Bol. San. Veg. Plagas, 29: 613-626, 2003

Aislamiento de Verticillium dahliae de suelo y caracterizaciónmorfológica de sus microesclerocios

F. J. LÓPEZ-ESCUDERO, D. NÚÑEZ-SANTOS, M. A. BLANCO-LÓPEZ

En este trabajo se describe una metodología que facilita el aislamiento directo de V.dahliae del suelo. Tras procesar la muestra por Tamizado Húmedo, se siembran alícuo-tas de la suspensión resultante en placas del medio Agar Polipectato Sódico Modificado(APSM) sobre las que se ha extendido una lámina de celofán. Las colonias de microes-clerocios de V. dahliae formadas sobre el celofán se recuperan retirando la cuadrícula dela lámina que las contiene. Las colonias adheridas al celofán se tratan en un baño deultrasonidos, se lavan y se filtran utilizando una bomba de vacío. Tras el filtrado, el resi-duo resultante se siembra en nuevas placas de APSM, PDA o PDA acidificado, dondelas colonias de Vi dahliae crecen libres de contaminantes, y se pueden transferir paraobtener el cultivo puro. Se ha obtenido así una colección de aislados de suelo de V. dah-liae, cuyos microesclerocios producidos sobre APSM se han caracterizado morfológica-mente. Los valores de la relación longitud/anchura de los microesclerocios de los aisla-dos obtenidos mostraron una amplia variabilidad comparados con los microesclerociosde los aislados de referencia, VI17 (defolíante) y V4 (no defolíante) de V. dahliae. Lascaracterísticas morfológicas de los microesclerocios en APSM podrían estar relaciona-das con el patotipo del aislado de este agente, como ha sido descrito por otros autores enotros medios de cultivo. Por ello, este método de aislamiento podría facilitar en el futu-ro estudios de ecología y virulencia del patógeno. Adicionalmente, la metodología desa-rrollada podría aplicarse de forma simultánea para la determinación de la densidad deinoculo de V. dahliae

F. J. LÓPEZ-ESCUDERO, D. NÚÑEZ-SANTOS, M. A. BLANCO-LÓPEZ. Departamento deAgronomía, ETSIAM, Universidad de Córdoba. Apdo. 3048, 14080 Córdoba.

Palabras clave: aislados defoliantes y no defoliantes de Verticillium dahliae, aisla-miento del suelo, caracterización morfológica, microesclerocios

INTRODUCCIÓN

Verticillium dahliae es un hongo de sueloque produce enfermedades denominadasVerticilosis, responsables de importantespérdidas en una amplia gama de especiescultivadas, entre las que destacan algodón,cultivos hortícolas y olivo. Los factores másimportantes que determinan el desarrollo delas Verticilosis incluyen la cantidad de agen-te presente en el suelo (densidad de inoculo)y su virulencia. El conocimiento de ambos

factores previamente a la siembra o planta-ción es fundamental para establecer nivelesde riesgo y diseñar estrategias de control,aspectos especialmente importantes en hués-pedes leñosos como el olivo.

Para la estimación cuantitativa de la den-sidad de inoculo de V. dahliae en el suelo sehan desarrollado una gran variedad demétodos (ASHWORTH et al, 1972; 1974;BEN-YEPHET y PINKAS, 1976; BUTTERFIELD y

DE VAY, 1977; DE VAY et al, 1974; EVANS et

al, 1966; HARRIS et al, 1993; HARRISON y

LIVINGSTONE, 1966; HUISMAN y ASHWORTH,1974 a y b; MENZIES y GRIEBEL, 1967) ymedios de cultivo (ASHWORTH et al, 1972;1974; AUSHER et al, 1975; BUTTERFIELD yDE VAY, 1977; DE VAY et al, 1974; EVANS etal, 1967; GREEN y PAPAVIZAS, 1968; HUIS-MAN y ASHWORTH, 1974 a y b; MENZIES yGRIEBEL, 1967; NADAKAVUKAREN y HORNER,1959; TAYLOR, 1969; TSAO, 1970). Estosprocesos tienen en común la siembra de unacantidad conocida de suelo en la superficiede un determinado medio de cultivo selecti-vo, sobre la cual tf dahliae produce coloniascon microesclerocios (ME) (estructurasvegetativas de supervivencia formadas poragregaciones de células). El número de estascolonias referida a la cantidad inicial desuelo sembrado constituye la densidad deinoculo y se expresa como número de ME opropágulos por gramo de suelo seco. A pesarde que la mayoría de los medios empleadospresentan selectividad suficiente para permi-tir el crecimiento de colonias reconociblesde V. dahliae, que posibilitan su conteo enpresencia de otros microorganismos delsuelo, ninguno de ellos en particular pareceser completamente satisfactorio (BUTTER-HELD y DE VAY, 1977; HARRIS et al, 1993,TERMORSHUIZEN, 2000).

Otra de las grandes limitaciones que se handescrito ha sido la dificultad o imposibilidadde obtener aislados de V dahliae del suelo,aspecto abordado por numerosos autores yque es necesario para caracterizar las pobla-ciones del patógeno en relación con su pato-genicidad y virulencia, grupos de compatibili-dad vegetativa, morfología y dinámica de ger-minación de sus propágulos. Por ello, el aná-lisis cuantitativo de V dahliae de una muestrade suelo no permite simultáneamente el aisla-miento del agente de dicha muestra, sino sólosu enumeración. Es decir, la transferenciadirecta de los ME que V. dahliae producesobre los medios semiselectivos a mediosconvencionales para la obtención de cultivospuros no suele ser posible debido a la grancantidad de hongos contaminantes que crecenen este medio. Por ello, se han descrito coneste objeto numerosas combinaciones o

variantes de algunos de los métodos que seemplean para su cuantificación, aunque en lamayoría de los casos el procesado de lasmuestras es muy complejo y laborioso, lastasas de recuperación son bajas y los aisla-mientos no suelen ser consistentes. Entre ellosse deben citar los intentos de recuperacióndirecta de ME de una muestra aplicandodiversos métodos de desinfestación de lascolonias o combinaciones de dilución enplaca, decantado, centrifugación, flotación ofiltrado de los propágulos recuperados (BEJA-RANO-ALCÁZAR, 1990; BEN-YEPHET y PINKAS,1976; EVANS et al, 1966, GROGAN et al,1979; HARRIS et al, 1993; HUISMAN y ASH-WORTH, 1974 a y b), así como la estimulaciónde la germinación de ME (BEJARANO-ALCÁ-ZAR, 1990; ISAAC y MACGARVIE, 1962). Otrosautores han evaluado el aislamiento del agen-te a partir de colonias desarrolladas en mediossemiselectivos con ácido poligalacturónicotras sembrar una muestra utilizando un mues-treador Andersen (BEJARANO- ALCÁZAR, 1990)o el método del Tamizado Húmedo (GROGANet al, 1979; JOAQUIM y ROWE, 1990) sin mejo-rar sensiblemente los resultados.

En resumen, la baja eficiencia de estastécnicas ha sido atribuida a: 1) la dificultadde distinguir entre las estructuras de supervi-vencia de este agente de las partículas desuelo y de otras estructuras fúngicas presen-tes (BEJARANO-ALCÁZAR, 1990; HUISMAN yASHWORTH, 1974 a y b); 2) al elevado por-centaje de los ME presentes en la muestra desuelo que se hallan embebidos en restosmicroscópicos de tejidos de plantas infecta-das que no permiten su identificación (ASH-WORTH et al, 1974; BEJARANO-ALCÁZAR,1990; BEN-YEPHET y PINKAS, 1976; Evans etal, 1966; HUISMAN y ASHWORTH, 1974 a yb); 3) al frecuente desarrollo de otros hongosa partir de los ME sembrados, que se atribu-ye a contaminantes adheridos a éstos o alaislamiento erróneo de propágulos parecidosa ME (BEJARANO-ALCÁZAR, 1990; EVANS etal, 1966; HUISMAN y ASHWORTH, 1974 a y b;DE VAY et al, 1974; LÓPEZ-ESCUDERO et al,2000); 4) a la reducida selectividad de losmedios de cultivo, que permiten el creci-

miento de contaminantes (hongos, bacterias,hiperparásitos de ME, etc.) con tasas de cre-cimiento muy superiores a las de V dahliae;y 5) a la posible dormancia de los ME que sehan producido sobre los medios semiselecti-vos (ISAAC y MACGARVIE, 1962).

En este trabajo se ha desarrollado unametodología para la recuperación de V dah-liae del suelo que reduce la mayor parte delas limitaciones expuestas y aumenta la fre-cuencia de obtención de aislados del agenteen cultivo puro a partir de una muestra desuelo, aspecto necesario para el estudio de laecología y virulencia del hongo en el suelo.Además, se han caracterizado morfológica-mente los ME producidos por los aisladosobtenidos en el medio de cultivo APSM,comparándolos con las características de losaislados defoliante y no defoliante de V. dah-liae. Esta metodología puede ser usada tam-bién, con ligeras variantes, para la determi-nación cuantitativa del patógeno en el suelo.

MATERIAL Y MÉTODOS

Determinación de la densidad de inocu-lo de las muestras

Las muestras de suelo incluidas en esteestudio provenían de suelos naturalmenteinfestados por V. dahliae, en su mayoríarecogidas de plantaciones de olivar afectadaspor la Verticilosis del Olivo, salvo las mues-tras 12 y 15, hasta la fecha cultivadas dealgodón o plantas madres de rosal, respecti-vamente (Tabla 1). Las muestras se proce-

saron inicialmente por el método del Tami-zado Húmedo (LÓPEZ-ESCUDERO, 1999;LÓPEZ-ESCUDERO y BLANCOLÓPEZ, 2001)para determinar la densidad de inoculo de Vdahliae en cada una de ellas. Para ello, cadamuestra de suelo se deseca al aire durante unmes, se limpia de elementos gruesos y sehomogeniza haciéndola pasar por un tamizde 0.8 mm. Una submuestra de 25g se sus-pende en 100 mi de agua destilada y la sus-pensión se agita durante 1 h a 270 rpm. Des-pués, la suspensión se tamiza a través de fil-tros de 150 y 35 um situados en tándem, y elresiduo retenido en el tamiz de 35 um serecupera en 100 mi de agua destilada. Trasagitar, alícuotas de 1 mi de la suspensión sesiembran en cada una de 10 placas de medioAPSM, que se incuban durante 14 días a24°C en oscuridad. Tras la incubación, lasplacas se lavan bajo el agua del grifo paraeliminar las partículas de suelo y el micelioaéreo superficial de las colonias fúngicas.Con la ayuda de un microscopio estereoscó-pico se cuentan las colonias de V dahliae,asumiendo que cada colonia detectada se haformado a partir de un microesclerocio indi-vidual o un grupo de ellos presentes en elsuelo, por lo que el resultado se expresacomo número de propágulos o ME porgramo de suelo seco (ppg).

Obtención de aislados del patógeno encultivo puro

Para la obtención de aislados de V. dah-liae en cultivo puro, las muestras fueron pro-

Fig. 1. Siembra de la suspensión de suelo en una placa de Agar Polipectato Sódico Modificado sobre la que se haextendido una lámina de papel de celofán estéril de 600 u.m (A); Colonia de V. dahliae formada sobre una cuadrículade celofán (obsérvese la fina capa de micelio y microesclerocios formada por el agente sobre la lámina) (B); Colonia

limpia de microesclerocios alargados crecida en el borde de la lámina de celofán (C).

Fig.2. Procesado de una colonia de V. dahliae formada sobre una cuadrícula de celofán con gran cantidad de partículasde suelo tras someterla a un baño de ultrasonidos y agitación (A): Lavado y filtrado en embudo quitasato conectado auna bomba de vacío (B); Papel de filtro con el residuo del filtrado y su siembra en APSM por dilución en placa (C):Placas de APSM con pequeñas colonias de V. dahliae separadas de las colonias de contaminantes (D); Transferencia

de colonias a PDA acidificado para la obtención de un cultivo puro (E).

cesadas aplicando algunas variantes al méto-do anterior. Partiendo de la suspensión en100 mi de agua destilada de partículas desuelo retenidas entre 150 y 35 \\m, se sem-braron alícuotas de 1 mi en placas de medioselectivo APSM sobre las que se había exten-dido una lámina de papel celofán permeabley estéril de 600 ¡am de grosor (Fig. 1 A).

Una vez sembradas las placas (Fig. 1 A) ycompletada la incubación (14 días a 22°C) seobservaron las colonias estrelladas del agen-te bajo lupa, pero sin eliminar el suelo sem-brado mediante lavado en el agua del grifocomo se ha descrito anteriormente para esti-mar la densidad de inoculo del suelo. Lascolonias de ME desarrolladas sobre la lámi-na de celofán se retiraron con unas pinzastras cortar con un escalpelo el trozo de celo-fán que las contenía, evitando que el agarquedara adherido (Fig. 1 B y C). Los trozosde celofán conteniendo las colonias se alma-cenaron en placas petri vacías con una finacapa de agua estéril a 4°C para su procesadoposterior.

En el caso de que las cuadriculas de celo-fán contuvieran colonias sucias, cubiertascon gran cantidad de partículas de suelo(Fig. 2 A), se suspendieron en 10 mi de agua

destilada en un tubo de fondo plano y sesometieron a un baño de ultrasonidos duran-te 30 s durante los cuales la suspensión seagitó con pinzas estériles. Tras el baño, eltubo se agitó durante 30 s para favorecer eldesprendimiento de las partículas de suelo yde los ME que componen la colonia a la sus-pensión. En caso necesario la suspensión sesometió por segunda vez al mismo proceso,hasta conseguir que la cuadricula de celofánquedara completamente limpia y pudiera serretirada con una pinza. La suspensión se lavóa continuación a través de un embudo quita-sato conectado a una bomba de vacío (Fig. 2B) reteniendo el residuo en un papel de filtrode laboratorio estéril de forma circular, utili-zando aproximadamente 500 mi de aguaestéril. El residuo retenido en el filtro (Fig. 2C) se recuperó en un tubo de fondo planocon 10 mi de agua estéril. Por último, sesembraron alícuotas de 0,5 mi de la suspen-sión así obtenida en placas de APSM (Fig. 2C) (5 repeticiones), que se incubaron a 22°Cen oscuridad. Entre los 6 y 14 días de incu-bación, las placas se observaron nuevamentebajo lupa, detectándose típicas colonias de V.dahliae con crecimiento independiente ylibres de contaminantes sobre la superficie

Fig. 3. Colonia semilimpia de V. ¿hilliae en APSM-celofán (A); Transferencia de microesclerocios de la coloniaanterior tras ser procesada por baño de ultrasonidos y agitación: en PDA acidificado a los 4 días (B) y 10 días (C)

de incubación y APSM (D).

del medio (Fig. 2 D). Estas colonias se trans-firieron a PDA acidificado para obtener cul-tivos puros (Fig. 2 E, Fig. 5).

En el caso de que las colonias tuvieranmenor cantidad de partículas de suelo (Fig. 3A) se lavaron mediante un proceso menosdrástico sometiéndolas, tras su suspensiónen agua estéril, a un baño de ultrasonidosdurante 15 s, para facilitarei desprendimien-to de las partículas de suelo a la suspensiónpero manteniendo adherido al trozo de celo-fán la capa de micelio y ME de la colonia(Fig. 1 B). A continuación esta capa se sepa-ró del cuadrado de celofán y se transfirió auna placa petri vacía. Bajo la lupa, con laayuda de una aguja enmangada se tomaronde esta masa vegetativa ME individuales opequeños grupos de éstos, se lavaron en una

gota de agua estéril depositada dentro de lamisma placa petri y se sembraron en placasde PDA acidificado (Fig. 3 B y C) y APSM(Fig. 3 D), incubándose a 22°C.

Finalmente, en el caso de que las coloniasestuvieran más limpias, libres de partículasde suelo tales como las formadas en bordes opliegues de la lámina de celofán (Fig. 4 A),se depositaron sobre un papel de filtro y uncolador y se lavaron exclusivamente conagua estéril por goteo. Bajo la lupa, con laayuda de un aguja enmangada se transfirie-ron ME individuales o pequeños grupos deéstos directamente a placas de APSM (Fig. 4B), incubándose a 22°C en oscuridad. Lascolonias libres de contaminantes se transfi-rieron a nuevas placas de PDA como cultivospuros (Fig. 5).

Fig. 4. Colonia de microesclerocios limpia recuperada de un pliegue en la lámina de celofán (A); Transferencia degrupos de microesclerocios de la colonia anterior lavado con agua esterilizada a placas de APSM (B).

Comparación de la eficacia cuantitati-va de los medios APSM y APSM-celofán.

Además de la metodología descrita parala obtención del agente del suelo, se evaluóla eficacia del medio APSM con celofán(APSM+C) para determinar la densidad deinoculo de V dahliae en el suelo tras la apli-cación del método del tamizado húmedo.Para ello se realizó un experimento de com-paración de análisis cuantitativo de estemedio con el medio normal APSM, sin lámi-na de celofán. Los objetivos fueron estudiarla posible influencia de la fuente de carbonoadicional (celofán) en la estimación delagente en el suelo y evaluar la posibilidad decuantificar y aislar al agente de la muestracon la aplicación de un sólo proceso.

Para ello se procesaron 8 muestras desuelo (muestras 1-8, Tabla 1) mediante tami-

zado húmedo. A continuación, de la soluciónde los residuos retenidos en el tamiz de 35¡xm para cada muestra, se sembraron alícuo-tas de 1 mi sobre los medios APSM yAPSM+C, con 10 repeticiones por medio ymuestra. Las placas se incubaron a 22°C y elconteo de colonias se realizó bajo lupa a los14 días de incubación.

Caracterización morfológica de los ais-lados de suelo en APSM.

Los aislados de V. dahliae obtenidosmediante el método de siembra en APSM+Cse caracterizaron morfológicamente median-te las medidas de longitud y anchura de losME de las colonias formadas en APSM (Fig.6). Para ello, se sembró cada aislado enAPSM y las placas se incubaron como se hadescrito hasta la aparición de las colonias de

Fig. 5. Cultivo puro de V. dahliae en PDA acidificado (A): Conservación de aislados de suelo en tubos de estría dePDA acidificado con aceite de parafina (B).

Fig. 6. Mediciones de longitud y anchura de microesclerocios de un aislado de suelo de V. dahliae realizados con elprograma AnalySIS (Soft Imagin System) por fijación de una imagen microscópica captada por una cámara de video

(Kappa).

ME del agente. De cada aislado, se seleccio-naron 3 colonias al azar, de las que se hicie-ron 6 preparaciones microscópicas (2 porcolonia) empleando fucsina acida en lactofe-nol. Las colonias escogidas tenían el mismotiempo de incubación y las transferencias serealizaron tomando porciones de agar delcentro y de la periferia de las colonias paraevitar diferencias morfológicas entre micro-esclerocios con diferente grado de madurez,o coalescencias entre dichas estructuras. Decada aislado se midieron la longitud, anchu-ra y relación longitud/anchura (L/A) de untotal de 200 ME por aislado (65-70 ME porcolonia). Para ello se usó el programa analí-tico de imagen AnalySIS (Soft Imaging Sys-tem), conectado a un microscopio NikonOptiphot a través de una video cámara(Kappa) (Fig. 6). Estos valores se compara-ron con los parámetros morfológicos de dos

aislados control de la micoteca del Laborato-rio de Patología Vegetal (Universidad deCórdoba) correspondientes a los patotiposdefoliante (D) (aislado VI17) y no defolian-te (ND) (V4) de V dahliae, que se incluye-ron también junto al resto de los aislados.Los valores de longitud, anchura y longi-tud/anchura de los ME se analizaronmediante el análisis de varianza, utilizandoel programa Statistix 4.1 (ANÓNIMO, 1994).

RESULTADOS

Densidad de inoculo de las muestras ycomparación de la eficacia cuantitativa delos medios APSM y APSM+C

El análisis cuantitativo de las muestras desuelo mediante el procedimiento del Tamiza-do Húmedo y siembra en APSM mostró unagran variabilidad en las densidades de inócu-

Tabla 1. Densidad de inoculo (DI) de Verticillium dahliae de muestras de suelo procedentes de diferentescampos procesadas en Agar Polipectato Sódico Modificado con celofán (APSM+C) o sin celofán (APSM).

Muestra yreferencia

1 Corchuela92 Corchuela 153 Corchuela 214 Corchuela 225 Piedras Altas6 La Vega7 Batán8 Alburquerque9 Corchuela 2

10 Corchuela 411 Corchuela 612 Santana13 Deh. Algarín14 M. Guillen15 Almodóvar

Procedencia

S.J. Rinconada (Sevilla)S.J. Rinconada (Sevilla)S.J. Rinconada (Sevilla)S.J. Rinconada (Sevilla)Marinaleda (Sevilla)Nac. Zambra (Córdoba)Ecija (Sevilla)La Carlota (Córdoba)S.J. Rinconada (Sevilla)S.J. Rinconada (Sevilla)S.J. Rinconada (Sevilla)Espeluy (Jaén)Lora del Rio (Sevilla)JaénAlmodóvar (Córdoba)

Textura

Franca-arcillosa-Franca-Franca-arcillosaFranca-arcillosa-limosa--Franca-arcillosa-arenosa-Franca-arenosaFranca-arcillosaFranca-Franca

a La densidad de inoculo, expresada en microesclerocios por gramo de suelo seco, se determinó por el método del tami-zado húmedo utilizando placas de Petri con APSM+C o APSM. Valores en filas seguidos por letras diferentes fueronsignificativamente diferentes a un nivel de probabilidad de P=0.05 de acuerdo al Test de Mínima Diferencia Significa-tiva Protegida de Fisher.

lo de las muestras escogidas desde 54,0 hasta1,2 ppg de suelo como se refleja en la Tabla 1.

De los análisis de textura disponibles dealgunos suelos (Tabla 1) se observa que lasdensidades de inoculo más elevadas corres-pondieron a suelos de textura franco-arcillo-sa (muestras 1 y 5) o franca (muestras 3, 13y 15), mientras que aquéllas más bajas seidentifican con suelos que presentan algúncomponente arenoso (muestras 9 y 11).

En los 8 suelos analizados mediante elmedio APSM+C , V. dahliae fue detectado,en tanto que en 2 de ellos no lo fue median-te el medio APSM. La densidad de inoculoobtenida por APSM+C fue superior o similara la detectada mediante APSM (Tabla 1).

Obtención de cultivos puros del pató-geno

El método de aislamiento de V. dahliae demuestras de suelo utilizando APSM+C resul-tó eficaz para recuperar cultivos puros deeste agente de una amplia gama de suelos dediferentes características y procedencias

(Tabla 1). Se han obtenido 28 aislados de las15 muestras de suelo utilizando APSM+C.Para las 8 primeras (muestras 1-8, Tabla 1),tras su recogida se compararon simultánea-mente, a partir de la misma submuestra, losmedios APSM y APSM+C para la determi-nación cuantitativa de la DI. En las 7 restan-tes (muestras 9-15, Tabla 1), el medioAPSM+C sólo se utilizó para la obtención deaislados, aunque en el momento de ser reco-gidas se determinó igualmente su DI enAPSM (Tabla 1).

En conjunto, el proceso de aislamientodel hongo a partir de las colonias recupera-das de APSM+C no fue excesivamente difi-cultoso, ya que el método permitió la elec-ción de aquéllas colonias más desarrolladas,con mayor número de ME, y más libres departículas de suelo. Estos dos aspectosaumentaron la eficacia de los posterioreslavados de la colonia y el éxito de obtenciónde un cultivo puro sin contaminación duran-te las transferencias. Sin embargo la detec-ción de colonias bajo la lupa fue más labo-

Fig. 7. Detalles de la morfología de microesclerocios alargados (A, B, C), ovalados (D), redondeados (E, F), esféricos(G) y redondeados o esféricos con proyecciones (H) (tamaño de barra de escala = 50^m).

riosa que en el método cuantitativo normal,ya que la observación se debió realizar sinretirar de la superficie de las placas la canti-dad de suelo sembrada tras el tamizadohúmedo. En cualquier caso el celofán favo-reció que las colonias de V dahliae formadaslo hicieran con un buen desarrollo, típica-mente estrelladas y con un elevado númerode ME. En los casos en los que se detectaroncolonias con bajo número de ME, poco desa-rrolladas o en las que pudiera existir algunaduda por su similitud con propágulos o mis-celáneos de otros hongos, éstas fueronrechazadas.

No se realizó un estudio detallado paradeterminar la frecuencia de éxito en laobtención de un aislado puro en relación algrado de contaminación de las colonias y/oal número total de colonias de V dahliaedetectadas en cada muestra. Aún así, la fre-cuencia general de purificación fue elevadacuando se partió de colonias escogidas pre-viamente por su limpieza y tamaño. Comoejemplo, de la muestra Santana se escogie-ron 7 colonias de las placas iniciales deAPSM+C y se obtuvieron 6 aislados de Vdahliae.

Cada uno de los aislados finalmente trans-feridos a PDA en cultivo puro constituyenaislados monoesclerociales, ya que procedende una sola colonia desarrollada sobreAPSM+C, asumiendo que sobre la superficie

de este medio cada colonia se ha desarrolla-do a partir de la germinación de un microes-clerocio individual de la muestra.

Caracterización morfológica de los ais-lados de suelo en APSM.

Los resultados muestran que existierondiferencias significativas en los valores mor-fológicos de los ME producidos sobreAPSM de los aislados V4 (ND) y VI17 (D)de la colección del Laboratorio de PatologíaVegetal de la ETSIAM, Universidad de Cór-doba (Tabla 2). La relación L/A media fue de2.92 para el aislado no defoliante y de 4.06para el defoliante. Esta relación, junto a losvalores de longitud y anchura por separadoreflejan que el aislado D (VI17) produce enAPSM, ME mucho más alargados y demayor tamaño en términos de superficie pro-yectada, que los formados por el ND, queson más redondeados y de tamaño compara-tivamente menor. Los coeficientes de varia-ción de estos parámetros fueron similarespara estos aislados.

La morfología de los ME de aislados de Vdahliae obtenidos del suelo varió considera-blemente en este medio de cultivo, desdevalores de L/A de 5.15, correspondiente a losmás alargados, hasta valores de 1.61, a losesféricos. En la Tabla 3 se han clasificadosegún su forma atendiendo a los intervalosde dicha relación en: alargados con valores

superiores a 4 (Fig. 7 A-C), en los que sehalla incluido el aislado D, VI17 (Tablas 2 y3); ovalados, de 3 a 4 (Fig. 7 D); redonde-ados, de 2 a 3 (Fig. 7 E-F), en el que se inclu-ye el aislado ND, V4, y que constituye elgrupo más numeroso; y esféricos, de 1 a 2,que suelen además coincidir con los demenor tamaño (Fig. 7 G). En cualquier caso,esta clasificación es orientativa, ya que,incluso dentro de cada grupo, se incluyenaislados con diferencias estadísticamentesignificativas respecto a la relación L/A(Tabla 3).

También se ha considerado la regularidadde los ME, denominándolos homogéneos, oirregulares en los que están presentes pro-yecciones o agrupaciones celulares melani-zadas cortas que unen el cuerpo del ME conel micelio hialino (Fig. 7 H).

Los resultados reflejan que hay diferen-cias morfológicas importantes entre los MEde aislados obtenidos de la misma muestrade suelo. Así, los 6 aislados de la muestra 12presentaron entre ellos gran variabilidadmorfológica dentro del mismo suelo, varian-do en términos de L/A desde 2.14 (aislado31) a 5.15 (aislado 29), clasificados comoredondeados y alargados, respectivamente.Igualmente, de cada una de las muestras 5, 7ó 10 se obtuvieron aislados de diferentestipos morfológicos (Tabla 3).

Por el contrario también se procesaronmuestras cuyos aislados no presentaron dife-rencias en relación con los tipos morfológi-cos descritos. Así, los 3 aislados obtenidosde la muestra 15, mostraron característicasmorfológicas similares, presentando micro-esclerocios esféricos, que fueron homogéne-os o irregulares, aunque existieron diferen-cias estadísticas significativas entre ellos res-pecto a la relación L/A. Lo mismo ocurriócon los 3 aislados procedentes de la muestra1, y los 3 de la muestra 4, clasificados todosellos como redondeados, aún existiendodiferencias significativas entre aislados deambas muestras y los pertenecientes a lamisma muestra.

DISCUSIÓN

El método de obtención de aislados desuelo de tf dahliae descrito ha resultado engeneral efectivo para una amplia gama desuelos. Esta técnica supera las dificultadesdescritas por DE VAY et al. (1974) en laobtención de aislados de suelo, e incrementaconsiderablemente los resultados de otrosautores que han expresado la dificultad deaislar el patógeno del suelo, e incluso laimposibilidad de obtenerlo de algunos suelosa pesar de haberlo cuantificado en ellos(BEJARANO-ALCÁZAR, 1990). El papel celo-

Tabla 2-Parámetros morfológicos de los microesclerocios de colonias desarrolladas enÁPSM de los aisladosdefoliante (VI17) y no defoliante (V4) de Verticillium dahliae.

Aislado Colonia

a Las cifras indican medias de los valores correspondientes a 200 microesclerocios del total de las 3 colonias (entre 65y 70 por colonia). Los valores en cada columna seguidos por letras diferentes fueron significativamente diferentes aun nivel de probabilidad de P=0.05 de acuerdo al Test de Mínima Diferencia Significativa Protegida de Fisher.

Tabla 3. Parámetros morfológicos de los microesclerocios de colonias desarrolladas sobre ÁPSM de aisladosde Verticillium dahliae obtenidos directamente de las muestras de suelo.

a Los valores son media de 200 microesclerocios de los aislados obtenidos de suelos naturalmente infestados, salvo losaislados V4 y VI17 que provienen de suelos infestados artificialmente. Los aislados se clasificaron según los inter-valos de la relación Longitud/Anchura en alargados (A), >4; ovalados (O), 3-4; redondeados (R), 2-3; esféricos (E),1-2; y según la ausencia o presencia de proyecciones celulares de los microesclerocios, en homogéneos (H) o irregu-lares (I).

" Valores en columnas seguidos por distintas letras fueron significativamente diferentes a un nivel de probabilidad deP=0.05 de acuerdo al Test de Mínima Diferencia Protegida de Fisher.

fan, usado extendiéndolo sobre placas dePDA para la producción artificial de ME deeste patógeno (MWANZA, 2000; DAVID et al,

1979; TJAMOS y FRAVEL, 1995), proporciona

además una fuente de carbono adicional parasu crecimiento ( D E VAY et al, 1974; TAL-BOYS, 1958; TAYLOR, 1969). En nuestro caso,

usando el medio APSM, las características

Santana EspeluyPiedras Altas MarinaledaM. Guillen JaénSantana S.J. RinconadaColección CórdobaSantana EspeluyBatán ÉcijaCorchuela 4 S.J. RinconadaColección CórdobaCorchuela 9 S.J. RinconadaAlburquerque La CarlotaSantana EspeluyCorchuela 22 S.J. RinconadaCorchuela 2 S.J. RinconadaLa Vega Nac. ZambraCorchuela 9 S.J. RinconadaCorchuela 22 S.J. RinconadaSantana EspeluySantana EspeluyPiedras Altas MarinaledaCorchuela 9 S.J. RinconadaPiedras Altas MarinaledaCorchuela 22 S.J. RinconadaAlmodóvar AlmodóvarCorchuela 6 S.J. RinconadaCorchuela 4 S.J. RinconadaDehesa Algarín Lora del RioBatán ÉcijaAlmodóvar AlmodóvarAlmodóvar Almodóvar

físicas del papel de celofán empleado permi-ten el crecimiento del hongo sobre éstedurante al menos 14 días de incubación sinproducir su degradación (MWANZA, 2000;2001), lo que permite fácilmente elegir yrecuperar las colonias de ME sin agar adhe-rido, que es una de las principales fuentes decontaminación en el proceso de repicado.

El método permite escoger aquellas colo-nias mejor formadas y más limpias de partí-culas de suelo y/o otros hongos contaminan-tes, por lo que la eficacia de purificación delun aislado aumenta considerablemente. Dela misma forma, es también convenientecomenzar las observaciones bajo lupa a par-tir de los 6-8 días tras la siembra, antes delperiodo de incubación prescrito para el aná-lisis cuantitativo normal (14 días). Esto evitaun excesivo crecimiento micelial de las colo-nias de microorganismos contaminantessobre las colonias de microesclerocios de V.dahliae que ya se hayan formado.

La densidad de inoculo, la textura y lacomposición biológica del suelo podrían serlos parámetros más influyentes en la eficaciadel método para obtener aislados puros. Enrelación con la cantidad de hongo en elsuelo, el número de aislados obtenidos encultivo puro mediante este método es limita-do, ya que no es posible procesar algunas delas colonias detectadas sobre el celofán, aun-que parece razonable que sea representativode al menos aquellos aislados que estén pre-sentes en mayor número en la muestra.Cuanto mayor sea la densidad de inoculo,mayor será la probabilidad de detectar colo-nias del agente, igual que en los métodos decuantificación normal, y de éstas se podránprocesar las más adecuadas. La textura delsuelo influye en el tamizado, en la capacidadde detección del método cuantitativo, y en elproceso de limpieza de la suspensión pararecuperar los aislados. Por último, la compo-sición microbiana de la muestra influyedirectamente en los procesos de competenciaque ocurren durante el crecimiento de V.dahliae sobre la lámina de celofán, ya queeste agente no tiene un crecimiento saprofí-tico comparable con el de otras especies

como Fusarium, Aspergillus, Gliocladium oPenicillium, que crecen habitualmente sobreAPSM (Barrón- Ruiz de Viana, datos nopublicados).

Algunos estudios indican que la morfo-logía de los ME producidos por V. dahliaeen determinados medios de cultivo podríaestar relacionada con la virulencia del aisla-do. Así en Agar Agua los aislados D produ-cen colonias en las que aparecen mezclas deME alargados y redondeados, y sólo redon-deados cuando se trata de aislados ND(BEJARANO-ALCÁZAR, 1990; BLANCO-LÓPEZet ai, 1985; SCHNATHORST y MATHRE,1966). La composición del medio o sustra-to sobre el que crece el hongo parece influirsobre la morfología de los ME y, de hechoesta característica ha servido para estable-cer, al menos preliminarmente, el patotipodel aislado (BEJARANO-ALCÁZAR, 1990).Sin embargo, tales relaciones deben sercorroboradas a posteriori mediante pruebasbiológicas de patogenicidad o análisismoleculares.

En particular, en el Dpto. Agronomía de laUniversidad de Córdoba, el método del tami-zado húmedo y el medio de cultivo APSM seemplean habitualmente en las investigacio-nes de epidemiología y control de la Vertici-losis del Olivo desarrolladas los últimos años(LÓPEZ-ESCUDERO, 1999; LÓPEZ-ESCUDERO yBLANCO-LÓPEZ, 2000; LÓPEZ-ESCUDERO etal, 1995; 2000; MWANZA y BLANCO-LÓPEZ,2000). Por ello resultan de interés en nuestrocaso, las diferencias morfológicas consis-tentes que hemos observado sobre APSMentre los aislados de referencia V4 y VI17correspondientes, respectivamente, a lospatotipos ND y D. En anteriores estudiostambién se ha observado que el aislado VI17(D) suele producir sobre APSM coloniasmás grandes en diámetro que el V4 (ND),con formas estrelladas más completas, y conME alargados, en tanto que el V4 formamayor proporción de ME redondeados. Aúnasí, también se ha observado con cierta fre-cuencia colonias mixtas en relación con laforma de sus ME con una alta proporción depropágulos ovalado-irregulares. En resumen,

el aislamiento directo de V. dahliae del suelopor la metodología descrita es una técnica defácil aplicación, especialmente para técnicoshabituados al estudio de hongos de suelo.Esta técnica puede mejorar el método delTamizado Húmedo empleado por algunosgrupos habitualmente en las investigacionessobre epidemiología y control de la Vertici-losis del Olivo. Además su uso puede ser deespecial utilidad para los estudios de etiolo-gía, variabilidad y virulencia de V. dahliae en

el suelo, fundamental para el establecimien-to de niveles de riesgo y sistemas de controlpreventivo de las Verticilosis.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado por el Pro-yecto AGF97-0546 de la Comisión Intermi-nisterial de Ciencia y Tecnología (CICYT) ypor el Proyecto QLRT-1999-1523 del V Pro-grama Marco de la Comisión Europea.

ABSTRACT

LÓPEZ-ESCUDERO F. J., D. NÚÑEZ-SANTOS, M. A. BLANCO-LÓPEZ. 2003. Isolation ofVerticillium dahliae from soil and morphologic characterization of its microsclerotia.Bol. San. Veg. Plagas, 29: 613-626.

In this work it is described a methodology to facilitate the pathogen isolation fromsoil samples. After processing a sample by wet sieving, aliquots of the resultant suspen-sion are sowed onto plates of Modified Sodium Polipectate Agar media (MSPA) coveredby a cellophane film. Colonies of Verticillium dahliae microesclerotia formed over thecellophane are recovered removing little squares that contain them. Colonies are washedby shaking, using an ultrasound bath and sieving then trough a filter connected to a pres-sure vacuum pump. The resultant residue is sowed onto new plates of MSPA, PDA orPDA acidified, where colonies grown free of contaminants and they can be transferred topure cultures. Therefore, a collection of soil isolates of this pathogen has been obtained,and their microesclerotia formed onto MSPA have been morphologically characterized.Values of the relation length/wide of individual microsclerotium have been compared tothose of microsclerotia formed in the same media by two reference isolates, V117 (defo-liating) and V4 (non-defoliating). Results show a wide range of this parameter in soil iso-lates, but also consistent differences of this relation between microsclerotia formed by thereference isolates. It is concluded that morphologic characteristics of microsclerotia onthis media might be connected with the pathotype of the isolate, as reported by other aut-hors using other culture media. This possibility could provide an important informationsimultaneously to the process of determination the inoculum density of V. dahliae in asoil sample. The recovery of soil isolates of Verticillium dahliae directly from the soil isnecessary to understand the ecology and virulence of the populations of this pathogen,and to design preventive strategies for controlling the disease it causes. This aspect is par-ticularly important to control the spreading of defoliating pathotype to new areas.

Key words: defoliating and non-defoliating isolates of Verticillium dahliae, soil iso-lation, morphologic characterization, microsclerotia.

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(Recepción: 12 febrero 2003)(Aceptación: 23 abril 2003)