JNOMBRE: MARIA DE LA PAZ ALEJANDRA GONZALEZ PAREDES

MATRICULA: 92346471

TELEFONO 6394130

J LICENCIATURA: BIOLOGIA EXPERIMENTAL

J DMSION: CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

UNIDAW: ETAPALAPA

TIUMESTRE 99-P

NOMBRE DEL PROYECTO: ESTUDIO COMPARATIVO DE LA INTERACCIÓN DE

CATIONES CON LIGANDOS IMODELO Y PROTEiNAS DE MEMBRANA RELACIONADAS CON EL METABOLISMO

VECTOlRIAL.

ESTUDIO COMPARATIVO DE LA ESTRUCTURA TRANSMEMBRANAL DE PROTEINAS TIPO ANTiPORT SODIOPROTÓN DE TRES OIRGANISMOS DEL ORDEN

RODENTIA.

J TITULO DEL TRABAJO:

LUGAR:: LABORATORIO DE BIOFíSICA MOLECULAR (S-25 1) AREA DE BIOQU~MICIA, BIOFiSICA Y FISIOLOGIA CELULAR DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA

DIVISION DE CIENCLU BIOL~GICAS Y DE LA SALUD

FECHA DE INICIO 1 DE AGOSTO DE 1998

J FECHA DE TERMINO: 7 DE MAYO DE 1 9 9

CLAVE: BE.014.98

/NOMBRE DEL ASESOR DR. RAIÚL ALVA GARCIA PROFESOR TITULAR B, TIEMPO COMPLETO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD

vo. @@SOR O1 MA. NZALEC PAREDES DR. RAlbL VA GARCIA

INTRODUCCION El transporte vectorial de iones es realizado por proteínas membranales (Kotik1983). Este fenómeno es necesario para la regulación de diferentes procesos biológicos. L o s primeros reportes sobre el aislamiento de translocadores antiport de naturaleza proteica se remoentan a fmales de la década de 1970 (Martin y col., 1984). En mitocondria se han detectado dos translocadores antiport Na' como K' (Jezek y col., 1990; Kakar y col; 1989); la función fisiológica asociada a este Último es mantener el volumen homeostático de las mitocondrias y sus propiedades se han descrito sólo en mitocondrias intactas; se ha identificado una proteina de 82 Kd comola responsable de esta actividad (Martín y col., 1989); la función fisiólogica asociada a este últimio es mantener el volumen homeostático de las mitocondrias y sus propiedades; se han descrito sólo en mitocondrias intactas; se ha identificado una proteína de 82 Kd como la responsable de esta actividad (Mart& y col., 1984). Una proteína similar se encarga de cumplir con la actividad en fibroblastos e, incluso, otra proteina isoforma, sencible a gluuxorticoides, en células de ileón (Yun y col., 1993). Se ha encontrado otro translocador antiport Na+'H+ en Escherichia coli, con dos variedades: "A-a y

Si bien se conocen los mecanismos de i:egulación, negativo ante la presencia de amiloruro y positivo con diferentes factcires de crecimiento, y se ha propuesto un modelo estructural del traslocadores antiport Na+/H+ por medio de técnicas de biología inolecular y bioquímica (Sardet y col, 1989) , aún no se ha establecido c1 mecanismo físico y químico de traslocación iónica promovida por el t r a n s l d o r antiport N'M'. Para estos &es es necesario dilucidar la naturaleza y estructura de los sitios de unión, activo y cataiítico, así como determinar 11% variedades de estado que regulan su funcionamiento. Por otro lado, en estudios sobre el transporte iónico, reaiizados en sistemas modelo, se ha observado que 1 a tras180cación de especies polares de una fase líquida acuosa (líqa) a una fase líquida oirgánica(líqo) implica la sustitución de la esfera de hidmtación del catión, por una esfera de coordinación ad hoc hidrófoba (Dworak y co1.,1991). La fuerza que impulsa a un catión metál.ico, en fase acuosa, a solvantarse en una fase orgánica es el potencial químico (n) del mismo catión (Estrada-O., 1983). Las fuerzas que se oponen a la solvantación de especies polares en fases orgánicas son relacionadas con las propiedades hidrófobas de estas últimas (vgr.: dielectricidad, hidrofobicidad, baja polmidad, etc.). El fenómeno de traslocación iónica a través de membrana lípidicas es un proceso coni3rmando por una serie de eventos ligados en secuencia (Mitchell, 1961), gobernados por variables de estado interrelacionadas pero independientes entre sí. Sin embargo, el conjunto de todas eilas contribuye a la regulación tina de la selectividad iónica observada en el metabolismo celular (Taylor y col., 1982; Alvay col., 1992).

NHA-b ( Piruier y col., 1993).

1

A la fecha, son escasas las evidencias experimentales referentes al orden en el que las variables termodinámicas regulan los eventos fisicoquímicos de la transferencia de especies polares entre interfaces líqa-líqo, relacionadas con la traslocación en sistemas biológicos. En este sentido, se ha sugerido quc: las interfaces pueden servir como aproximación experimental a la superfiicie de la membrana biológica (Girault y SchiffnR 1989;Vanysek, 1990).

Los perñiea de interacción ¡ónice de las ionóforos püotearea. La revisión de los datos publicados pamite comenzar a estructurar un esquema poco más mónico, aunque aún parcial y limitado, que se espera pueda ser ampliado y arreglado sistemáticamenw posterionnente. Se puede sugerir que la estabilidad de los complejos (Ks) es proporcional a la carga iónica qi del metal, ya que el log Ks de los complejos monovalentes suele aumentar con la exposición de la carga eléctrica nuclew; esto bien puede explicar lo pequeilo de las Ks determinadas para los cationes polivalentes. Segundo, la estabilidad es varios órdenes de magnitud mayor conforme sé incrementa el número de átomos liganits (Q) en la molécula y, por lo mismo, la fuerza de la atracción electrostática polar entre ligante y ligado. Y, tercera, la estabilidad parece disminuir cuando aumenta el radio iónico(ri) del metal ligado. Se puede resumir, este modelo verbal de “quelaticidad”, en la expresión preliminar

LOS experimentos de transporte, tanto en sistemas naturales como artificiales, se ven complicados por la participación cle todas las reacciones individuales que constituyen fenómeno general. La falta de correlación entre estos modelos experimentales pone en evidencia el hecho de que la formación del complejo es sólo una de toda la serie de reacciones químicas y fisicas que constituyen al proceso del transporte catiónico mediado por poliéteres carboxílicos. Las observaciones experimentales conducen dmctamente a proponer un modelo general para el flujo o traslocación cle cationes metálicos mediado por los poliéteres monocarboxilicos tipo nigericina, el cual se puede fonnular como el producto de varios factores:

Ji a Q H i n , p L , ai, Bei, E"¡, Ti, pi, [Alrn, FA, p.4, Ks, CpL, DL, p, Kd)

El valor del pH microambiental adyacente a la membrana @Hm) afecta la disociación del p p o carboxiio del poliéter, lo que depende de suconstante de acidez @Ka); la información existente sugiere que la molécula protonada es más afín que la aniónica por el metal (Toro y cols. , 1987). La alta concentración quimica del catión (ai) induce su uniáa a la molécula ligante en la interface membrana-agua; ésta depende factores intrínsecos del m a como su afinidad electrónica (:a), potencial de reducción (Eo¡), radio (Ti) y carga iónicas (Si). Sí, a su vez, la concentración del acarreador en la membrana([A]m) es suficiente, es posible que varias moléculas se aglomeren ( Toro y cols., 1987; Ballardini y cols., 1992; Chattopadhyay y cols., 1992;Lyazghi y cols., 1992d), en función de su flexibilidad (FA) y polaridad (PA), alrededor del catión en función del pH interfasial originando un oligómero conductor.Una vez formado el complejo poliéter-metal, lo que depende de est,abilidad (Ks), éste debe solubilimse (Maxwell y cols., 1992) en la fase orgánica (CPL) para poder difundk (DL), a favor del gradiente químico del catión, a través de las cadenas lipídicas de la matriz hasta el otro extremo de la membrana; en este caw es importante la polaridad del en medio membranal (w).Cuando el complejo se encuentra en la interface, la molécula se disocia (Kd) del catión que se solubiiiza en el medio BCUOSO.

Así, el poliéter libre difunde de vuelta para completar un ciclo de transporte. La anterior es una primera aproximación que busca llegar a describir de forma integral y sistématica al proceso global de la traslocación iónica faciii- inicialmente, acarreadores modelo. El propósito de este proyecto es proceder con la integración de cada una de las variables o parámetros descritos en un sistema hoíístico que permita alcanzar la descripción y comprensión del funcionamiento de los sistemas de acarreadores antiparalelos membranales proteicos presentes en los seres vivos.

OBJETIVOS OBJEiTVO GENERAL

El objetivo general del presente proyecto es generar un modelo de los factores fisicoquimicos ambientales y de estructura molecular de los ionóforos proteicos, para correcionarlo con la selectividad y los mecBnismos de traslocación iónica en los seres vivos.

7

OBJETIVOS ESPECIFICOS Comparar la estructura transmembranal de tres antiports sodio/protón de roedores para construir un modelo que contribuya a dilucidar el mecanismo de acción ionoforéiica de este translocador antipori. Identificar los dominios relacionados con los eventos que se presentan durante la traslocación catali;mda de especies polares a través de membranas biológicas.

a.

b.

METODOLOGIA

Predicción de la estructura

Fue realizada en uno de los métodos más novedosos para la predicción por computadora de la estructura semndaria es el sistema PHD (la abreviatura en inglés de Prediction of Heildelberg) en red neuronal, con un alineamento múltiple de secuericias, almacenadas en los archivos de HSSP(ia abreviatura de homology derived Seconhty Structure Prediction) fue llevada a cabo por el programa MaxHom. Para predecir la estructura secundaria del translocador antip~~t, se utilizó el algoritmo PHD, propuesto por Rost y Sander (1 994). Este método utiliza una red neuronal, esto es un paquete de software que es

capaz de establecer un procesamiimto en paralelo, se basa en un conjunto de subrutinas y programas que se ejecutan de manera individual ea paralelo, se basa en un conjunto de subrutinas y programas que se ejecutan de manera individual en paralelo y diferentes niveles, con diferentes vías de comunicación entre ellas. El sistema depende de un conjunto de 95% para establecer cada aminoácido del conjunto en la conformación más probable (helicoidal, extendida, giro o irregular). La metodología incluye una búsqueda de secuencias, con diferentes grados de homología, su alineamiento múltiple de secueni:ias, y el análisis de variabilidad en cada una de las posiciones de las secuencias.

El archivo de salida incluyó la predicción de cada residuo en la secuencia y colacionar con algunas de las conformaciones mencionadas, la accesibilidad a la solvente predich,a para cada aminoácido, y la confiabilidad de ambas predicciones (Rost y Sanders, 1994).

Fredicciidn de la topologia de Iiw regwnes transmembranales La predicción fue realizada por PHD, versión 1.0, se utilizó una base de datos HSSP con 40292 secueniias almacenadas (Rost y Sander, 1993a), a través de la red INTERNET con una computadora Pentium I a 200 MHz (Tablas anexas). Este sistema utiliza una red nr:uronal usando para comparar y analizar de

manera simultánea diferentes secuencias y m c t u r a s , con diversos grados de homologia almacenadas en si base de datos, encontrando las distintas secciones homólogac; y estableciendo los posibles acomodos de las regiones en el espaciio y sus estructuras mAs estables, así como el grado de homologia que ]presenta con otras proteínas similares. Esto último, nos provee del concepto de coeficiente de variación, un indicador con el cual se determina la tasa de cambio, observada en las posiciones de cada uno de los residuos en la secuencia. En este indicador se consideraron los siguientes puntos: la conservación de residuo en la cadena analizadas, las diferencias entre el residuo original y el residuo sustituyente. La red es capaz. de predecir 2 estados helicoidales de las regiones transmembranales y estar dos unidades de análisis de salida Esta predicción es asignada de acuerdo ai valor de la unidad de salida en forma descendente. Con base en los valores de las unidades de salida se estableció el coeticiente de variación que es una forma de estimar los cambios que aparecen en las diferentes posiciones de los residuos, de acuerdo con los resultados del análisis de alineamiento múiltiple de las secuencias. Los valores se “castigan” según sea el número de cambios, las caracteristicas de aminoácido cambiado( de poEar a no polar, neutro a polar o no-polar, neutro a cargado, de positivo a negativo y viceverria en cualquiera de los casos). El mínimo valor es cero y representa una variación nula respecto a las secuencias de las diferentes cadenas polipetídicas seleccionadas, en mayor valor posible es de 99 y representa una cambio total del residuo en la secuencia (Rost y Sanders, 1993). El parámetro utilizado para estimar el acomodo de los segmentos

transmanbranales detenninm las cargas eléctricas que presenta las secciones polares que unen a los segmentos tranmembranales. El costo energético par hacer cruzar una carga eléctrica través de una bicapa lipídica es muy alto como para permitir el paso de gran cantidad de estas en un segmento polar, al tomar su arreglo una proteína anfipática en la membrana Si hay pocas cargas eléctricas presentes, es posible considerar que esta sewión atraviesa la membrana y se lodiwt en el exterior de la célula

Por el contrario, cuando una sección atraviesa la membrana y se localiza en el exterior de la célula. Por el contrario, cuando una sección posee una gran cantidad de cargas (msS de 3 grupos cargados eléctricamente) inducen a pensar que esta sección permanece en el compartimento interno o matiz intracelular (Bookstein, 1997). La predicción del estado confonnacional de cada residuo en una secuencia se calculó de la siguiente manera: para cada residuo se realizó una evaiuación de cada uno de los cuatro estados conformacionaies con una ecuación (esos cuatro estados son hélice-a, hoja p extendida, giro p y un estado aleatorio indefinido) validos para este método. La ecuación se resolvió considerando la influencia de 8 residuos antes y después de cada aminoácido estudiado. Para cada estado confo-ionai se da una constante decisiva(c.d.), la cual se sustrae del resultado de la ecuación. Er;ta constante es un parámetro ajustable escogido con la intención de obtener la predicción óptima. Una vez que se calcularon las cuatro ecuaciiones se han calculado, el estado de conformación para el residuo estudiado, se selecciona de acuerdo al el valor más alto obtenido. La calificación dada a cada uno de los segmentos transmembranales (transmembranales, globulares, de superficie, etc.) se baso en Ila comparación del anáiisis de las cwacteristicas de los residuos de los segmentos predichos en la proteína estudiada con un algoritmo usado para determinar la estructura secundaria en proteínas solubles en agua, así que fue posible que los resultados del ensayo estab1ezc:an como globulares a alguna región de la secuencia, aún cuando sea establecida como transmembranal por otros sistemas de anáiisis. Todos los estudios fueron realizados en una computadora Pentium I a 200 MHz..

Estructura secundaria L,a predicción de los tipos de estructura secundaria (hélice-u y cadena

aleatoria) se llevó a cabo por medio del método en red neuronal (PHD) y siguió esta serie de pasos:

[l) Predicción de los segmelntos transmembranaks. Una ventana de 21 residuos se mantiene a lo largo de la secuencia de la proteína, generando una serie sucesiva de segmentos 21 residuos cuya hidrofobicidad <H>, la cual asigna un valor de hidrofobicidad a cada tipo de aminoácido. Pmi determinar cuales de los segmentos corresponden a hélices a transmembranaies, se implemenia~on los siguientes pasos:

.

a) Se eliminan todos los segmentos cuya carga hidrofóbica <H> sea menor a 0.42.

b) Se selecciona al “candiclato” a partir de los segmentos restantes, considerando siempre el valor <H> más alto presente y se descalifica a cualquier segmento con mhs de un residuo en común con el candidato.

c) Se repite el paso anterior hasta que todos los segmentos restantes hayan sido escogidos o descariados.

Todos los candidatos serán descartados a menos que:

a) Haya al menos un candidato con una <H> mayor o igual que 0.68 o

b) Haya dos candidatos, los cuales al s u m a sendas <H> el resultado sea igual a mayor que 1 . 1 .

Si cualquiera de estos dos C I ~ O S ocurre, todos los segmentos candidato se les considera posibles segmentos transmembranales. [ 21 Caracterización de los segmentos bansmembranales predichos,

asociados a hélices. Para producir una clasificación, este método uso un grXico del momemito hidrofóbico. Este procedimiento se le aplica a las hélices predichas de la siguiente manera: a) El análisis comenzó con una ventana 1 1 residuos a través de la

secuencia helicoidal. Ehtonces se generó un juego de ventanas sucesivas con los vallores de <H> y un valor del momento hidrofóbico <aeH>, donde u& se definió de esta forma: el valor del momento hidrófotkm. Hay tres regiones principales para los tipos de interacciones de las proteínas con la membrana: globular, de superficie y transmembranal. La mayoría de los segmentos transmenibranales helicoidales predichos se encuentran en la matriz de la membrana con algunas hélices ocasionales en la supeIficie y transmembranal. La mayoría de los segmentos transmenibranales helicoidaies predichos se encuentran en la matriz de la membrana con algunas hélices ocasionales en la supedicie. Las regiones trenSmembranaies se subdividen en dos clases: multiméricas y monoméricas.

7

La red predijo tres tiposi de estructura secundaria usando números reales a partir de las unidades de salida. La predicción fue obtenida por el alineado múltiple de la secuencia, seleccionando a partir de la asignación de la máxima unidad correspondiente. Sin embargo estos números contienen información adicional, pe. ej., la diferencia entre la máxima unidad de salida y el subsecuente valor es usado para calcular el índice de tanfiabilidad (Rost y Sanders, 1994).

ACTIVIDADES REALIZADAS

El presente proyecto tuvo una duración de 480 horas durante un período de seis meses, en el cual fueron realizadas diferentes actividades durante tres bmestres.

Primer bimestre

Obíuvieron las estructuras primarias de las proteinas antipori Na+/H+ de rata, ratón y hámster, dispontibles en los bancos de datos del Centro Nacional de información Biotecnológica de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos, vía Internet. Posterionnente se analizarán ]por medio de la computadora en el Laboratorio de Europeo de Biología Molecular, por el método de Predici Protein de Rost, vía Internet.

Segundo bunestre

Se compararon los datos obtenidos de cada una de las proteínas antipori Na+,’H+. Por otro lado, se identificaron 10s dominios transmembrauales y plasmáticos en la estructura secundaria de las proteínas estudiadas.

Tercer bimestre

Hubo un desarrollo de modelos de I:struWa-función de las proteinas estudiadas.

R

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

OBJETWO GENERAL El objetivo general del presente proyecto fue alcanzado, donde se genero un modelo de los factores fisicoquímicos ambientales y de estructura molecuim de los ionóforos proteicos, para correcionarlo con la selectividad y los mecanismos de traslocación iónica en los seres vivos.

OBJETIVOS ESPECIFICOS a. En este también se alcanzo, ya que se compararon las estructuras

banmembranales de tres antiporis sodio/protón de roedores donde se contribuyo ha tener un modelo para facilitar el mecanismo de acción ionoforética de este translocador antiport.

También fue alcanzado donde se identifico los dominios relacionados con los eventos que se presentan durante la traslocación catdizada de especies polares a través de membranas biológicas.

b.

METAS ALCANZADAS

Al tener las estructuras transmembranales de los antiporis Na+/H' de rata, ratón y hámster, se construyó un modelo general que sugiere sitios relacionados el mecanismo de acción inoforética de este acarreador. Se identificaron los dominios relacionados con los eventos que presentan durante el proceso de la interacción del acarreador con los cationes rnéialico5 y se contribuye a explicar la regulación de la translocación catalizada de especies polares a través de membranas biológicas. Por otro lado, ai integrar la infomiación obtenida de los estudios fisicoquímicos de los sistemas proteicos, se pudo observar que en ciertos segmentos de los " E l de mamíferos, la relación hidrofóbico/polar de los residuos está altamente conservada.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES El análisis estructural de los antiports NHE-1 estudiados hasta el momento propone los siguientes resultados.

En la primera secuencia de aminoácidos, comparando con ratón, rata y hámster se observa que, partir del aminoácido 16 al 32, la secuencia está altamente conse~~ada en rata y ratón. Por otro lado, en la secuencia 121 se observa que en las tres especies se conservan las secuencias, con una estnictura transmembranal bien definida, así como en la secuencia 61, pero difiere de la anterior en su alto carácter hidrofilico.

S3019H 121 IGFHVIPTISSIVPESCLLIWGLLVGGLIKGVGETPPPFLQSDVFFLFLLPPIILDAGYF P26431 121 IGFHVIPTISSIVPES~CLLIWGLLVGGLIKGVGETPPPFLQSDVFFLFLLPPIILDAGYF Q61165 121 IGFHVIPTISSIVPES~CLLIWGLLVGGLIKGVGETPPPFLQSDVFFLFLLPPIILDAGYF

En la secuencia 181 se observan las estructuras íransmembranales a apa& de la isaleucina y terminando en una leucina (en las tres especies) con muy alta conservación, lo que sugiere u:na intima relación con la actividad ionoforética de la proteína. Lo que también ocime con la secuencia 361

S30198 181 LPPLRQFTENLGTILIFAWGTLWNAFFGGLLYAVCLVGGLLYAVCLVGGEQINNIGLLDTLLFGSIISA P26431 181 LPPLRQFTENLGTILIFAWGTLWNAFFGGLLYAVCLVGGLLYAVCLVGGEQINNIGLLDTLLFGSIISA 061 165 181 LPPLRQFTENLGTILIFAWGTLWNAFFGGLLYAVCLVGGLLYAVCLVGGEQINNIGLLDTL~GSIISA

En la siguiente secuencia, la 241, en el hámster se observa que a partir del aminoácido número 246 se c,ambia de una valina por una leucina en ambas especies (rata y ratón). Ya que ambos son no polares, se conserva la característica fisicoquímica de la hélice iransmembranal. En el residuo 287 cambia de aspartato a gluiamato, por lo que iambiém se conservan las propiedades en el caso de sitios polares.

S30198 241 VDPVAWAVFEElHlNELLHlLVFGESLLNDAVNVLYHLFEEFANYDSIGISDIFLGFL P26431 241 VDPVAVLAVFEElHlNELLHlLVFGESLLNDAVrVVLYHLFEEFASYEYIGISDIFLGFL Q61165 241 VDPVAVLAVFEEIHIfIELLHlLVFGESLLNDAVNVLYHLFEEFASYDSlGlSDlFLGFL

En la siguiente secuencia el residuo la 306 presenta l a diferencia de alanina por serina, lo que sugiere que esta hélice iransmembranal no es esencial para el mecanismo ionoforético. Por otro lado, las regiones transmembranales de carácter hidrofóbico e hidrofilico se conservan generalmente, sugiriendo un papel esüucturai

S30198 301 SFFWALGGVFVFV(;VWGVIAAFTSRFTSRFTSHIRVIEPLFVFLYSY~YLSAELFHLSGIMAl P26431 301 SFFWSLGGVFVFV(;VWGVIAAFTSRFTSRFTSHlRVlEPLFVFLYSY~YLS~LFHLSGlMAl Q61165 301 SFFWALGGVFVFV(~VWGVIAAFTSRFTSRFTSHIRVIEPLFVFLYSY~YLSAELFHLSGIMA1

in

.. .

En las siguientes secuencias SI: observa muy alta conservación en las secuencias 481, 541, 601. En la primera de estas secuencias se observa una región transmembranal. Las secuencias restantes son hidrofllicas (tienen una alta polaridad). La alta conservación también sugiere su participación en el mecanismo de acción ionofor&ica, probablemente como sitios de reconocimiento catiónico en los sitios aniónicos y de sensibilidad a otros factores fisicoqdmicos ambientales @H, p. ej.) en los !sitios catiónicos. En cambio, la secuencia 661 que se conserva en rata y ratón, en el hámster muestra cambios de metionina por leucina o isoleucina, o de metionina por aianina, lo que sugiere que estas regiones no tienen un papel funcional muy importante.

S30198 421 TLLFCL~ARVLGVLVILTWFINKFRIVKLTPKDQFIIAYGGLRGAIAFSLGYLMDKKHFPM P26431 421 TLLFCLIARVLGVLVI~TWFINKFRIVKLTPKDQFIIAYGGLRGAIAFSLGYLLDKKHFPM Q61165 421 TLLFCLIARVLGVLVLTWFlNWRlVKLTPKDQFllAYGGLRGAIAFSLGYLLDKKHFPM

S30198 481 CDLFLTAIITVIFFTVf:VQGMTlRPLVDLLAVKKKKQETKRSlNEElHTQFLDHLLTGlED P26431 481 CDLFLTAIITVIFFNf:VQGMTlRPLVDLLAVKKKKQETKRSlNEElHTQFLDHLLTGlED Q61165 481 CDLFLTAlITVIFFTV~'VQGMTIRPLVDLLAVKKKQETKRCINEEIHTQFLDHLLTGIED

S30198 541 ICGHYGHHHWKDKI.NRFNKKYVKKCLIAGERSKEPQLIAHKMEMKQAIELVESGGMC P2643t 541 ICGHYGHHHWKDKI.NRFNKKWKKCLIAGERS~PQLIAFYH~EMKQAIELVESGGMC S30198 601 IPSAVSTVSMQNIHF'KSMASERILPALSKDKEEEIRKILRSNLQ~RQRLRSYNRHTLVA P26431 601 IPSAVSTVSMQNIHP'KSAASERILPALSKDKEEEEIRKILRSNLQ~RQRLRSYNRHTLVA 061 165 601 IPSAVSTVSMQNIHP'KAVTSDRILPALSKDKEEEIRKILRSNLQKTRORLRSYNRHTLVA

Nuevamente en la secuencia 721 se observa también muy conservada en las especies rara y ratón, pero el oambio a pa& del aminoiicido 751 aspartato por glicina en hámster también sugiere poca relevancia funcional sé esta región. Ai igual sucede en la secuencia 781 que presenta diferencias notables con los antiports de rata y ratón.

11

Según datos reportados Paveld y col; 1998, se cree que la proteína tiene 12 segmentos de la membrana mas conservados 6 y, lo cual sugieren que pueden estar involucrados en un transporte selectivo de catioues. Aunque varios residuos polares esparcidos en toda la región de la membrana de estos antiports no hay par conservado de residuos de Asp dentro de la región transmembranal.

Esto sugiere que pueden haber una diferencia fundamental en ligamiento y transporte de cationes entre pracariotes, levaduras y en eucariotes superiores.

Por otro lado también en mamíferos diferentes distribuciones de tejidos y grados variantes de sensibilidad se crese que son electroneutros, ya que intercambian 1 Na.' por 1 Esto nos sugiere que los segmmtos reportados y comparados con los nuestros se observan que existe una varialoilidad en los segmentos 7 y 10, mientras que el resto representa una pequeña wuiabiiidad similar en residuos.

También cabe mencionar el alineado de las secuencias muestra poca variabilidad en las secuencias 301, 361, CÍÍl y 661, así como una aita conservación de residuos hidrofilicos y polares, tanto aniónicos como 8-, en los mismos. Esto permite observar que existe UM ruta biogenética a través de ancestros exis- te una conservación de residhos básicos en posiciones transmembranales y plasmáticas equivalentes del alineado.

El análisis de los resultados de este estudio estructural sugiere aparentes diferencias entre variabilidad química (residuos) y fisicoquírnicas@olar/no

Estas observaciones ofrecen información, que sugiere la presencia de sitios hoinólogos y análogos especí:ñcos muy probablemente relacionados con las funciones traslocadoras de las osmoenzimas del tipo "E.

bajo la mayoría de las condiciones fisiológicas (David, 1997).

POW;

RECOMENDACIONES

Los resuitados obtenidos durante este trabajo permiten sugerir las siguientes recomendaciones:

a) Se debe revisar la bibliografía referente a otras especies más lejanas filogenéticamente, y no descartar la posibilidad de que: - Existen parentescos genéticos entre las especies. - Se deben comparar las secuencias transmembranales y así como

la polaridad de los: segmentos, tanto tranmembranales como plasmiiticos.

b) Así como también, se deben revisar los diferentes algoritmos existentes, en busca de posibles difamcias de relevancia en la predicción de las relaciones estrucíura-fuacimbn de las osmoenzimas.

BIBLIOGRAFIA

NOMBRE: MARIA DE LA PAZ ALEJANDRA GONZALEZ PAREDES MATRICULA: 92346471 LICENCIATURA: BIOLOGíA EXPERMENTAL "üL0 DEL PROYECTO

ESTUDIO COMPARATWO DE LA ESTRUCTURA TRANSMEhBRANAL DE PROTEiNAS TIPO ANTPORT SODIOPROTÓN DE TRES ORGANISMOS DEL ORDEN

RODENTIA. FECHA DE INICIO F E C H A D E T " 0 : 7 DEMAYODE 1999 NOMBRE DEL ASESOR DR. RAIh ALVA GARCIA

1 DE AGOSTO DE 1998

PROFESOR TITILAR B, TIEMPO COMPLETO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD

OBJETLVOS

protei& para cormionado- cotl la tnrslocación iónica en los saw vivos.

a

selectividad y los mecaaismos de

QBJETIVOS ESPECIPICOS Comparar la estnictuni tnmsmunbrauai de tres antiports sodidprotón de r- P - ' un modelo queumiribuyaadilucida~el mecauismo de accih ionoforctica de este trauslodor autim. Identificar los dominios relacionados cm los evmtos que se prssentlm durauteia trsslocacih catalugda deaspeciespolaresatravésde m u n w biológicas.

El W s i s eshuchuai de los antiports "E-1 estudidos hasta el momento propone los

Es importante mencionar el alineado de las Seaicncias muestra poca vanabüidad en las mencis8 301, 361,601 y 661, asi como una alta conservación de residuos hidroíüicos y polares, taato aniónicos como &, en los mismos.

Esto permite observar que exisie una nits biogenétira a iravés de ancesiros existe una coMQMci6n de residuos básicos en posiciones transmanbrMales y plasmditicas equivalentes dd allliead0 El W s i s de los resuliados de este estudio eshucturd sugiere apsrenta djfercnCips entre variabilidad química (residuos) y fi--h/no polar);Estrs obsavaciones ofreca uifomiación, que sugiere la pnsmoia de sitios homólogos y análogos egpcdficos muy probablemente relacionados wn las hciones traslocadoras de Ips osmaiillimas

b.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

siguientes rssultados

...

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2

7 MA. DE LA

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Alva,R.,Lugo-R.,J.A.,Artzt,E.,CQb6n,J.,Riv~4B.E.,Toro,M.yEstrsda-O.,

Babdni, R., Gandolfi, M.T., Moya M.L., F’rodi, L. y B- V. 1992. IsraclJ.

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