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Universidad de Chile
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
MEMORIA DE TÍTULO
EFECTO DE ENDOCANABINOIDES EN CARCINOMA PROSTATICO
HUMANO Y POSIBLE VIA DE ACCION INTRACELULAR
OCTAVIO ORELLANA SERRADELL
Memoria para optar al titulo de Bioquímico
PROFESOR PATROCINANTE . DIRECTOR DE MEMORIA
LORENA GARCIA N., PhD HECTOR CONTRERAS M., PhD
Dpto. Bioquímica y Biología Molecular Instituto de Ciencias Biomédicas
Fac. Cs. Químicas y Farmacéuticas U. de Chile Fac. de Medicina U. Chile
Marzo 2010
1
Agradecimientos
Ahora que esta etapa esta acabando, es imposible no mirar atrás y ver cuantas
personas han influido en forma positiva en mí para poder llevar a buen termino este gran
proyecto que ha sido mi tesis. Es por esto que aprovecho este pequeño espacio para poder
dar las gracias a todas las personas que han puesto su granito de arena (y a veces mucho
mas) para poder completar satisfactoriamente este trabajo.
Primero que todo deseo agradecer a mi familia por todo el apoyo que me han brindado
siempre, aun cuando parecía que esto nunca se acabarían ellos siempre estuvieron ahí para
darme un empujón más y continuar trabajando. Ellos lo han dado todo por mi y cada cosa que
ha estado en su poder lo han hecho para poder ayudarme a salir adelante.
También quiero aprovechar esta oportunidad para agradecer a mis amigos, quienes
después de mi familia han sido el más grande apoyo que he tenido durante este largo camino.
Gracias a Elizabeth por inspirarme a ser mejor cada día y por llenar de luz mi vida y en
especial por creer en mí siempre. A Merivette y a Edith por darme las palabras de animo que
necesitaba cuando los experimentos no resultaban parecía que nunca resultarían y
especialmente les agradezco por darme los empujones que necesitaba cuando no tenia
ganas de sentarme a escribir.
Quiero agradecer también al Doctor Héctor Contreras por la gran oportunidad que me
dio de poder trabajar con el, por confiar en mi siempre y por apoyarme en todo a través de mi
trabajo de tesis, desde el diseño experimental a la corrección de este escrito. Agradezco
también a todo el equipo del Laboratorio de Andrología Celular y Molecular de la Facultad de
Medicina de la Universidad de Chile. A Catty por estar siempre dispuesta a enseñarme y
guiarme en cada nuevo experimento y a Graciela por siempre tener todas las cosas listas
para solo dedicarme a mis experimentos, pero en especial le agradezco el ser una gran
amiga. También quiero agradecer a Bernardita que fue la persona que me enseño muchas de
las técnicas que use durante mi tesis, y en especial le agradezco el tener la paciencia de
enseñarme a trabajar con cultivos celulares. En general agradezco a todo nuestro grupo de
trabajo por hacer del ambiente en el laboratorio un ambiente familiar siempre lleno de buena
onda.
2
Agradezco además al Doctor Miguel Llanos del INTA por ayudarme con algunos
experimentos de mi tesis poniendo a su disposición su laboratorio y reactivos y en especial
por darme la oportunidad de trabajar con el durante algunos meses, aprendiendo cada día
algo nuevo. Gracias también a las personas que conocí ahí, en especial a Vale y Carolina que
desde el primer día me hicieron sentir como en casa.
Finalmente quiero agradecer a todas las demás personas que tuvieron alguna
influencia positiva sobre mí durante todo este proceso que ha significado mi tesis. Muchos
fueron los que de una u otra manera contribuyeron con sus palabras, ideas y diferentes
puntos de vista, quizás no puedo nombrarlos a todos por separado pero hago uso de este
espacio para agradecerles.
3
Índice
Pág.
Agradecimientos 1
Índice 3
Índice de figuras 5
Índice de Tablas 6
Abreviaturas 7
Resumen 8
Abstract 10
Introducción 12
Hipótesis y Objetivos 18
1.- Materiales y Métodos 19
1.1 Fármacos 19
1.2 Líneas celulares 19
1.3 Cultivos primarios 19
1.4 Inmunocitoquímica 20
1.5 Ensayo de radioligando 20
1.6 Tratamientos con endocanabinoides 21
1.7 Bloqueo de receptores CB1 21
1.8 Método de MTT 22
1.9 Citometría de Flujo 22
1.10 Ensayo de Anexina V 22
1.11 Western Blot 23
1.12 Análisis estadístico 24
2.- Resultados 25 2.1.- Expresión de receptores CB1 y CB2 en líneas celulares y cultivos
primarios de cáncer prostático 25
2.1.1.- Detección de receptores CB1 y CB2 en líneas celulares y cultivos
primarios de Cáncer prostático por inmunocitoquímica 25
2.1.2.- Análisis de proporción de receptores CB1 y CB2 en líneas celulares
y cultivos primarios de cáncer prostático por ensayos de radio-ligando 25
2.1.3.- Análisis de expresión de receptores CB1 y CB2 en líneas celulares
de cáncer prostático mediante Western Blot 27
4
2.1.4 Análisis de expresión de receptores CB1 y CB2 en cultivos primarios
de cáncer de próstata e hiperplasia prostática benigna por Western Blot 28
2.2 Evaluación de la viabilidad de cultivos celulares de cáncer
de próstata ante el tratamiento con endocanabinoides 29
2.2.1 Efecto del tratamiento con endocanabinoides sobre la viabilidad
de líneas celulares de cáncer prostático 30
2.2.2 Viabilidad de Cultivos primarios frente al tratamiento con
Endocanabinoides 31
2.2.3 Efecto del bloqueo de receptores CB1 en la viabilidad de líneas Celulares 31
2.2.4 Efecto del bloqueo de receptores CB1 en la sobrevida de Cultivos Primarios 32
2.3 Evaluación del efecto de endocanabinoides sobre el ciclo celular
en líneas celulares y cultivos primarios de cáncer de próstata 33
2.3.1 Análisis de la expresión de PCNA en líneas celulares y cultivos
primarios de Cáncer de próstata 33
2.3.2 Análisis de Ciclina D1 en cultivos primarios de cáncer de próstata 34
2.3.3 Análisis de ciclo celular en líneas celulares 35
2.3.4 Análisis del ciclo celular en cultivos primarios 36
2.4 Análisis de apoptosis en líneas celulares y cultivos primarios
de cáncer prostático 37
2.4.1 Ensayo de Anexina V en células PC3 38
2.4.2 Ensayo de Anexina V en Cultivos Primarios de Cáncer Prostático 38
2.4.3 Análisis de Caspasa 3 y Bcl-2 en Cultivos Primarios de
Cáncer de próstata 39
2.5 Estudio de las vías intracelulares involucradas en la acción de
endocanabinoides en CaP por Western Blot 40
Discusión 42
Conclusiones 46
Bibliografía 47
5
Índice de Figuras
Pág.
Figura 1. Endocanabinoides, sus receptores y efectos en distintos tipos de cáncer. 14
Figura 2. Mecanismos de acción de canabinoides sobre células tumorales 15
Figura 3. Detección de receptores CB1 y CB2 en células PC3 y cultivos primarios
de CaP. 26
Figura 4. Porcentaje de unión de 3H-CP 55,940 en distintos cultivos de CaP. 26
Figura 5. Relación de receptores CB1 y CB2 en membranas de cultivos primarios
y líneas celulares de CaP y HPB. 27
Figura 6. Efecto de endocanabinoides sobre la expresión de los receptores CB1
y CB2 en líneas celulares de CaP (PC3 y LnCaP) 28
Figura 7. Efecto de endocanabinoides sobre la expresión de los receptores CB1
y CB2 en cultivos primarios de CaP y HPB 29
Figura 8. Efecto de endocanabinoides sobre líneas celulares de cáncer prostático 30
Figura 9. Efecto de endocanabinoides sobre Cultivos Primarios de CaP 31
Figura 10. Efecto de SR141716 sobre la acción de endocanabinoides en líneas
celulares de CaP 32
Figura 11. Efecto de SR141716 sobre la acción de endocanabinoides en cultivos
primarios de CaP 33
Figura 12. Análisis del efecto de endocanabinoides sobre la expresión de PCNA
en células PC3 y cultivos Primarios de CaP mediante Western Blot 34
Figura 13. Efecto de endocanabinoides sobre la expresión de D1 en Cultivos
Primarios de CaP y HPB mediante Western Blot 35
Figura 14. Porcentaje de células en las distintas etapas del ciclo celular de líneas
celulares de CaP 36
Figura 15. Porcentaje de células en las distintas etapas del ciclo celular de cultivos
primarios de CaP y HPB 37
Figura 16. Efecto de endocanabinoides sobre la expresión de C3 activa y Bcl-2
en Cultivos Primarios de CaP y HPB 40
Figura 17. Efecto de endocanabinoides sobre la expresión de Erk y Akt en Cultivos
Primarios de CaP mediante Western Blot 41
6
Índice de Tablas
Tabla 1. Porcentaje de células PC3 viables, en necrosis o apoptosis 34
Tabla 2. Porcentaje de células de cultivo primario de CaP viables, en necrosis
o apoptosis. 35
7
Abreviaturas
- Ana: Anadamida - 2AG: 2 Araquidonil Glicerol - Me: Metanandamida - MTT: Dimetil Tiazolil Difenil Tetrazolio - PCNA: Proliferating Celular Nuclear Antigen - CaP: Cancer de Prostata - HPB: Hiperplasia prostática benigna - PTEN: phosphatase and tensin homolog - TP53: Tumour Protein 53 - IGF-I: Insulin- like growth factor - TGF-α: Tumour growth factor alpha - FGF: Fibroblast growth factor - EGF: Epidermal growth factor - THC: Tetrahidrocanabinol - THC-COOH: ácido tetrahidrocanabinol carboxílico - TRPV-1: transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 - NGF: Nerve Growth factor - VEGF: Vascular endothelial growth factor - FBS: Fetal Bovine Serum - ATCC: American Type Culture Collection - DHT: Dihidrotestosterona - DMEM: Dulbecco’s modified Eagle's medium - RPM: revoluciones por minuto - PBS: Phosphate buffered saline - BSA: Bovine Serum Albumine - FITC: Fluorescein isothiocyanate - Tris: tris (hidroximetil) aminometano - DMSO: Dimetil Sulfoxido - HEPES: 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid - PI: Propidium Iodide - RIPA: Radioimmunoprecipitation assay - NP40: 40 nonyl phenoxylpolyethoxylethanol - SDS: sodium dodecyl sulfate - EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid - TBS: Tris buffered saline - CDK: Cyclin-dependent kinase
- NF-kB: Nuclear Factor kappa Beta
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Resumen
En etapas tempranas el cáncer prostático es dependiente de andrógenos, por lo que la
castración clínica ha mostrado significativos efectos en las etapas iniciales de esta patología.
A pesar de esto en sus etapas avanzadas el cáncer prostático es resistente a tales
tratamientos. Evidencias recientes muestran que los derivados de la cannabis sativa y sus
análogos ejercerían un efecto protector contra diferentes clases de patologías oncológicas,
por lo que un estudio a fondo del efecto de estos sobre el cáncer de próstata se hace
importante en la búsqueda de nuevas alternativas farmacológicas en la lucha contra esta
enfermedad.
El objetivo de la presente memoria fue detectar la presencia de receptores para
canabinoides (CB1 y CB2) en células cancerígenas de origen prostático y evaluar el efecto de
la utilización de endocanabinoides sobre estas células. Para ello se utilizaron líneas celulares
comerciales y cultivos primarios de origen prostático. La presencia de los receptores CB1 y
CB2, fue demostrada por medio de Inmunocitoquímica y Western Blott. Luego se realizaron
tratamientos, utilizando Anandamida (Ana), 2 Araquidonil Glicerol (2-AG) y el análogo sintético
de Ana, Metanandamida (Me). Se comprobó que ninguno de ellos modificó la expresión de
receptores CB1 y CB2 en las líneas celulares utilizadas, aunque si se encontró un ligero
aumento en la expresión de receptores CB2 en los cultivos primarios de Cáncer de Próstata
(CaP) e Hiperplasia Prostática Benigna (HPB). Además, mediante ensayos de radioligando,
se determinó que la cantidad de receptores CB1 presentes en la membrana de las células, es
mucho mayor que la de receptores CB2 en todos los tipos de cultivos estudiados.
Utilizando el método de MTT, se pudo determinar que los tratamientos producían un
descenso en la sobrevida celular en los distintos cultivos celulares. Este efecto demostró ser
dosis dependiente. El uso de un bloqueador específico para el receptor CB1 (SR141716)
confirmó que este efecto viene dado principalmente por la activación del receptor CB1.
Los ensayos de citometría de flujo no mostraron variación alguna en las etapas del
ciclo celular que pudieran ser causales de la disminución en la viabilidad celular en todos los
cultivos de CaP. A pesar de encontrar un leve descenso en los niveles de expresión de PCNA,
no se detectó variación en los niveles de Ciclina D1.
Sin embargo, ensayos de anexina V, Western Blot para caspasa 3 y descenso de los
niveles de Bcl-2, confirman la activación de la vía apoptótica.
9
Finalmente se encontró que los endocanabinoides estarían activando la vía Erk y al
mismo tiempo produciendo un descenso en los niveles de activación de la vía Akt.
En resumen, la acción de los endocanabinoides en las células tumorales prostáticas
vendría dado por la activación de la apoptosis. El conocimiento de las vías de acción de los
endocanabinoides, permite abrir un camino en la utilización terapéutica de estos análogos en
el cáncer de próstata.
10
Abstract
“The Effect of endocannabinoids in Human Prostate Cancer and a possible pathway of
intracellular action.”
On earlier stages prostate cancer is androgen-dependent, thus medical castration has
shown significant effects at the initial stages of this pathology. Despite this early effect,
advanced prostate cancer is resilient to such treatments. Recent evidences show that
cannabis sativa’s derivatives and its analogs could be exerting a protective effect against
different types of oncologic pathologies, for that reason a thorough study of the effect of these
compounds on prostate cancer becomes important on the search for new pharmacological
alternatives on the fight against this illness.
The purpose of this thesis is to detect the presence of the cannabinoid receptors (CB1
and CB2) on cancer cells with a prostatic origin and evaluate the effect of the in vitro use of
synthetic analogs. In order to do this we used commercial cell lines and primary cultures
derived from prostate cancer. The presence of the CB1 and CB2 receptors was shown by
immunocytochemistry and Western Blot. Later, treatments were made (using Ana, 2-AG and
Ana’s synthetic analog, Me) where we found that no treatment was able to modify the
expression of the receptors CB1 and CB2 on the cell lines that we used, though we did find a
small rise in the expression of CB2 on the primary cultures of CaP and HPB. Apart from this,
using a binding essay we determined that the amount of CB1 receptors on the cell’s plasmatic
membrane is much bigger than the CB2 amount on all the studied cultures.
Using the MTT method, we proved that the treatments produced a cell growth inhibitory
effect on all the different Prostate Cancer cultures. This effect was demonstrated to be dose
dependent. The use of a specific CB1 receptor blocker (SR141716) confirmed that this effect
comes specifically by the activation of the CB1 receptor.
The flow cytometry essays showed no variation at all on the different cell cycle stages
on all the prostate cancer cultures after being treated, which could be signaled as the cause
for the diminution seen on the cell growth. Even though we found a small reduction on the
PCNA expression levels, we didn’t detect any variation on the D1 cyclin levels.
However, Annexin V essays, Western Blot analysis for Caspase 3 and a reduction in
the Bcl-2 levels, confirmed the activation of the apoptotic pathway.
11
Finally we found that the endocannabinoids would be activating the Erk pathway and at
the same time producing a lowering in the activation levels of the Akt pathway.
In resume, the action of the endocannabinoids is through the activation of the apoptotic
pathway. The knowledge of the activation pathways of endocannabinoids allows to open a way
for the therapeutic use of these analogs on prostate cancer.
12
Introducción
El CaP es una patología oncológica de alta prevalencia en la mayoría de los países del
mundo (1). En Chile mueren diariamente más de 3 hombres (1.200 anuales) por este cáncer
siendo la segunda causa de muerte por cáncer en varones. El cáncer de próstata (CaP) se
presenta en forma asintomática y es de progresión lenta, lo que lleva a que su diagnostico se
de muchas veces cuando el cáncer ya se encuentra en un estado muy avanzado. Se estima
que la duplicación de los valores de antígeno prostático especifico (PSA) se alcanza a los 2
años de detectada la enfermedad. Existen estudios que indican una correlación directa entre
la aparición de los síntomas con la aparición de metástasis, lo que limita las opciones de
tratamiento (2).
Debido a esto y a los distintos grados de agresividad tumoral, el impacto que tienen el
diagnóstico precoz y un tratamiento adecuado de la enfermedad, repercuten directamente en
la calidad de vida del paciente (2,3).
Pese a ser una patología frecuente, la etiología del CaP es poco conocida. Se
conocen algunos factores de riesgo como: la raza, la dieta, la historia familiar y principalmente
la edad. A medida que el hombre envejece, la probabilidad de la aparición del cáncer de
próstata aumenta progresivamente (3).
La patogénesis molecular del CaP tampoco ha sido claramente identificada. Se ha
observado que ciertas alteraciones a nivel genético son importantes para producir el cambio
necesario para que una célula prostática normal se transforme en una célula neoplásica, por
ejemplo se ha reportado que mutaciones en algunos genes como PTEN, TP53, E-cadherina y
β-Catenina (4) son importantes para que se produzca esta transformación. Además de estos
genes se ha visto participación activa de algunos factores de crecimiento como Insulin growth
factor I (IGF-I), Transforming growth factor alpha (TGF-α) y otros péptidos de la familia de
Fibroblast growth factor (FGF) asociados al control proliferativo de las células prostáticas (5) y
que están involucrados en el proceso de crecimiento y posterior metástasis del cáncer
prostático.
13
En el CaP, el FGF y la presencia de sus receptores se han correlacionado
positivamente con la progresión cancerosa y metastásica (6). También se ha visto que EGF
es capaz de unirse a receptores específicos en la línea celular prostática LNCaP e inducir la
expresión del gen c-fos, relacionado con el control de la proliferación celular (7). Los factores
moleculares involucrados son variados y a medida que se produce la transformación celular,
la célula prostática adquiere un nuevo fenotipo (maligno) que le da la capacidad de invadir y
generar metástasis a distintas partes del cuerpo.
Por estas razones es que se han desarrollado diversas aproximaciones para tratar de
controlar el desarrollo del CaP. Se han diseñado diferentes fármacos e incluso terapias
naturales que empíricamente han mostrado beneficios para los pacientes. Recientemente se
ha sugerido que la marihuana, a través de alguno de sus principios activos, podría estar
relacionada con la detención del crecimiento tumoral, impidiendo su progreso a etapas más
agresivas de la patología (8)
La marihuana actúa en el organismo como un psicoactivo a través de la producción de
su principio activo el canabinoide (-)-∆9-Tetrahidrocanabinol (THC). El THC es un compuesto
aromático terpenoide muy poco soluble en agua. En la planta existe principalmente como
acido tetrahidrocanabinol carboxílico (THC-COOH). La condensación enzimática del geranil
pirofosfato y acido olivetólico resulta en ácido canabigerólico el cual es ciclado por la enzima
THC- ácido sintetasa dando THC-COOH. Se han descrito, caracterizado y clonado dos tipos
de receptores para canabinoides: el receptor CB1, originalmente encontrado en cerebro y el
CB2, originalmente encontrado en el bazo. Ambos receptores son parte de la superfamilia de
receptores de membrana acoplados a Proteína G. (9,10).
Aparte de los ligandos exógenos como el THC, el organismo produce compuestos
similares denominados endocanabinoides, capaces de modular numerosas respuestas
fisiológicas, mediadas a través de los receptores de membrana CB1 y CB2 (9,10); aunque
también se ha descrito que pueden actuar sobre el receptor TRPV-1 de manera receptor
independiente (11).
14
Los endocanabinoides son derivados de ácidos grasos no saturados que actúan como
ligandos endógenos de los receptores CB1/CB2 de canabinoides. Estas moléculas se unen
con alta afinidad a los receptores CB1/CB2, participando en procesos biológicos normales del
sistema inmune, respiratorio, circulatorio y reproductivo.
El sistema endocanabinoide está ampliamente conservado a través de las especies y
se ha relacionado con distintas funciones del organismo. Se ha estudiado ampliamente su
función en los procesos que controlan el apetito actuando directamente en el núcleo
hipotalámico (12) y también produciendo un aumento en la producción de leptina circulante
(13), además de esto se han reportado roles para el sistema endocanabinoide en procesos
como la neurogénesis, memoria e incluso en el proceso de reproducción (14, 15, 16). A nivel
celular se ha encontrado que los endocanabinoides son capaces de modular una gran gama
de funciones celulares como por ejemplo proliferación celular, diferenciación y sobrevivencia
(Figura 1).
Figura 1. Endocanabinoides, sus receptores y efectos en distintos tipos de cáncer. Maurizio Bifulco, Anna Maria Malfitano, Simona Pisanti and Chiara Laezza. (2008). Endocannabinoids in endocrine and related tumours. Endocrine-Related Cancer 15: 391–408.
15
Esto sugiere que estas moléculas podrían controlar el proceso de transformación y
crecimiento de las patologías neoplásicas. (17,18) A este respecto, se ha visto que pueden
inhibir la proliferación de distintos tipos de tumores, posiblemente a través de la inhibición de
vías proliferativas como la de adenilato ciclasa (19) y de la proteína quinasa A (20), arresto del
ciclo celular por inducción de p27 (21), descenso en la expresión del receptor para EGF
(EGF-R) y descenso en la expresión o actividad de los receptores para Nerve growth factor
(NGF), Vascular endothelial growth factor (VEGF) y prolactina (21,22,23) (Figura 2).
Asimismo, cuando se realiza un tratamiento con antagonistas específicos para
endocanabinoides la capacidad invasiva del tumor aumenta. La gran ventaja que
representaría el uso de endocanabinoides para combatir el CaP, es que se ha demostrado
que los receptores para estas moléculas se encuentran sustancialmente sobre expresados en
las células prostáticas cancerígenas al compararlas con tejido prostático sano (24).
Figura 2. Mecanismos de acción de canabinoides sobre células tumorales. Maurizio Bifulco, Anna Maria Malfitano, Simona Pisanti and Chiara Laezza. (2008). Endocannabinoids in endocrine and related tumours. Endocrine-Related Cancer 15: 391–408.
16
Los endocanabinoides más estudiados son la araquidoniletanolamina o anandamida
(Ana) y el 2-araquidonilglicerol (2-AG). Recientemente se ha reportado en las líneas celulares
(PC3 y DU-145), evidencias que señalan que el incremento del nivel intracelular de 2-AG
inhibe la capacidad invasiva de células tumorales de CaP, obteniéndose resultados similares
cuando se utiliza un análogo estable, a través de un mecanismo que involucra la ocupación
de los receptores CB1. El mecanismo a través del cual se produce esta respuesta sería la
inhibición de la actividad de la proteína quinasa A (20).
Por otro lado, Ana ha demostrado tener participación directa en la disminución de la
acción proliferativa de EGF sobre líneas celulares de cáncer prostático. En células Du-145 y
LNCap, disminuye los niveles del receptor para este factor de crecimiento y además provoca
un arresto proliferativo en G1 y un incremento en la muerte celular por apoptosis y necrosis
(25).
Sin embargo, es escasa y contradictoria la información disponible respecto de las vías
de señalización involucradas en la acción de los endocanabinoides en el CaP. Para otros
tipos de cáncer, se han reportado algunos antecedentes sobre la activación de determinadas
vías al tratar con endocanabinoides, como por ejemplo, la activación de la vía Akt en células
de astrocitoma al usar THC y Ana (26) o la activación de la vía Erk al usar THC en líneas
celulares de gliomas (27), finalmente se ha visto también la activación de la vía JNK al usar
endocanabinoides en distintos tipos de células nerviosas que expresan receptores CB1 (28).
En resumen, los antecedentes encontrados en la literatura sugieren diversos efectos
de los endocanabinoides sobre el CaP tales como: efectos antiproliferativos, anti invasivo y
apoptótico. Es importante considerar que lo reportado hasta ahora, ha sido obtenido utilizando
líneas celulares comerciales, las que pese a provenir de un CaP, han sido manipuladas
genéticamente para lograr su inmortalización. Por ello, los resultados y la proyección de estos
estudios para el tratamiento de la patología con el paciente es muy limitada. Los resultados
obtenidos no pueden ser proyectados con seguridad a lo que podría observarse en una
persona con CaP.
17
Por lo anterior, estudiar los efectos de los endocanabinoides en cultivos primarios de
CaP reflejaría con mayor precisión el efecto y su posible mecanismo de acción. De acuerdo
con esto, existiría una real proyección de su eventual utilización clínica como herramienta
terapéutica.
18
Hipótesis
“Los endocanabinoides ejercen un efecto protector contra el cáncer de próstata en
líneas celulares y cultivos primarios de cáncer prostático”
Objetivos
Objetivo general.
El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto que tienen diferentes endocanabinoides
utilizados en cultivos primarios y líneas celulares de cáncer prostático, además de identificar el
mecanismo mediante el cual estarían produciendo dicho efecto y la vía de acción que estaría
siendo activada por ellos en cultivos primarios de CaP.
Objetivos Específicos.
1. Caracterizar la presencia y expresión proteica de los receptores de canabinoides tipo CB1 y
CB2 en líneas celulares y cultivos primarios de células de CaP de diferente grado de malignidad
mediante Inmunocitoquímica, Western Blott y ensayos de radioligando.
2. Evaluar el efecto de los endocanabinoides Ana, 2-AG y un análogo sintético de Ana (Me)
sobre la proliferación, apoptosis y ciclo celular en líneas celulares y cultivos primarios de CaP y
HPB mediante ensayos específicos.
3. Dilucidar la vía de señalización intracelular mediante la cual los canabinoides estarían
ejerciendo su efecto en cultivos primarios de carcinoma prostático.
19
1.- Materiales y métodos
1.1 Fármacos.
Anandamida (ANA, Nº de catálogo: 172100), 2 Araquidonil Glicerol (2-AG, (Nº de catálogo:
181251) y Metanandamida (Me, (Nº de catalogo: 445900) fueron adquiridos de Calbiochem (San
Diego, CA, USA). CP 55,940 (Nº de catalogo: NET1051025UC) fue adquirido de New England
Nuclear Radiochemicals, actividad especifica: 174.2 Ci/mmol). SR141716 fue adquirido de Sanofi
Recherche (Montpellier, France).
1.2 Líneas Celulares.
Se utilizaron líneas celulares comerciales de origen prostático para ensayar la sensibilidad a
los diferentes tipos de tratamientos con endocanabinoides. Estas se mantuvieron según
indicaciones de la casa comercial, en medio Dulbeco modificado y HAM F12 suplementado con 10
% FBS. Las líneas fueron adquiridas en ATCC (American Type Culture Colection) y fueron las
siguientes:
LNCaP: Línea celular establecida a partir de tejido proveniente de un nódulo linfático metastatizado
de un carcinoma prostático de un hombre caucásico de 50 años. Presentan morfología epitelial con
un crecimiento adherente modulado por DHT, como células aisladas o débilmente agrupadas. Son
de baja tumorigenicidad.
PC3: Línea celular proveniente de una metástasis ósea de un adenocarcinoma prostático de un
hombre caucásico de 62 años. Es de crecimiento adherente y presenta morfología epitelial. Es de
elevada tumorigenicidad.
1.3 Cultivos Primarios.
Se obtuvieron muestras de tejido prostático fresco de pacientes con Adenocarcinoma
prostático. Todo el protocolo de obtención de muestras y su uso contó con la aprobación de los
comités de Bioética de la Facultad de Medicina y el Hospital Clínico de la Universidad de Chile, los
cuales incluyeron los correspondientes consentimientos informados (Proyecto DI MULT 05/36-2
Universidad de Chile). Las muestras se cortaron en trozos pequeños y se sometieron a digestión
enzimática con colagenasa (2mg/ml), hialuronidasa (1 mg/ml) y desoxirribonucleasa (0,5 mg/ml).
20
Luego se colocaron en un baño termoregulado con agitación a 37°C durante 8 horas.
Posteriormente las muestras se dejaron reposar por 10 minutos, formándose dos fases: una
superior que contiene células estromales y un pellet enriquecido en células epiteliales. Estas
últimas se lavaron en DMEM a 37°C y se centrifugaron a 2000 RPM durante 7 minutos. Finalmente
las células se resuspendieron en medio Dulbeco modificado y HAM F12 suplementado con 7 % de
Suero fetal bovino (FBS) y DHT y se sembraron en placas de cultivo adecuadas (Castellón et. al,
2005).
Para el formulario de consentimiento informado y cartas del comité de ética referirse al
proyecto MULT 05/36-2. DI. U. de Chile.
1.4 Inmunocitoquímica
Las células (líneas celulares y cultivos primarios) fueron sembradas sobre cubreobjetos y
cultivadas normalmente, posteriormente fueron fijadas durante 30 minutos utilizando una solución
de buffer fosfato, sacarosa y paraformaldehido. Luego fueron conservadas en PBS-Azida a 4°C. Al
momento de realizar la inmunocitoquímica los cubres fueron lavados con una solución de PBS-
Glicina 20 mM y luego bloqueadas con PBS-glicina (20 mM) – BSA (0,1 %). Posteriormente se
incubaron con los anticuerpos primarios para CB1 (Cayman Chemical CB1 Receptor) a una dilución
de 1:100 y CB2 (Cayman Chemical CB2 Receptor) a una dilución de 1:50. Luego se utilizó un
anticuerpo secundario unido a FITC (Jackson ImmunoResearch Fluorescein-Conjugated AffiniPure
Goat Anti-Rabbit). Las imágenes fueron obtenidas utilizando un microscopio de Spinning Disc
Olympus BX61Wl.
1.5 Ensayo de Radioligando
Para el ensayo de radioligando se utilizaron los pellet resultantes del proceso de extracción
de proteínas de las muestras (descrito en la sección de western blot). Este pellet contiene todas las
membranas contenidas en las células y las proteínas unidas a estas, por lo que este ensayo se
realizó para analizar los receptores unidos a la membrana celular. Se utilizaron las membranas
obtenidas a partir de 100.000 células para cada muestra.
El pellet fue resuspendido en buffer tris-HCl 50 mM pH 7.4, a continuación se pasaron 50 ul
a un tubo de ensayo y se agregaron 100 μl de buffer Tris-HCl, la reacción comenzó al agregar 15 μl
de 3H-CP 55,940 5 μM (New England Nuclear Radiochemicals, actividad específica de 174.2
Ci/mmol) el cual es un potente análogo del THC y que se une con una gran afinidad tanto al
21
receptor CB1 como al CB2. Los tubos se incubaron a 30ºC por una hora con ligera agitación y la
reacción es finalizada agregando 4 ml de buffer de lavado frio.
La solución se filtró al vacio y los filtros (Whatman, Glass Microfibre filters) se lavaron dos
veces con 4 ml de solución de lavado. Los filtros se dejaron secar por 1 hora a 37ºC, se colocaron
luego en viales especiales y se les agregó 10 ml de líquido de centelleo. Posteriormente se midió la
radioactividad en un contador de centelleo Packard 1600 TR Liquid Scintillation Analyzer.
1.6 Tratamientos con endocanabinoides
Cada muestra fue dividida en 4 placas diferentes para su posterior uso en los distintos
experimentos y tratamientos con los fármacos, dejando una sin tratar que se utilizó como control.
Los ensayos preliminares de dosis respuesta para los análogos utilizados (Metanandamida (ME), 2-
AraquidonilGlicerol (2-AG) y Anandamida (Ana)) se realizaron sobre líneas celulares y
posteriormente sobre cultivos primarios una vez visto el tiempo de efecto óptimo. Los efectos fueron
evaluados sobre la sobrevida celular a 24 (datos no mostrados) y 48 horas de incubación, utilizando
para ello el método de MTT. Los resultados a distintos tiempos mostraron que a 24 horas el efecto
de los fármacos era solo leve por lo que se decidió utilizar 48 horas como el tiempo de tratamiento
para los diferentes experimentos. Se utilizaron además 3 distintas concentraciones para cada
tratamiento: 2.5, 5 y 10 μM. Según los resultados obtenidos por MTT se decidió utilizar los fármacos
a una concentración de 5 μM en todo el resto de los experimentos pues fue la concentración que
mostró mejor comportamiento dosis respuesta. Las drogas fueron diluidas en DMSO (Ana y 2-AG) y
en etanol (Me) según las indicaciones de los proveedores.
1.7 Bloqueo de los receptores CB1
Previamente a ser tratados con los endocanabinoides los cultivos fueron incubados con SR
171416 (obtenido de Sanofi Recherche, Montpellier France), el cual es un bloqueador específico
para los receptores CB1. Las células se incubaron con el bloqueador a una concentración de 20 um
(diluido en DMSO) por 30 minutos a 37°C y en oscuridad. Pasado el tiempo, el bloqueador fue
retirado y las células lavadas repetidas veces con PBS. Una vez hecho esto los cultivos fueron
tratados normalmente con los diferentes endocanabinoides. Luego de 48 horas, las células fueron
sometidas al ensayo de MTT para medir la sobrevida de los cultivos, el protocolo usado para esto
fue el mismo detallado anteriormente para esta técnica.
22
1.8 Método de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio)
Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos (aproximadamente 5.000 células por
pocillo) y a las 48 hrs. fueron tratadas con las distintas concentraciones de los análogos de
endocannabinoides. Los tratamientos se hicieron al menos por quintuplicado. Luego de 48 horas de
tratamiento, el medio de cultivo fue descartado y a cada pocillo se le agregaron 100 μl de una
solución stock de MTT (15 μl de solución stock MTT (5mg/ml) 500 μl de solución Locke. (NaCl 24
mM, NaHCO3 4mM, KCl 5mM, HEPES 10 mM, Glucosa 5mM, CaCl2 x 2H2O 2,3 mM, MgCl2 x
6H2O 1mM)) y se dejaron las placas incubar por distintos tiempos; 2 horas para líneas celulares y 3
horas para cultivos primarios, a 37° C en oscuridad.
Posteriormente la solución fue descartada y los cristales depositados en el fondo del pocillo
fueron resuspendidos en 100 μl de DMSO. Luego, la placa se agitó suavemente durante 10 minutos
y la absorbancia fue medida a 550 nm en un espectrofotómetro para Elisa (Perlong DNM-9602). La
absorbancia obtenida de los pocillos sin tratamiento se consideró como 100 % de sobrevida, los
resultados fueron expresados como porcentajes relativos al control.
1.9 Citometría de Flujo
Las células fueron cultivadas como se señaló anteriormente, se trataron durante 48 horas
con los 3 análogos por separado y a una concentración de 5 μm cada uno. Luego de esto las
células fueron tripsinizadas y fijadas en etanol frío al 70 % y se almacenaron en tubos de citometría
de flujo a -20° C. Al momento de ser evaluadas, las células fueron centrifugadas y luego
resuspendidas con 200 a 400 μl de la siguiente solución: Ioduro de Propidio (0,5 mg/ml), RNasa
(100 μg/ml) en PBS. Posteriormente, las células fueron incubadas en oscuridad a 37°C durante 30
minutos y luego la fluorescencia fue leída en el canal FL3, en un equipo FACScan (Becton
Dickinson). Los datos fueron analizados utilizando el programa WinMDI y se presentaron como
gráficos mostrando el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular para cada cultivo.
1.10 Ensayo de Anexina V
Para el ensayo de Anexina V se utilizó el kit BD Pharmingen Annexin V-FITC Apoptosis
Detection Kit. Las células fueron cultivadas y tratadas como se describió anteriormente con los
distintos endocanabinoides a una concentración de 5 μM durante 6 horas. Transcurrido el tiempo,
las células fueron tripsinizadas y posteriormente lavadas con PBS frío.
23
Luego de esto fueron centrifugadas a 2500 RPM por 5 minutos, el sobrenadante fue
descartado y el pellet resuspendido en 1 ml de PBS frío. Se contaron las células en una cámara de
Neubauer y cien mil células fueron transferidas a un tubo de citometría de flujo. Se centrifugaron las
células nuevamente y se descarto el sobrenadante, el pellet fue resuspendido en 100 uL de buffer
de unión 1X (buffer incluido en el kit), una vez resuspendidas las células se agregaron al tubo 5 uL
de Anexina V-FITC y 5 uL de PI, se agitó suavemente y se incubó por 15 minutos en oscuridad y a
temperatura ambiente (25 °C). Transcurrido el tiempo se agregaron al tubo 400 uL de buffer de
unión y se procedió a medir la fluorescencia en un equipo FACScan (Becton Dickinson).
Los datos fueron analizados utilizando el programa WinMDI y se presentaron como tablas
mostrando los distintos estados en que se encontraban las células luego del tratamiento.
1.11 Western Blot
Las líneas celulares y cultivos primarios fueron tratados con los distintos endocanabinoides
a una concentración de 5 μM durante 48 horas. Posteriormente fueron tripsinizadas y centrifugadas
a 2500 RPM por 5 minutos y el pellet obtenido fue resuspendido en una solución RIPA (Tris HCl 50
nM pH 7,4, NaCl 0,15 M, Deoxicolato de Sodio 1 %, NP40 1%, SDS 0,1 %, EDTA 5nM) con
inhibidores de proteasas (Benzamidina 0,01 mg/ml, Antipaina 0,002 mg/ml, Leupeptina 0,005
mg/ml, fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) 4mM) y de fosfatasas (Na3VO4 1mM). El pellet fue
disgregado utilizando una micropipeta y posteriormente una jeringa. La suspensión resultante fue
puesta en agitación durante 15 minutos a 4°C. Luego fué centrifugada a 13.500 RPM (x g) durante
15 minutos a 4°C. El sobrenadante se descartó y se cuantificó la concentración proteica del pellet
utilizando el método de Bradford a 570 nm con lectura en espectrofotómetro Ray Leigh modelo UV-
1600.
Los extractos proteicos fueron utilizados en una electroforesis en gel de poliacrilamida en
condiciones reductoras, cargándose 40 μg de proteína en cada carril y se utilizó un estándar de
peso molecular preteñido (Pierce). Posteriormente los geles fueron electrotransferidos a una
membrana de nitrocelulosa (BioRad) a 50 mA y 4°C durante toda la noche. Una vez terminada la
electrotransferencia, se comprobó la eficiencia de la esta tiñendo las membranas con Rojo de
Ponceau. Se retiró el Rojo de Ponceau con sucesivos lavados con agua. Luego, las membranas
fueron bloqueadas con una solución de TBS-Tween (Tris-HCl 100 mM, NaCl 0,9 %, Tween-20 0,1
%, pH 7,5) – Leche descremada 5 % por una hora a temperatura ambiente en agitación suave.
Después las membranas fueron lavadas con TBS-Tween y posteriormente incubadas con el
anticuerpo primario correspondiente, diluido en TBS-Tween durante toda la noche a 4°C.
24
A continuación se retiró el anticuerpo primario y se lavaron las membranas con TBS-Tween
y se incubaron con los respectivos anticuerpos secundarios (Jackson Immuno Research,
Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti Rabbit IgG 1:100 y Jackson Immuno Research,
Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti Mouse IgG 1:100) diluidos en TBS-Tween - Leche
descremada 5 % (solución de bloqueo) por una hora a temperatura ambiente.
Finalmente las membranas fueron incubadas en una solución EZ-ECL (Biological Industries,
Israel) durante 2 minutos y la marca quimioluminiscente se detecto utilizando placas radiográficas
en oscuridad. Las placas fueron digitalizadas y la intensidad de las bandas se analizó utilizando el
programa UN-SCA-IT gel versión (Silo Scientific Corporation, UTAH, USA).
Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios y en las siguientes diluciones: Cayman
Chemical CB1 Receptor 1:500, Cayman Chemical CB2 Receptor 1:250, Novocastra PCNA 1:500,
Novocastra Ciclina D1 1:500, Cell Signaling Caspase 3 1:100, Cell Signaling Bcl-2 1:250, Cell
Signaling p44/42 MAPK (Erk1/2) 1:250, Santa Cruz Biotechnology p-Akt 1/2/3 (Thr308)-R 1:500.
Los resultados se estandarizaron utilizando actina como control de carga y se tomó como
control de expresión normal a las células sin tratamiento. La expresión en estas últimas fue
considerado como 100 % de expresión y la expresión proteica de las células tratadas se expreso
como porcentaje relativo respecto de estas.
1.12 Análisis estadístico
Los datos fueron presentados como la media +/- desviación estándar (SD) y en el caso en
que el número de datos lo permitió se aplicó un análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis.
25
2.- RESULTADOS
2.1 Expresión de receptores CB1 y CB2 en líneas celulares y cultivos primarios de
cáncer prostático.
Se procedió a analizar la presencia de ambos receptores para endocanabinoides tanto en
líneas celulares como en cultivos primarios de cáncer prostático y se evaluó si los tratamientos con
endocanabinoides sintéticos inducen cambio en la expresión de lo receptores CB1 y CB2 en
ambos tipos de cultivos.
2.1.1 Detección de receptores CB1 y CB2 en líneas celulares y cultivos primarios de CaP por
inmunocitoquímica.
Como se puede observar en la figura 3, el ensayo de inmunocitoquímica demostró la
presencia de ambos receptores tanto en la línea celular PC3 (figura 3B y 2C) como en los cultivos
primarios para CaP (Figura 3E y 3F). También se vió que tanto CB1 como CB2 se encuentran
uniformemente repartidos en la superficie de las células cancerigenas. Los controles negativos
como era de esperarse no mostraron marca alguna (Figura 3A y 3D).
Pese a que ambos receptores muestran una marca de similar intensidad no es posible decir a partir
de este experimento cual estaría en mayor cantidad, para este fin se realizaran ensayos de
radioligando.
2.1.2 Análisis de proporción de receptores CB1 y CB2 en líneas Celulares y Cultivos
primarios de CaP por ensayos de radio-ligando
Todas las preparaciones de membranas (provenientes de la extracción proteica de 100.000
células) de los distintos cultivos celulares fueron capaces de unir el 3H-CP 55,940, el cual se une a
ambos receptores con una afinidad equivalente (29). El uso de Metanandamida, agonista específico
para los receptores CB1, fue capaz de bloquear la unión del análogo de THC a la membrana de los
distintos cultivos celulares en CaP de distintos grados de malignidad (Figura 4). Como el 3H-CP
55,940 se une con igual afinidad a CB1 y CB2 (29), luego de incubar las membranas con
Metanandamida 50 μM (agonista especifico para CB1) cualquier radioactividad que aún queda
presente debe ser atribuida al 3H-CP 55,940 que se unió a los receptores CB2.
26
Figura 3. Detección de receptores CB1 y CB2 en células PC3 y cultivos primarios de CaP. Los controles negativos (paneles 3A y 3D) representan a las células sin anticuerpo primario. Los paneles 3B y 3E representan células PC3 y de cultivo primario de CaP respectivamente incubados con anticuerpo primario contra CB1 (1:100). Paneles 3C y 3F representan células PC3 y de cultivo primario de CaP respectivamente incubados con anticuerpo primario contra CB2 (1:50). El aumento utilizado fue de 400X. Resultados representativos de 3 ensayos diferentes para cada cultivo.
Figura 4. Porcentaje de Binding de 3H -CP 55,940 en distintos cultivos de CaP. Se utilizaron las membranas de 100.000 de las siguientes células: PC3 y LNCaP, cultivos primarios de CaP y HPB y células de cerebro.Las preparaciones de membranas fueron incubadas con Metanandamida 50 μM por 30 minutos, luego de esto se agregaron 15 μl de 3H-CP 55, 940 y se incubó por 1 hora a 37ºC. El medio de reacción se filtró y la radioactividad unida a los filtros se midió en un contador de centelleo (n=2). Las barras representan la media +/- SD.
27
Los resultados del ensayo de unión nos permiten inferir la proporción en que se encuentran
los dos receptores para endocanabinoides en la membrana de las células. De acuerdo con ello y tal
como se esperaba de acuerdo a la literatura, las muestras de cerebro mostraron una escasa
presencia de receptores CB2, en cambio, los cultivos primarios de origen prostático y las líneas
celulares presentaron una mayor cantidad de receptores CB2 que las muestras de cerebro. A pesar
de esto, dichos cultivos presentaron una cantidad mucho menor de receptores CB2 que de CB1
(Figura 5).
Los cultivos primarios de CaP y ambas líneas celulares, mostraron cantidades muy similares
de receptores CB1. Sólo la HPB mostró una densidad de receptores CB2 cercana al doble de la
detectada en los otros cultivos de CaP (Figura 5).
Figura 5. Relación de receptores CB1 y CB2 en membranas de cultivos primarios y líneas celulares de CaP y HPB. Se utilizaron las siguientes células: PC3 y LNCaP, cultivos primarios de CaP y HPB y células de cerebro. Resultados obtenidos por medio de ensayos de Radio-Ligando. (n=2). Las barras representan la media +/- SD.
2.1.3 Análisis de expresión de receptores CB1 y CB2 en líneas celulares de cáncer
prostático mediante Western Blot.
El análisis por medio de Western Blott mostró que los endocanabinoides no ejercieron efecto
alguno en la expresión del receptor CB1 en las dos líneas celulares utilizadas (PC3 y LNCaP) al
comparar los resultados obtenidos con los tratamientos con los controles no tratados (Figura 6). Lo
mismo se pudo observar en el caso del análisis de la expresión del receptor CB2 en ambas líneas
celulares estudiadas donde tampoco se pudo observar ningún cambio significativo en la expresión
de dicho receptor.
Densidad de Receptores
Cerebro CaP HPB LNCaP PC30
20
40
60
80
100CB1
CB2
% d
e u
nió
n
28
Figura 6. Efecto de endocanabinoides sobre la expresión de los receptores CB1 y CB2 en líneas celulares de CaP (PC3 y LnCaP). Los cultivos fueron tratados por 48 horas con los distintos tratamientos a una concentración de 5μM y posteriormente analizados mediante Western Blott. Los resultados fueron expresados como porcentajes con respecto a las células control (n=3). Las barras representan la media +/- SD.
2.1.4 Análisis de expresión de receptores CB1 y CB2 en cultivos primarios de CaP y HPB
mediante Western Blot.
Al igual que lo observado en líneas celulares, ninguno de los endocanabinoides mostró
efecto sobre la expresión del receptor CB1 en la concentración que se utilizó en el ensayo, ya sea
en lo cultivos de CaP como en los de HPB (Figura 7). Pero a diferencia de lo visto en líneas
celulares, Anandamida fue capaz de provocar un aumento en la expresión del receptor CB2 tanto
en los cultivos primarios para CaP como para HPB, donde también 2AG fue capaz de provocar un
aumento semejante. El efecto visto en HPB fue también mayor que el observado en los cultivos
para CaP.
29
Figura 7. Efecto de endocanabinoides sobre la expresión de los receptores CB1 y CB2 en cultivos primarios de CaP y HPB. Los cultivos fueron tratados por 48 horas con los distintos tratamientos a una concentración de 5μM y posteriormente analizados mediante Western Blott. Los resultados fueron expresados como porcentajes con respecto a las células control (n=3). Las barras representan la media +/- SD.
2.2 Evaluación de la viabilidad de cultivos celulares de CaP ante el tratamiento con
endocanabinoides.
Posteriormente se evaluó la sensibilidad de los diferentes cultivos celulares de CaP al
tratamiento con los distintos endocanabinoides. Para esto se utilizaron líneas celulares
representativas de distintos grados de malignidad tumoral (PC3 y LNCaP) además de cultivos
primarios de CaP. Mediante el método de MTT se pudo evaluar el efecto que tienen los
endocanabinoides en la sobrevida de los diferentes cultivos celulares de CaP. Por otro lado,
utilizando citometría de flujo, se estudio si las drogas estarían actuando sobre el proceso de división
de las células tumorales provocando alteraciones en el ciclo celular.
30
2.2.1 Efecto del tratamiento con endocanabinoides sobre la viabilidad de líneas celulares de
cáncer prostático.
En el caso de las líneas celulares (Figura 8) se observó que ambas líneas resultaron fueron
sensibles a los tratamientos con todos los endocanabinoides estudiados. Además se observó que
los 3 fármacos provocaron efectos relativamente semejantes a las distintas concentraciones usadas
(aunque Metanandamida si mostró un efecto menor respecto de los otros) siendo las células
LNCaP levemente mas sensibles a los tratamientos que las PC3. Estos resultados se pueden
corresponder con el hecho de que esta línea celular representa a un cáncer de menor capacidad
invasiva que la línea PC3. El uso de concentraciones crecientes de cada droga, provocó una
disminución mayor en la sobrevida de los cultivos luego de 48 horas de tratamientos, en una forma
casi lineal, por lo que podríamos deducir que los endocanabinoides estarían actuando en forma
dosis dependiente.
Figura 8. Efecto de endocanabinoides sobre líneas celulares de cáncer prostático. Los distintos cultivos fueron tratados con distintas concentraciones de endocanabinoides durante 48 horas a 37ºC. Luego de esto el porcentaje de sobrevida fue evaluado mediante MTT (con n=4 para ambas líneas). El porcentaje esta expresado con respecto al control. Las barras representan la media +/- SD. Se aplicó un análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis (p<0,005).
31
2.2.2 Viabilidad de Cultivos primarios frente al tratamiento con Endocanabinoides
Como se observa en la figura 9, los cultivos Primarios de CaP resultaron ser más resistentes
a los tratamientos con endocanabinoides que las líneas celulares, pero aun así mostraron una
viabilidad reducida comparada con los cultivos control. Los cultivos de CaP, resultaron ser
ligeramente más resistentes a los tratamientos que los cultivos de HPB. También se observó que al
aumentar la concentración de las drogas aumentaron también el efecto en la viabilidad pero en
menor medida que el efecto que se pudo observar en las células LNCaP y PC3, también se pudo
ver que al igual que en dichas líneas celulares Metanandamida también tuvo un efecto ligeramente
menor que lo demás endocanabinoides.
Figura 9. Efecto de endocanabinoides sobre Cultivos Primarios de CaP. Los distintos cultivos fueron tratados con distintas concentraciones de endocanabinoides durante 48 horas a 37ºC. Luego de esto el porcentaje de sobrevida fue evaluado mediante MTT (con n=3 para cada cultivo). El porcentaje esta expresado con respecto al control. Las barras representan la media +/- SD. 2.2.3 Efecto del bloqueo de receptores CB1 en la viabilidad de líneas Celulares
A partir de los resultados anteriores se analizó si el efecto obtenido estaba dado por la
activación de uno o de ambos receptores (CB1 o CB2). Para esto se procedió a incubar las células
con un bloqueador específico para el receptor CB1 (SR141716) y posteriormente se incubaron con
los endocanabinoides de forma idéntica a los experimentos de viabilidad anteriores.
32
En la figura 10 se observa que el efecto sobre la viabilidad de las células inducido por los
endocanabinoides fue completamente bloqueado al tratar las células previamente con SR141716
(bloqueador especifico para los receptores CB1) e incluso en algunos casos se encontró una mayor
viabilidad que en el control. Solo cuando se uso la concentración mas alta para los tratamientos (10
μM) se observó una mínima disminución en la sobrevida de los cultivos en comparación con el
control. Esto nos lleva a sugerir que el efecto producido por los endocanabinoides estaría mediado
exclusivamente por la activación de los receptores CB1.
Figura 10. Efecto de SR141716 sobre la acción de endocanabinoides en líneas celulares de CaP. Los cultivos para ambas líneas celulares fueron incubados con SR141716 durante 30 minutos a 37ºC. Luego de esto se trataron en forma semejante a la detallada en los ensayo de sobrevida. Los resultados y porcentajes de sobrevida fueron evaluados mediante MTT. Los porcentajes son respecto al control (con n=3). Las barras representan la media +/- SD.
2.2.4 Efecto del bloqueo de receptores CB1 en la sobrevida de Cultivos Primarios
En la figura 11 se observa que en los cultivos primarios de CaP y HPB, al igual que en las
líneas celulares un bloqueo del efecto de los diferentes endocanabinoides. Dicho bloqueo no fue
completo al utilizar las concentraciones más altas para los distintos tratamientos. De esto podemos
concluir que, al igual que lo observado en líneas celulares, el efecto que tienen los
endocanabinoides en cultivos primarios también estaría dado por la activación exclusiva de los
receptores CB1.
33
Figura 11. Efecto de SR141716 sobre la acción de endocanabinoides en cultivos primarios de CaP. Los diferentes cultivos fueron incubados con SR141716 durante 30 minutos a 37ºC. Luego de esto se trataron en forma semejante a la detallada en los ensayo de sobrevida. Los resultados y porcentajes de sobrevida fueron evaluados mediante MTT. Los porcentajes son respecto al control (con n=3). Las barras representan la media +/- SD.
2.3 Evaluación del efecto de endocanabinoides sobre el ciclo celular en líneas
celulares y cultivos primarios de CaP.
Luego de detectar una disminución en la sobrevida de los cultivos con los tratamientos con
endocanabinoides, se intentó determinar si el efecto podría estar siendo causado por alteraciones
en el ciclo celular. Para ello se estudió la expresión de PCNA y Ciclina D1 y se analizó la cantidad
de DNA en las células mediante citometría de flujo.
2.3.1 Análisis de la expresión de PCNA en líneas celulares y cultivos primarios de CaP.
PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) es una proteína que actúa como cofactor de la
DNA Polimerasa delta en células eucarióticas y cumple una función importante durante los
procesos de replicación y reparación del DNA en las células. El análisis por Western Blott mostró
que los tres tratamientos disminuyeron los niveles de PCNA tanto en los cultivos primarios de CaP
como en las células PC3 (Figura 12). También se pudo ver que todos los tratamientos mostraron un
efecto semejante sobre los niveles de esta proteína ya que la disminución de la expresión similar.
Un dato importante es que tanto las líneas celulares como los cultivos primarios de Cáncer
Prostático mostraron ser igualmente sensibles a los endocanabinoides al analizar el efecto de los
tratamientos sobre el nivel de expresión de PCNA, mostrando porcentajes de diminución similares
entre si.
34
Figura 12. Análisis del efecto de endocanabinoides sobre la expresión de PCNA en células PC3 y cultivos Primarios de CaP mediante Western Blott. Las células fueron tratadas por 48 horas con los distintos tratamientos a una concentración de 5uM. Resultados expresados como porcentaje respecto a las células sin tratar (n=3). Las barras representan la media +/- SD.
2.3.2 Análisis de Ciclina D1 en cultivos primarios de CaP.
La Ciclina D1 es una proteína que actúa como reguladora y moduladora de las actividades
de las CDK 4 y CDK 6. La actividad de ambas quinasas es necesaria durante la transición de G1 a
S en el ciclo celular. Se ha visto que mutaciones y sobreexpresión de esta proteína están
relacionadas con la tumorigenicidad de varios tipos de cáncer. Por lo que para estudiar los posibles
efectos de los endocanabinoides sobre el ciclo celular en el CaP, se procedió a analizar su
expresión a través de Western Blott y el posible efecto de los tratamientos sobre dicha expresión.
El análisis mostró que ninguno de los tratamientos fue capaz de provocar modificaciones en
la expresión de la Ciclina D1, ni en los cultivos primarios de CaP ni en los de HPB (Figura 13).
35
Figura 13. Efecto de endocanabinoides sobre la expresión de D1 en Cultivos Primarios de CaP y HPB mediante Western Blott. Las células fueron tratadas por 48 horas con los distintos tratamientos a una concentración de 5uM. Resultados expresados como porcentaje respecto a las células sin tratar (n=3).Las barras representan la media +/- SD.
2.3.3 Análisis de ciclo celular en líneas celulares
La técnica de citometria de flujo permite la cuantificación del contenido de ADN de las
células y así nos ayuda a determinar la distribución de una población celular a lo largo de las
distintas fases del ciclo celular. Esto se consigue utilizando marcadores de ADN que incrementan
su fluorescencia (en este caso Ioduro de Propidio). La cantidad de marcador unido es proporcional
a la cantidad de ADN, y por tanto la fluorescencia recogida en el citómetro es proporcional a la
cantidad de ADN de cada célula. Los resultados obtenidos para ambas líneas celulares (PC3 y
LNCAP) son similares, mostrando un gran porcentaje de células en fase G1 luego un porcentaje
menor en G2 y uno aun menor en fase S (Figura 14). Sin embargo en el caso del tratamiento con 2-
AG se observo una mayor cantidad de células en la fase S que en la G2 en la línea celular LNCaP,
pero aun así ambas son mucho menores que la G1. En general no se observaron cambios en la
distribución a lo largo del ciclo celular en ninguna de las distintas líneas utilizadas ni con ninguno de
los tratamientos ocupados, salvo el ya mencionado caso de 2AG en las células LNCaP.
36
Figura 14. Porcentaje de células en las distintas etapas del ciclo celular de líneas celulares de CaP. La figura 13-A representa un histograma ejemplificando las zonas que se midieron para calcular el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular. El área bajo la curva fue medida utilizando el programa WINMDI. La figura 13-B muestra los porcentajes en que se reparten las células a través de las 3 fases del ciclo celular. Las etapas del ciclo celular fueron evaluadas mediante citometría de flujo luego de 48 horas de tratamiento con los endocanabinoides en células LnCaP y PC3. (n=3). Las barras representan la media +/- SD.
2.3.4 Análisis del ciclo celular en cultivos primarios
El análisis de ciclo celular por citometría de flujo para cultivos primarios de CaP no mostró
arresto celular en alguna de las fases del ciclo celular, cuando los cultivos fueron tratados con los
endocannabinoides (Figura 15). Lo que si se pudo observar es que a pesar de encontrar
comparativamente una mayor cantidad de células en fase G1 que en las otras etapas, este
porcentaje es levemente menor que el encontrado en las líneas celulares, esto se observó tanto en
los cultivos primarios de CaP como en los de HPB.
37
Figura 15. Porcentaje de células en las distintas etapas del ciclo celular de cultivos primarios de CaP y HPB. La figura 13-A representa un histograma ejemplificando las zonas que se midieron para calcular el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular. El área bajo la curva fue medida utilizando el programa WINMDI. La figura 13-B muestra los porcentajes en que se reparten las células a través de las 3 fases del ciclo celular. Las etapas del ciclo celular fueron evaluadas mediante citometría de flujo luego de 48 horas de tratamiento con los endocanabinoides en cultivos primarios de CaP y HPB (n=3). Las barras representan la media +/- SD.
2.4 Análisis de apoptosis en líneas celulares y cultivos primarios de CaP.
Al ver descartada la opción de que los endocanabinoides estuvieran ejerciendo su efecto
sobre los diferentes cultivos de CaP mediante modificaciones en el ciclo celular, se quiso investigar
si el efecto en la baja de la viabilidad celular vista por MTT podría estar dado por activación de la
vía apoptótica. Para comprobar esto se realizo un ensayo de citometría de flujo con Anexina V
FITC, el cual sirve para detectar apoptosis en su fase temprana en cultivos celulares.
Luego de esto se procedió a realizar ensayos de Western Blott para evaluar los cambios en
los niveles de expresión de determinadas proteínas que se encuentran involucradas directamente
en el proceso de apoptosis.
38
2.4.1 Ensayo de Anexina V en células PC3.
Como podemos observar en la tabla 1, el ensayo de Anexina V en la línea celular PC3
muestra que aun en condiciones normales existe un porcentaje de células que están en estado
activo de apoptosis y necrosis. Las células control mostraron tener un porcentaje relativamente
mayor de células en estado necrótico que en apoptosis, en cambio, las células tratadas presentaron
un aumento de mas del 100 % en el porcentaje de células en fase temprana de apoptosis, pero no
se evidencia cambio alguno en el porcentaje de células en estado necrótico. Metanandamida y
Anandamida mostraron una capacidad levemente mayor para inducir apoptosis en las células PC3
que 2-AG
Tabla 1. Porcentaje de células PC3 viables, en necrosis o apoptosis analizado mediante citometría de flujo para Anexina V. Las células fueron incubadas con los diferentes tratamientos a una concentración de 5um y por 6 horas antes de su análisis (n=2). Los datos representan el promedio de los experimentos.
2.4.2 Ensayo de Anexina V en Cultivos Primarios de Cáncer Prostático.
El ensayo de Anexina V en cultivos primarios de CaP mostró que al igual que las líneas
celulares, en cultivos primarios existe también un porcentaje de células que aun sin ser tratadas, se
encuentran en estado apoptótico o necrótico. Además, este porcentaje resultó ser mayor en cultivos
primarios que el visto en líneas celulares (Tabla 2).
Tal como se pudo observar en líneas celulares, los cultivos primarios también presentaron
un mayor porcentaje de células en estado necrótico que apoptótico al encontrarse en condiciones
normales. Esta proporción cambia al exponer las células a los distintos tratamientos, observándose
luego de esto un aumento en la cantidad de células en estado de apoptosis temprano, las cuales
ahora se encuentran en mayor cantidad que las células en estado de necrosis.
PC3 % Células
Viables
% Células en
Necrosis
% Células en
Apoptosis
Ctrl. 88 % 7 % 4 %
Me 82 % 6 % 12 %
2-Ag 84 % 6 % 9 %
Ana 83 % 5 % 11 %
39
Pese a esto, el efecto que se pudo ver en cultivos primarios fue menor que el visto antes en
las células PC3 a nivel de porcentaje de aumento. Además de esto, a diferencia de lo visto en
líneas celulares, en cultivos primarios el mayor efecto observado fue usando 2-AG.
Interesantemente, este endocanabinoide había mostrado el menor efecto de los tres tratamientos
en el ensayo previo con líneas celulares.
Ca
P
% Células
Viables
% Células en
Necrosis
% Células en
Apoptosis
Ctrl
. 88 % 10% 7 %
Me 83 % 10 % 12 %
2-
Ag 78 % 10 % 15 %
Ana 76 % 11 % 13 %
Tabla 2. Porcentaje de células de cultivo primario de CaP viables, en necrosis o apoptosis analizado mediante citometría de flujo para Anexina V. Las células fueron incubadas con los diferentes tratamientos a una concentración de 5um, por 6 horas. El análisis fue hecho mediante citometría de flujo para Anexina V (n=1).
2.4.3 Análisis de Caspasa 3 y Bcl-2 en Cultivos Primarios de CaP.
Caspasa 3 y Bcl-2 son proteínas directamente involucradas en el proceso de apoptosis
celular, siendo Caspasa 3 una proteína proapoptotica y Bcl-2 una antiapoptotica. Una vez
descartado que el efecto de lo tratamientos fuera dado por modificaciones en el ciclo celular y
comprobando mediante el ensayo de anexina V que los endocanabinoides estarían provocando
apoptosis, se paso analizó la expresión de estas proteínas como marcadores de este proceso.
40
Los resultados mostraron un aumento en los niveles de Caspasa 3 tanto en los cultivos de
Cáncer Prostático como en los de HPB, siendo estos últimos levemente más sensibles a los
tratamientos que los cultivos de CaP (Figura 16). Coincidente con esto se observó que los niveles
de BcL-2 descendieron en ambos tipos de cultivo primario luego de las 48 horas de tratamiento, el
efecto observado fue semejante entre todos los endocanabinoides. Nuevamente los cultivos de
HPB se mostraron ligeramente más sensibles que los de Cáncer Prostático.
Figura 16. Efecto de endocanabinoides sobre la expresión de C3 activa y Bcl-2 en Cultivos Primarios de CaP y HPB. Los cultivos celulares fueron tratados por 48 horas con los distintos tratamientos a una concentración de 5uM y posteriormente analizados por Western Blot. Los resultados fueron expresados como porcentaje respecto a las células sin tratar (n=3). Las barras representan la media +/- SD. 2.5 Estudio de las vías intracelulares involucradas en la acción de endocannabinoides en
CaP por Western Blot.
Se ha visto que los endocanabinoides y los derivados de la cannabis en general ejercen su
acción activando e inactivando diferentes vías de transducción de señales intracelulares en distintos
tipos de cáncer. Diversos estudios han sido realizados en diferentes patologías oncológicas pero
estos se han hecho siempre en líneas celulares.
41
Es por eso que con el propósito de dilucidar cuales podrían ser las vías de señalización
intracelular que estarían involucradas en la acción de los endocanabinoides en el CaP, estudios en
cultivos primarios de este se hacen necesarios.
La mayor expresión de Erk vista por Western Blott luego de que las células fueron tratadas,
sugiere un aumento en la activación de la vía Erk en los cultivos primarios de CaP (Figura 17). De
la misma manera se pudo ver que mientras la vía Erk se ve activada, la presencia de la forma
activa (fosforilada) de la proteína Akt se ve disminuida en porcentajes similares al aumento de la
activación de Erk. Todos los tratamientos mostraron efectos relativamente similares sobre los
cultivos primarios de CaP.
Figura 17. Efecto de endocanabinoides sobre la expresión de Erk y Akt en Cultivos Primarios de CaP mediante Western Blott. Las células fueron tratadas por 48 horas con los distintos tratamientos a una concentración de 5uM. Resultados expresados como porcentaje respecto a las células sin tratar (n=3). Las barras representan la media +/- SD.
42
3.- Discusión
El cáncer de próstata se ha convertido en el cáncer más frecuente en hombres y una de las
mas amenazantes enfermedades en los países occidentales y pese a que existen terapias que se
han mostrado efectivas, como la deprivación de andrógenos, estas no son capaces de eliminar la
totalidad de las células tumorales, además de esto los tratamientos con quimioterapeuticos resultan
en grandes efectos secundarios para los pacientes.
En el último tiempo se ha visto que los endocanabinoides tienen una amplia gama de
efectos reguladores en una variada gama de procesos fisiológicos. Uno de los usos más
prometedores tiene que ver con el efecto que tienen sobre diversos tipos de cáncer y su potencial
utilización en el tratamiento contra estas enfermedades.
En el presente trabajo estudiamos el efecto que tienen estos endocanabinoides en líneas
celulares y cultivos primarios de cáncer prostático, el mecanismo de acción y las potenciales vías
intracelulares involucradas.
Estudio de expresión de receptores CB1 y CB2.
Diversos estudios han demostrado la presencia de estos receptores en cáncer Prostático
(24, 30), en el presente estudio además de demostrar por medio de Inmunocitoquímica la presencia
de dichos receptores en líneas celulares comerciales (PC3), demostramos su presencia en cultivos
primarios de CaP. Además utilizando ensayos de radio-ligando demostramos que el receptor CB1
estaría expresado en mayor cantidad en la membrana de las células tumorales que el receptor
CB2. Esto puede explicarse con que el efecto que los endocanabinoides están ejerciendo viene
dado por la activación de los receptores CB1. También se pudo ver que los tratamientos con
endocanabinoides no alteran los niveles de expresión del receptor CB1, tanto en líneas celulares
con en los cultivos primarios, pero si se vio un ligero aumento en los niveles de expresión de CB2
en los cultivos primarios de CaP y HPB al ser tratados con Anandamida y también con 2AG en el
caso de los cultivos para HPB. El receptor CB2 en condiciones normales se expresa casi
principalmente en células pertenecientes al sistema inmune, donde se le han atribuido varios
efectos en distintos tipos de células (31,32,33) esto nos lleva a pensar que este efecto podría estar
involucrado con la generación de otros tipos de defensa contra esta enfermedad neoplásica, como
por ejemplo la activación de algunos mecanismos de destrucción propios de células del sistema
inmune.
43
Efecto de endocanabinoides sobre Líneas celulares y cultivos primarios de cáncer prostático
Una vez demostrada la presencia y expresión de los receptores para endocanabinoides,
nuestro siguiente paso fue el análisis del efecto que los análogos sintéticos de endocannabinoides
tendrían sobre los distintos cultivos celulares de cáncer prostático.
En primer lugar se estableció la sensibilidad de los diferentes cultivos a distintas
concentraciones de los tres endocanabinoides. Primero que todo como se utilizaron solventes
diferentes al agua y que pueden ser tóxicos para las células (DMSO y etanol) se hicieron ensayos
para demostrar que las concentraciones utilizadas de estos solventes no tenían efecto alguno sobre
la sobrevida de los cultivos (datos no presentados). Se pudo observar que los solventes no ejercían
ningún efecto sobre los diferentes cultivos de células de cáncer prostático en ninguna de las
concentraciones utilizadas. Una vez comprobado que el efecto viene dado exclusivamente por los
tratamientos usados y no por los solventes pudimos demostrar que los cultivos primarios fueron
más resistentes a los endocanabinoides que las líneas celulares. También se observó que a mayor
malignidad se ve una mayor resistencia dentro de cada tipo de cultivo, es decir, que los cultivos de
cáncer prostático son más resistentes que los de HPB y que las células PC3 son más resistentes
que las LnCaP. Además de esto se observó que el efecto provocado por lo tratamientos ocurre en
forma dosis dependiente, aunque el aumento en dicho efecto no es lineal, esto puede estar dado
posiblemente por una saturación de los receptores a medida que va aumentando la concentración
de cada tratamiento.
La incubación previa de los distintos cultivos con SR141716 fue capaz de prevenir en forma
casi total el efecto que los distintos tratamientos provocaron, tanto en las líneas celulares como en
los cultivos primarios. Siendo SR141716 un antagonista selectivo para el receptor CB1, los
resultados obtenidos nos llevan a la conclusión de que el efecto observado con los distintos
tratamientos viene dado por la activación de CB1 y no de CB2 o TRPV1, descartando también un
posible efecto independiente de receptores. Olea-Herrero et al; en un trabajo publicado este año
(34) postula que el efecto en la sobrevida de células PC3 al ser tratadas con Metanandamida
estaría dado específicamente por la activación del receptor CB2, esto no solo difiere de nuestros
resultados sino también de investigaciones publicadas, como la de Agudelo et al; que pese a no
utilizar Metanandamida, utiliza su análogo endógeno Anandamida. Este grupo reportó que el efecto
de Anandamida viene dado por la activación de lo receptores CB1. Además de esto la afinidad de
Metanandamida por el receptor CB2 es tan baja (Ki = 815 nM para CB2 y Ki = 20 nM para CB1 de
acuerdo a los datos del proveedor) que algunos investigadores lo consideran un agonista especifico
para CB1 (35).
44
Análisis del mecanismo de acción de los endocanabinoides
Una vez comprobado el efecto que los endocanabinoides tienen sobre los distintos cultivos
de cáncer prostático y encontrado además que este viene dado por la activación de los receptores
CB1 se paso a analizar por medio de que mecanismo estaría ocurriendo dicho efecto.
Lo primero que se hizo fue estudiar si los tratamientos tenían efecto a nivel del ciclo celular.
Lo primero que se realizó fue un análisis del efecto de los endocanabinoides sobre los niveles de
PCNA, el cual es un marcador común de proliferación celular. Los resultados mostraron un ligero
descenso en los niveles de expresión luego de las 48 horas de tratamiento tanto en líneas celulares
como en lo cultivos primarios, lo que nos llevo a suponer un posible efecto a nivel del ciclo celular.
Pese a estos resultados el análisis de Ciclina D1 no mostró variaciones luego de los tratamientos y
aun más, los análisis del ciclo celular realizados por citometría de flujo tampoco mostraron
variaciones ni arrestos en ninguna etapa del ciclo. El hecho de que el descenso de PCNA no haya
provocado variaciones a nivel del ciclo celular como era esperado puede correlacionarse con que
dicho descenso fue leve, ya que PCNA no solo cumple funciones a nivel de replicación del DNA
sino también a nivel de reparación, este descenso puede que no sea suficiente para provocar un
cambio en las distintas etapas del ciclo celular de los cultivos estudiados (36).
Una vez descartado que el efecto de los endocanabinoides viniera por modificaciones en el
ciclo celular se buscó descubrir si el proceso de apoptosis seria el que estuviera provocando el
descenso en la sobrevida de los cultivos.
Los resultados del ensayo de Anexina V mostraron un aumento en el numero de células en
estado de apoptosis temprana luego de ser tratadas con los distintos endocanabinoides mas no se
evidencio ningún cambio en el porcentaje normal de células en estado necrótico, por lo que se
eligió la vía apoptótica como el posible mecanismo de acción que los tratamientos tendrían. La
tendencia observada en los ensayos de Anexina V fue apoyada por lo estudios hechos por Western
Blott de la expresión de Caspasa 3 y Bcl-2. Los resultados mostraron tal como esperábamos un
aumento en los niveles de Caspasa 3 activa lo cual es uno de los eventos principales en el
mecanismo de apoptosis, consecuentemente se pudo ver un descenso en los niveles de expresión
de Bcl-2 lo que era de esperarse dada la función anti apoptótica que tiene esta proteína. El efecto
en simultáneo que se observa en ambas proteínas podría venir dado por alguna modificación en la
actividad del Nuclear Factor kappa Beta (NF-kB) provocada por los endocanabinoides. La vía de
NF-kB participa en procesos de proliferación mediante varios mecanismos entre los cuales se
cuentan el control de la expresión de BcL-2 y también la activación de proteínas de la vía de las
caspasas.
45
En cáncer prostático se ha visto que esta vía se encuentra sobre estimulada (8) por lo que
los endocanabinoides podrían estar actuando a nivel de NF-kB actuando asi al mismo tiempo sobre
Caspasa 3 y Bcl-2.
Todos estos resultados nos sugieren que los endocanabinoides estarían ejerciendo su
efecto activando la vía apoptótica sin modificar las etapas del ciclo celular ni provocar necrosis.
Análisis de vía de acción.
Los análisis por medio de Western Blott mostraron un descenso en los niveles de AKT en los
cultivos primarios de cáncer prostático luego de los tratamientos con lo endocanabinoides. AKT
funciona como regulador positivo crítico del metabolismo y proliferación celular (37) lo que se
correlaciona positivamente con el efecto provocado por los tratamientos sobre los diferentes
cultivos de cáncer prostático y además con los reportes que han mostrado que AKT disminuye en
otros tipos de cáncer al ser tratados con THC (27, 38). Por otro lado los canabinoides y el aumento
en Erk han sido correlacionados con procesos antiproliferativos (39). Los resultados observados en
nuestros estudios muestran una simultanea activación de la vía Erk y un descenso en los niveles de
AKT, la combinación de estos dos sucesos contribuyen a la activación de vías antiproliferativas y un
descenso en los mecanismos proliferativos de los cultivos primarios de cáncer prostático. Por otro
lado también se encontró a la proteína Akt en forma fosforilada constitutivamente. Sabemos que las
células PC3 presentan esta característica por carecer del supresor tumoral PTEN, el cual activa
normalmente a AKT, nuestro trabajo demuestra que también esto podría estar pasando en cultivos
primarios de cáncer prostático, lo que confirma lo que solo se había reportado con anterioridad por
otros autores en cortes de tejido mediante inmunohistoquímica (40).
Un análisis de las proteínas que se encuentran río abajo y arriba de las ya estudiadas sería
importante para poder describir mejor los mecanismos intracelulares que estarían activándose en
las células cancerigenas al ser tratadas con endocanabinoides y poder buscar otros posibles
blancos de intervención para potenciar los efectos que mostraron tener los tratamientos sobre estas
células cancerigenas.
Finalmente, de acuerdo con lo encontrado en este trabajo podemos concluir que los
endocanabinoides son capaces de detener el crecimiento de células prevenientes del cáncer de
próstata mediante un aumento en el proceso de apoptosis. Además estarían ejerciendo su acción
modulando las vías de señalización Erk y Akt. De acuerdo a lo anterior los endocanabinoides
aparecen como una potente herramienta a investigar para el desarrollo de fármacos contra el
Cáncer de Próstata.
46
Conclusiones
1. Caracterizar la presencia y expresión proteica de los receptores de canabinoides
tipo CB1 y CB2 en líneas celulares y cultivos primarios de CaP de diferente grado
de malignidad mediante Inmunocitoquímica, Western Blott y ensayos de
radioligando.
- Tanto las células PC3 como el CaP presentan ambos receptores para
endocanabinoides.
- El receptor CB1 se encuentra en mucha mayor cantidad que el CB2 en todos los
cultivos estudiados.
- Los endocanabinoides no alteran la expresión del receptor CB1 en ningún tipo
celular estudiado. CB2 se ve ligeramente aumentado en el caso de la HPB, al ser
tratado con 2AG y Ana.
2. Evaluar el efecto de los endocanabinoides Ana, 2-AG y el análogo sintético de Ana
(Me) sobre la proliferación, apoptosis y ciclo celular en líneas celulares y cultivos
primarios de CaP y HPB mediante ensayos específicos.
- Los endocanabinoides provocan un descenso en la sobrevida de las líneas celulares
y cultivos primarios de CaP en forma dosis dependiente.
- El efecto de los endocanabinoides ocurre por medio de la activación del receptor
CB1, ya que los efectos en la sobrevida fueron evitados utilizando el bloqueador
especifico para este receptor (SR141716).
- Los endocanabinoides producen un efecto en la sobrevida de todos los cultivos
estudiado activando la vía apoptótica. No se pudieron observar efectos significativos
sobre las etapas del ciclo celular ni aumento en la muerte de las células por necrosis.
3. Dilucidar la vía de señalización intracelular mediante la cual los canabinoides
estarían ejerciendo su efecto en cultivos primarios de carcinoma prostático.
- Los endocanabinoides actúan activando la vía de señalización intracelular Erk y al
mismo tiempo provocan un descenso en la activación de la vía Akt
47
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