubik (A) 2 7 Balldren 2
8 Rubik (A)3 8 Balldren 3
9 Rubik (A) 4 9 Balldren 4
10 Rubik (A) 5 10 Balldren 5
11 F. Milot 1 11 Rubik(B) 1
12 F. Milot 2 12 Rubik(B) 2
MATERIALE DHE METODA
43
13 F. Milot 3 13 Rubik(B) 3
14 F. Milot 4 14 Rubik(B) 4
15 F. Milot 5 15 Rubik(B) 5
16 Lohe 1 16 Krujë 1
17 Lohe 2 17 Krujë 2
18 Lohe 3 18 Krujë 3
19 Lohe 4 19 Krujë 4
20 Lohe 5 20 Krujë 6
21 Balldren 1 21 Krujë 8
22 Balldren 2 22 Shkodër 4
23 Balldren 3 23 Shkodër 5
24 Balldren 4 24 F.Milot 5
25 Balldren 5 25 Rubik(A) 1
26 Rubik (B) 1 26 Rubik(A) 2
27 Rubik (B) 2 27 Rubik(A) 3
28 Rubik (B) 3 28 Rubik(A) 4
29 Rubik (B) 4 29 Rubik(A) 5
30 Rubik (B) 5 30 F.Milot 1
31 Krujë 1 31 F.Milot 2
32 Krujë 2 32 F. Milot 3
33 Krujë 3 33 F. Milot 4
34 Krujë 4 34 Torovica 1
35 Krujë6 35 Torovica 2
36 Krujë 8 36 Torovica 3
37 Shkodër 4 37 Torovica 4
38 Shkodër 5 38 Torovica 5
39 Torovica 1 39 Postriba 1
40 Torovica 2 40 Postriba 2
41 Torovica 3 41 Postriba 3
42 Torovica 4 42 Postriba 4
43 Torovica 5 43 Postriba 5
Analizimi i të dhënave
Pas verifikimit të përmasave të fragmenteve të prodhuara nga prerja me enzima
restriksioni, u ndërtua një matricë binare (prezenca e bandave u shënua me 1 dhe
mungesa me 0), e cila u përdor për të ndërtuar dendrogramat e ngjashmërisë midis
gjenotipeve duke përdorur metodën UPGMA të softit NTSYS 2.1.
2.2.6. Shumëfishimi i fragmenteve gjenike të monoterpen-sintetazave nga gADN
dhe ARN totale e popullatave të Salvia officinalis
Fragmentet gjenike të MTP-ve nga ADN-ja gjenomike dhe ARN-ja totale për 13
popullatat e marra në studim u analizuan si më poshtë.
MATERIALE DHE METODA
44
2.2.6.1. Amplifikimi i rajonit qëndror të gjeneve koduese të MTP-ve nga ADN
gjenomike
Primerat e përdorur për të shumëfishuar një rajon qëndror të ruajtur të gjeneve
koduese të monoterpen sintetazave ishin:
Forward Sbs350 -5‟ TTCAACAGTTGGAGTTGATTGATGA 3‟- dhe
Reverse Sbs1010 -5‟ ATTCCACAATCCTATCTCTCACAAA-3‟, të hartuar për të
shumëfishuar një amplikon ~800 bp Sekuencat e tyre janë përcaktuar pas
mbivendosjes së disa gjeneve koduese të MTP nga bimë aromatike, përcaktimit të
rajoneve intronike, dhe përzgjedhjes së rajoneve të konservuara mirë. Më pas prej
gjenit kodues të sabinen sintetazës nga Salvia officinalis është përzgjedhur një rajon
pa introne për të hartuar primerat (A.Grazhdani, 2004).
Volumi i reaksionit të shumëfishimit ishte 25 µl dhe përmbante këto përqëndrimet
finale të përbërësve: Buffer PCR1X, 0.2 mM dNTP, 100 pmol primera (forward dhe
reverse), 3 mM MgCl2 , 0.5 U Taq ADN Polimerazë dhe 20-30 ng ADN.
Kushtet e ciklimit: 3 minuta në 94°C, e ndjekur nga 0.5 minuta denatyrim në 94
°C, 1
minutë lidhje në 50°C, 30 sekonda në 72
°C e përsëritur për 35 cikle, dhe 5 minuta në
72°C.
2.2.6.2. Amplifikimi i rajonit qendror të gjeneve koduese të MTP-ve nga ARN
totale me anë të RT-PCR
Me synim kontrollin e diversitetit të fragmentit gjenik specifik të MTP nga popullatat
e ndryshme në studim, u vendos që amplikoni të shumëfishohej nga templat ADN je
gjenomike dhe ARNje totale. Për procedurën e RT-PCR me primerat specifike Sbs
350/Sbs 1010 u përdor kiti OneTaq®
RT-PCR i Invitrogen. Ky kit kombinon dy
përzierje, M-MuLV Enzyme Mix and OneTaq Hot Start 2X Master Mix me bufer
Standart për aplikimet dy-fazëshe të RT-PCR.
Reaksioni i sintezës së vargut të parë të cADN-së:
• Denatyrimi i ARN-së në 70°C për 5 min për të larguar struktura dytësore që mund të
pengojnë sintezën e cADN në gjatësinë e duhur.
• Inkubim në 42°C për një orë.
Sinteza e vargut të parë të cADN-së.
1. Përzihet mostra e ARN-së dhe d(T)23VN në dy tuba mikrocentrifuge RN-aza-
free (të paraqitura në tabelën 2.4).
Tabela 2.4. Përzierja e reaksionit të fazës së parë të RT-PCR
Përbërësit Vëllimi
ARN-ja totale 3 µl
d(T)₂₃VN(50µM) 6µl
H₂O i pastër nga nukleazat 15 µl
Vëllimi total 21 µl (7 µl për tub + 1 µl ARN)
MATERIALE DHE METODA
45
2. Denatyrohet ARN për 5 min në 70⁰C. Vorteksohen mostrat me shpejtësi dhe
vendosen në akull.
3. Shtohen përbërësit e mëposhtëm në një tub që përmban 8µl
ARN/primer/solucion dNTP dhe përzihen duke pipetuar.
Reaksion Mix M-MuLV 10µl
Enzimë Mix M-MuLV 2 µl
Në tubin kontroll që rezulton negativ shtojmë:
Reaksion Mix Mix M-MuLV 30 µl
H₂O 6 µl
4. Inkubohet sasia prej 20 µl e reaksionit të sintezës së cADN-së në 42⁰C për një orë.
5. Inaktivizohen enzimat në 80⁰C për 4 min. Ҫohet sasia e reaksionit në 50µl me 30µl
H₂O. Produkti i cADN-së ruhet në -20⁰C.
Shumëfishimi i cADN me PCR
1. Përdoret 2-5 µl e produktit të cADN-së për 25 µl reaksion mix të PCR.
2. Përzihen sa më poshtë në një tub PCR-je në akull (reaksioni paraqitet tek tabela
2.5):
Tabela 2.5. Përbërja e reaksionit të RT-PCR
Përbërësit Sasia
One Taq Hot Start 2X Master Mix 37,5 µl
10 µl Forward Primer Sbs 1,5 µl
10 µl Reverse Primer Sbs 1,5 µl
cADN-ja e holluar 6 µl
H₂O i pastër nga nukleazat 28,5 µl
Sasia totale 69 µl
23 µl për tub + 2 µl cADN
Përzierja i nënshtrohet kushteve të ciklimit të paraqitura në tabelën 2.6
MATERIALE DHE METODA
46
Tabela 2.6. Kushtet e ciklimit te RT-PCR
Analizimi i produkteve te RT-PCR u krye në xhel agarozë 1,2% ne TAE 1X.
2.2.7. Purifikimi nga xheli i fragmenteve të shumëfishuara me PCR me përmasat
e pritshme
Për të ekstraktuar nga xheli produktet me përmasat e pritshme rreth 800çb, u përdor
protokolli i Promega Quick Protocol të Wizard R SV gel & PCR clean-up System.
Protokolli
a) Pas elektroforezës, pritet banda nga xheli dhe vendoset në një tub
mikrocentrifuge 1.5 ml.
b) Shtohet 10 µl solucion tretës për cdo 10 mg të xhelit të prerë. Kryhet
vortex dhe inkubohet në 50-650C, deri sa xheli të tretet plotësisht (për 30
minuta).
a) Futet minikolona SV në një tub kolektor.
b) Transferohet përzierja e xhelit të tretur në minikolonë. Inkubohet në
temperaturë dhome për 1 minutë.
c) Centrifugohet në 16,000 xg (14.500 rpm) për 1 minutë.
d) Ruhet minikolona duke e vendosur ne një tub te ri kolektor.
e) Shtohet 700 µl solucion larës membranor (shtohet edhe etanol)
f) Centrifugohet në 16.000 xg (14.500 rpm) për 1 minutë. Derdhet mbetja
dhe ri-insertohet minikolona në tubin kolektor.
g) Përsëritet larja e membranës së kolonës me 500 µl solucion larës
membranor dhe centrifugohet në 16.000 xg për 5 minuta.
h) Zbrazet tubi kolektor dhe ri-centrifugohet pelleti në kolonë për 1 minutë
me kapakun e mikrocentrifugës të hapur për të lejuar avullimin e çdo
mbetje etanoli.
i) Transferohet minikolona në tub mikrocentrifuge 1.5 ml.
j) Shtohet 50 µl dd H2O në minikolonë. Inkubohet në temperaturë dhome për
1 minutë deri në 3 minuta dhe më pas centrifugohet në 16.000xg për 1
minutë.
a) ADN-ja ruhet në 40C ose -20
0C.
Denatyrimi 95⁰C 30 sek
25-40 cikle
94⁰C
66⁰C
68⁰C
15-30 sek
30 sek
1 min x kb
Zgjatja finale 68⁰C 5 min
Mbajtja 4-10⁰C ∞
30X
MATERIALE DHE METODA
47
2.2.8. Klonimi i ADN-së së purifikuar nga xheli në plazmidet pTOPO 2.1 të Kitit
TA Cloning Kit (pCR 2.1 K2060-40)
Përbërësit e reaksionit të klonimit janë përshkruar në tabelën 2.7.
Tabela 2.7. Përbërësit e reaksionit të klonimit
Përbërësit Volumi
Reaksioni i lidhjes 10 µl
Ujë i bidistiluar 5 µl
10X Bufer lidhje 1 µl
Vektor PCR-je (25 ng/µl) 2 µl
Produkt i freskët PCR-je (~10 ng) 1 µl
T4 ADN ligazë 1 µl
1. Inkubohen reaksionet e lidhjes në 14°C për të paktën 4 orë.
2. Centrifugohen reaksionet e lidhjes për pak sekonda dhe vendosen në akull.
Transformimi
1. Lejohen të shkrihen shishet me qelizat One Shot në akull.
2. Piketohet 1-2µl të çdo reaksioni lidhje tek qelizat dhe përzihen lehtësisht me
pipetë për t‟u përzier më mirë.
3. Inkubohen shishet në akull për 30 minuta.
4. Vendosen në banjo uji për ekzaktësisht 30 sekonda në temperaturë 420C. Më
pas vendosen direkt në akull pa u përzier.
5. Shtohet 250 µl terren SOC në çdo shishe.
6. Përzihen shishet në një inkubator me tundje në 37°C në 225 rpm për 1 orë.
Analizimi
1. Vendosen 10µl qeliza transformante mbi një pjatë me terren LB që përmban
50 µg/ml ampicilinë dhe X-Gal.
2. Inkubohen në 37°C për 18 orë. Pjatat e petrit vendosen në +4
°C për 2-3 orë për
ndryshimin e ngjyrës.
3. Më pas u analizuan 12 nga transformantët e pangjyruar (të bardhë) të
popullatave të Krujës, Torovicës dhe Postribës për praninë e insertit me anë të
analizës restriktive.
MATERIALE DHE METODA
48
2.2.9. Analizimi i transformantëve me anë të analizës restriktive
Së pari u vlerësuan përmasat e inserteve të kloneve pozitive me anë të prerjes së
plazmideve rekombiante me EcoRI.
Për këtë:
U përgatitën kultura bakteriale nga klonet pozitive
U ekstraktuan plazmidet nga këto baktere
U prenë plazmidet me enzimat prerëse EcoRI dhe Taq I.
Përgatitja e kulturave bakteriale
Nga kolonitë e bardha të librarive të popullatave të Krujës, Torovicës dhe Postribës
(nga katër për çdonjërën) u morr material dhe u mboll në kulturë LB që përmbante
100g/ml ampicilinë.
2.2.9.1. Ekstraktimi i ADN-së plazmidike nga klone të përzgjedhura të baktereve
transformante
Pas përzgjedhjes të baktereve transformonte u ekstraktua ADN-ja plazmidike me kitin
GenElute TM
Plasmid Miniprep Kit, SIGMA, protokolli i të cilit paraqitet më poshtë.
Protokolli:
Të gjitha hapat realizohen në temperaturë dhome.
1. Precipitohet 1-5ml pellet me anë të centrifugimit nga kultura me E.coli
rekombinante në 12.000xg për 1 minutë.
2. Pelleti bakterial tretet në 200 µl solucion tretjeje.
3. Lizohen qelizat duke shtuar 200 µl solucion lizimi. Menjëherë përzihen
përbërësit me inversion të lehtë (6-8 herë) deri sa përzierja bëhet e qartë dhe
viskoze.
4. Precipitohen mbetjet qelizore duke shtuar 350 µl të solucionit
lidhës/neutralizues. Me kujdes përzihen tubat me inversion 4-6 herë. Përftohet
pelleti qelizor me centrifugim në 12.000 xg 10 minuta.
5. Përgatitja e kolonës. Futet kolona lidhëse e GenElute Miniprep në një
mikrotub. Shtohet 500 µl solucion i përgatitjes të kolonës në çdo kolonë
miniprep dhe centrifugohet në 12.000 xg për 30 sekonda-1 minutë. Derdhet
përzierja e rënë nga kolona.
6. Shtimi i lizatit të pastër. Transferohet lizati i pastër i përftuar nga hapi 4 në
kolonën e përgatitur në hapin 5 dhe centrifugohet në 12.000 xg për 30
sekonda-1 minutë. Përsëri derdhet përzierja e rënë nga kolona.
7. Përpara përdorimit shtohet etanol në solucionin e përqëndruar të shpëlarjes.
Shtohet 750 µl i solucionit larës i tretur me etanol në kolonë. Centrifugohet në
12.000 g për 30 sek-1 min. Derdhet përzierja dhe centrifugohet përsëri në
shpejtësi maksimale 1-2 minuta pa asnjë solucion larës për të larguar etanolin
e tepërt.
MATERIALE DHE METODA
49
8. Tretja e ADN-së. Transferohet kolona në një tub kolektor të pastër. Shtohet
100 µl solucion tretës ose ujë i bidistiluar në kolonë. Centrifugohet në 12.000
g për 1 minutë. ADN ruhet në -20°C.
2.2.9.2 Prerja e plazmideve me enzimat e restriksionit EcoRI dhe TaqI
Me synim identifikimin e përmasave të fragmenteve të klonuara në plazmide, u krye
prerja e tyre me dy enzima restriksioni EcoRI dhe TaqI.
Protokolli i prerjes u realizua sipas përcaktimeve të Kitit (Invitrogen) për EcoRI, dhe
Promega për TaqI. Në reaksionet e prerjes u përdorën:
1µl enzimë prerëse EcoRI (50U/µl), 2 µl Buffer 10X, 30ng ADN plazmidike, dhe
ddH2O, deri në volumin total prej 20 µl; Për prerjen me TaqI u përdorën 2.5 µl buffer
10X, 0.2 µl enzimë TaqI (10U/µl), 30ng ADN plazmidike dhe ddH2O deri në 25 µl.
2.3. Vlerësimi i përmbajtjes së monoterpeneve në vajrat esenciale të popullatave
të Salvia officinalis me anë të GC
Paraprakisht u izoluan vajrat esenciale nga gjethe të thara të sherbelës nga 13
popullatat e marra në studim të paraqitura në tabelën 2.1 dhe më pas u analizuan
përbërësit e tyre me analizën gaz-kromatografike.
2.3.1. Izolimi i vajrave esencialë për Salvia officinalis
Gjethet e sherbelës (50g gjethe të thara në hije) ishin subjekt i hidro-distilimit për 16
orë pa ndërprerje me aparaturën e llojit Clevenger (rekomanduar nga Pharmacophea
Europea, 2014) për izolimin e vajit esencial. Vaji esencial u grumbullua në 1 ml
toluen si solvent ekstraktimi. Ekstraktit ju largua uji duke shtuar 1 gr sulfat natriumi
anhidër (Asllani, 2004). Ai u ruajt në shishe te errëta (viale) në +40C. Vaji esencial i
gjetheve të sherbelës i tretur në toluen u analizua me anë të GC/FID.
2.3.2. Aparatura dhe analiza gaz-kromatografike
Pajisja e përdorur për të analizuar vajrat esenciale të popullatave në studim ishte e
tipit Varian 450 GC e pajisur me injektor PTV dhe detektor me jonizim në flakë
(FID). Ndarja e komponimeve të esencave të sherebelës u krye në kolonën kapilare
VF-1ms (30 m gjatësi x 0.33 mm diametër të brendshëm x 0.25 μm film).
Temperatura e injektorit dhe e detektorit u vendosën respektivisht në 280°C dhe
300°C. Mënyra e injektimit u zgjodh split (1:100). Si gaz mbartës dhe gaz ndihmës u
përdor azoti me prurje totale respektivisht 1ml/min dhe 24ml/min. Temperatura
fillestare e furrës u mbajt 50°C për 2min pastaj u rrit në 150
°C me 6
°C/min. Pas kësaj
në 280°C me 8
°C/min dhe së fundi në 300
°C me 10
°C/min. Në 300°C u mbajt për 2
minuta. U injektua për çdo mostër një vëllim prej 2μl. Për vlerësimin cilësor dhe
sasior u përdor një përzierje e n-oktanit (C8) deri tek eikosanet (C20) për të llogaritur
indeksin e Kovats-it. Rezultatet së bashku me të dhënat e literaturës u përdorën për
identifikimin e komponimeve kryesore (Adams, 1995; David et al, 2010; Konig et al,
1999). Të dhënat sasiore të komponimeve të analizuara janë dhënë në % kundrejt
totalit.
MATERIALE DHE METODA
50
2.3.3. Analiza statistikore e rezultateve
Përbërësit e vajrave esenciale të popullatave të analizuara me anë të GC u përpunuan
me anë të programit statistikor PCo-A. Si rezultat u përftua grupimi i popullatave
sipas nivelit të ngjashmërisë.
REZULTATE DHE DISKUTIME
51
3. REZULTATE DHE DISKUTIME
3.1 Stabilizimi i metodikave të ekstraktimit të ADN-së gjenomike dhe ARN-së
totale
Doyle & Doyle (1987) dhe GenElute TM Plant Genomic DNA Kit (SIGMA) G2N-70
ishin dy metodat e përdorura për ekstraktimin e ADN gjenomike nga gjethe të
sherbelës. Përcaktimi i protokollit, që do të jepte sasinë më të madhe të materialit
gjenetik me një nivel minimal kontaminantësh është faza e parë e punës në biologjinë
molekulare të bazuar tek acidet nukleike. Sasia dhe cilësia e mirë e ADN-së është e
domosdoshme nëse materiali gjenetik do të përdoret në teknika si polymerase chain
reaction (PCR), Southern blotting dhe analiza të tjera gjenomike. Protokolli Doyle &
Doyle (1987) (i modifikuar) dhe metoda e bazuar në kitin GenElute TM Plant
Genomic DNA, dhanë rezultate të kënaqshme pas modifikimeve shtesë (Tabela
3.1&Figura 3.1). Kështu, Doyle &Doyle (1987) i bazuar ne CTAB, një detergjent
jonik i fortë i përdorur për të lehtësuar ndarjen e proteinave nga acidet nukleike në
materialet biologjike të ekstraktuara, u modifikua duke shtuar trajtimet me PVPP dhe
Proteinazë K (Krizman et al., 2006).
Protokolli i dytë i bazuar në GenElute TM Plant Genomic DNA Kit (SIGMA) u
modifikua duke shtuar një fazë purifikimi me fenol:kloroform:izoamilalkool.
Tabela 3.1. Rezultatet e matjeve spektrofotometrike të sasisë dhe cilësisë së ADN gjenomike
sipas Doyle & Doyle (1987) i modifikuar
Popullatat Abs260 Abs280 Abs230 260/280 260/230 Përqëndrimi
(ng/µl) Lloji
Postriba 1.432 0.741 0.81 1.93 1.79 71.6 dsADN
Rubik(A) 1.297 0.675 0.711 1.92 1.82 64.8 dsADN
Rubik(B) 1.462 0.93 1.7 1.58 0.86 73.1 dsADN
F.Milot 1.75 1.08 1.04 1.62 1.68 87.5 dsADN
Lohe 1.359 0.679 1.289 2 1.05 67.9 dsADN
Balldren 1.614 0.784 0.925 2.06 1.74 80.7 dsADN
Kruja 0.934 0.48 0.56 1.94 1.66 46.7 dsADN
Shiroka 1.526 0.88 0.79 1.73 1.93 76.3 dsADN
Torovica 0.968 0.54 1.06 1.82 0.91 48.4 dsADN
Grishaj 1.316 0.67 1.04 1.96 1.27 65.8 dsADN
Shëngjin 1.115 0.61 0.89 1.82 1.24 55.75 dsADN
Valbona 1.33 0.75 1.14 1.76 1.17 66.5 dsADN
Ulza 1.19 0.6 0.92 1.98 1.3 59.5 dsADN
Lezha 0.892 0.46 0.69 1.95 1.29 44.6 dsADN
REZULTATE DHE DISKUTIME
52
Tabela 3.2. Rezultatet e matjeve spektrofotometrike të sasisë dhe cilësisë së ADN gjenomike
sipas GenElute TM Plant Genomic DNA Kit (SIGMA) G2N-70
Popullatat Abs260 Abs280 Abs230 260/280 260/230 Përqëndrimi
(ng/µl) Lloji
Postriba 0.767 0.426 0.572 1.8 1.34 38.35 dsADN
Rubik(A) 0.293 0.151 0.136 1.94 2.15 14.6 dsADN
Rubik(B) 0.996 0.53 0.702 1.88 1.42 49.7 dsADN
F.Milot 0.75 0.39 0.62 1.92 1.22 37.5 dsADN
Lohe 0.968 0.59 0.81 1.62 1.22 48.5 dsADN
Balldren 0.488 0.245 0.19 1.99 2.57 24.3 dsADN
Kruja 0.724 0.41 0.28 1.75 2.68 36.2 dsADN
Shiroka 0.814 0.45 0.58 1.8 1.42 40.7 dsADN
Torovica 0.692 0.43 0.92 1.6 0.75 34.6 dsADN
Grishaj 0.967 0.55 0.85 1.77 1.14 48.35 dsADN
Shëngjin 0.758 0.39 0.72 1.9 1.05 37.9 dsADN
Valbona 0.892 0.55 0.72 1.63 1.24 44.6 dsADN
Ulza 0.685 0.4 0.48 1.71 1.42 34.25 dsADN
Lezha 0.693 0.41 0.91 1.67 0.76 34.65 dsADN
Tabelat 3.1 dhe 3.2 përshkruajnë rezultatet e matjeve të sasisë dhe cilësisë së ADN-ve
gjenomike nga trembëdhjetë popullatat e marra në studim sipas protokollit Doyle &
Doyle (1987) të modifikuar dhe atij të GenElute TM Plant Genomic DNA Kit
(SIGMA) G2N-70 respektivisht.
Figura 3.1. Krahasimi i cilësisë së ADN-së të sherbelës së ekstraktuar duke përdorur të dy
metodat
Metoda Doyle & Doyle (1987) e modifikuar, jep rezultate më të mira mbi cilësinë e
ADN-së (Tabela 3.1/3.2 dhe Figura 3.1).
REZULTATE DHE DISKUTIME
53
Figura 3.2. Krahasimi i sasisë së ADN-së të sherbelës së ekstraktuar duke përdorur të dy
metodat
Sipas rezultateve të përftuara të paraqitura më lart në figurën 3.2, metoda Doyle &
Doyle (1987) e modifikuar, jep rezultate më të mira mbi sasinë e ADN-së.
Në vijim në Tabelën 3.3 jepen rezultatet spektrofotometrike të cilësisë dhe sasisë së
ARN totale të ekstraktuar sipas Young et al. 2007.
Tabela 3.3. Rezultatet spektrofotometrike të cilësisë dhe sasisë së ARN totale të ekstraktuar
sipas Young et al. 2007
Popullatat Abs260 Abs280 Abs230 260/280 260/230 Përqëndrimi
(ng/µl) Lloji
Postriba 0.966 0.478 0.52 2.02 1.85 38.64 ARN
Rubik(A) 0.967 0.408 0.51 2.37 1.9 38.68 ARN
Rubik(B) 1.082 0.538 0.551 2.01 1.96 43.28 ARN
F.Milot 1.52 0.72 0.76 2.11 1.99 60.8 ARN
Lohe 1.634 0.8 0.89 2.03 1.84 65.4 ARN
Balldren 1.027 0.384 0.564 2.07 1.82 41.08 ARN
Kruja 1.854 0.964 1.037 1.92 1.79 74.16 ARN
Shiroka 1.384 0.68 0.59 2.04 2.32 55.4 ARN
Torovica 1.352 0.65 0.81 2.08 1.66 54.08 ARN
Grishaj 1.453 0.71 1.05 2.06 1.39 58.12 ARN
Shëngjin 1.326 0.63 0.73 2.11 1.82 53.04 ARN
Valbona 1.264 0.62 0.75 2.03 1.69 50.56 ARN
Ulza 1.65 0.77 1.07 2.12 1.53 66.1 ARN
Lezha 1.16 0.52 0.81 2.21 1.42 46.4 ARN
Stabilizimi i metodikave të ekstraktimit të acideve nukleike të kategorive ADN
gjenomike dhe ARN totale ishte hapi i parë në vargun e metodave të përdorura në këtë
punim. Cilësia dhe sasia e të dy biomolekulave rezulton e kënaqshme për përdorimin
e tyre në praktikat që vijojnë.
REZULTATE DHE DISKUTIME
54
3.2 Vlerësimi i diversitetit të rajonit intergjenik trn të cp-ADN-së të popullatave
të Salvia officinalis bazuar në PCR-RFLP
Gjenomat organelare përfshirë ato kloroplastike evolojnë më ngadalë se gjenoma
bërthamore. Ky fenomen konservimi prej kohësh është përdorur për të hartuar primera
të aftë për të shumëfishuar rajone polimorfike jo-koduese dhe koduese të cpADN-së,
si edhe gjenomën e plotë kloroplastike në specie bimore (Dhingra and Folta 2005;
Ibrahim et al., 2007.).
Tashmë është i njohur fakti se përbërësit monoterpenoidike të vajrave esencialë të
bimëve janë provuar se sintetizohen përmes një rrugëkalimi jo-mevalonik (Eisenreich,
1997) dhe se origjina e monoterpen-sintetazave e kompartmentalizimi i tyre ka të bëjë
me kloroplastet dhe leukoplastet e qelizave të parenkimës fotosintetizuese (Bouvier,
2000).Për këtë arsye në këtë punim fillimisht u vlerësua diversiteti i rajonit intergjenik
trn të ADN-së kloroplastike, i cili rezulton të jetë përdorur me sukses për të zbuluar
diversitetin e popullatave të Salvia officinalis.
Çifti i primerave trnF-trnL sipas Ibrahim (2012), shumëfishoi me sukses rajonet
korresponduese të cpADN-ve në të gjitha gjenotipet e analizuara të Salvia officinalis.
Produktet e shumëfishimit të cpADN-së paraqiten në Figurën 3.3 për 13 popullatat e
sherbelës së Shqipërisë së veriut ( 43 gjenotipe) me çiftin e primerave trnL-trnF (të
hartuar sipas Ibrahim et al., 2012).Nga e majta në të djathtë paraqiten gjenotipet e
përshkruara në Tabelën 2.3 të kapitullit II. Markeri molekular 1kbp gjendet në tre
puse, respektivisht i fundit në të dy gjysmat exhelit të parë (në të majtë) dhe i dhjeti në
xhelin e dytë (në të djathtë).
Rajoni inter-gjenik trnL-F dhe sekuencat e gjenit rbcL të cpADN-së janë përdorur për
të studiuar Salviat dhe llojet e përafërta (Walker, 2004; Ibrahim, 2012; Li, 2013) për
të përshkruar lidhjet filogjenetike nga një numër autorësh. Speciet e Salvia grupohen
bazuar në origjinë (Clebsch, 2003) dhe ky rezultat është në përputhje me studimin e
Walker (2004) dhe Ibrahim (2010), pavarësisht se në studim u përdorën rajone të
ndryshme të cpADN-së.
Figura 3.3. Produktet e shumëfishimit të cpADN nga 13 popullatat e sherbelës së Shqipërisë
së veriut ( 43 gjenotipe) me çiftin e primerave trnL-trnF
REZULTATE DHE DISKUTIME
55
Në studimin tonë, meqënëse amplikoni i shumëfishuar kishte përmasa të njëjta për të
gjithë gjenotipet (Figura 3.3), u vendos të përdorej prerja me enzima restriktive të dy
tipeve për të zbuluar dallimet ndërmjet fragmenteve një-përmasore. Profilet e prerjes
me enzimat e restriksionit TaqI dhe AluI paraqiten në Figurën 3.4A dhe 3.4B. Enzima
Taq1 prodhoi 4 banda madhore prezente në të gjitha gjenotipet dhe një bandë minore
polimorfike (Figura 3.4 A/B).
Ne figurën 3.4.A mostrat renditen nga e majta në të djathtë; markeri molekular 100çb
gjendet në tre puse, respektivisht i fundit në gjysmën e sipërme të xhelit, i gjashti në
gjysmën e poshtme dhe i fundit në xhelin e dytë (në të djathtë), respektivisht. Numrat
1-43 përkojnë me gjenotipet e përshkruara në Tabelën 2.3, M tregon markerin
molekular të tipit GeneRulerTM 100bp.
Figura3.4.(A) Produktet e marra nga prerja e amplikoneve të PCR me primerat trnL-trnF me
enzimën prerëse TaqI për 43 gjenotipe të Salvia officinalis
Enzima e dytë restriktive prodhoi katër banda madhore dhe katër banda polimorfike
minore (Figura 3.4.B). Gjithashtu,numrat 1-43 përkojnë me gjenotipet e përshkruara
në Tabelën 2.3, M tregon markerin molekular te tipit GeneRulerTM 100bp. Markeri
ndodhet në 3 puset e fundit tek dy gjysmat e xhelit të parë (në të majtë) dhe xhelit të
dytë (në të djathtë).
REZULTATE DHE DISKUTIME
56
Figura 3.4 (B) Produktet e marra nga prerja e amplikoneve të PCR me primerat trnL-trnF me
enzimën prerëse AluI për 43 gjenotipe të Salvia officinalis.
Analiza e të dhënave nga RFLP-PCR bazuar në analizën UPGMA rezultoi në
dendrogramat e ngjashmërive ndërmejt popullatave të pasqyruara në Figurat 3.5A dhe
3.5.B.
Figura 3.5A tregon se prerja me AluI e amplikonit mund ti organizojë 43 gjenotipet e
Salvias në gjashtë grupe kryesore, ndër të cilat popullata e Krujës rezulton më e
veçanta pasi ndan me të tjerat një ngjashmëri të nivelit 40%.
Figura 3.5.(A). Dendrograma e afërisë për 43 gjenotipe (13 popullata) të sherbelës bazuar në
përmasat e produkteve të prerjes restriktive të fragmenteve të cp-ADN (Enzima Alu1)
Produktet e prerjes me TaqI të amplikoneve u përdorën për të ndërtuar një
dendrogramë ngjashmërie ndërmjet gjenotipeve të analizuara (Figura 3.5.B).
Dendrograma i organizon gjenotipet në dy grupe kryesore që ndajnë 75% ngjashmëri,
pa mundur të veçojë popullata të caktuara.
RFLPs on S.officinalis AluI
Coefficient of Jaccard
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
1
2
20
21
22
40
23
24
25
32
29
27
26
28
30
41
44
43
42
3
17
18
19
37
36
31
38
34
4
5
6
7
8
16
15
14
13
12
11
10
9
39
33
35
REZULTATE DHE DISKUTIME
57
Figura 3.5.(B) Dendrograma e afërisë për 43 gjenotipe (13 popullata) të sherbelës bazuar në
përmasat e produkteve të prerjes restriktive të fragmenteve të cp-ADN (Enzima Taq1)
Meqënëse qëllimi i punës ishte përdorimi i cpADN-së bazuar në profilet e PCR-RFLP
për të zbuluar diversitet gjenetik të mundshëm midis popullatave kryesore të sherbelës
të Shqipërisë së veriut, përdorimi i profileve AluI rezultoi shumë më informativ se ai i
TaqI. (Fig 3.5 A)
Çdo bandë e përftuar nga PCR-RFLP shërben për të dalluar individët. Rezultatet mbi
numrin e bandave të dhëna nga secila enzimë janë 8 për AluI dhe 5 për Taq1,
respektivisht.
Kontribut më të madh ndaj dimensionit 1 jep enzima AluI ndërsa enzima Taq1 jep një
kontribut shumë të vogël pothuajse të pakonsiderueshëm.
Vija me ngjyrë të kuqe të ndërprera në figurat e mëposhtme tregon kontributin
mesatar të pritshëm. Për një dimension të dhënë, çdo kategori me një kontribut më të
madh se vlera kufi konsiderohet i rëndësishëm në kontributin ndaj të njëjtit
dimension.
RFLPs on Salvia officinalis of Northern Albania 43 genotypesTaqI
Coefficient
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
1
2
3
4
5
6
36
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
43
40
38
41
34
33
30
28
26
24
22
20
18
32
39
42
19
21
23
25
27
29
31
35
37
REZULTATE DHE DISKUTIME
58
Figura 3.6.A/B. Kontributi i enzimave prerëse AluI dhe TaqI në zbulimin e diversitetit
gjenetik ndërmjet fragmenteve të cp-ADN për popullatat e sherbelës të Shqipërisë së veriut
Dy figurat 3.6 A/B tregojnë kontributin e enzimave AluI dhe TaqI në evidentimin e
shkallës së ngjashmërisë ndërmjet gjenotipeve të analizuara, të konceptuara me anë të
softit PcoA, i cili është aplikuar mbi një matricë të përbashkët të të dhënave të
përftuara nga përdorimi i të dy enzimave.
REZULTATE DHE DISKUTIME
59
Figura 3.7. Shpërndarja grafike e kontributit të dy enzimave AluI dhe TaqI në diskriminimin
e individëve.
Më sipër (Figura 3.7.) paraqitet shpërndarja grafike e kontributit të dy enzimave për
secilën bandë të dhënë, të analizuara me softin PCA. Këto variabla na ndihmojnë të
përcaktojmë kategoritë më të rëndësishme në përcaktimin e dimensioneve dhe tregon
se në cilin pol të dimensioneve janë duke kontribuar kategoritë e marra në analizim.
Në këtë rast dimensionet janë bandat e përftuara në xhel dhe të dhënat tregojnë se si
kanë kontribuar të dy enzimat e përdorura në diskriminimin dhe diversitetin midis
individëve duke përcaktuar numrin e bandave të përftuara.
Dendrograma e ndërtuar në Figurën 3.8, duke përdorur këto të dhëna i organizon
popullatat në gjashtë grupe kryesore: Kruja (si popullata më e veçantë që ndan vetëm
45% me të tjerat), Postriba, Torovica, Rubik-Milot, Balldren-Rubik-Lohe, Rubik-
Shkodër, që ndajnë rreth 80% ngjashmëri me njëra-tjetrën. Nga mënyra e grupimit në
nivelet e ngjashmërisë nga 80-100%, popullata më të veçanta rezultojnë Kruja,
Torovica dhe Postriba.
REZULTATE DHE DISKUTIME
60
Figura 3.8. Dendrograma e ndërtuar mbi bazën e të dhënave të PCR-RFLP mbi cpADN e 43
gjenotipeve të sherbelës së veriut të Shqipërisë, të marra nga të dy enzimat TaqI dhe AluI
Për të përftuar një pamje më të qartë të afërisë ndërmjet popullatave bazuar në këtë
rajon specifik të cpADN-ve, u përdor softi PcoA, i cili bazuar në matricë binare të të
dhënave të PCR-RFLP të përshkruar më lart, prodhoi një paraqitje grafike të treguar
në figurën 3.9.
Figura 3.9. Afëria ndërmjet popullatave sipas të dhënave të PCR- RFLP mbi cpADN
Edhe kjo paraqitje grafike (Figura 3.9) tregon se popullatat e Krujës, Torovicës dhe
Postribës veçohen nga te tjerat, duke treguar një nivel diversiteti të konsiderueshëm
ndërmjet popullatave të Shqipërisë së veriut, të cilat reflektojnë një dallueshmëri të
pamjaftueshme morfologjike për tu përdorur në evidentimin e diversitetit të tyre.
Përdorimi i PCR-RFLP-së sipas protokollit të ndjekur në këtë studim është përdorur
nga disa autorë për të kryer studime taksonomike të bimëve.
REZULTATE DHE DISKUTIME
61
Walker(2004) përdori pikërisht rajonin trnL-F të cpADN-së për të studiuar
monofiletinë/polifiletinë e gjinisë Salvacea dhe lidhjet e saj me Menthae.
Më pas Ibrahim (2012) dhe autorë të tjerë e perdorën për studime në nivelin e
popullatave te Salvia officinalis duke arritur në konkluzione të rëndësishme mbi
diversitetin dhe evoluimin e tyre.
3.3 Vlerësimi i fragmenteve gjenike të MTP nga popullatat e Salvia officinalis
të Shqipërisë së veriut.
Rezultatet për vlerësimin e fragmenteve gjenike të MTP-ve nga popullatat e marra në
studim shpjegohet në ndarjet e mëposhtme.
3.3.1 Shumëfishimi i fragmenteve gjenike të MTP nga gADN dhe ARN totale
Trembëdhjetë popullata natyrore të sherbelës së Shqipërisë së veriut u analizuan për të
vlerësuar diversitetin e gjeneve koduese të monoterpen-sintetazave sipas një strategjie
të bazuar në homologjinë e kësaj klase gjenike. Metodologjia e ndjekur u bazua në
shumëfishimin me PCR të një fragmenti gjenik qëndror të gjenit kodues për sabinën-
sintetazën nga modele gADN dhe ARN totale. Sekuencat e primerave specifike të
përdorur (Grazhdani A., 2003) u përcaktuan pas mbivendosjes së disa gjeneve
koduese të MTP nga bimë aromatike dhe përcaktimit të rajoneve të konservuara mirë,
prej nga ku u hartuan primerat Sbs1010/Sbs 350 (të përshkruar ne Kapitullin 2 të
kësaj teze). Meqënëse gjenet koduese të MTP shpesh gjenden në një kopje të vetme
në gjenomat bimore, e në raste të tjera raportohen të jenë të organizuar në familje
gjenike, çka e reflekton edhe ngjashmëria e lartë ndërmjet enzimave që kodojnë, në
këtë punim u vendos të shumëfishohet fragmenti specifik nga të dy kategoritë e
acideve nukleike. Kjo u krye për të parë nëse në popullatat e sherbelës të veriut
produktet e shumëfishimit do të ishin polimorfike, dhe nëse do të kishte dallime për
shkak të acideve nukleike të përdorura si modele për shumëfishimin.Figura 3.10 më
poshtë tregon fragmentet e shumëfishuara nga të dy kategoritë e templateve, që
rezultuan të njëjta, duke provuar se rajoni i shumëfishuar në të gjitha popullatat nuk
përmbante introne, pra ishte pjesë e një fragmenti plotësisht kodues.
Figura 3.10. Produktet e shumëfishimit të templatit ADN gjenomike dhe ARN totale për 13
popullatat me anë të Sbs350/Sbs1010
REZULTATE DHE DISKUTIME
62
Figura 3.11. Produktet e shumëfishimit me anë të Sbs350/Sbs1010 nga templat ARN -je
Në figurën 3.10, nga e majta në të djathtë në gjysmën e sipërme të xhelit renditen
produktet e shumëfishimit të 13 gjenotipeve me anë të Sbs350/Sbs1010; Mostrat 1-13
nga templat gADN;1-6 nga tempat ARN; Markeri molekular 1kbp. Në gjysmën e
poshtme të xhelit renditen nga e majta në të djathtë mostrat 7-10 nga templat ARN,
kontrolli dhe Markeri 1kbp.
Në figurën 3.11, nga e majta në të djathtë në xhel renditen produktet e shumëfishimit
me anë të Sbs350/Sbs1010 nga templat ARN 11-13; kontrolli; Markeri 1kbp.
Produkti i pritshëm i shumëfishimit është rreth 800çb, dhe është prodhuar në të gjitha
mostrat.
Me synim evidentimin e dallimeve ndërmjet amplikoneve që kanë përmasa të njëjta, u
vendos që të vijonte puna me nxjerrjen nga xheli dhe klonimin e tyre në E.coli sipas
metodologjisë së Invitrogen. Klonimi do të mundësojë veçimin e produkteve të
shumëfishta një-përmasore pasi çdo plazmid mund të strehojë vetëm një fragment
ADN-je.
3.3.2. Analizimi i plazmideve rekombinante me anë të analizës restriktive
Përmasat e inserteve të kloneve pozitive nga popullatat më të veçanta u vlerësuan me
anë të prerjes së plazmideve rekombinante me EcoRI. Në figurën 3.12 paraqiten
profilet e prerjeve të amplikoneve për kater koloni transformante nga popullata e
Krujës.
REZULTATE DHE DISKUTIME
63
Figura 3.12. Profilet e prerjes restriktive për popullatën e Krujës
Në figurën e mësipërme 3.12 paraqiten profilet e prerjes restriktive për popullatën e
Krujës, nga e majta në të djathtë; Markeri molekular 1kbp, kolonitë 1, 2, 3, 4 Siç duket nga figura 3.12 kolonia 1 ka dhënë dy produkte prerjeje të amplikonit me
përmasa respektivisht 0,2 dhe 0,7 kbp; Kolonitë 2 dhe katër kanë dhënë produkte me
përmasa 0,3 dhe 0,5 kbp; Kolonia 3 ka dhënë një fragment 0.9kbp. Referuar këtyre
profileve në popullatën e Krujës ka së paku tre fragmente të ndryshme të gjeneve
koduese të MTP.
Figura 3.13. Profilet e prerjes restriktive për popullatën e Postribës
Në figurën e mësipërme 3.13 paraqiten profilet e prerjes restriktive për popullatën e
Postribës, nga e majta në të djathtë; Markeri molekular 1kbp, kolonitë 1, 2, 3, 4. Siç duket nga figura 3.13, në popullatën e Postribës, plazmidet rekombinante kanë
strehuar nga një fragment të vetëm në të katër kolonitë e analizuara.
Figura 3.14. Profilet e prerjes restriktive për popullatën e Torovicës
REZULTATE DHE DISKUTIME
64
Në figurën e mësipërme 3.14 paraqiten profilet e prerjes restriktive për popullatën e
Torovicës, nga e majta në të djathtë; Markeri molekular 1kbp, kolonitë 1, 2, 3, 4. Profilet e prerjes tregojnë se kolonitë 1 dhe 3 kanë strehuar nga një fragment 0,8kbp të
barabartë në përmasa; Kolonia 2 ka strehuar dy fragmente 0,3 dhe 0,5kbp; kolonia 4
ka strehuar një fragment 7,5kbp. Bazuar në figurën 3.14 prej popullatës së Torovicës
janë shumëfishuar së paku tre fragmente gjenike të ndryshme të MTP.
Si rrjedhim, popullatat e marra në studim përmbajnë deri në tre kategori të
fragmenteve gjenike të MTPs. Kjo tregon se pavarësisht ngjashmërisë së madhe të
fragmenteve të izoluara, ato nuk janë identike, një rezultat ky i rëndësishëm për
diversitetin e gjeneve koduese të MTPs në këto popullata.
Metodat për izolimin e gjeneve koduese të MTPs të përdorura ndër vite janë të
ndryshme, por të gjitha marrin në konsideratë faktet se shprehja e tyre është e
kontrolluar në qelizat gjëndrore të trikomave, ose e kufizuar në faza të caktuara
vegjetative të bimës, ose e nxitur si një përgjigje mbrojtëse ndaj predatorëve.
Njëherësh, disa metoda marrin parasysh shprehjen në qeliza ose inde specifike të
MTPs (Grazhdani, 2000). Nëse do të klasifikoheshin metoda bazë të përdorura janë
metoda të gjenetikës reverse të bazuara ne enzimat e purifikuara, PCR të bazuara në
ngjashmerinë e rajoneve gjenike, dhe teknika të bazuara tek mutantët.
Në analizimin e gjeneve koduese të MTPs një evolucion të mirëfilltë solli analizimi në
1999, i monoterpeneve tek Quercus ilex L. dhe bimët transgjenike të Betula pendula
Roth, nga Bohlmann (1999). 24 fragmente koduese të MTPs u analizuan me RFLP
dhe u klasifikuan në 5 grupe bazuar në hartën restriktive.
Dy prej kloneve të izoluara u shprehën tek E. coli nga ku u vu re se njëri kodonte për
multiprodukt të panjohur të kategorisë së monoterpen-sintetazave, i cili katalizonte
formimin e α-pinenit, sabinenit dhe β-pinenit, ndërsa kloni i dytë i emërtuar QiPINS
përbënte një sekuencë të plotë koduese.
Raportimet mbi kapacitetin e një terpen-sintetaze të vetme për të prodhuar produkte
shumëfishe shpesh lidhen me veçoritë e gjeneve të tyre koduese. Analizat e
sekuencave koduese të MTPs në bimë të ndryshme kanë treguar rajone të konservuara
dhe karakteristika strukturore, numër të barabartë intronesh dhe përmasa të ngjashme
të ekzoneve, si dhe pozicion të njëjtë të tyre (Bohlmann et al., 1998).
Por, një numër autorësh mendojnë se diversiteti i monoterpeneve është i lidhur me
diversitetin funksional për shkak të dublikimit të gjeneve. Zapata (2013) rindërtoi
historinë evolutive të monoterpen sintetazave (TPSb) tek speciet Protium, si edhe
ndryshimet taksonomike e kimike në gjininë e pemëve tropikale. Studimi rezultoi në
gjetjen e provave se ngjaret e dublikimit kanë çuar në formimin e 3 deri në 5 kopje të
gjeneve TPSb tanimë të pranishëm në Protium.
Në mbështetje të kësaj ideje ka qënë edhe Mac Lean (1983), i cili raporton se gjenet
koduese të terpen-sintetazave i përkasin një familjeje gjenike, anëtaret e të cilës
karakterizohen nga rajone shumë të konservuara dhe nga rajone, që ka mundësi të
kodojnë për domene katalitike, të cilat mund të kenë diverguar lehtësisht prej njeri-
tjetrit përmes akumulimit të mutacioneve të ndryshme.
Në familjen Lamiaceae (Labiatae) gjenden disa monoterpen-sinteza përfshirë linalool
dhe limonen sintetazën, të cilat janë klonuar dhe përcaktuar funksionalisht në disa
bimë të familjes Labiatae. Saeidnia (2014) përcaktoi praninë e linaloolit dhe limonen-
REZULTATE DHE DISKUTIME
65
sintetazës në katër specie të familjes Labiatae përfshirë Nepeta cataria, Lavandula angustifolia, Hyssopus officinalis dhe Salvia schlarea.
Studime mbi gjenet koduese të MTPs tek Salvia officinalis dhe Salvia fruticosa të Greqisë (Grazhdani A., 2000; 2003, 2004) kanë raportuar izolimin dhe karakterizimin e një sërë sekuencash të gjeneve të MTPs të cilat ndajnë ngjashmëri të mëdha (të vërejtura nga mbivendosja e fragmenteve gjenike dhe ajo e sekuencave të deduktuara të aminoacideve respektive. Sipas Bohlmann (1998) ngjashmëria ndërmjet anëtarëve të familjeve gjenike të këtij lloji është e pritshme (në mjaft raste është e nivelit mbi 40%).
3.4 Vlerësimi i diversitetit të popullatave të sherbelës së Shqipërisë së veriut bazuar në përmbajtjen e MTP në vajrat esenciale
Diversiteti i popullatave të sherbelës së Shqipërisë të Veriut bazuar në përmbajtjen e monoterpeneve në vajrat esenciale u vlerësua me anë të teknikës Gaz-kromatografike.
3.4.1. Rezultatet të Gaz-kromatografisë për popullatat e Salvia officinalis Më poshtë janë paraqitur kromatogramat e marra me anë të teknikës të gaz-kromatografisë me detektor me jonizim me flakë. Me anë të kësaj teknike në përgjithësi fitohen nga 70 deri 120 komponime por vetëm 20-25 prej tyre përbëjnë komponentët kryesore (me përqëndrim më të madh se 1%). Këto kompozime kryesore janë identifikuar tek të gjitha mostrat e marra në analizë dhe janë përdorur për studimin tonë.
Në kromatograma e rëndësishme është koha e daljes (retention time) të secilit pik, e vendosur në boshtin e abshisave. Kjo është e lidhur me identifikimin e komponentit dhe analizën cilësore të tij. Në kushte të njëjta kromatografike një komponim del gjithmonë në të njëjtën kohë. Lartësia e pikeve gjithashtu është e rëndësishme sepse ajo është e lidhur me analizën sasiore.Sa më i madh të jetë piku, aq më i madh është përqëndrimi i tij. Lartësia e pikeve matet me Hz në boshtin e ordinatave. Në studimin tonë jemi bazuar në raportin relativ të sipërfaqjes të secilit pik kundrejt totalit të sipërfaqjeve të të gjithë pikeve të integruar. Totali i tyre konsiderohet 100%.
Figura 3.15. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Shkodrës
36343230282624222018161412108642
2,200,000
2,000,000
1,800,000
1,600,000
1,400,000
1,200,000
1,000,000
800,000
600,000
400,000
200,000
0
-200,000
-400,000
-600,000
TI
ON
TI
OF
F
RT [min]
sherebele shkoder90.DATAµV
REZULTATE DHE DISKUTIME
66
Figura 3.16. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Malësisë së Madhe (Grishaj)
Figura 3.17. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Torovicës
Figura 3.18. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Rubikut
3836343230282624222018161412108642
5,000,000
4,500,000
4,000,000
3,500,000
3,000,000
2,500,000
2,000,000
1,500,000
1,000,000
500,000
0
-500,000
TI
ON
TI
OF
F
RT [min]
Sherebele malesi madhe87.DATAµV
3836343230282624222018161412108642
1,900,0001,800,000
1,700,000
1,600,000
1,500,0001,400,000
1,300,000
1,200,000
1,100,0001,000,000
900,000
800,000700,000
600,000
500,000
400,000300,000
200,000
100,000
0-100,000
-200,000
-300,000
TI
ON
TI
OF
F
RT [min]
Sherebele Torovec87.DATAµV
36343230282624222018161412108642
5,000,000
4,500,000
4,000,000
3,500,000
3,000,000
2,500,000
2,000,000
1,500,000
1,000,000
500,000
0
-500,000
-1,000,000
TI
ON
TI
OF
F
RT [min]
Sherebele Rubik87.DATAµV
REZULTATE DHE DISKUTIME
67
Figura 3.19. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të Krujës
Figura 3.20. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Balldrenit
Figura 3.21. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të Fushë
Milot-it
36343230282624222018161412108642
2,800,000
2,600,000
2,400,000
2,200,000
2,000,000
1,800,000
1,600,000
1,400,000
1,200,000
1,000,000
800,000
600,000
400,000
200,000
0
-200,000
-400,000
TI
ON
TI
OF
F
RT [min]
sherebeleKruje87.DATAµV
3836343230282624222018161412108642
2,800,000
2,600,000
2,400,000
2,200,000
2,000,000
1,800,000
1,600,000
1,400,000
1,200,000
1,000,000
800,000
600,000
400,000
200,000
0
-200,000
-400,000
-600,000
-800,000
TI
ON
TI
OF
F
RT [min]
Sherebele Balldren87.DATAµV
REZULTATE DHE DISKUTIME
68
Figura3.22. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të Lezhës
Figura 3.23. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të Lohes
REZULTATE DHE DISKUTIME
69
Figura 3.24. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Postribës
Figura 3.25. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Shëngjinit
REZULTATE DHE DISKUTIME
70
Figura 3.26. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të Ulzës
Figura 3.27. Kromatogramë e marrë me GC/FID për popullatën e Salvia officinalis të
Valbonës
Përbërja e vajrave esenciale për 13 popullatat natyrore të sherbelës të Shqipërisë së
veriut tregoi se nga 20 përbërës të vajrave esencialë të analizuar me GC/FID (figura
REZULTATE DHE DISKUTIME
71
3.28, tabela 3.4), përbërësit më të shumtë janë α-tujon, β-tujon, kamfor, 1,8-cineol dhe
kamfen.
Αlfa-tujon është përbërësi më predominant me një rang shpërndarje nga 18.67% (në
popullatat e Shëngjinit) në 36.1% (popullata e Postribës), e ndjekur nga kamfori në
një rang 10.98% (Balldren) deri në 22.95% (Rubik); 1.8-cineol nga 8.4% (Valbona)
në 22.23% (Shkodër); kamfen nga 2.14% (Balldren) në 11.43% (Rubik); β-tujon nga
2.29% (Ulza) në 7.67% (Valbona), dhe α-pinen nga 2.2% (Postriba) në 9.42%
(Kruja). Monoterpene të tjera të gjetura ishin borneol (1.21% në Balldren-3.89% në
popullatat e Shëngjinit), β-pinen (0.88% tek popullata e Torovicës në 2.44% tek
Lezha), mirceni (0.4% në popullatën e Ulzës deri në 1.96% në popullatën e Lezhës),
bornil acetati (0.33% në popullatën e Shkodrës në 2.77% në popullatën e Lohes).
Dy nga 20 përbërësit e analizuar ishin seskuiterpene, β-karafilen dhe humulen, të
gjetura në një sasi që i korrespondojnë vlerave nga 0.25% (në popullatën e Grishaj,
Malësi e Madhe) në 7.62% (popullatën e Balldrenit) dhe nga 0.32% (popullata e
Shëngjinit) në 8.02% (popullata e Ulzës), respektivisht. Përëbërësit e tjerë ishin në
sasi më të vogla se 1%. Kontributi (në përqindje) i grupeve terpenoide varionte midis
popullatave. Përbërësit e monoterpeneve varionin nga 0.02-36.1% dhe seskuiterpenet
nga 0.25%-8.02%. Ndryshime të vogla u panë për monoterpenet e oksigjenuara.
Mirceni ishte monoterpeni me sasi më të vogël (0.4%-2.84%). (Tabela 3.4)
Rezultatet e përbërësve të vajrave esenciale për popullatat e Shqipërisë të Veriut
(Tabela 3.4) janë në përputhje me literaturën në lidhje me përbërësit kryesorë të
terpenoideve (Said-Al Ahlet al., 2015; Porte et al., 2013; Couladis et al., 2002;
Stesevic et al., 2014; Menghini et al., 2012; Jug-Dujakovic´ et al., 2012). Ndërkohë,
sasitë e përbërësve, ashtu siç pritej, ndryshojnë nga ato të raportuara në vendet e
Mesdheut dhe vende të tjera të botës, gjithashtu edhe midis popullatave lokale në
studim.
Ndryshime të rëndësishme në sasi ka shprehur α-tujoni, i cili në popullatat e
Shqipërisë të veriut rezultoi më i lartë krahasuar me ato të popullatave të Brazilit
(Porte et al., 2013); popullatat e Egjiptit (Said-Al Ahl et al., 2015); popullatat e
Serbisë (Couladis et al., 2002); popullatat e Malit të Zi (Stesevic et al., 2014) dhe
Italisë qendrore (Menghini et al., 2012). Ndërsa popullatat e Bosnjë-Hercegovinës
tregojnë përqindje më të lartë për α-tujonin (Jug-Dujakovic´et al., 2012) krahasuar me
popullatat tona.
REZULTATE DHE DISKUTIME
72
Tabela 3.4. Përbërja e vajrave esenciale të popullatave të Shqiperisë së veriut (monoterpenet dhe seskuiterpenet kryesore)
REZULTATE DHE DISKUTIME
73
Sasia totale e monoterpeneve në popullatat e Shqipërisë të veriut është më e ulët se ato
të raportuara nga mostrat e Hercegovinës qendrore dhe Europës jugore (Cvektovikj et
al., 2015; Jug-Dujakovic´ et al., 2012). Duke konsideruar përbërësit e
seskuiterpeneve, vajrat esenciale nga Shqipëria e veriut përmbajnë dy përbërës,
humulene dhe β-karafilen, ndërsa mostrat nga lindja e Lituanisë (Bernotien et al.,
2007), Serbisë (Couladis et al., 2007), Europës jugore (Cvektovikj et al., 2015), dhe
Malit të Zi (Stesevic et al., 2014) kanë një përqindje të vogël të tre përbërësve shtesë.
Nëse shohim ndryshimet në përbërësit madhorë midis popullatave lokale shqiptare,
është e dukshme se mostrat nga Torovica, Malësi e Madhe (Grishja), Lohe, Prostriba,
Balldren dhe Valbona kanë nivelin më lartë të α-tujonit (Tabela 3.4, figura 3.28).
Popullatat e Balldrenit dhe Valbonës kanë vlerat më të larta të β-tujonit; Tetë prej 13
popullatave kanë përbërësin kamfor më shumë se 20% dhe gjithashtu ka shumë
variabilitet në përbërësit e 1,8-cineolit dhe α-pinenit.
Figura 3.28. Përmbajtja në kategoritë kryesore të monoterpeneve dhe sesquiterpeneve
në popullatat e Shqipërisë së veriut
Përbërja e kamfenit tregon rritje për 2 popullatat (Shkodër, Rubik), ndërsa popullatat e
tjera kanë pothuajse gjysmën e sasisë.
3.4.2. Shkalla e ngjashmërisë ndërmjet popullatave bazuar në përmbajtjen e
vajrave esenciale
Krahasimi i përbërësve të vajrave esenciale në 13 popullatat në studim mund të
shërbejnë për ti grupuar ato në 6 grupe kryesore, të cilat nuk janë të lidhura me
afërsinë gjeografike ose lartësinë mbi nivelin e detit (Figura 3.29).
REZULTATE DHE DISKUTIME
74
Figura 3.29. PCA-Biplot i grupon popullatat në studim në varësi të përmbajtjes së vajrave
esenciale
Në figurën e mësipërme rreshtat përfaqësojnë popullatat dhe kolonat (kategoria e
variablave) përfaqëson çdo përbërës të vajrave esencialë për secilën popullatë.
Distanca midis çdo popullate ose përbërësi te vajit esencial na jep informacion mbi
diversitetin e tyre. Popullatat me profile të ngjashme janë afër faktorit të hartës si për
boshtet X (popullatat) dhe boshtet Y (kolonat për vajrat esencialë).
Figura 3.30. Paraqitja grafike e kontributit të çdo përbërësi të vajrave esenciale tek popullatat
e sherbelës së Shqipërisë së veriut në raport me njëri-tjetrin
REZULTATE DHE DISKUTIME
75
Përbërja cilësore dhe sasiore e vajrave esenciale të sherbelës është e rëndësishme
veçanërisht për qëllime tregtare. Bazuar në ISO 9909 për përdorimet mjekësore, jo të
gjithë përbërësit e vajrave esenciale të sherbelës të marra në studim (Figura 3.28)
përputhen me kërkesat e ISO 9909 dhe German Drug Codex. Shumica e popullatave
natyrore të Shqipërisë të veriut kanë sasinë e duhur të α-tujonit, kamforit, 1,8-cineolit,
β-tujonit, α-humulenit, linalool, borneol dhe acetat bornilit, por përbërës të tjerë
(Figura 3.30) si α-pineni, kamfeni dhe limoneni rezultojnë në sasi më të mëdha.
Figura më lart paraqet kontributin e cdo përbërësi të vajrave esenciale të sherbelës në
popullatat e marra në studim, duke evidentuar kështu vlerën reale të cdo njërës
popullatë për tu përdorur për qëllime tregtare.
Nëse krahasojmë grupimin e popullatave të sherbelës bazuar në rezultatet e RFLPs të
rajonit trn të cp-DNA me rezultatet e Figurës 3.9, vërejmë ngjashmëri të
konsiderueshme. Përdorimi i rajoneve ndërgjenike të cpDNA si mjete për studime
sistematike në nivel popullatash është i rëndësishëm për shkak të shumëllojshmërisë
së lartë të dëshmuar nga këto rajone krahasuar me rajonet gjenike të cpDNA. Kështu,
variabilitieti i sasisë së monoterpeneve, si produkte të gjeneve koduese të
monoterpen-sintetazave, që korrespondon me variabilitietin e rajoneve trn të cp-DNA,
mund të shpjegohet me rolin e mundshëm të këtyre rajoneve jo-koduese në
rregullimin e shprehjes së gjeneve për MTPs, i cili është raportuar se ndodh në qelizat
e specializuara të trikomave gjëndrore të indeve të ndryshme të sherbelës.
PERFUNDIME
76
PËRFUNDIME
Trembëdhjetë popullata natyrore të sherbelës së Shqipërisë së veriut u
analizuan për herë të parë për të vlerësuar diversitetin e gjeneve koduese të
monoterpen-sintetazave dhe produkteve të tyre monoterpenoidike.
Metodologjia e ndjekur u bazua në shumëfishimin e bazuar në homologjinë e
gjeneve koduesë te TPs me anë të PCR (nga gADN dhe ARN totale), klonimin
e produkteve (në plazmidin pTOPO2.1), krijimin e librarive përkatëse në
E.coli dhe verifikimin me anë të prerjes restrikive të diversitetit të fragmenteve
të klonuara.
Produkti i pritshëm 0.9kbp i gjeneve koduese të MTPs u prodhua nga të gjitha
popullatat, dhe prerja restriktive e kloneve të tre popullatave më të veçanta
(sipas profileve kimike dhe PCR-RFLP të cpADN-së) provoi praninë e
produkteve të shumëfishta një-përmasore.
Paraprakisht, për të përcaktuar popullatat më të veçanta të sherbelës, të cilat
nuk paraqesin dallime morfologjike, u përdor RFLP-PCR mbi cpADN-të e
tyre. Çifti i primerave trnF-trnL (Ibrahim et al., 2012) shumëfishoi fragmentin
e pritshëm nga të gjitha mostrat e Salvia officinalis të analizuara dhe në vijim
iu nënshtrua RFLP për të verifikuar dallimet në përmbajtjen e fragmenteve për
çdo popullatë.
Analiza e të dhënave nga RFLP-PCR e cp-ADN (AluI dhe TaqI), bazuar në
UPGMA cluster analysis prodhoi dendrograma të ngjashmërisë, falë të cilave
43 gjenotipet u organizuan në gjashtë grupe kryesore.
Efektiviteti i enzimave prerëse AluI dhe TaqI për të evidentuar dallimet në
produktet e shumëfishuara nga cpADN, u bë i dukshëm me anë të software
PCoA, grafikët e prodhuar treguan superioritetin e AluI.
Gaz-kromatografia u përdor për të analizuar përmbajtjen në MT të vajrave
esenciale të 13 popullatave të marra në studim. Përbërësit kryesorë rezultuan
α-tujoni, β-tujoni, kamfori, cineoli, α-pineni, dhe kamfeni. Monoterpenet me
sasi të vogla zenë vetëm deri 5%; sesquiterpenet përfaqësohen nga β-
kariofileni dhe humuleni, që përbëjnë më pak se 10%;
Dallim i rëndësishëm vihet re në sasinë e α-tujonit të mostrave shqiptare, e cila
krahasuar me ato të Brazilit, Egjyptit, Serbisë, dhe Italisë qendrore është e
lartë, ndërsa ndaj mostrave të Malit te Zi më e ulët.
Software PCoA u përdor për të grupuar popullatat sipas ngjashmërisë së
profileve kimike. Bazuar në të popullatat mund të konsiderohen si shumë të
ngjashme (Postriba-Valbona; Torovica-Malësi e Madhe); mund të grupohen
(Shkodra-Rubik; F.Milot-Shëngjin); ose të veçohen si të ndryshme (Balldren,
Kruja, Lohe, Ulza, Lezha).
Grupimi i popullatave bazuar në profilet e vajrave esenciale nuk ka të bëjë me
aferinë gjeografike apo lartësinë mbi nivelin e detit të popullatave.
PERFUNDIME
77
Krahasimi i grupimeve të popullatave të sherbelës sipas ngjashmërisë, bazuar
në diversitetin e rajonit trn të cp-ADN-ve dhe sipas profileve të vajrave
esenciale, tregon se ato janë të ngjashme.
Variabiliteti në përmbajtjen cilësore dhe sasiore të monoterpeneve, si produkti
final i gjeneve koduese të monoterpen sintazave, të cilat korrespondojnë me
variabilitetin e rajoneve trn të cpADN-ve, mund të shpjegohen me rolin e
mundshëm të ketij rajoni në rregullimin e shprehjes të gjeneve koduese të
monoterpeneve.
Produktet e shumëfishta të rajonit qendror të gjeneve koduese të MTP-ve të
izoluara nga popullatat e Krujës, Postribës dhe Torovicës, të cilat bazuar në të
tre kategoritë e analizave të kryera rezultojnë më të veçantat, dëshmojnë
diversitetin gjenetik të këtyre gjeneve edhe në sherbelat e veriut të Shqipërisë.
BIBLIOGRAFIA
78
BIBLIOGRAFIA
1. Allen D.J. (2014). Salvia officinalis. The IUCN Red List of Threatened
Species:e.T203260A2762648. http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2014-
1.RLTS.T203260A2762648.
2. Alonso W. R., and Croteau R. (1993) Methods Plant Biochem. 9, 239–260
3. Alonso W.R.; Rajaonarivony J.I.; Gershenzon J. and Croteau R. (1992).
Purification of 4S-limonene synthase, a monoterpene cyclase from the
glandular trichomes of peppermint (Mentha x piperita) and spearmint (Mentha
spicata). Journal of Biological Chemistry 267:7582-7587.
4. Arraiza M.P.; Arrabal C.; López J.L.(2012). Seasonal variation of essential oil
yield and composition of sage (Salvia officinalis L.), grown in Castilla – La
Mancha (Central Spain). 5. Asllani U. (2004): Bimët mjekësore të vendit tonë. Monografi, Tiranë; 81-95
6. Asllani U. (2004): Bimët mjekësore të vendit tonë. Monografi, Tiranë; 81-95
7. Asllani U. (2000). Journal of Essential Oil Research 12(1):79-84
8. Asllani U. (2000). Journal of Essential Oil Research 12(1):79-84.
9. Avise J.C. (1994). Molecular Markers, Natural History, and Evolution.
Chapman & Hall, New York (511 pp.).
10. Babani F.; Toska V.; Koci K.; Bacu A.; Misiri E. (2005). Genetical and
chemical characterization of four populations of Salvia officinalis. Stud. Biol.
No10, 69-77, 2005.
11. Babani F.; Toska V.; Koci K.; Bacu A.; Misiri E. (2005). Genetical and
chemical characterization of four populations of Salvia officinalis. Stud. Biol.
No10, 69-77, 2005. 12. Grazhdani A., Makris. A, Owen C.; 2003. Use of the restriction analysis as a useful
tool for the identification of the differences among PCR amplified products of TPS
gene fragments. Stud. Biol.
13. Grazhdani-Bacu A., Makris.A, Owen.C, 2004. Expression patterns of two
unique MTP gene fragments isolated from Salvia officinalis and Salvia
fruticosa, Biological Studies 8/2004: 3-8.
14. Bacu A.; Babani F. (2005).Molecular characterization of Salvia officinalis
andSalvia triloba grown in Albania. AJNTS (Albanian Journal of Natural and
Technical Sciences), 2005.Pg 65-71. ISSN: 2074-0867.
15. Bacu A.; Loeser C.; Marko O.; Appenroth K. (2011). Amplified length
polymorphisms (AFLP) group populations of Salvia officinalis of Albania in
accordance to their geographical locations. International Journal of Ecosystem
and Environment Research (IJEES). ISBN: 978-9928-4068-0-4. Vol I, Issue 1.
2011. Pg.172-176.
16. BacuA. (2012). Baza të Bioteknologjisë Molekulare.
17. Badenes M. L. and Parfitt D. E., (1995). Phylogenetic relationships of the
cultivated Prunus species from an analysis of chloroplast DNA
variation. Theor. Appl. Genet. 90: 1035–1041.
18. Bailey L.H. (1924). "Manual of Cultivated Plants" 1924
19. Baldauf S.L.; Palmer J.D. (1990) Evolutionary transfer of the chloroplast tufA
gene to the nucleus. 344-262-265
BIBLIOGRAFIA
79
20. Baricevic D.; Bartol T. (2000). The biological pharmacological activity of the
Salvia genus V., In: Kintzios, S. E. The Genus Salvia Haewood Academic
Publishers, Amsterdam, 2000.
21. Belhattab R.; Larous L.; Figueiredo A.C.; Santos-Gomes P.A.; Barroso J.G.;
Pedro L.G. (2005).Origanum glandulosum Desf. grown wild in Algeria:
essential oil composition and glycosidic bound volatiles. Flavour Fragrance J
2005;20: 209–12.
22. Bernotienė G.; Nivinskienė O.; Butkienė R.; and Mockutė D. (2007). Essential
oil composition variability in sage (Salvia officinalisL.). CHEMIJA. 2007.
Vol. 18. No. 4. P. 38–43
23. Bick, J.A. and B.M. Lange (2003) Metabolic cross talk between cytosolic and
plastidial pathways of isoprenoid biosynthesis: Unidirectional transport of
intermediates across the chloroplast envelope membrane. Archives of
Biochemistry and Biophysics 415:146-154
24. Bohlmann J.; Steele C.L.; Croteau R. (1998) Monoterpene synthases from
grand fir (Abies grandis): cDNA isolation, characterization and functional
expression of myrcene synthase, (−)-4S-limonene synthase and (−)-(1S,5S)-
pinene synthase. J Biol Chem. 1997;272:21784–21792. [PubMed]
25. Bohlmann J.;Phillips M.; Ramachandiran V.;Katoh S.;Croteau R. (1999):
cDNA Cloning, Characterization, and Functional Expression of Four Nee
Monoterpene Synthase Members of the Tpsd Gene Family from Grand Fir
(Abies grandis). Archives of Biochemistry and Biophysics. Vol. 368. Issue
2;232 – 243
26. Bohlmann, J.; Steele C.L.; and Croteau R. (1997). Monoterpene synthases
from grand fir (Abies grandis). cDNA isolation, characterization, and
functional expression of myrcene synthase, (-)-(4S)-limonene synthase, and (-
)-(1S,5S)-pinene synthase. Journal of Biological Chemistry 272:21784-21792.
27. Bohlmann J.; Martin D.; Oldham N.J. and Gershenzon J. (2000). Terpenoid
secondary metabolism in Arabidopsis thaliana: CDNA cloning,
characterization, and functional expression of a myrcene/(E)-beta-ocimene
synthase. Archives of Biochemistry and Biophysics 375:261-269.
28. Bohlmann J.; Meyer-Gauen G. and Croteau R. (1998b). Plant terpenoid
synthases: Molecular biology and phylogenetic analysis. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 95:4126-4133.
29. Bohlmann J.; Phillips M.; Ramachandiran V.; Katoh S. and Croteau R. (1999)
cDNA cloning, characterization, and functional expression of four new
monoterpene synthase members of the tpsd gene family from grand fir (Abies
grandis). Archives of Biochemistry and Biophysics 368:232–243.
30. Bohlmann J.; Meyer-Gauen G. and Croteau R. (1998): Plant terpenoid
synthases: Molecular biology and phylogenetic analysis. Proceedings of the
National Academy of Sciences. 95, 4126-4133
31. Boscherini G.; Morgante M.; Rossi P. (1994). Allozyme and chloroplast DNA
variation in Italian and Greek populations of Pinus
leucodermis. Heredity 73: 284–290.
32. Bouaziz M.; Yangui T.; Sayadi S.; Abdelhafidh and Dhouib. (2009)
Disinfectant properties of essential oils from Salvia officinalis L. cultivated in
Tunisia. Food Chem Toxicol. 2009; 47:2755–2760.
33. Bouvier F.; Rahier A. and Camara B. (2005). Biogenesis, molecular regulation
and function of plant isoprenoids. Progress in Lipid Research 44:357-429.
BIBLIOGRAFIA
80
34. Bown D.(1995)The herb Society of America: encyclopedia of herbs & their
uses. New York: Dorling Kindersley Publishing Inc. 1995. 563p.
35. Brown T.A. (2010). Gene cloning and DNA analysis: An introduction, 6th
Edition. Wiley-Blackwell.
36. Buckle J. (2003). Clinical Aromatherapy. New York: Churchill Livingstone.
37. Chamorro E.R.; Zambón S.N.; Morales W.G.; Sequeira A.F.; Velasco G.A.
(2011). Study of the Chemical Composition of Essential Oils by Gas
Chromatography. Gas Chromatography in Plant Science, Wine Technology,
Toxicology and Some Specific Applications. Pg 307-325
38. Chappell, J., F. Wolf, J. Proulx, R. Cuellar and C. Saunders (1995). Is the
reaction catalyzed by 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase a
rate-limiting step for isoprenoid biosynthesis in plants? Plant Physiology
109:1337-1343.
39. Cheng, A., Lou, Y., Mao, Y., Lu, S., Wang, L. and X. Chen. (2007): Plant
terpenoids: Biosynthesis and ecological functions. Journal of Integrative Plant
Biology. 49, 179-186
40. Christianson, D.W. (2006). Structural biology and chemistry of the terpenoid
cyclases. Chemical Reviews 106:3412-3442.
41. Clark, R.J. and Menary R.C. (1980a). Environmental effects on peppermint
(Mentha piperita L.). II. Effects of temperature on photosynthesis,
photorespiration and dark respiration in peppermint with reference to oil
composition. Australian Journal of Plant Physiology 7:693-697.
42. Clark, R.J. and Menary R.C. (1980b). Environmental effects on peppermint
(Mentha piperita L.). I. Effect of day length, photon flux density, night
temperature and day temperature on the yield and composition of peppermint
oil. Australian Journal of Plant Physiology 7:685-692.
43. Clebsch, B. (2003). The new book of Salvias, sages for every garden. Timber
Press, Portland, Oregon, U.S.A.
44. Colby, S.M. Alonso W.R.; Katahira E.J.; McGarvey D.J. and Croteau R.
(1993). 4S-limonene synthase from the oil glands of spearmint (Mentha
spicata). cDNA isolation, characterization, and bacterial expression of the
catalytically active monoterpene cyclase. Journal of Biological Chemistry
268:23016-23024.
45. Colson, M., Pupier R. and Perrin A. (1993). Biomathematical study of the
number of peltate glands on Mentha x piperita leaves. Canadian Journal of
Botany 71:1202-1211.
46. Couladis M.; Tzakou O.; Mimica-Dukic N.; Jancic R.; Stojanovic D. (2002).
Essential oil of Salvia officinalis L. from Serbia and Montenegro. Flavor and
Fragrance Journal. Volume 17, Issue 2 March/April 2002 Pages 119–126.
DOI: 10.1002/ffj.1065.
47. Croteau, R. (1987) Chem. Rev. 87,929–954
48. Croteau, R. (1992) in Recent Developments in Flavor and Fragrance
Chemistry(Hopp, R., and Mori, K., eds) pp. 263–273, VCH, Weinheim,
Germany
49. Croteau, R., Alonso, W. R., Koepp, A. E., and Johnson, M. A. (1994) Arch.
Biochem. Biophys. 309, 184–192
50. Croteau, R., and Karp, F. (1979) Arch. Biochem. Biophys. 198,512–522
BIBLIOGRAFIA
81
51. Crozier A.; Clifford M.N.; Yokota T., Jaganath I.B.; Marks S.C.; Saltmarsh
M. (2006). Secondary metabolites in fruits, vegetables, beverages and other
plant-based dietary components. Pg 208-302. Blackwell Publishing Ltd.
52. Curtis, S. E. and Clegg M.T. (1984) Molecular evolution of chloroplast DNA
sequences. Mol. Biol. Evol.1:29 l-301
53. Cusidó, R.M.; Palazón J.; Bonfill M.; Expósito O.; Moyano E. and Piñol M.T.
(2007). Source of isopentenyl diphosphate for taxol and baccatin III
biosynthesis in cell cultures of Taxus baccata. Biochemical Engineering
Journal 33:159-167.
54. Cvektovikj I.; Stefkov Gj.; Karapandzova M.; Kulevanova S.; Satovic Z.
(2015). Essential Oils and Chemical Diversity of Southeast European
Populations of Salvia officinalis L. Chemistry and biodiversity Journal.
Volume 12, Issue 7 July 2015 Pages 1025–1039. DOI:
10.1002/cbdv.201400273
55. David F., Scanlan F., Sandra P., Szelewski M. (2010): Analysis of essential oil
compounds using retention time locked methods and retention time databases,
Application, Agilent Technologies, 5988-6530EN
56. De Sortis A.; Di Pasquale G.; Dolce M.; Gregolo S.; Papa S.; Rettore G.F.
(2009). Linee guida per la riduzione della vulnerabilità di elementi non
strutturali arredi e impianti, Presidenza del Consiglio dei Ministri
Dipartimento della Protezione Civile (in Italian).
57. Demesure B.; Sodzi N. and Petit R. J. (1995). A set of universal primers for
amplication of polymorphic noncoding regions of mitochondrial and
chloroplast DNA in plants. _/ Mol. Ecol. 4: 129_/131.
58. Dhingdra A. and Folta M.K. (2005). ASAP: Amplification, sequencing and
annotation of plastomes. BMC Genomics 6: 176 doi: 10.1186/1471-2164-6-
176.
59. Downie S.R, Palmer J.D (1992a) Use of chloroplast DNA rearrangements in
reconstructing plant phylogeny. In: Soltis PS, Soltis DE, Doyle JJ (eds)
Molecular systematics of plants. Chapman and Hall, New York, pp 14-35.
60. Doyle, J.J., and J.L. Doyle, (1987): A rapid DNA isolation procedure for
small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. v. 9: 11-15.
61. Dudareva N.; Cseke L.; Blanc VM.; Pichersky E. (1996) Evolution of floral
scent in Clarkia: novel patterns of S-linalool synthase gene expression in the
C. breweriflower. Plant Cell8:1137–1148
62. Dudareva, N.; Martin D.; Kish C..; Kolosova N.; Gorenstein N.; Faldt J.;
Miller B. and Bohlmann J. (2003). (E)-beta-ocimene and myrcene synthase
genes of floral scent biosynthesis in snapdragon: Function and expression of
three terpene synthase genes of a new terpene synthase subfamily. The Plant
Cell 15:1227-1241.
63. Dudareva N.; Andersson S.; Orlova I.; Gatto N.; Reichelt M.; Rhodes D.;
Boland W. and Gershenzon J. (2005). The nonmevalonate pathway supports
both monoterpene and sesquiterpene formation in snapdragon flowers.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 102:933-938.
64. Dumolin S.; Demesure B. and Petit R. J.(1995). Inheritance of chloroplast and
mitochondrial genomes in pedunculate oak investigated with an efficient PCR
method. Theor. Appl. Genet. 91: 1253–1256.
BIBLIOGRAFIA
82
65. Dweck A. C.(2000). The folklore and cosmetic use of various Salvia species,
in: Kintzios, S. E. (Ed.), Sage; The Genus Salvia. Harëood Academic
Publishers, Amsterdam, pp. 1-26.
66. Ebrahimabadi A.H.; Mazoochi A.; Kashi F.J.; Djafari-Bidgoli Z. and Batooli
H. (2010) Essential oil omposition and antioxidant and antimicrobial
properties of the aerial parts of Salvia eremophila Boiss. from Iran. Food
Chem Toxicol. 2010; 48(5):1371-6.
67. Eisenreich W.; Bacher A.; Arigoni D. and Rohdich F. (2004). Biosynthesis of
isoprenoids via the non-mevalonate pathway. Cellular and Molecular Life
Sciences 61:1401-1426.
68. Estevez J.M.; Cantero A.; Reindl A.; Reichler S. and Leon P. (2001). 1-deoxy-
D-xylulose-5-phosphate synthase, a limiting enzyme for plastidic isoprenoid
biosynthesis in plants. Journal of Biological Chemistry 276:22901-22909.
69. Fahn A. (1988). Secretory tissues in vascular plants. New Phytologist
108:229-257.
70. Fähnrich A.; Krause K.; Piechulla B. (2011): Product Variability of the
„Cineole Cassette‟ Monoterpene Synthases of Related Nicotiana Species.
Molecular Plant. Vol. 4. No. 6; 965 – 984
71. Falara V.;Akhtar T.A.; Nguyen T.T.H.;Spyropoulou E.A.;Bleeker
P.M.;Schauvinhold I.;Matsuba Y.;Bonini M.E.;Schilmiller A.L.;Last
R.L.;Schuurink R.C.;Pichersky E. (2011): The Tomato Terpene Synthase
Gene Family. Plant Physiology. Vol. 157 no. 2; 770 – 789
72. Farhat G.N.; Affara N.I. and Gali-Muhtasib H.U. (2001) Seasonal changes in
the composition of the essential oil extract of East Mediterranean sage (Salvia
libanotica) and its toxicity in mice. Toxicon. 2001; 39(10):1601-5.
73. Figueiredo A.C.; Barroso J.G.; Pedro L.G.; Scheffer J.J.C. (2008) Factors
affecting secondary metabolite production in plants: volatile components and
essential oils. Flavour Fragrance J 2008;23:213–26.
74. Gambliel H. and Croteau R. (1982) J. Biol. Chem. 257, 2335–2342
75. Gambliel, H., and Croteau, R. (1984) J. Biol. Chem. 259, 740–748
76. Gantt J. S.; Baldauf S.L.; Calie P.J.; Weeden N. F. & Palmer J. D. (1991)
Transfer of rpl22 to the nucleus greatly preceded its loss from the chloroplast
and involved the gain of an intron. EMBO J. 10, 3073–3078.
77. Gielly L. and Taberlet P. (1994). The use of chloroplast DNA to resolve plant
phylogenies: noncoding versus rbcL sequence. Mol. Biol. Evol. 11: 769–777.
78. Grausgruber-Gröger S.; Schmiderer C.; Steinborn R.; Novak J. (2012). Journal
of Plant Physiol. 2012. Mar 1;169(4):353-9. doi: 10.1016/j.jplph.2011.11.004.
Epub 2011. Seasonal influence on gene expression of monoterpene synthases
in Salvia officinalis (Lamiaceae).
79. Greenhagen B.T.; O‟Maille P.E.; Noel J.P.; and Chappell J. (2006).
Identifying and manipulating structural determinates linking catalytic
specificities in terpene synthases.
80. Güenther E. (1950). 3RD
Ed. The Essential Oils. D. Van Nostrand, New York
81. Hampel D.; Mosandl A. and Wust M. (2005). Biosynthesis of mono- and
sesquiterpenes in carrot roots and leaves (Daucus carota L.): Metabolic cross
talk of cytosolic mevalonate and plastidial methylerythritol phosphate
pathways. Phytochemistry 66:305-311.
82. Hedge I.C.; Tutin T.G.; Hetwood V.H.; Burges N.A.; Moore D.M.; Valentine,
D.H.; Walters S.M. and Webb D.A. (1972) (Eds.), Salvia L., in: Flora
BIBLIOGRAFIA
83
Europaea, vol. 3 Diapensiaceae to Myoporaceae, The Press Syndicate of the
University of Cambridge Publishers, Great Britain, pp 188-192.
83. Hemmerlin A.; Hoeffler J.F.; Meyer O.; Tritsch D.; Kagan I.A.;
Grosdemange-Billiard C.; Rohmer M and Bach T.J. (2003). Cross-talk
between the cytosolic mevalonate and the plastidial methylerythritol
phosphate pathways in tobacco bright yellow-2 cells. The Journal of
Biological Chemistry 278:26666-26676.
84. Huang J. C. and Sun M. (2000). Genetic diversity and relationships of
sweetpotato and its wild relatives in Ipomoea series Batatas (Convolvulaceae)
as revealed by intersimple sequence repeat (ISSR) and restriction analysis of
chloroplast DNA. _/ Theor. Appl. Genet. 100:1050_/1060.
85. Ibrahim R.I.H.; Sakamoto M. and Azuma J.I. (2012). PCR-RFLP and genetic
diversity analysis of cp-DNA in some species of the genus Salvia L.
Chromosome Botany 7: Pg 1-8
86. Ibrahim R.I.H.; Azuma, J.I.; and Sakamoto M. (2007). PCR_RFLP analysis of
the whole chloroplast DNA from three cultivated species of cotton
(Gossypium L.). Euphytica 156: 47-56
87. Ibrahim, R.I.H.; Azuma, J.I., and Sakamoto, M. (2006). Complete nucteotide
sequence of the cotton (Gossypium barbadense L.) chloroplast genome with a
comparative analysis of sequence among 9 dicot plants. Gen. Genet. Syst.
81:311-321
88. Orhan I.; Kartal M.; Kan Y. and Sener B. (2008) Activity of Essential Oils and
Individual Components against Acetyl-and Butyrylcholinesterase. Z.
Naturforsch. 2008; 63c, 547-553.
89. Itani W.S.; El-Banna S.H.; Hassan S.B.; Larsson R.L.; Bazarbachi A and Gali-
Muhtasib H.U. (2008) Anti colon cancer components from Lebanese sage
(Salvia libanotica) essential oil. Cancer Biol Ther. 2008; 7(11): 1765-73.
90. Jiang R.W.; Lau K.M.; Hon P.M.; Mak T.C.; Woo, K.S. and Fung K.P. (2005)
Chemistry and biological activities of caffeic acid derivatives from Salvia
miltiorrhiza. Curr. Med. Chem., 12, 237-246.
91. Jug-Dujakovic M.;Ristic M.;PljevljakusicD.;Dajic´-Stevanovic Z.;Liber
Z.;Hancevic K.; Radic T.;Sˇatovic Z. (2012). High Diversity of Indigenous
Populations of Dalmatian Sage (Salvia officinalis L.) in Essential-Oil
Composition. CHEMISTRY & BIODIVERSITY – Vol. 9 (2012). Pg. 2309-
2324.
92. Juhás S.; Cikos S.; Czikková S.; Veselá J.; Il'ková G.; Hájek T.; Domaracká
K.; Domaracký M.; Bujnáková D.; Rehák P. and Koppel J. (2008) Effects of
Borneol and Thymoquinone on TNBS-Induced Colitis in Mice. Folia Biol
(Praha). 2008; 54(1): 1-7.
93. Kamatou G.P.P.; Makunga N.P.; Ramogola W.P.N. and Viljoen A.M. (2008).
South Africa Salvia species: a revieë of biological activities and
phytochemistry. J. Ethnopharmacol., 119, 664-672.
94. Kampranis S.C.; Ioannidis D.; Purvis A.; Mahrez W.; Ninga E.; Katerelos
N.A. (2007). Rational conversion of substrate and product specificity in a
Salvia monoterpene synthase: structural insights into the evolution of terpene
synthase function.Plant Cell19 1994–2005. 10.1105/tpc.106.047779 [PMC
free article][PubMed][Cross Ref]
BIBLIOGRAFIA
84
95. Karousou R.; Hanlidou E. and Kokkini S. (2000). The sage plants of Greece:
distribution and infraspecific variation, in: Kintzios, S. E. (Ed.), Sage; The
Genus Salvia. Harëood Academic Publishers, Amsterdam, pp 27-46.
96. Kathe A.; Honnef S.; Heym A. (2000) Medicinal and Aromatic Plants in
Albania, Bosnia-Herzegovina, Bulgaria, Croatia and Romania‖, Bonn,
Germany 2000, fq.65
97. Kennedy D.O.; Dodd F.L.; Robertson B.C.; Okello E.J.; Reay J.L.; Scholey
A.B. and Haskell C.F. (2011) Monoterpenoid extract of sage (Salvia
lavandulaefolia) with cholinesterase inhibiting properties improves cognitive
performance and mood in healthy adults. J Psychopharmacol. 2011; 25(8):
1088-1100.
98. Kongjika E.; Bacu A.; Papajani V. (2005). "Scientific assessment of some
aromatic medicinal plants, their cultivation perspective", coauthor, Tirana
2005, ISBN 99943-656-7-3.
99. Külheim C.; Padovan A.; Hefer C.; Krause S.T.; Köllner T.G.; Myburg
A.A.; Degenhardt J.; Foley W.J. (2014): The Eucalyptus terpene synthase gene
family. BMC Genomics. DOI 10.1186/s12864-015-1598-x
100. Lane A.; Boecklemann A.; Woronuk G.N.; Sarker L.; Mahmoud S.S. (2010) A
genomics resource for investigating regulation of essential oil production in
Lavandula angustifolia. Planta 2010;231:835–45.
101. Laule O.; Furholz A.; Chang H.S.; Zhu T.; Wang X.; Heifetz P.B.; Gruissem
W. and Lange M. (2003). Crosstalk between cytosolic and plastidial pathways
of isoprenoid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 100:6866-
6871.
102. Leung A.Y.; Foster S. (1996). Encyclopaedia of common natural ingredients
used in food, drugs and cosmetic s, Wiley, New York. 2nd ed: pp. 173-17
103. Lewinsohn E.; Gijzen M.; and Croteau R. (1992) Arch. Biochem. Biophys.
293, 167–173
104. LI Q.Q.; Hui LI M.; Yuan J-Q.; Cui H.Zh.; Huang. Q. L.; Xiao P-G. (2013).
Phylogenetic relationships of Salvia (Lamiaceae) in China: Evidence from
DNA sequence datasets. Journal of Systematics and Evolution 51 (2): 184–195
(2013) doi: 10.1111/j.1759-6831.2012.00232.x
105. Li M.H.; Chen J.M.; Peng Y.; Wu Q. and Xiao, P.G. (2008). Investigation of
Danshen and related medicinal plants in China. J. Ethnopharmacol., 120, 419-
426.
106. Lichtenthaler H.K. (1999). The 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway of
isoprenoid biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Physiology and
Plant Molecular Biology 50:47-65.
107. Lima C.F.; Carvalho F.; Fernandes E.; Bastos M.L.; Santos-Gomes P.C.;
Fernandes-Ferreira M. and Pereira-Wilson C. (2004) Evaluation of
toxic/protective effects of the essential oil of Salvia officinalis on freshly
isolated rat hepatocytes. Toxicol In Vitro. 2004; 18(4): 457-65.
108. Liu Y.; Wang H.Y andLi G. (2005). Advances in the plant isoprenoid
biosynthesis pathway and its metabolic engineering. Journal of Integrative
Plant Biology 47:769-782.
109. Loizzo M.R.; Menichini F.; Tundis R.; Bonesi M.; Nadjafi F.; Saab A.M.;
Frega N.G. and Menichini F. (2010) Comparative Chemical Composition and
Antiproliferative Activity of Aerial Parts of Salvia leriifolia Benth. and Salvia
BIBLIOGRAFIA
85
acetabulosa L. Essential Oils Against Human Tumor CellIn Vitro Models. J
Med Food. 2010; 13(1):62-9.
110. Loizzo M.R.; Tundis R.; Menichini F.; Saab A.M.; Statti G.A. and Menichini
F. (2007) Cytotoxic Activity of Essential Oils from Labiatae and Lauraceae
Families Against In Vitro Human Tumor Models. Anticancer Res. 2007;
27(5A): 3293-9.
111. Lücker J.;El Tamer M.K.;Scheab E.;Verstappen F.E.;Van der Plas
L.H.;Bouemeester H.J.;Verhoeven H.A. (2002): Monoterpene biosynthesis in
lemon (Citrus limon). cDNA isolation and functional analysis of four
monoterpene synthases. Eur J Biochem. 269(13):3160-71
112. MacMillan, J. (2001). Occurrence of gibberellins in vascular plants, fungi, and
bacteria. Journal of plant growth regulation, 20 (4), 387 - 442.
113. Mahmoud S.S. and Croteau R.B. (2001). Metabolic engineering of essential
oil yield and composition in mint by altering expression of deoxyxylulose
phosphate reductoisomerase and menthofuran synthase. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 98:8915-8920.
114. Mahmoud S.S. and Croteau R.B. (2003). Menthofuran regulates essential oil
biosynthesis in peppermint by controlling a downstream monoterpene
reductase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 100:14481-14486.
115. Mahmoud S.S.; Williams M. and Croteau R. (2004) Cosuppression of
limonene-3-hydroxylase in peppermint promotes accumulation of limonene in
the essential oil. Phytochemistry 65:547-554.
116. Maric S.; Maksimovic M.; Milos M. (2006) The impact of the locality
altitudes and stages of development on the volatile constituents of Salvia
officinalis L. from Bosnia and Herzegovina. J Essent Oil Res 2006;18:178–80.
117. McCaskill D. and Croteau R. (1995). Isoprenoid synthesis in peppermint
(Mentha x piperita): Development of a model system for measuring flux of
intermediates through the mevalonic acid pathway in plants. Biochemical
Society Transactions 23:290S.
118. McConkey M.E.; Gershenzon J.; Croteau R.B. (2000) Developmental
regulation of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of
peppermint.Plant Physiol122:215–223
119. McGarvey D.J. and Croteau R. (1995). Terpenoid metabolism. The Plant Cell
7:1015-1026.
120. McGeady P. and R. Croteau (1995). Isolation and characterization of an
active-site peptide from a monoterpene cyclase labelled with a mechanism-
based inhibitor. Archives of Biochemistry and Biophysics 317:149-155.
121. Menghini L.; Leporini L.; Pintore G.; Chessa M.; Tirillini B. (2012). Essential
oil content and composition of three sagevarieties grown in Central Italy.
Journal of Medicinal Plants Research Vol. 7(9), pp. 480-489, 3 March,
2013 Available online at
http://www.academicjournals.org/JMPRDOI:10.5897/JMPR012.960ISSN
1996-0875 ©2013 Academic Journals.
122. Mitchell L.E.; Savage T.
J.; Katahira E. and Croteau R. (1998): Monoterpene synthases from Common
Sage (Salvia officinalis) The Journal of Biological Chemistry. Vol 273. No.
24; 14891 – 14899
BIBLIOGRAFIA
86
123. Moss L.; Rouseaa M.; Wesnes K.A. and Moss M. (2010) Differential effects
of the aromas of Salvia species on memory and mood. Hum Psychopharmacol
Clin Exp. 2010; 25: 388–396.
124. Nugent J.M. and Palmer J.D. (1991) RNA-mediated transfer of the gene cox
II from the mitochondrion to the nucleus during flowering plant evolution.
Cell 66: 473–481
125. Nuro A.;Shëngjergji D.; Dama A.; Napuçe A.; Borshi Xh.; Salihila J. (2016)
“Characterization Of Thymus Vulgaris Essential Oil Using Gc/Fid Technique.
Case Study: Populates From North Albania - Karakterizimi Kimik Me Gc/Fid
I Vajit Esencial Për Timus Vulgaris. Rast Studimi Popullata Nga Veriu I
Shqipërisë” Revistë shkencore e Albanian University. Nr 3 Fq 25-32 (2016)
ISSN 2220 – 461X
126. Nuro A.; Salihila J.; Marku E.; Shëngjergji D.; Napuçe A.; Dama A. (2015)
“Study by chromatographic techniques of essential Oil for Pinus Nigre
populations, Albania - Studimi me teknikën e kromatografisë të gaztë i vajit
esencial për popullatën e Pinus Nigre, Shqipëri” Nr 3 Fq 19-25 (2015) ISSN
2220 – 461X
127. Nuro A.; Salihila J.; Shëngjergji D.; Napuce A.; Dama A. (2015) “Chemical
analyze of Essential Oil of Helichrysum Italicum in North Albania - Analiza
kimike e vajit esencial për Helichrysum Italicum nga Veriu i Shqipërisë”
Revista “Optime” Reviste shkencore e Albanian University.Nr 3 Fq 25-32
(2015) ISSN 2220 – 461X
128. Nuro A.; Salihila J.; Marku E. (2015) “Analiza me GC/FID e
esencavetëdëllinjëstëkuqe (Juniperusoxycedrus L.) dhedëllinjëstë zezë
(Juniperuscommunis L.) ngadisa zona tëvendittonë” “Buletini i Shkencave te
Natyrës”, Nr 19 Fq 158-167 (2015) Tiranë. www.fshn.edu.al/buletini
129. Palmer J.D. (1987). Chloroplast DNA evolution and biosystematic uses of
chloroplast DNA variation. Am.Nat. 130:6-29.
130. Papadhopuli G. (1976) Bimët mjekësore dhe aromatike të Shqipërisë, Tiranë
1976, fq.340
131. Papageorgiou V.; Gardeli C.; Mallouchos A.; Papaioannou M. and Komaitis
M. (2008) Variation of the chemical profile and antioxidant behavior of
Rosmarinus officinalis L. and Salvia fruticosa Miller grown in Greece. J Agric
Food Chem. 2008; 56(16):7254-64.
132. Parani M.; Rajesh K.; Lakshmi M. (2001). Species identification in seven
small millet species using polymerase chain reaction restrition fragment length
polymorphism of trnS-psbC gene region. _/ Genome 44:495_/499.
133. Parducci L. and Szmidt A.E. (1999). PCR-RFLP analysis of cpDNA in the
genus Abies. _/ Theor. Appl. Genet. 98: 802_/808.
134. Paré P.W.; Tumlinson J.H. (1997) De Novo Biosynthesis of Volatiles lnduced
by lnsect Herbivory in Cotton Plants. Paré PW et al., Plant Physiol 1997, 114,
1161.
135. Peana A.; Satta M.; Moretti M.D. and Orecchioni M. (1994) A study
oncholeretic activity of Salvia. Planta Med. 1994; 60(5):478-9.
136. Pemberton E.; Turpin P.G. (2008) The Effect of Essential Oils on Work-
Related Stress in Intensive Care Unit Nurses. Holist Nurs Pract. 2008; 22(2):
97–102.
BIBLIOGRAFIA
87
137. Perry N.S.L.; Houghton P.J.; Jenner P.; Keith A. and Perry E.K. (2002) Salvia
lavandulaefolia essential oil inhibits cholinesterase in vivo. Phytomedicine.
2002; 9: 48–51.
138. Perry N.SL.; Houghton P.J.; Theobald A.; Jenner P. and Perry E.K. (2000)
Invitro inhibition of human erythrocyte acetylcholinesterase by salvia
lavandulaefolia essential oil and constituent terpenes. J Pharm Pharmacol.
2000; 52(7): 895-902.
139. Pichersky E.;. Raguso R.A.; Lewinsohn E. and Croteau R. (1994). Floral scent
production in Clarkia (Onagraceae) (I. localization and developmental
modulation of monoterpene emission and linalool synthase activity). Plant
Physiology 106:1533-1540.
140. Pitarevic I.; Kuftinec J.; Blazevic N.; Kustrak D. (1984) Seasonal variation of
essential oil yield and composition of Dalmatian sage, Salvia officinalis. J
Nat Prod 1984;47:409–12.
141. Pitarokili D.; Tzakou O.; Loukis A. and Harvala C. (2003) Volatile
metabolites from Salvia fruticosaas antifungal agents in soilborne pathogens. J
Agric Food Chem. 2003; 51(11):3294-301.
142. Porte A.; Godoy R.L.O.; Maia-Porte L.H. (2013). Chemical composition of
sage (Salvia officinalisL.) essential oil from the Rio de Janeiro State (Brazil).
Rev. Bras. Pl. Med., Campinas, v.15, n.3, p.438-441, 2013.
143. Putievsky E.; Ravid U.; Dudai N. (1986) The influence of season and harvest
frequency on essential oil and herbal yields from a pure clone of sage (Salvia
officinalis L.), grown under cultivation conditions. J Nat Prod 1986;49:326–9.
144. Pyun H.J.; Wagschal K.C.; Jung D.I.; Coates R.M. and Croteau R. (1994)
Arch. Biochem. Biophys. 308,488–496
145. Rademacher W. (2000). Growth retardants: Effects on gibberellin biosynthesis
and other metabolic pathways. Annu. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 51:510–
531.
146. Raguso R.A. and Pichersky E (1999). New perspectives in pollination biology:
Floral fragrances. A day in the life of a linalool molecule: Chemical
communication in a plant-pollinator system. Part 1: Linalool biosynthesis in
flowering plants. Plant Species Biology 14:95-120.
147. Ritland K. and Clegg M.T. (1987) Evolutionary analysis of plant DNA
sequences. Am Nat 130:$74-100
148. Rodriguez-Concepcion M.I.; Ahumada E.; Diez-Juez S.; Sauret-Gueto L.M.;
Lois F.; Gallego L.; Carretero-Paulet N.; Campos and Boronat A. (2001). 1-
deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase and plastid isoprenoid
biosynthesis during tomato fruit ripening. The Plant Journal: For Cell and
Molecular Biology 27:213-222.
149. Rodriguez-Concepcion, M.; Fores O.; Martinez-Garcia J.F.; Gonzalez V.;
Phillips M.A.; Ferrer A. and Boronat A. (2004). Distinct light-mediated
pathways regulate the biosynthesis and exchange of isoprenoid precursors
during Arabidopsis seedling development. Plant Cell 16:144-156.
150. Rohmer M.; Knani M.; Simonin P.; Sutter B. and Sahm H. (1993). Isoprenoid
biosynthesis in bacteria: A novel pathway for the early steps leading to
isopentenyl diphosphate. The Biochemical Journal 295:517-524.
151. Rota C.; Carraminand J.J.; Burillo J. and HERRERA A. (2004) In Vitro
Antimicrobial Activity of Essential Oils from Aromatic Plants against Selected
Foodborne Pathogens. J Food Prot. 2004; 67:1252–1256.
BIBLIOGRAFIA
88
152. Saeidnia S.;Gohari A.R.;Haddadi A.;Amin G.;Nikan M.;Hadjiakhoondi A.
(2014): Presence of monoterpene synthase in four Labiatae species and Solid-
Phase Microextraction- Gas chromatography-Mass Spectroscopy analysis of
their aroma profiles. Pharmacognosy Res; 138–142. doi: 10.4103/0974-
8490.129033
153. Said-Al Ahl H.; Hussein M.S.; Gendy A. S.H.; Tkachenko K.G. (2015).
Quality of Sage (Salvia officinalis L.) Essential Oil Grown in Egypt .
International Journal of Plant Science and Ecology Vol. 1, No. 4, 2015, pp.
119-123 http://www.aiscience.org/journal/ ijpse
154. Sambrook J.; Fritsch E.F.;& Maniatis,T. (1989). Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6.
155. Saoealuck B.; Paisooksantivatana Y.; Eeimer B.C.; Choepongpang S. (2014):
Molecular Cloning and expression levels of the monoterpene synthase gene
(ZMM1) in cassumunar ginger (Zingiber Montanum (Koenig) Link Ex Dietr.).
Arch. Biol. Sci., Belgrade, 66(4). 1321 – 1331.
156. Sarac N. and Ugur A.(2008) The in vitro antimicrobial activities of the
essential oils of some Lamiaceae species from Turkey. J Med Food. 2008;
12(4): 902–907.
157. Savage T. J.; Hatch M.W.; and Croteau R. (1994) J. Biol. Chem. 269,4012–
4020.
158. Savage T.J.; Hume H.I.; Little S.D.; D.B.; and Croteau R. (1995) Arch.
Biochem. Biophys. 320,257–265
159. Savage T.J.; Hatch M.E. and Croteau R. (1994): Monoterpene Synthases of
Pinus contorta and Related Conifers. The Journal of Biological Chemistry.
Vol. 269. No. 6; 4012 – 4020
160. Schmiderer C.; Grausgruber-Gröger S.; Grassi P.; Steinborn R.; Novak J.
(2010) Influence of gibberellin and daminozide on the expression of terpene
synthases in common sage (Salvia officinalis). J Plant Physiol 2010;167:779–
86.
161. Schuhr C.A.; Radykewicz T.; Sagner S.; Latzel C.; Zenk M.H.; Arigoni D.;
Bacher A.; Rohdich F. and Eisenreich W. (2003). Quantitative assessment of
crosstalk between the two isoprenoid biosynthesis pathways in plants by NMR
spectroscopy. Phytochemistry Reviews 2:3-16.
162. Schwab W.; Fuchs C.; Huang F.C. (2013). Transformation of terpenes into
fine chemicals.
163. Senol F.S.; Orhan I.E.; Erdem S.A.; Kartal M.; Sener B.; Kan Y.; Celep F.;
Kahraman A. and Dogan M. (2011) Evaluation of Cholinesterase Inhibitory
and Antioxidant Activities of Wild and Cultivated Samples of Sage (Salvia
fruticosa) by Activity- Guided Fractionation. J Med Food. 2011; 14(11):1476-
83.
164. Shelton D.A.; Zabaras D.; Chohan S.; Eyllie S.G.; Baverstock P.R.; Leach
D.N. & Henry R.J. (2004): Isolation and partial characterization of a putative
monoterpene synthase from Melaleuca alternifolia. Plant Physiology and
Biochemistry. Vol. 42. No. 11; 875-882.
165. Shimada T.; Endo T.; Fujii H.; Hara M. and Omura M. (2005): Isolation and
characterization of (E)-beta-ocimene and 1,8 cineole synthases in Citrus
unshiu Marc. Plant Science. 168, 987-995
BIBLIOGRAFIA
89
166. Sonbol A.; Babakhani B. and Mehrabian A.R.(2006) Antimicrobial Activity of
Six Constituents of Essential Oil from Salvia. Z. Naturforsch. 2006; 61 c:
160–164.
167. Stagos D.; Portesis N.; Spanou C.; Mossialos D.; Aligiannis N.; Chaita E.;
Panagoulis C.; Reri E.; Skaltsounis L.; Tsatsakis A.M. and Kouretas D. (2012)
Correlation of total polyphenolic content with antioxidant and antibacterial
activity of 24 extracts from Greek domestic Lamiaceae species. Food Chem
Toxicol. 2012; 50(11):4115-24
168. Staudt M. and Seufert G. (1995). Light-dependent emission of monoterpenes
by holm oak (Quercus ilex L.). Naturwissenschaften 82:89-92.
169. Steele C.L.; Lewinsohn E.and Croteau R. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S. A. 92, 4164–4168
170. Steinborn M.B.; Langner R. (2012) Arousal modulates temporal preparation
under increased time uncertainty: evidence from higher-order sequential foto-
reperiod effects. Acta Psychol (Amst) 139: 65–76, 2012.
171. Stesevic D.; Ristic M.; Nikolic V.; Nedovic M.; Cakovic D.; Satovic Z.
(2014). Chemotype Diversity of Indigenous Dalmatian Sage (Salvia officinalis
L.) Populations in Montenegro. Chemistry and Biodiversity Journal. Volume
11, Issue 1 January 2014 Pages 101–114. DOI: 10.1002/cbdv.201300233
172. Taberlet P.; Gielly L.; Pautou G. (1991). Universal primers for amplification
of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Mol. Biol. 17: 1105–
1109.
173. Tenore G.C.; Ciampaglia R.; Arnold N.A.; Piozzi F.; Napolitano F.; Rigano D.
and Senatore F. (2011) Antimicrobial and antioxidant properties of the
essential oil of Salvia lanigera from Cyprus. Food Chem Toxicol. 2011;
49(1):238-43.
174. Terra D.L.; Lonzarich V.; Asquini E.; Navarini L.; Graziosi G.;Liverani
F.S.;Pallavicini A. (2013): Functional characterization of three Coffea arabica
L. monoterpene synthases: Insights into the enzymatic machinery of coffee
aroma. Phytochemistry. Vol. 89; 6 – 14
175. Tildesley N.T.J.; Kennedy D.O.; Perry E.K.; Ballard C.G.; Wesnes K.A. and
Scholeya A.B.(2005) Positive modulation of mood and cognitive performance
following administration of acute doses of Salvia lavandulaefolia essential oil
to healthy young volunteers. Physiol Behav. 2005; 83:699–709
176. Topcu G.; Turkmen Z.; Schilling J.K.; Kingston D.G.I.; Pezzuto J.M.&
Ulubelen A. (2008) Cytotoxic Activity of Some Anatolian Salvia. Extracts and
Isolated Abietane Diterpenoids, Pharmaceutical Biology, 46:3, 180-184, DOI:
10.1080/13880200701735411
177. Trapp S.C. and Croteau R.B. (2001). Genomic organization of plant terpene
synthases and molecular evolutionary implications. Genetics 158:811-832.
178. Tsumura Y.; Kawahara T.; Wickneswari R. (1996). Molecular phylogeny of
Dipterocarpaceae in south-east Asia using RFLP of PCR-amplified chloroplast
genes. _/ Theor. Appl. Genet. 93: 22_/29.
179. TurnerG.W. and Croteau R. (2004). Organization of monoterpene biosynthesis
in Mentha. Immunocytochemical localizations of geranyl diphosphate
synthase, limonene-6-hydroxylase, isopiperitenol dehydrogenase, and
pulegone reductase. Plant Physiology 136:4215-4227.
180. Turner G.W.; Gershenzon J. and Croteau R.B. (2000a). Development of
peltate glandular trichomes of peppermint. Plant Physiology 124:665-680.
BIBLIOGRAFIA
90
181. Velickovic D.T.; Randjelovic N.V.; Ristic M.S.; Velickovic A.S.; Smelcerovic
A.A. (2003). Chemical constituents and antimicrobial activity of the ethanol
extracts obtained from the flower, leaf and stem of Salvia officinalis L., J.
Serb. Chem. Soc. 68:17-24.
182. Velikova V.; Loreto F.; Tsonev T.; Brilli F. and Edreva A. (2006). Isoprene
prevents the negative consequences of high temperature stress in Platanus
orientalis leaves. Functional Plant Biology 33:1-10.
183. Vicario F.; Vendramin G.; Rossi P. (1995). Allozyme, chloroplast DNA and
RAPD markers for determining genetic relationships between Abies alba and
the relic population of Abies nebrodensis. Theor. Appl. Genet. 90:1012–1018.
184. Vukovic´-Gacˇic´ B.; Nikcˇevic´ S.; Beric´-Bjedov T.; Knezˇevic ´-Vukcˇevic´
J. and Simic´ D. (2006). Antimutagenic effect of essential oil of sage (Salvia
officinalis L.) and its monoterpenes against UV-induced mutations in
Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Food Chem. Toxicol. 2006;
44: 1730–1738.
185. Wagschal K.C.; Pyun H.J.; Coates R.M. and Croteau R. (1994) Arch.
Biochem. Biophys. 308,477–487
186. Wagschal K.; Savage T.J. and Croteau, R. (1991) Tetrahedron 47, 5933–5944
187. Walker J.B.; Sytsma K.J.; Treutlein J.; Winks M. (2004)Salvia(Lamiaceae) is
not monophyletic: Implications for the sys-tematic, radiations and ecological
specializations of Salvia and tribe Mentheae. Am J Bot. 91(7):1115–1125
188. Wang G. Z.; Matsuoka Y. and Tsunewaki K. (2000). Evolutionary features of
chondriome divergence inTriticum(wheat) and Aegilops shown by RFLP
analysis of mitochondrial DNAs. Theor. Appl. Genet. 100:221–231.
189. Whittington D.A.; Wise M.L.; Urbansky M.; Coates R.M.; Croteau R.B. and
Christianson D.W. (2002). Bornyl diphosphate synthase: Structure and
strategy for carbocation manipulation by a terpenoid cyclase. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America 99:15375-
15380.
190. Wichtl M.; Brinckmann J.A.; Lindenmaier M.P. (2004) trans. Herbal Drugs
and Phytopharmaceuticals. 3rd ed. Stuttgart: Medpharm GmbH Scientific
Publishers; 2004.
191. Wise M.L.and Croteau R. (1998) in Comprehensive Natural Products
Chemistry: Isoprenoids (Cane, D. E., ed) Vol. 2, Elsevier Science, Oxford,UK,
in press
192. Wise M.L. and Croteau R. (1998) in Comprehensive Natural Products
Chemistry: Isoprenoids (Cane, D. E., ed) Vol. 2, Elsevier Science, Oxford,UK,
in press
193. Wise M.L.; Savage T.J.; Katahira E. and Croteau R. (1998). Monoterpene
synthases from common sage (Salvia officinalis). cDNA isolation,
characterization, and functional expression of (+)-sabinene synthase, 1,8-
cineole synthase, and (+)-bornyl diphosphate synthase. Journal of Biological
Chemistry 273:14891-14899.
194. Xie Z.; Kapteyn J.; Gang D.R. (2008) A systems biology investigation of the
MEP/terpenoid and shikimate/phenylpropanoid pathways points to multiple
levels of metabolic control in sweet basil glandular trichomes. Plant J 2008;54:
349–61
BIBLIOGRAFIA
91
195. Xu D.H.; Abe A.; Kanazawa A. (2001). Identification of sequence variations
by PCR-RFLP and its application to the evaluation of cpDNA diversity in wild
and cultivated soybeans. Theor. Appl. Genet. 102:683–688.
196. Yousefzadi M.; Sonboli A.; Ebrahimi S.N. and Hashemi S.H. (2007)
Antimicrobial Activity of Essential Oil and Major Constituents of Salvia
chloroleuca. Z. Naturforsch. 2007; 63c:337–340.
197. Yumrutas O.; Sokmen A.; Akpulat H.A.; Ozturk N.; Daferera D.; Sokmen M.
and Tepe B. (2012) Phenolic acid contents, essential oil compositions and
antioxidant activities of two varieties of Salvia euphratica from Turkey. Nat
Prod Res. 2012; 26 (19):1848-51.
198. Zapata F.;Fine P.V.A. (2013): Diversification of the monoterpene synthase
gene family (TPSb) in Protium, a highly diverse genus of tropical
trees.Molecular Phylogenetics and Evolution. Vol. 68, Issue 3; 432 – 442
199. Zhang M.; Liu J.; Li K.; Yu D. (2013). Identification and Characterization of a
Novel Monoterpene Synthase from Soybean Restricted to Neryl Diphosphate
Precursor. PLoS ONE 8(10): e75972. doi:10.1371/journal.pone.0075972
200. ZURAWSKI G.and CLEGG M.T. (1987) Evolution of higher-plant
chloroplast DNA-en- coded genes: implications for structure-function and
phylogenetic studies. Annu. Rev. Plant Physiol. 38:39 l-4 18
ANEKSE
92
ANEKS I
Përbërja e buferit të ekstraktimit të ADN-së sipas Doyle&Doyle 1987
50 mM Tris pH 8.0
50 Mm EDTA pH 8.0
0,4 M LiCl.
CTAB 1%
PVP 2%
TWEEN 20 2%
NaCl 1,1M
Përbërja e buferit të ekstraktimit CTAB.
20 mM EDTA
0,1 M Tris-HCl pH 8.0
14M NaCl
CTAB 2 % dhe β-merkapto etanol 0,4 %, i cili shtohet menjëherë para
përdorimit.
ANEKSE
93
ANEKS II
Përbërja e buferit të ekstraktimit (100 ml) të ARN-së:
10 ml buffer glicinë 10 X
20 ml 10% SDS (sodium dodecyl sulphate)
10 ml 10% NLS (N-lauryl sarcosine)
+60 ML H2O
ANEKSE
94
ANEKS III
Rezultatet e pike-ve bazuar në kromatogramat e analizuara me GC-FID të
sherbelës për çdo popullatë të marrë në studim:
Peak results : Kruja
System : SystemLAO
Method : alkolet 2
User : lao
Index Name
Time
[Min]
Quantity [%
Area]
Area
[%]
1 UNKNOWN 3.06 0.01 0.008
2 UNKNOWN 3.14 0.01 0.013
3 UNKNOWN 3.29 0.01 0.008
4 UNKNOWN 3.4 0.03 0.027
5 UNKNOWN 3.51 0.01 0.006
6 UNKNOWN 3.57 0 0.001
7 UNKNOWN 3.64 0.58 0.584
8 UNKNOWN 3.69 0.23 0.229
9 UNKNOWN 3.78 0.13 0.133
10 UNKNOWN 4.2 0.01 0.007
11 UNKNOWN 4.62 0.01 0.007
12 UNKNOWN 4.88 0.05 0.046
13 UNKNOWN 4.99 0.33 0.328
14 UNKNOWN 5.3 9.42 9.416
15 UNKNOWN 5.61 7.93 7.927
16 UNKNOWN 6.13 0.08 0.078
17 UNKNOWN 6.25 1.34 1.336
18 UNKNOWN 6.59 0.86 0.855
19 UNKNOWN 6.97 0.02 0.015
20 UNKNOWN 7.49 1.39 1.389
21 UNKNOWN 7.87 13.92 13.916
22 UNKNOWN 7.99 0.25 0.251
23 UNKNOWN 8.11 0.01 0.014
24 UNKNOWN 8.34 0.02 0.021
25 UNKNOWN 8.71 0.12 0.125
26 UNKNOWN 9.04 0.03 0.026
27 UNKNOWN 9.62 0.07 0.072
28 UNKNOWN 10.37 26.32 26.315
29 UNKNOWN 10.67 5.86 5.861
30 UNKNOWN 10.72 0.02 0.02
31 UNKNOWN 10.81 0.05 0.048
32 UNKNOWN 11.64 16.94 16.936
33 UNKNOWN 11.88 0.06 0.065
34 UNKNOWN 12.05 0.08 0.081
35 UNKNOWN 12.24 0.02 0.024
36 UNKNOWN 12.65 1.56 1.561
ANEKSE
95
37 UNKNOWN 13.07 0.45 0.45
38 UNKNOWN 13.55 0.19 0.186
39 UNKNOWN 13.85 0.04 0.036
40 UNKNOWN 14.67 0.03 0.026
41 UNKNOWN 15.19 0.12 0.123
42 UNKNOWN 17.58 0.26 0.26
43 UNKNOWN 17.79 0.11 0.108
44 UNKNOWN 17.97 0.02 0.02
45 UNKNOWN 18.05 0.04 0.044
46 UNKNOWN 18.36 0.15 0.147
47 UNKNOWN 23.68 1.67 1.672
48 UNKNOWN 23.98 0.07 0.072
49 UNKNOWN 25.11 3.6 3.599
50 UNKNOWN 25.32 0.03 0.031
51 UNKNOWN 29.82 0.09 0.088
52 UNKNOWN 29.94 0.01 0.01
53 UNKNOWN 30.47 3.63 3.635
54 UNKNOWN 30.64 0.01 0.015
55 UNKNOWN 30.86 0.52 0.518
56 UNKNOWN 31.66 0.06 0.057
57 UNKNOWN 31.82 0.77 0.771
58 UNKNOWN 31.93 0.06 0.059
59 UNKNOWN 32.75 0.17 0.165
60 UNKNOWN 33.24 0.1 0.1
61 UNKNOWN 33.55 0.04 0.038
62 UNKNOWN 34.34 0.02 0.022
Total 100 100
Peak results: Torovica
System : SystemLAO
Method : alkolet 2
User : lao
Index Name
Time
[Min]
Quantity [%
Area] Area [%]
1 UNKNOWN 3.18 0 0.002
2 UNKNOWN 3.22 0 0.002
3 UNKNOWN 3.3 0.02 0.018
4 UNKNOWN 3.41 0.01 0.006
5 UNKNOWN 3.55 0.43 0.431
6 UNKNOWN 3.6 0.07 0.071
7 UNKNOWN 3.7 0.09 0.09
8 UNKNOWN 4.81 0.07 0.072
9 UNKNOWN 4.93 0.18 0.18
10 UNKNOWN 5 0.02 0.021
ANEKSE
96
11 UNKNOWN 5.2 3.72 3.724
12 UNKNOWN 5.54 6.21 6.206
13 UNKNOWN 5.7 0.01 0.006
14 UNKNOWN 6.09 0.15 0.152
15 UNKNOWN 6.2 0.88 0.877
16 UNKNOWN 6.54 0.99 0.99
17 UNKNOWN 6.94 0.02 0.022
18 UNKNOWN 7.19 0 0.005
19 UNKNOWN 7.27 0 0.003
20 UNKNOWN 7.32 0 0.004
21 UNKNOWN 7.47 1.28 1.277
22 UNKNOWN 7.81 13.86 13.86
23 UNKNOWN 7.96 0.03 0.029
24 UNKNOWN 8.07 0.05 0.048
25 UNKNOWN 8.69 0.13 0.131
26 UNKNOWN 9.03 0.03 0.028
27 UNKNOWN 9.37 0.01 0.01
28 UNKNOWN 9.61 0.08 0.079
29 UNKNOWN 9.76 0.04 0.037
30 UNKNOWN 10.36 31.16 31.163
31 UNKNOWN 10.64 5.73 5.732
32 UNKNOWN 10.7 0.04 0.037
33 UNKNOWN 10.79 0.05 0.051
34 UNKNOWN 10.94 0.01 0.008
35 UNKNOWN 11.64 21.55 21.548
36 UNKNOWN 11.79 0.02 0.025
37 UNKNOWN 11.87 0.07 0.073
38 UNKNOWN 12.04 0.08 0.085
39 UNKNOWN 12.23 0.04 0.038
40 UNKNOWN 12.39 0.01 0.006
41 UNKNOWN 12.66 2.44 2.444
42 UNKNOWN 13.07 0.56 0.556
43 UNKNOWN 13.34 0.02 0.017
44 UNKNOWN 13.53 0.21 0.215
45 UNKNOWN 13.6 0.16 0.159
46 UNKNOWN 13.84 0.1 0.098
47 UNKNOWN 14.16 0.01 0.008
48 UNKNOWN 14.52 0.01 0.009
49 UNKNOWN 14.66 0.04 0.042
50 UNKNOWN 15.05 0.01 0.009
51 UNKNOWN 15.18 0.08 0.083
52 UNKNOWN 15.51 0.01 0.013
53 UNKNOWN 15.87 0.02 0.019
ANEKSE
97
54 UNKNOWN 16.35 0.01 0.007
55 UNKNOWN 16.82 0.02 0.023
56 UNKNOWN 17.06 0.02 0.018
57 UNKNOWN 17.6 1.02 1.02
58 UNKNOWN 17.79 0.2 0.195
59 UNKNOWN 17.96 0.05 0.049
60 UNKNOWN 18.05 0.03 0.035
61 UNKNOWN 18.35 0.13 0.129
62 UNKNOWN 18.87 0.03 0.034
63 UNKNOWN 19.19 0.01 0.01
64 UNKNOWN 19.36 0.01 0.014
65 UNKNOWN 19.69 0.02 0.024
66 UNKNOWN 19.85 0.01 0.013
67 UNKNOWN 20.47 0.01 0.008
68 UNKNOWN 21.93 0.02 0.021
69 UNKNOWN 23.17 0.17 0.169
70 UNKNOWN 23.63 0.51 0.51
71 UNKNOWN 24 0.27 0.271
72 UNKNOWN 24.46 0.05 0.048
73 UNKNOWN 24.56 0 0.003
74 UNKNOWN 25.04 1.44 1.44
75 UNKNOWN 25.3 0.03 0.028
76 UNKNOWN 25.94 0.02 0.023
77 UNKNOWN 27.38 0.02 0.015
78 UNKNOWN 27.57 0.01 0.012
79 UNKNOWN 27.8 0.01 0.014
80 UNKNOWN 28.57 0.01 0.013
81 UNKNOWN 29.42 0.01 0.009
82 UNKNOWN 29.65 0.02 0.015
83 UNKNOWN 29.82 0.09 0.094
84 UNKNOWN 29.93 0.02 0.017
85 UNKNOWN 30.06 0.03 0.028
86 UNKNOWN 30.43 3.1 3.095
87 UNKNOWN 30.63 0.01 0.008
88 UNKNOWN 30.85 0.63 0.628
89 UNKNOWN 31.65 0.07 0.071
90 UNKNOWN 31.8 0.72 0.716
91 UNKNOWN 31.92 0.06 0.063
92 UNKNOWN 32.75 0.15 0.149
93 UNKNOWN 32.95 0.02 0.016
94 UNKNOWN 33.24 0.09 0.087
95 UNKNOWN 33.55 0.04 0.038
Total 100 100
ANEKSE
98
Peak results: Rubik
System : SystemLAO
Method : alkolet 2
User : lao
Index Name Time [Min]
Quantity [%
Area] Area [%]
1 UNKNOWN 3.02 0 0.002
2 UNKNOWN 3.1 0.01 0.007
3 UNKNOWN 3.17 0 0.002
4 UNKNOWN 3.24 0.01 0.008
5 UNKNOWN 3.34 0.05 0.053
6 UNKNOWN 3.42 0.01 0.009
7 UNKNOWN 3.46 0.01 0.009
8 UNKNOWN 3.51 0 0.005
9 UNKNOWN 3.61 1.21 1.21
10 UNKNOWN 3.74 0.21 0.212
11 UNKNOWN 4.06 0.01 0.005
12 UNKNOWN 4.14 0 0.004
13 UNKNOWN 4.56 0 0.004
14 UNKNOWN 4.82 0.15 0.151
15 UNKNOWN 4.94 0.42 0.419
16 UNKNOWN 5.27 5.86 5.857
17 UNKNOWN 5.66 11.43 11.432
18 UNKNOWN 5.74 0.01 0.008
19 UNKNOWN 5.86 0.01 0.008
20 UNKNOWN 6.13 0.15 0.153
21 UNKNOWN 6.23 1.05 1.049
22 UNKNOWN 6.58 1.21 1.209
23 UNKNOWN 6.94 0.03 0.027
24 UNKNOWN 7.19 0.02 0.019
25 UNKNOWN 7.55 1.36 1.358
26 UNKNOWN 7.92 12.46 12.46
27 UNKNOWN 8.11 0.07 0.069
28 UNKNOWN 8.69 0.09 0.086
29 UNKNOWN 9.02 0.01 0.006
30 UNKNOWN 9.37 0.02 0.018
31 UNKNOWN 9.59 0.07 0.075
32 UNKNOWN 9.75 0.05 0.046
33 UNKNOWN 10.61 27.52 27.519
34 UNKNOWN 10.83 3.42 3.422
35 UNKNOWN 10.92 0.03 0.029
36 UNKNOWN 11.04 0.03 0.03
ANEKSE
99
37 UNKNOWN 11.29 0.03 0.026
38 UNKNOWN 11.98 22.93 22.925
39 UNKNOWN 12.09 0.07 0.07
40 UNKNOWN 12.22 0.13 0.128
41 UNKNOWN 12.36 0.02 0.025
42 UNKNOWN 12.43 0.02 0.017
43 UNKNOWN 12.81 1.85 1.847
44 UNKNOWN 12.92 0.01 0.009
45 UNKNOWN 13.19 0.49 0.493
46 UNKNOWN 13.42 0.02 0.022
47 UNKNOWN 13.61 0.19 0.193
48 UNKNOWN 13.72 0.09 0.086
49 UNKNOWN 13.93 0.2 0.198
50 UNKNOWN 14.2 0.01 0.006
51 UNKNOWN 14.54 0.01 0.011
52 UNKNOWN 14.7 0.04 0.041
53 UNKNOWN 14.81 0 0.002
54 UNKNOWN 15.07 0.01 0.007
55 UNKNOWN 15.22 0.08 0.076
56 UNKNOWN 15.34 0.01 0.006
57 UNKNOWN 15.53 0.02 0.017
58 UNKNOWN 15.88 0.02 0.019
59 UNKNOWN 16.36 0.01 0.011
60 UNKNOWN 16.83 0.01 0.015
61 UNKNOWN 17.07 0.01 0.006
62 UNKNOWN 17.67 0.95 0.949
63 UNKNOWN 17.82 0.17 0.169
64 UNKNOWN 17.98 0.04 0.039
65 UNKNOWN 18.07 0.03 0.026
66 UNKNOWN 18.38 0.12 0.123
67 UNKNOWN 18.9 0.05 0.051
68 UNKNOWN 19.2 0.04 0.04
69 UNKNOWN 19.36 0.01 0.014
70 UNKNOWN 19.69 0.02 0.019
71 UNKNOWN 21.94 0.01 0.01
72 UNKNOWN 23.2 0.14 0.14
73 UNKNOWN 23.34 0 0.003
74 UNKNOWN 23.63 0.15 0.154
75 UNKNOWN 24.04 0.2 0.197
76 UNKNOWN 24.29 0.01 0.009
77 UNKNOWN 24.47 0.09 0.092
78 UNKNOWN 25.08 0.94 0.938
79 UNKNOWN 25.31 0.03 0.027
ANEKSE
100
80 UNKNOWN 26.47 0.01 0.008
81 UNKNOWN 27.56 0.01 0.007
82 UNKNOWN 29.68 0.02 0.017
83 UNKNOWN 29.82 0.04 0.042
84 UNKNOWN 30.11 0.04 0.035
85 UNKNOWN 30.55 2.3 2.296
86 UNKNOWN 30.69 0 0.004
87 UNKNOWN 30.93 0.56 0.564
88 UNKNOWN 31.66 0.06 0.059
89 UNKNOWN 31.87 0.55 0.551
90 UNKNOWN 31.96 0.03 0.027
91 UNKNOWN 32.76 0.06 0.057
92 UNKNOWN 32.95 0.01 0.013
93 UNKNOWN 33.25 0.04 0.038
94 UNKNOWN 33.56 0.03 0.032
95 UNKNOWN 34.75 0.01 0.008
Total 100 100
Peak results: Malësi e Madhe (Grishaj)
System : SystemLAO
Method : alkolet 2
User : lao
Index Name Time [Min]
Quantity [%
Area]
Area
[%]
1 UNKNOWN 3.09 0 0.001
2 UNKNOWN 3.17 0.01 0.007
3 UNKNOWN 3.25 0 0.005
4 UNKNOWN 3.31 0.01 0.006
5 UNKNOWN 3.41 0.03 0.027
6 UNKNOWN 3.53 0.01 0.007
7 UNKNOWN 3.58 0 0.005
8 UNKNOWN 3.67 0.47 0.467
9 UNKNOWN 3.71 0.09 0.089
10 UNKNOWN 3.81 0.1 0.096
11 UNKNOWN 4.21 0 0.002
12 UNKNOWN 4.63 0 0.002
13 UNKNOWN 4.9 0.02 0.024
14 UNKNOWN 5.01 0.25 0.25
15 UNKNOWN 5.34 4.01 4.008
16 UNKNOWN 5.72 7.31 7.31
ANEKSE
101
17 UNKNOWN 5.92 0 0.003
18 UNKNOWN 6.04 0 0.003
19 UNKNOWN 6.15 0.04 0.036
20 UNKNOWN 6.3 0.94 0.935
21 UNKNOWN 6.67 1.41 1.405
22 UNKNOWN 7.01 0.08 0.077
23 UNKNOWN 7.25 0 0.004
24 UNKNOWN 7.38 0.05 0.046
25 UNKNOWN 7.48 0.11 0.105
26 UNKNOWN 8.05 10.47 10.472
27 UNKNOWN 8.2 0.02 0.021
28 UNKNOWN 8.39 0.01 0.006
29 UNKNOWN 8.77 0.23 0.23
30 UNKNOWN 9.08 0.01 0.007
31 UNKNOWN 9.86 0.24 0.235
32 UNKNOWN 10.62 16.83 16.83
33 UNKNOWN 10.91 15.7 15.697
34 UNKNOWN 11.16 6.66 6.661
35 UNKNOWN 12.22 22.89 22.886
36 UNKNOWN 12.3 0.11 0.113
37 UNKNOWN 12.39 0.02 0.015
38 UNKNOWN 12.51 0.02 0.023
39 UNKNOWN 12.59 0.01 0.012
40 UNKNOWN 13.03 2.68 2.677
41 UNKNOWN 13.34 0.54 0.54
42 UNKNOWN 13.74 0.2 0.199
43 UNKNOWN 13.87 0.16 0.164
44 UNKNOWN 14.03 0.03 0.029
45 UNKNOWN 14.09 0.02 0.024
46 UNKNOWN 14.29 0.02 0.016
47 UNKNOWN 14.43 0.01 0.01
48 UNKNOWN 14.62 0.01 0.015
49 UNKNOWN 14.78 0.03 0.033
50 UNKNOWN 14.88 0 0.004
51 UNKNOWN 15.15 0.02 0.022
52 UNKNOWN 15.29 0.05 0.051
53 UNKNOWN 15.41 0 0.005
54 UNKNOWN 15.6 0.02 0.021
55 UNKNOWN 15.92 0.03 0.025
56 UNKNOWN 16.16 0.01 0.012
57 UNKNOWN 16.45 0.02 0.02
58 UNKNOWN 16.55 0.01 0.013
59 UNKNOWN 16.76 0.01 0.007
60 UNKNOWN 16.91 0.04 0.038
61 UNKNOWN 17.14 0.01 0.009
62 UNKNOWN 17.79 1.64 1.636
63 UNKNOWN 17.89 0.13 0.128
ANEKSE
102
64 UNKNOWN 18.05 0.07 0.07
65 UNKNOWN 18.13 0.03 0.03
66 UNKNOWN 18.44 0.08 0.084
67 UNKNOWN 18.95 0.02 0.023
68 UNKNOWN 19.24 0.01 0.006
69 UNKNOWN 19.39 0.02 0.017
70 UNKNOWN 19.71 0.02 0.021
71 UNKNOWN 19.9 0.01 0.011
72 UNKNOWN 20.16 0.01 0.012
73 UNKNOWN 20.33 0.01 0.014
74 UNKNOWN 20.51 0.01 0.009
75 UNKNOWN 21.73 0.02 0.016
76 UNKNOWN 21.96 0.02 0.019
77 UNKNOWN 23.13 0.03 0.03
78 UNKNOWN 23.33 0.27 0.275
79 UNKNOWN 23.77 0.98 0.983
80 UNKNOWN 24.2 0.56 0.561
81 UNKNOWN 24.5 0.01 0.013
82 UNKNOWN 25.17 1.23 1.232
83 UNKNOWN 25.36 0.03 0.025
84 UNKNOWN 25.96 0.02 0.015
85 UNKNOWN 26.77 0.02 0.023
86 UNKNOWN 27.4 0.01 0.01
87 UNKNOWN 27.82 0.02 0.015
88 UNKNOWN 27.91 0.01 0.012
89 UNKNOWN 28.58 0.01 0.008
90 UNKNOWN 29.44 0.01 0.009
91 UNKNOWN 29.69 0.01 0.005
92 UNKNOWN 29.85 0.09 0.092
93 UNKNOWN 29.97 0.01 0.011
94 UNKNOWN 30.58 1.86 1.862
95 UNKNOWN 30.93 0.24 0.244
96 UNKNOWN 31.69 0.03 0.035
97 UNKNOWN 31.84 0.2 0.201
98 UNKNOWN 31.95 0.03 0.031
99 UNKNOWN 32.79 0.08 0.081
100 UNKNOWN 33.26 0.05 0.046
101 UNKNOWN 33.57 0.01 0.011
102 UNKNOWN 33.88 0.01 0.011
Total 100 100
ANEKSE
103
Peak results: Balldren
System : SystemLAO
Method : alkolet 2
User : lao
Index Name
Time
[Min]
Quantity [%
Area]
Area
[%]
1 UNKNOWN 3.24 0 0.005
2 UNKNOWN 3.29 0 0.002
3 UNKNOWN 3.35 0.02 0.018
4 UNKNOWN 3.47 0.01 0.006
5 UNKNOWN 3.53 0 0.002
6 UNKNOWN 3.6 0.97 0.973
7 UNKNOWN 3.65 0.2 0.197
8 UNKNOWN 3.75 0.19 0.19
9 UNKNOWN 4.24 0.05 0.051
10 UNKNOWN 4.84 0.04 0.036
11 UNKNOWN 4.96 0.05 0.051
12 UNKNOWN 5.03 0.05 0.053
13 UNKNOWN 5.24 4.46 4.457
14 UNKNOWN 5.54 2.21 2.214
15 UNKNOWN 5.65 0.01 0.01
16 UNKNOWN 5.88 0.02 0.019
17 UNKNOWN 6.13 0.16 0.157
18 UNKNOWN 6.25 2.38 2.376
19 UNKNOWN 6.57 0.97 0.97
20 UNKNOWN 6.97 0.06 0.06
21 UNKNOWN 7.35 0.11 0.109
22 UNKNOWN 7.5 0.95 0.947
23 UNKNOWN 7.85 12.99 12.986
24 UNKNOWN 7.98 0.27 0.271
25 UNKNOWN 8.1 0.01 0.008
26 UNKNOWN 8.34 0.04 0.038
27 UNKNOWN 8.71 0.4 0.4
28 UNKNOWN 9.03 0.02 0.019
29 UNKNOWN 9.62 0.04 0.038
30 UNKNOWN 9.78 0.09 0.09
31 UNKNOWN 10.43 32.91 32.909
32 UNKNOWN 10.74 8.45 8.45
33 UNKNOWN 10.85 0.01 0.013
34 UNKNOWN 11.61 10.98 10.977
35 UNKNOWN 11.8 0.02 0.024
36 UNKNOWN 11.88 0.04 0.039
37 UNKNOWN 12.05 0.08 0.083
38 UNKNOWN 12.25 0.02 0.02
39 UNKNOWN 12.64 1.21 1.212
ANEKSE
104
40 UNKNOWN 13.08 0.45 0.451
41 UNKNOWN 13.54 0.2 0.198
42 UNKNOWN 13.62 0.11 0.11
43 UNKNOWN 13.85 0.02 0.024
44 UNKNOWN 14.53 0.01 0.01
45 UNKNOWN 14.67 0.02 0.016
46 UNKNOWN 15.06 0.01 0.013
47 UNKNOWN 15.19 0.14 0.144
48 UNKNOWN 16.83 0.01 0.011
49 UNKNOWN 17.58 0.09 0.09
50 UNKNOWN 17.79 0.08 0.076
51 UNKNOWN 18.05 0.05 0.051
52 UNKNOWN 18.36 0.17 0.172
53 UNKNOWN 20.29 0.02 0.02
54 UNKNOWN 21.93 0.04 0.038
55 UNKNOWN 23.1 0.02 0.019
56 UNKNOWN 23.69 2.07 2.074
57 UNKNOWN 23.98 0.02 0.023
58 UNKNOWN 24.47 0.03 0.03
59 UNKNOWN 25.19 7.62 7.616
60 UNKNOWN 25.35 0.07 0.075
61 UNKNOWN 25.95 0.03 0.033
62 UNKNOWN 26.29 0.01 0.015
63 UNKNOWN 26.75 0.04 0.038
64 UNKNOWN 27.39 0.02 0.02
65 UNKNOWN 27.81 0.04 0.041
66 UNKNOWN 29.82 0.07 0.067
67 UNKNOWN 30.54 6.04 6.043
68 UNKNOWN 30.67 0.02 0.019
69 UNKNOWN 30.9 0.84 0.839
70 UNKNOWN 31.15 0.02 0.019
71 UNKNOWN 31.66 0.07 0.069
72 UNKNOWN 31.82 0.79 0.787
73 UNKNOWN 31.93 0.04 0.039
74 UNKNOWN 32.75 0.11 0.107
75 UNKNOWN 33.24 0.05 0.054
76 UNKNOWN 33.55 0.05 0.053
77 UNKNOWN 34.35 0.02 0.015
Total 100 100
ANEKSE
105
Peak results: Shkodër
System : SystemLAO
Method : alkolet 2
User : lao
Index Name Time [Min]
Quantity [%
Area]
Area
[%]
1 UNKNOWN 3.13 0.02 0.019
2 UNKNOWN 3.32 0.03 0.034
3 UNKNOWN 3.57 0.66 0.661
4 UNKNOWN 3.72 0.12 0.117
5 UNKNOWN 4.82 0.03 0.028
6 UNKNOWN 4.94 0.29 0.285
7 UNKNOWN 5.22 4.51 4.512
8 UNKNOWN 5.57 8.1 8.097
9 UNKNOWN 5.71 0.01 0.007
10 UNKNOWN 5.86 0.01 0.008
11 UNKNOWN 6.1 0.14 0.137
12 UNKNOWN 6.56 1.41 1.408
13 UNKNOWN 6.95 0.06 0.056
14 UNKNOWN 7.2 0 0.004
15 UNKNOWN 7.48 1.04 1.039
16 UNKNOWN 7.84 12.77 12.769
17 UNKNOWN 7.96 0.03 0.032
18 UNKNOWN 8.08 0.02 0.019
19 UNKNOWN 8.32 0.01 0.005
20 UNKNOWN 8.69 0.21 0.206
21 UNKNOWN 9.02 0.05 0.055
22 UNKNOWN 9.37 0.01 0.013
23 UNKNOWN 9.6 0.09 0.095
24 UNKNOWN 9.76 0.12 0.116
25 UNKNOWN 10.38 30.32 30.324
26 UNKNOWN 10.69 6.45 6.455
27 UNKNOWN 10.83 0.04 0.043
28 UNKNOWN 11.15 0.03 0.032
29 UNKNOWN 11.69 21.31 21.307
30 UNKNOWN 11.9 0.07 0.073
31 UNKNOWN 12.06 0.07 0.068
32 UNKNOWN 12.25 0.04 0.038
33 UNKNOWN 12.69 2.45 2.446
34 UNKNOWN 12.87 0.01 0.006
35 UNKNOWN 13.09 0.49 0.492
36 UNKNOWN 13.63 0.33 0.33
ANEKSE
106
37 UNKNOWN 13.86 0.05 0.051
38 UNKNOWN 14.17 0.02 0.016
39 UNKNOWN 14.31 0.01 0.01
40 UNKNOWN 14.52 0.01 0.012
41 UNKNOWN 14.67 0.04 0.036
42 UNKNOWN 15.19 0.07 0.07
43 UNKNOWN 15.52 0.02 0.025
44 UNKNOWN 15.84 0.02 0.022
45 UNKNOWN 16.07 0.01 0.009
46 UNKNOWN 16.36 0.01 0.014
47 UNKNOWN 16.48 0.02 0.02
48 UNKNOWN 16.82 0.03 0.032
49 UNKNOWN 17.62 1.44 1.442
50 UNKNOWN 17.79 0.11 0.108
51 UNKNOWN 17.96 0.06 0.063
52 UNKNOWN 18.37 0.06 0.063
53 UNKNOWN 18.89 0.01 0.014
54 UNKNOWN 19.36 0.02 0.015
55 UNKNOWN 19.67 0.02 0.018
56 UNKNOWN 19.85 0.01 0.008
57 UNKNOWN 20.12 0.01 0.011
58 UNKNOWN 20.31 0.01 0.01
59 UNKNOWN 20.47 0.01 0.01
60 UNKNOWN 21.69 0.01 0.013
61 UNKNOWN 21.91 0.02 0.017
62 UNKNOWN 23.2 0.28 0.275
63 UNKNOWN 23.64 0.88 0.876
64 UNKNOWN 24.03 0.52 0.519
65 UNKNOWN 24.45 0.02 0.021
66 UNKNOWN 25.02 1.1 1.103
67 UNKNOWN 25.29 0.02 0.024
68 UNKNOWN 25.92 0.02 0.019
69 UNKNOWN 26.73 0.02 0.017
70 UNKNOWN 27.37 0.02 0.017
71 UNKNOWN 27.79 0.03 0.026
72 UNKNOWN 28.29 0.34 0.344
73 UNKNOWN 28.94 0.44 0.438
74 UNKNOWN 29.15 0.23 0.235
75 UNKNOWN 29.4 0.04 0.039
76 UNKNOWN 29.6 0.03 0.031
77 UNKNOWN 29.8 0.11 0.115
78 UNKNOWN 30.39 1.77 1.774
79 UNKNOWN 30.61 0.01 0.005
ANEKSE
107
80 UNKNOWN 30.81 0.23 0.228
81 UNKNOWN 31.75 0.22 0.222
82 UNKNOWN 31.89 0.03 0.034
83 UNKNOWN 32.73 0.09 0.089
84 UNKNOWN 33.23 0.05 0.045
85 UNKNOWN 33.54 0.01 0.011
86 UNKNOWN 33.86 0.01 0.01
87 UNKNOWN 34.6 0.04 0.039
Total 100 100
Peak results:Valbona
System : SystemLAO
Method : alkolet 2
User : lao
Index Name
Time
[Min]
Quantity [%
Area]
Area
[%]
1 UNKNOWN 6.2 0.02 0.021
2 UNKNOWN 6.3 0.05 0.0502
3 UNKNOWN 6.6. 0.22 0.202
4 UNKNOWN 6.9 0.04 0.041
5 UNKNOWN 8.5 0.13 0.1304
6 UNKNOWN 9 2.93 2.931
7 UNKNOWN 9.1 0.2 0.21
8 UNKNOWN 10.3 0.04 0.0405
9 UNKNOWN 10.7 3.93 3.9304
10 UNKNOWN 12.4 1.42 1.4205
11 UNKNOWN 13 0.05 0.051
12 UNKNOWN 13.2 0.02 0.02101
13 UNKNOWN 15 0.69 0.697
14 UNKNOWN 15.3 0.09 0.098
15 UNKNOWN 16.1 0.43 0.4303
16 UNKNOWN 17.3 1.3 1.3021
17 UNKNOWN 17.9 8.4 8.41
18 UNKNOWN 19.1 0.06 0.061
19 UNKNOWN 19.3 0.03 0.03201
20 UNKNOWN 19.9 0.5 0.5027
21 UNKNOWN 20.2 0.04 0.0402
22 UNKNOWN 21.5 0.92 0.921
23 UNKNOWN 22.3 0.16 0.167
24 UNKNOWN 28.3 0.05 0.055
ANEKSE
108
25 UNKNOWN 28.5 0.02 0.022
26 UNKNOWN 29.3 0.02 0.0214
27 UNKNOWN 29.5 0.04 0.045
28 UNKNOWN 29.9 0.02 0.0223
29 UNKNOWN 31.9 32.43 32.432
30 UNKNOWN 32 0.05 0.0552
31 UNKNOWN 32.6 0.09 0.092
32 UNKNOWN 32.7 0.03 0.037
33 UNKNOWN 32.9 0.11 0.112
34 UNKNOWN 33 7.67 7.676
35 UNKNOWN 34.2 0.03 0.034
36 UNKNOWN 34.6 0.03 0.032
37 UNKNOWN 35.3 0.02 0.022
38 UNKNOWN 35.6 0.03 0.0315
39 UNKNOWN 36.4 0.07 0.0787
40 UNKNOWN 37.7 16.02 16.022
41 UNKNOWN 37.9 0.13 0.132
42 UNKNOWN 39.3 0.43 0.435
43 UNKNOWN 39.6 0.02 0.0213
44 UNKNOWN 39.9 0.03 0.0314
45 UNKNOWN 40.9 0.12 0.1224
46 UNKNOWN 41.6 0.04 0.0413
47 UNKNOWN 41.8 0.16 1.1675
48 UNKNOWN 42.1 0.03 0.0333
49 UNKNOWN 42.6 0.06 0.0694
50 UNKNOWN 42.8 0.04 0.0445
51 UNKNOWN 43.1 0.45 0.456
52 UNKNOWN 43.2 3.74 3.743
53 UNKNOWN 43.4 0.03 0.0314
54 UNKNOWN 43.6 0.06 0.0622
55 UNKNOWN 43.9 0.11 0.113
56 UNKNOWN 44.1 0.04 0.0414
57 UNKNOWN 44.8 0.03 0.0313
58 UNKNOWN 45.4 0.03 0.032
59 UNKNOWN 46 0.15 0.156
60 UNKNOWN 46.2 0.25 0.2542
61 UNKNOWN 46.6 0.15 0.155
62 UNKNOWN 46.9 0.05 0.053
63 UNKNOWN 47.4 0.12 0.1231
64 UNKNOWN 47.5 0.16 0.1614
65 UNKNOWN 47.7 5.39 5.397
66 UNKNOWN 48.3 0.04 0.0423
67 UNKNOWN 48.6 0.06 0.0625
ANEKSE
109
68 UNKNOWN 49 0.71 0.713
69 UNKNOWN 49.1 0.51 0.514
70 UNKNOWN 49.3 2.14 2.141
71 UNKNOWN 49.6 0.07 0.0713
72 UNKNOWN 50.7 0.08 0.0865
73 UNKNOWN 51 0.04 0.0434
74 UNKNOWN 51.2 0.03 0.0323
75 UNKNOWN 52.7 0.09 0.0996
76 UNKNOWN 52.9 0.05 0.0513
77 UNKNOWN 54.4 0.1 0.121
78 UNKNOWN 55.3 0.03 0.0322
79 UNKNOWN 56.2 0.03 0.0314
80 UNKNOWN 56.9 0.04 0.043
81 UNKNOWN 57.3 0.02 0.0232
82 UNKNOWN 57.6 0.07 0.0765
83 UNKNOWN 59.4 0.02 0.0223
84 UNKNOWN 61.8 0.1 0.132
85 UNKNOWN 64.9 0.02 0.0232
86 UNKNOWN 65.9 0.12 0.124
87 UNKNOWN 67 0.04 0.0423
88 UNKNOWN 67.6 0.1 0.131
89 UNKNOWN 68.6 0.09 0.09605
90 UNKNOWN 68.9 0.31 0.315
91 UNKNOWN 69.6 0.04 0.0434
92 UNKNOWN 69.9 0.14 0.1421
93 UNKNOWN 70.9 2.62 2.623
94 UNKNOWN 74.1 0.03 0.034
95 UNKNOWN 75.7 0.05 0.0545
96 UNKNOWN 75.9 0.06 0.06703
97 UNKNOWN 76.1 0.03 0.0324
98 UNKNOWN 76.5 0.1 0.114
99 UNKNOWN 80.5 0.14 0.144
100 UNKNOWN 81.1 0.05 0.0535
101 UNKNOWN 82.9 0.04 0.0443
102 UNKNOWN 84.7 0.06 0.0622
103 UNKNOWN 97.7 0.5 0.531
Total 100 100
ANEKSE
110
Peak results: Lezha
System : SystemLAO
Method : alkolet 2
User : lao
Index Name Time [Min]
Quantity [%
Area]
Area
[%]
1 UNKNOWN 5.934 0.09 0.0948
2 UNKNOWN 6.23 0.25 0.2482
3 UNKNOWN 6.515 0.05 0.0468
4 UNKNOWN 7.805 0.2 0.1819
5 UNKNOWN 8.158 4.2 4.1872
6 UNKNOWN 9.404 5.1 5.1361
7 UNKNOWN 10.613 2.4 2.435
8 UNKNOWN 10.929 0.07 0.0687
9 UNKNOWN 12.108 1.9 1.9597
10 UNKNOWN 12.346 0.1 0.1196
11 UNKNOWN 12.815 0.43 0.4293
12 UNKNOWN 13.466 1.8 1.8049
13 UNKNOWN 13.861 16.17 16.1669
14 UNKNOWN 14.434 0.09 0.0967
15 UNKNOWN 14.997 0.65 0.6555
16 UNKNOWN 15.861 0.58 0.5799
17 UNKNOWN 16.273 0.32 0.3232
18 UNKNOWN 21.131 22.95 22.949
19 UNKNOWN 21.289 0.21 0.2063
20 UNKNOWN 21.42 0.09 0.0943
21 UNKNOWN 21.667 4.2 4.1918
22 UNKNOWN 21.932 0.05 0.0461
23 UNKNOWN 23.249 0.07 0.067
24 UNKNOWN 23.92 0.09 0.0908
25 UNKNOWN 24.277 17.9 17.9174
26 UNKNOWN 24.344 0.41 0.4095
27 UNKNOWN 24.812 0.1 0.1035
28 UNKNOWN 25.407 0.05 0.0463
29 UNKNOWN 25.906 1.64 1.639
30 UNKNOWN 26.163 0.07 0.0682
31 UNKNOWN 26.409 0.52 0.5191
32 UNKNOWN 26.63 5.2 5.2301
33 UNKNOWN 26.756 0.09 0.0875
34 UNKNOWN 26.897 0.3 0.281
35 UNKNOWN 27.152 0.06 0.0562
36 UNKNOWN 27.838 0.17 0.1726
ANEKSE
111
37 UNKNOWN 28.044 0.23 0.233
38 UNKNOWN 28.368 0.24 0.2427
39 UNKNOWN 28.5 0.09 0.0994
40 UNKNOWN 28.779 4.3 4.2617
41 UNKNOWN 29.089 0.61 0.6057
42 UNKNOWN 29.234 0.75 0.7545
43 UNKNOWN 29.37 2.4 2.3969
44 UNKNOWN 30.216 0.05 0.0494
45 UNKNOWN 31.061 0.12 0.1192
46 UNKNOWN 31.226 0.05 0.0516
47 UNKNOWN 31.871 0.09 0.0974
48 UNKNOWN 33.235 0.08 0.0791
49 UNKNOWN 37.303 0.1 0.1029
50 UNKNOWN 38.089 0.05 0.0549
51 UNKNOWN 38.483 0.09 0.0981
52 UNKNOWN 38.697 0.2 0.1994
53 UNKNOWN 39.145 0.19 0.1915
54 UNKNOWN 39.524 1.46 1.4583
55 UNKNOWN 42.037 0.08 0.0757
56 UNKNOWN 42.36 0.06 0.059
57 UNKNOWN 44.819 0.06 0.0594
Total 100 100
Peak results: Lohe
System : SystemLAO
Method : alkolet 2
User : lao
Index Name Time [Min]
Quantity [%
Area]
Area
[%]
1 UNKNOWN 2.378 0.22 0.2224
2 UNKNOWN 2.528 4.5 4.4689
3 UNKNOWN 3.103 6.02 6.0187
4 UNKNOWN 3.725 2.85 2.8472
5 UNKNOWN 3.937 0.18 0.1826
6 UNKNOWN 4.66 1.23 1.2296
7 UNKNOWN 5.027 0.36 0.3618
8 UNKNOWN 5.427 2.4 2.3949
9 UNKNOWN 5.667 10.92 10.9175
10 UNKNOWN 6.42 0.61 0.6094
11 UNKNOWN 6.997 0.56 0.558
12 UNKNOWN 7.253 0.33 0.3293
13 UNKNOWN 10.625 29.2 29.1642
ANEKSE
112
14 UNKNOWN 11.038 3.65 3.649
15 UNKNOWN 11.467 0.13 0.1304
16 UNKNOWN 12.84 21.5 21.4837
17 UNKNOWN 13.29 0.4 0.3775
18 UNKNOWN 14.115 1.33 1.3269
19 UNKNOWN 14.395 4.05 4.0503
20 UNKNOWN 14.633 0.76 0.7561
21 UNKNOWN 16.012 5.8 5.777
22 UNKNOWN 16.712 2.7 2.6886
23 UNKNOWN 24.15 0.5 0.468
Total 100 100
Peak results: Shëngjin
System : SystemLAO
Method : alkolet 2
User : lao
Index Name Time [Min] Quantity [% Area] Area [%]
1 UNKNOWN 4.288 0.17 0.17445
2 UNKNOWN 4.409 3.33 3.32854
3 UNKNOWN 4.62 0.9 0.99141
4 UNKNOWN 4.659 6.24 6.23995
5 UNKNOWN 4.778 0.7 0.7618
6 UNKNOWN 4.953 1.5 1.46527
7 UNKNOWN 5.046 0.1 0.10331
8 UNKNOWN 5.092 2.09 2.08756
9 UNKNOWN 5.3 1.39 1.39918
10 UNKNOWN 5.365 0.11 0.11175
11 UNKNOWN 5.481 0.3 0.29466
12 UNKNOWN 5.659 0.26 0.25632
13 UNKNOWN 5.775 0.44 0.44094
14 UNKNOWN 5.835 3.53 3.52768
15 UNKNOWN 5.872 13.4 13.3696
16 UNKNOWN 5.972 0.27 0.26639
17 UNKNOWN 6.126 0.19 0.18582
18 UNKNOWN 6.288 0.45 0.43989
19 UNKNOWN 6.745 0.51 0.51036
20 UNKNOWN 6.919 0.6 0.59907
21 UNKNOWN 7.026 18.7 18.67534
22 UNKNOWN 7.197 2.5 2.53327
23 UNKNOWN 7.586 0.07 0.06855
24 UNKNOWN 7.672 21.97 21.97302
ANEKSE
113
25 UNKNOWN 8.031 3.89 3.88827
26 UNKNOWN 8.234 0.28 0.27808
27 UNKNOWN 8.473 0.09 0.09518
28 UNKNOWN 10.369 2.52 2.51957
29 UNKNOWN 10.506 0.12 0.12247
30 UNKNOWN 10.674 0.11 0.10883
31 UNKNOWN 12.327 0.12 0.12182
32 UNKNOWN 12.433 0.28 0.27678
33 UNKNOWN 13.506 4.75 4.74688
34 UNKNOWN 13.966 0.31 0.31219
35 UNKNOWN 14.362 6.36 6.35723
36 UNKNOWN 14.85 0.33 0.32996
Total 100 100
Peak results: Ulza
System : SystemLAO
Method : alkolet 2
User : lao
Index Name Time [Min] Quantity [% Area] Area [%]
1 UNKNOWN 6.66 0.3 0.29856
2 UNKNOWN 6.936 0.07 0.07138
3 UNKNOWN 8.924 0.17 0.17298
4 UNKNOWN 9.026 0.14 0.13905
5 UNKNOWN 9.31 2.77 2.76761
6 UNKNOWN 9.784 0.03 0.0288
7 UNKNOWN 9.865 6 6.00028
8 UNKNOWN 10.692 0.2 0.19648
9 UNKNOWN 10.846 1.5 1.52084
10 UNKNOWN 11.19 1.07 1.07107
11 UNKNOWN 11.793 0.1 0.10363
12 UNKNOWN 12.242 0.23 0.22879
13 UNKNOWN 12.535 0.37 0.36984
14 UNKNOWN 12.722 2.85 2.85392
15 UNKNOWN 12.86 8.37 8.37137
16 UNKNOWN 13.328 0.05 0.04882
17 UNKNOWN 13.829 0.42 0.42542
18 UNKNOWN 14.161 0.98 0.09826
19 UNKNOWN 14.351 0.03 0.02733
20 UNKNOWN 14.988 0.6 0.59711
21 UNKNOWN 15.377 0.6 0.5774
22 UNKNOWN 15.804 19.04 19.04142
23 UNKNOWN 16.137 2.3 2.29728
24 UNKNOWN 16.325 0.04 0.04006
ANEKSE
114
25 UNKNOWN 16.463 0.16 0.15641
26 UNKNOWN 16.83 0.05 0.05257
27 UNKNOWN 17.113 0.17 0.17165
28 UNKNOWN 17.412 27.6 27.64254
29 UNKNOWN 17.476 0.03 0.02822
30 UNKNOWN 17.735 0.07 0.07142
31 UNKNOWN 17.874 0.19 0.18828
32 UNKNOWN 17.958 0.32 0.32359
33 UNKNOWN 18.093 3.18 3.17986
34 UNKNOWN 18.464 0.41 0.40901
35 UNKNOWN 18.671 0.061 0.06086
36 UNKNOWN 18.931 0.16 0.1558
37 UNKNOWN 19.18 0.19 0.18912
38 UNKNOWN 19.535 1.21 1.21142
39 UNKNOWN 19.955 0.04 0.0448
40 UNKNOWN 20.159 0.02 0.02453
41 UNKNOWN 20.445 0.04 0.03941
42 UNKNOWN 20.562 0.02 0.02355
43 UNKNOWN 20.631 0.03 0.03354
44 UNKNOWN 20.728 0.03 0.03138
45 UNKNOWN 21.134 0.03 0.03156
46 UNKNOWN 21.84 0.032 0.03198
47 UNKNOWN 22.041 0.31 0.30563
48 UNKNOWN 22.538 2.65 2.64836
49 UNKNOWN 22.649 0.17 0.17154
50 UNKNOWN 22.685 0.08 0.08116
51 UNKNOWN 22.88 0.12 0.11559
52 UNKNOWN 23.239 0.07 0.07587
53 UNKNOWN 23.91 0.1 0.10418
54 UNKNOWN 24.516 0.15 0.15249
55 UNKNOWN 24.777 0.11 0.11281
56 UNKNOWN 24.865 0.04 0.04149
57 UNKNOWN 25.754 0.075 0.07498
58 UNKNOWN 25.875 0.1 0.10064
59 UNKNOWN 26.243 0.03 0.02869
60 UNKNOWN 26.762 0.03 0.02863
61 UNKNOWN 27.012 0.05 0.04852
62 UNKNOWN 27.522 4.5 4.52204
63 UNKNOWN 27.763 0.08 0.08153
64 UNKNOWN 27.895 0.2 0.1985
65 UNKNOWN 28.029 0.03 0.02832
66 UNKNOWN 28.148 0.23 0.23393
67 UNKNOWN 28.27 0.03 0.03051
ANEKSE
115
68 UNKNOWN 28.448 0.27 0.27091
69 UNKNOWN 28.709 8.03 8.02728
70 UNKNOWN 28.906 0.11 0.11063
71 UNKNOWN 29.293 0.16 0.16138
72 UNKNOWN 29.745 0.03 0.02549
73 UNKNOWN 29.825 0.03 0.02263
74 UNKNOWN 29.911 0.024 0.02388
75 UNKNOWN 29.988 0.15 0.14693
76 UNKNOWN 30.047 0.03 0.03236
77 UNKNOWN 30.562 0.06 0.05695
78 UNKNOWN 30.875 0.18 0.18474
Totali 100 100
Peak results: Fushë Milot
System : SystemLAO
Method : alkolet 2
User : lao
Index Name Time [Min]
Quantity [%
Area]
Area
[%]
1 UNKNOWN 3.03 0.04 0.042
2 UNKNOWN 4.07 0.2 0.23
3 UNKNOWN 5.5 0.4 0.43
4 UNKNOWN 6.1 0.04 0.039
5 UNKNOWN 8.32 0.5 0.52
6 UNKNOWN 9.91 0.2 0.166
7 UNKNOWN 10.659 3.4 3.4
8 UNKNOWN 11.09 6.3 6.3
9 UNKNOWN 12.007 1.4 1.4
10 UNKNOWN 12.151 0.1 0.143
11 UNKNOWN 12.238 0.1 0.078
12 UNKNOWN 12.382 1.2 1.24
13 UNKNOWN 13.051 2.3 2.3
14 UNKNOWN 13.325 0.9 0.92
15 UNKNOWN 13.768 11 10.8
16 UNKNOWN 13.965 0.1 0.121
17 UNKNOWN 14.348 1.3 1.31
18 UNKNOWN 14.758 0.7 0.72
19 UNKNOWN 14.924 0.5 0.52
20 UNKNOWN 15.146 0.1 0.06
21 UNKNOWN 15.374 0.04 0.038
22 UNKNOWN 15.465 0.1 0.095
23 UNKNOWN 15.835 0.4 0.4
ANEKSE
116
24 UNKNOWN 15.9 0.1 0.071
25 UNKNOWN 15.978 0.05 0.056
26 UNKNOWN 16.023 0.04 0.036
27 UNKNOWN 16.162 0.05 0.0532
28 UNKNOWN 16.28 22 21.7
29 UNKNOWN 16.531 3.7 3.7
30 UNKNOWN 16.865 0.05 0.054
31 UNKNOWN 17.243 0.1 0.062
32 UNKNOWN 17.405 26 26.1
33 UNKNOWN 18.45 3 3.2
34 UNKNOWN 19.143 0.01 0.012
35 UNKNOWN 19.874 0.06 0.0587
36 UNKNOWN 20.246 0.06 0.0645
37 UNKNOWN 20.567 0.1 0.097
38 UNKNOWN 21.854 0.1 0.0946
39 UNKNOWN 22.529 0.4 0.37
40 UNKNOWN 22.785 0.03 0.032
41 UNKNOWN 23.315 0.1 0.154
42 UNKNOWN 23.879 0.1 0.124
43 UNKNOWN 24.515 0.8 0.83
44 UNKNOWN 24.753 0.2 0.157
45 UNKNOWN 25.642 0.1 0.093
46 UNKNOWN 26.536 0.1 0.135
47 UNKNOWN 26.923 2 2.3
48 UNKNOWN 27.432 3.5 3.5
49 UNKNOWN 27.964 0.1 0.075
50 UNKNOWN 28.432 5.6 5.6
Total 100 100
Peak results: Postriba
System : SystemLAO
Method : alkolet 2
User : lao
Index Name Time [Min]
Quantity [%
Area]
Area
[%]
1 UNKNOWN 4.234 0.06 0.065
2 UNKNOWN 5.328 0.08 0.079
3 UNKNOWN 5.782 0.11 0.113
4 UNKNOWN 6.187 0.1 0.125
5 UNKNOWN 6.749 0.06 0.057
6 UNKNOWN 7.256 0.13 0.128
7 UNKNOWN 7.846 0.03 0.0354
ANEKSE
117
8 UNKNOWN 8.093 0.07 0.0673
9 UNKNOWN 8.434 2.2 2.2
10 UNKNOWN 9.345 0.13 0.132
11 UNKNOWN 9.879 0.04 0.0435
12 UNKNOWN 10.404 4.1 4.1
13 UNKNOWN 10.654 2 2
14 UNKNOWN 11.833 0.94 0.94
15 UNKNOWN 12.022 2 2
16 UNKNOWN 13.325 2.4 2.41
17 UNKNOWN 13.758 9.4 9.4
18 UNKNOWN 13.964 0.4 0.43
19 UNKNOWN 14.549 0.3 0.28
20 UNKNOWN 14.758 0.3 0.3
21 UNKNOWN 15.837 0.2 0.2
22 UNKNOWN 16.221 36 36
23 UNKNOWN 16.626 4.7 4.7
24 UNKNOWN 17.361 17.6 17.6
25 UNKNOWN 18.428 1.6 1.6
26 UNKNOWN 19.194 0.3 0.32
27 UNKNOWN 20.672 1.3 1.34
28 UNKNOWN 20.869 0.15 0.147
29 UNKNOWN 21.132 0.03 0.03
30 UNKNOWN 21.578 0.1 0.098
31 UNKNOWN 22.506 1.5 1.5
32 UNKNOWN 22.782 0.12 0.117
33 UNKNOWN 23.154 0.06 0.0587
34 UNKNOWN 23.784 0.07 0.0664
35 UNKNOWN 23.967 0.15 0.152
36 UNKNOWN 24.325 0.12 0.117
37 UNKNOWN 24.765 0.4 0.357
38 UNKNOWN 24.907 0.12 0.117
39 UNKNOWN 25.302 0.1 0.093
40 UNKNOWN 25.564 0.1 0.121
41 UNKNOWN 25.783 0.07 0.0689
42 UNKNOWN 25.173 0.1 0.114
43 UNKNOWN 25.689 0.03 0.026
44 UNKNOWN 27.38 3.2 3.2
45 UNKNOWN 28.424 7 7
Total 100 100
118
PËRMBLEDHJE
Trembëdhjetë popullata natyrore të sherbelës së Shqipërisë së veriut u analizuan për të
vlerësuar diversitetin e gjeneve koduese të monoterpen-sintetazave dhe produkteve të
tyre monoterpenoidike. Metodologjia e ndjekur u bazua në shumëfishimin me PCR të
një fragmenti gjenik qëndror të MTP nga gADN dhe ARN totale, klonimin e tij në
plazmidin pTOPO2.1, transformimin në E.coli, dhe mbjelljen e baktereve për të
krijuar trembëdhjetë librari. Përzgjedhja e rekombinantëve dhe klonimi u kryen sipas
metodologjisë të kitit të Invitrogen. Meqënëse, përmasat e MTP-ve të shumëfishuara
nga modele të gADN dhe ARN totale ishin identike, çka do të thotë se rajoni i
shumëfishuar ishte kodues në të gjitha popullatat, u vendos të përzgjidhen për studim
të mëtejshëm popullatat më të veçanta. Meqënëse monoterpen-sintetazat kanë origjine
plastidike, u izolua cp-ADN nga të trembëdhjetë popullatat dhe me anën e primerave
intergjenike trnL/F (Ibrahim et al., 2012) u vlerësua bazuar në PCR-RFLP diversiteti i
rajonit të shumëfishuar. Paralelisht, u ekstraktuan vajrat esenciale dhe me anë të GC u
përcaktua përmbajtja e monoterpeneve në to. Rezultatet e të dy metodave të vlerësimit
të bazuara në cp-ADN dhe gaz-kromatografi, treguan se popullatat mund të
grupoheshin dhe se grupimi korrelonte, duke veçuar si më uniket popullatat e Krujës,
Torovicës dhe Postribës. Për këto tre popullata studimi vijoi duke izoluar (prej
librarive) plazmidet rekombinante nga katër koloni respektivisht për çdo popullatë,
për tu analizuar me anë të enzimave restriktive. Rezultatet treguan se profilet e
prerjeve të fragmenteve gjenike të MTP i dallojnë popullatat njëra nga tjetra. Të
dhënat e përshkruara më sipër u përdorën për ti grupuar popullatat sipas ngjashmërisë
me anë te softit PcoA dhe për të ndërtuar një sërë konkluzionesh të rëndësishme mbi
biodiversitetin e sherbelës së Shqipërisë së veriut.
Fjalëkyçe: monoterpene, PCR-RFLP, gaz-kromatografi, cp-ADN
ABSTRACT
Thirteen natural populations of sage of northen Albania were analyzed to evaluate the
diversity of monoterpene coding genes, and monoterpene composition of their
essential oils. Methodology was based on the PCR based amplification of a central
MTP gene fragment from gDNA and total ARN, cloning of amplicons at pTOPO2.1
plasmids, transformation to E.coli, and plating according to the manufacturers
instructions (Invitrogen), thus creating thirteen libraries. Since the dimensions of the
MTP amplicons from gDNA and total ARN were the same, meaning there were no
introns, work continued for the selection of the most unique populations. cpDNA
were isolated from 13 populations and intergenic primers trnL/F (Ibrahim et al., 2012)
were used to perform PCR-RFLPs. Simultaneosly, esencial oils were extracted and
GC were employed to analyse the quality and quantity of main monoterpene and
sesquiterpene components. Results from both methods, cp-DNA based and GC-
based,showed that populations could be grouped in similar way, leaving aside as the
most distinctive ones the populations of Kruja, Torovica and Postriba. For the last,
recombinant plasmids were isolated from four clones for each library, and restriction
digested. Results show differences among the three populations. Results from the
above work were used to group populations according to similarity based on PCoA
soft, and to build important conclusions on the biodiversity of sage from northern
Albania.
Keywords: monoterpene, PCR-RFLP, gas-chromatography, cp-ADN