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UNIVERSIDAD DE CHILE
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica
Activación del receptor B1 de bradicininas en miofibroblastos cardiacos por captopril: reducción de la síntesis de colágeno
Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico
CHRISTIAN SMOLIC SMOLIC
Patrocinante : Dr. Guillermo Díaz-Araya.
Directores de tesis : Dr. Guillermo Díaz-Araya.
Dr. Sergio Lavandero G.
Santiago, Chile 2008
AGRADECIMIENTOS
Primero que todo quiero agradecer al Dr. Guillermo Díaz-Araya por darme la
oportunidad de conocer el mundo de la ciencia y a sus habitantes, por estar dispuesto a
ayudarme cuando lo necesité y por todo el apoyo que me dio durante este último año y un
poco mas. , siendo para mí un orgullo realizar esta memoria con él.
Porque madre hay una sola, gracias de corazón para ti Silvita, que haz hecho todo
los posible y un poco de imposible para lograr que salga adelante y poder estar ahora
escribiendo estas palabras (nunca imaginaste en que iba a terminar la historia cuando
hace 18 años me regalaste aquel diccionario de biología), a mis abuelos Luisa y Antonio,
a mi tío-hermano Rodolfo y a Mauricio por estar siempre ahí, por la buena crianza, el
cariño, y todo lo que necesitara, infaltable es también Eliot, el mas pequeño de la familia y
Amaranta, en quien puedo plasmar los acordes de mi vida.
Lugar especial en esta pagina es para ti Andrea, que me has sido mi compañera
de maldades y alegrías, que cargaste junto a mi el peso de la vida universitaria y haces
que la vida sea mas simple cuando disfrutamos una taza de té (en especial ese de berries
de la cajita morada) y sonreímos cuando se empañan los lentes.
También existe la familia que se elije, que a través de los años demuestra estar
contigo en todo momento: Fabián, Enrique, René, Deny y Daniel, a mis “pada–wan” Oscar
y Manuel, gracias totales.
A todos los que me han acompañado en esta larga travesía llamada farmacia,
cuando, junto a Ricardo, Cristian, Alvaro, Jorge, María Jesús, Mauricio, Jaime y María
Elena juntábamos las mesas en el casino para almorzar…aun son importantes. No puedo
dejar de agradecer a quienes me retornaron al camino amarillo: Alan, Josita, Steph, Cote,
Italo, David… que junto a esas noches interminables de estudio, chocositos, pruebas,
pizas cuadradas, café y Lerogin frambuesa fuimos capaces de conquistar el mundo.
A quienes hacen agradable el llegar cada día al laboratorio y que el trabajo rudo
sea también diversión: Pablo, Miguel, Raúl, Pedro, Daniel y Fabiola, nunca dejemos de
ser Fibros!!!
A todos ustedes muchas gracias.
1
Esta memoria de tíulo se realizó en el Laboratorio de Farmacoquímica, Departamento de
Química Farmacológica y Toxicológica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas,
Universidad de chile, con financiamiento de los proyectos FONDECYT Nº 1061059 y
FONDAP Nº 105010006.
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ÍNDICE GENERAL
Página
ÍNDICE GENERAL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
ÍNDICE DE FIGURAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
ABREVIATURAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
RESUMEN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
SUMMARY. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10
1. INTRODUCCIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.1. Generalidades. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...11
1.2. Corazón. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2.1. Fibroblastos cardiacos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2.2. Miofibroblastos cardiacos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12
1.3. Infarto y remodelado cardíaco. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.3.1. Tratamiento farmacológico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
1.4. Cininas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.4.1. Receptores de cininas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..14
1.5. Enzima convertidora de angiotensina (ECA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.5.1. Inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.6. Nuevo modo de acción de iECAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
2. HIPÓTESIS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
3. OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3.1. Objetivo general . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
3.2. Objetivos especificos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
4. MATERIALES Y MÉTODOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
4.1. Reactivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
4.2. Modelo animal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
3
4.3. Aislamiento y cultivo de fibroblastos cardiacos de rata neonata. . . . . . . . . . . . . .19
4.4. Diferenciación a miofibroblastos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
4.5. Preparación de extractos celular totales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
4.6. Electroforesis en geles de poliacrilamida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21
4.7. Electrotransferencia de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
4.8. Inmunowestern blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
4.9. Fotografía de transmisión y epifluorescencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
4.10. Determinación Ca+2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
4.10.1. Procesamiento digital de imágenes (Ca+2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23
4.11. Colágeno soluble . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
4.12. Proliferación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24
4.13. Zimografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
4.14. Análisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
5. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
5.1. Diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos por efecto de TGF-β1 . . . . . . . 26
5.2. Expresión del receptor B1 de bradicininas en miofibroblastos . . . . . . . . . . . . . . 28
5.3. Funcionalidad del receptor B1 de bradicinina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
5.4. Efecto de DAKD sobre la secreción de colágeno en fibroblastos
y miofibroblastos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31
5.5. Efecto de DAKD sobre la viabilidad de fibroblastos y miofibroblastos . . . . . . . . 32
5.6. Efecto de DAKD sobre la actividad gelatinásica de la metaloproteasa-2
de la matriz extracelular (MMP-2) en fibroblastos y miofibroblastos . . . . . . . . . .33
5.7. Captopril activa receptor B1 de bradicininas en miofibroblastos . . . . . . . . . . . . .35
5.8. Efecto de iECAs sobre la secreción de colágeno en fibroblastos
y miofibroblastos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.9. Efecto de iECAs sobre la viabilidad de fibroblastos y miofibroblastos . . . . . . . . .37
5.10. Efecto de iECAs sobre la actividad gelatinásica de la metaloproteasa-2
de la matriz extracelular (MMP-2) en fibroblastos y miofibroblastos . . . . . . . . . . 38
5.11. Efecto de Leu 8-BK en la secreción de colágeno soluble. . . . . . . . . . . . . . . . . . .40
4
6. DISCUSIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
6.1. Efecto de TGF-β1 sobre la diferenciación de fibroblasto a miofibroblasto. . . . . . . 41
6.2 Receptores de Bradicininas en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos. . . . . . . .42
6.3 Funcionalidad de los receptores B1 y B2 de bradicininas en miofibroblastos. . . . .44
6.3.1 Vías transduccionales de receptores de cininas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
6.3.2 Efecto de iECAs sobre el receptor B1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
6.4 Efecto de DAKD y Captopril sobre la secreción de colágeno. . . . . . . . . . . . . . . . .47
7. CONCLUSIONES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49
8. BIBLIOGRAFÍA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50
5
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig 1. Receptores de cininas y vías de transducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Fig 2 Efecto de TGF-β1 sobre la expresión de la proteína α–SMA . . . . . . . . . . . . . . ..26
Fig 3. Inmunolocalización de α-SMA en fibroblastos cardiacos neonatos
estimulados con TGF-β1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Fig 4. Expresión de la ECA en Fibroblasto y Miofibroblasto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Fig 5. Niveles de expresión del receptor B1 cininas en miofibroblastos cardiacos . . . . .29
Fig 6 Ang II y BK aumentan los niveles intracelulares de calcio en miofibroblastos. . . 30
Fig 7 DABK y DAKD aumentan los niveles intracelulares de calcio en miofibroblastos 30
Fig 8. Aumento en la concentración de calcio intracelular por
BK, DABK y DAKD en miofibroblastos en presencia de (Leu 8-BK) . . . . . . . . . . 31
Fig 9. Efecto de DAKD sobre la secreción de colágeno al medio de
cultivo de fibroblastos y miofibroblastos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Fig 10. Efecto de DAKD sobre la viabilidad de fibroblastos y miofibroblastos . . . . . . . . 33
Fig 11. Actividad gelatinásica de pro MMP-2 en fibroblastos y miofibroblastos . . . . . . . 34
Fig 12. Actividad gelatinásica MMP-2 activa en fibroblastos y miofibroblastos . . . . . . . 34
Fig 13 Efecto de iECAS sobre la concentración de calcio
intracelular en miofibroblastos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35
Fig 14. (Leu 8-BK) antagonista de B1R bloquea el aumento en la concentración
de calcio intracelular inducido por por captopril en miofibroblastos . . . . . . . . . . 36
Fig 15. Efecto de iECAs sobre la secreción de colágeno soluble en
fibroblastos y miofibroblastos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Fig 16. Efecto de iECA sobre la viabilidad de fibroblastos y
miofibroblastos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38
Fig 17. Actividad gelatinásica de pro MMP-2 en fibroblastos y miofibroblastos. . . . . . . 39
Fig 18. Actividad gelatinásica MMP-2 activa en fibroblastos y miofibroblastos. . . . . . . 39
Fig 19 Colágeno soluble miofibroblastos. Efecto de Leu8-BK. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40
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ABREVIATURAS
α-SMA : Alfa actina de músculo liso µg : Microgramo µl : Microlitro µm : Micrómetro µM : Micromolar Ang II : Angiotensina II APS : Persulfato de amonio B1R : Receptor de bradicinina subtipo 1 B2R : Receptor de bradicinina subtipo 2 BK : Bradicinina BSA : Albúmina de suero de bovino cAMP : AMP ciclico Ca2+ : Calcio csp : cantidad suficiente para DABK : des-Arg9-bradicinina DAKD : des-Arg10-kalidina DMEM F-12 : Dulbecco's Modified Eagle's Medium formula 12 DMSO : Di metil sulfoxido ECA : Enzima convertidora de angiotensina EDTA : Acido etilendiaminotetraacético eNOS : Oxido nítrico sintasa endotelial FBS : Suero fetal de bovino FCN : Fibroblastos cardiacos neonatos Fig : Figura Fluo 3-AM : Fluo-3-acetoximethylester GFP : Proteína fluorescente verde GMPc : guanosin mono fosfato ciclico HEPES : Acido N-2-hidroxietilpiperazina N-2-etanosulfónico iECA : Inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina IGFI - 1 : Factor de crecimiento análogo a insulina tipo 1 KD : kalidina Kd : Constante de disociación kDa : Kilo Dalton KKS : Sistema kalicreina-cinina IL 1β : Interleuquina 1β IL-4 : Interleuquina 4 IM : Isquemia miocardica iNOS : Oxido nítrico sintasa inducible Leu 8-BK : des-Arg9 Leu8-BK (antangonista B1R) Lys-BK : lisil bradicinina MAPK : Proteína quinasa activada por mitógenos MCN : Miofibroblasto cardiaco neonato MEC : Matriz extracelular mg : Miligramo min : Minuto
7
mL : Mililitro mm : Milímetro mM : Milimolar MMP : Metaloproteasa Na3VO4 : Ortovanadato de sodio NaCl : Cloruro de Sodio NaOH : Hidróxido de sodio NEP : Endopeptidas neutra nm : nanómetros nM : nanomolar nmoles : nanomoles
NO : Oxido nítrico NOS : Oxido nítrico sintasa PBS : Tampón fosfato salino PKC : Proteína kinasa C PLC : Fosfolipasa C PMSF : Fenilmetilsulfonifluoruro rpm : Revoluciones por minuto s : Segundos SD : Desviación estándar SDS : Dodecil sulfato de sodio SDS-PAGE : Gel de poliacrilamida desnaturante TBS : Tampón tris salino TCA : Acido tricloro acético TEMED : N,N,N´,N´-tetrametil-etilendiamina TGF-β1 : Factor de crecimiento transformante beta 1 TNF-α : Factor de necrosis tumoral α Tris : Tris-(hidroximetil)-aminoetano vs : Versus WB : Western blot
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RESUMEN
Los miofibroblastos cardíacos, son células diferenciadas desde fibroblastos por
efecto del TGF-β1 durante 84 horas, y secretan una gran variedad de mediadores
inflamatorios, citoquinas, y proteínas de la matriz extracelular (colágeno tipo I,
fibronectina, etc.). Además, presentan una amplia variedad de receptores, entre ellos
receptores de angiotensina y bradicinina.
Se han descritos 2 subtipos de receptores de bradicininas, B2R, receptor clásico y
constitutivo y B1R, receptor inducible en condiciones de exposición a citoquinas
inflamatorias y daño tisular. En este trabajo se estudió la presencia de B1R en
miofibroblastos, y tras su estimulación por agonistas específicos, su efecto sobre
proteínas de la matriz extracelular. Nuestros resultados mostraron que el receptor B1 de
bradicininas está presente en los miofibroblastos, mientras que está ausente en
fibroblastos cardiacos. El receptor B1, presente en miofibroblastos, es funcional ya que
DAKD y DABK agonistas selectivos B1R, activaron de forma temprana y transitoria la vía
de señalización que aumenta los niveles intracelulares de Ca2+. En respuesta a la
activación de B1R con DAKD se observó en forma tardía una disminución en el colágeno
soluble secretado al medio de cultivo, siendo este evento independiente de la actividad de
MMP-2 y de la viabilidad celular.
Últimamente se ha planteado un nuevo mecanismo de acción de iECAs en la cual
enalaprilato (molécula activa del enalapril) y captopril, pero no lisinopril, activan al B1R.
Nuestros resultados indican que captopril activó B1R, produciendo un aumento temprano y
transitorio de Ca2+ intracelular. Al igual que DAKD, captopril redujo la secreción de
colágeno en miofibroblastos, independiente de la acción de MMP-2 y de la viabilidad
celular. Captopril y lisinopril también redujeron el colágeno secretado en fibroblastos
cardiacos, y debido a la ausencia de B1R en fibroblastos, nuestros resultados sugieren
que ello se debería a la capacidad de los iECAs de bloquear la degradación de
bradicininas secretadas en forma endógena, las que activarían B2R, induciendo una
disminución en la secreción de colágeno soluble. Estos resultados agregan un nuevo
mecanismo por el cual los fármacos iECA serían capaces de modular el remodelamiento
cardiaco en pacientes hipertensos y/o con infarto cardiaco.
9
Activation of bradykinin B1 receptor in cardiac myofibroblasts by captopril:
Reduction of the collagen synthesis
SUMMARY The cardiac myofibroblasts, are differentiated cells from cardiac fibroblasts by TGF-
β1 during 84 hours, and secrete a variety of inflammatory mediators, cytokines,
extracellular matrix proteins (collagen type I, fibronectin, etc.). In addition, with a wide
variety of receptors, including Angiotensin and Bradykinin receptors.
Have been described 2 receptor subtypes of bradykinin, B2R, which is constitutive
and B1R, which is inducible after exposure to inflammatory cytokines or tissue injury. In the
present thesis we study the presence of B1R in cardiac myofibroblast and the effects of
specific agonist in changing the components of the extracellular matrix. Our results
showed that the B1R is present in the myofibroblasts, whereas it is absent in cardiac
fibroblasts. This receptor present in myofibroblasts, is functional because DAKD and
DABK selective agonists B1R, activated so early and temporary increases the levels of
intracellular Ca 2 +. In response to the activation of B1R with DAKD was observed late in a
decrease in collagen soluble secreted to the culture medium, this event is independent
from the activity of MMP-2 and cell viability.
Recently, there has arisen a new mechanism of action of iACE in which enalaprilat
(the active molecule enalapril) and captopril, but not lisinopril activate the B1R. Our results
indicate that B1R was activated by captopril, producing an early and transient increase of
intracellular Ca2+. Like DAKD, captopril reduced the secretion of collagen in
myofibroblasts, independent of the action of MMP-2 and cell viability. Captopril and
lisinopril also reduced the collagen secreted from cardiac fibroblasts, and due to the
absence of B1R in fibroblasts, our results suggest that this should be the ability of iACE to
block the degradation of bradykinin, which activated B2R, which ultimately leads to a
decrease in the secretion of soluble collagen. These findings add a new mechanism by
which drugs would be capable of ACE inhibitors modulate the cardiac remodeling in
patients with hypertension and / or cardiac infarction.
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INTRODUCCION
1.1 Generalidades
En Chile, y también a nivel mundial, la mortalidad por patologías cardiovasculares
corresponde aproximadamente al 30% del total (1). Las estimaciones futuras indican que
para el año 2020 esas enfermedades serán la causa del 73% de las defunciones y del
60% de la carga de morbilidad. Por este motivo, resulta de gran trascendencia investigar a
tanto a nivel clínico como básico las causalidades de estas patologías con el fin de
disminuir esas estimaciones (2).
1.2 Corazón
La mayoría de las patologías cardiovasculares se localizan en el corazón. En este
órgano la población celular está compuesta principalmente de cardiomiocitos 30% en
número y 70 % en masa, y por células no musculares (fibroblastos, células endoteliales,
células del músculo liso vascular, macrófagos residentes, mastocitos, etc), que
corresponden aproximadamente al 30% en masa y 70 % en número de células cardiacas,
de esta población celular la mayoría son fibroblastos cardiacos (3).
1.2.1 Fibroblastos cardiacos
Inicialmente se pensó que los fibroblastos cardiacos tenían una función
meramente estructural, sin embargo, hoy se sabe que son un elemento celular muy
activo, pues los fibroblastos poseen una amplia variedad de receptores, y secretan
diversos factores de crecimiento y citoquinas, los que pueden actuar en forma autocrina
y/o paracrina. Además son blanco para una amplia variedad de estímulos tanto
mecánicos como químicos (4), mediante los cuales pueden migrar, proliferar y
diferenciarse a un fenotipo mucho más activo (5). En condiciones normales, la principal
función del fibroblasto es producir proteínas de la matriz extracelular (MEC),
principalmente colágeno y fibronectina, las que forman la matriz tridimensional que
11
sustenta a los cardiomiocitos, mientras que en estados patológicos o de daño tisular
participan activamente en el proceso de cicatrización (3,6). Otro hecho importante es la
gran interacción que existe entre los fibroblastos y los cardiomiocitos. Por ejemplo, los
factores de crecimiento liberados desde el cardiomiocito por estiramiento mecánico,
actúan sobre el fibroblasto induciendo su proliferación y síntesis de colágeno. Por otro
lado, el fibroblasto secreta angiotensina II (Ang II) y endotelina las que en forma paracrina
inducen la hipertrofia del cardiomiocito (3). Una última e importante característica del
fibroblasto cardiaco es su capacidad de diferenciarse a un fenotipo mucho más activo
denominado miofibroblasto. Bajo condiciones patológicas como un infarto miocárdico, se
liberan al medio intersticial mediadores tanto paracrinos como autocrinos como el factor
de crecimiento transformante subtipo beta 1 (TGF-β1), factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF), factor de crecimiento análogo a la insulina tipo II (IGF-II) y la
interleuquina-4 (IL-4), los que estimulan la proliferación del fibroblasto cardiaco y su
diferenciación a miofibroblasto (7).
1.2.2. Miofibroblastos cardiacos
El miofibroblasto posee una amplia variedad de receptores, además secreta
diversos factores de crecimiento, citoquinas, quimioquinas, mediadores inflamatorios y
proteínas de la matriz extracelular, los que actúan en forma paracrina y autocrina (7). Este
fenotipo celular tiene como principal característica la presencia de microfilamentos
citoplasmáticos formados por diferentes tipos de proteínas, siendo una de ellas la α-actina
de músculo liso (α-SMA) (8). Esta proteína es uno de los principales marcadores del
fenotipo del miofibroblasto. Este tipo celular que no es residente normal del tejido cardiaco
también se caracteriza por la secreción disminuida de metaloproteasas (MMPs) y
aumento en la producción de proteínas de la matriz extracelular, lo que se traduce
finalmente en un aumento en el tejido fibrótico (9). La principal función de estas células es
la reparación tisular (cicatrización) después de la injuria o daño tisular, como un infarto
cardiaco. Se desconoce porqué los miofibroblastos persisten en el infarto cardiaco
después de largo tiempo, en comparación a los miofibroblastos de la piel, los cuales
desaparecen por apoptosis una vez sanada la herida (10).
Comparativamente, los fibroblastos manifiestan un comportamiento celular
(proliferación, adhesión, migración y contracción de geles de colágeno) y de secreción de
12
proteínas de la MEC totalmente diferente a lo miofibroblastos, siendo más efectivos en
proliferación y migración, mientras que los miofibroblastos presentan mayor adhesión y
secreción de proteínas de la MEC (11,12).
1.3 Infarto y remodelado cardíaco
El remodelado cardiaco es importante en la progresión de enfermedades
cardiovasculares como el infarto de miocardio, las enfermedades cardiacas valvulares,
miocarditis y miocardiopatía dilatada (11). En el proceso de remodelado están involucrados
fibroblastos, los cuales son reclutados hacia las zonas dañadas, miofibroblastos, que
presentan mayor capacidad de adhesión, y de producción de proteínas de la MEC (15,16), la
vascularización coronaria y miocitos cardiacos (13.). La progresión del remodelado
ventricular después de los acontecimientos indicados incluye: disminución y reducción de
miocitos en el área infartada, dilatación de la cámara ventricular, fibrosis, formación de
cicatriz y acumulación excesiva de matriz intersticial (14).
En el infarto cardiaco los niveles plasmáticos de angiotensinógeno y renina están
aumentados. También en zonas de alto recambio de colágeno (como por ejemplo en
zonas de infarto al miocardio), existe una alta densidad y actividad de ECA (enzima
convertidora de angiotensina) (10) , el aumento de ECA en la cicatriz del infarto aumenta la
concentración local de Ang II y a su vez aumenta la degradación de cininas, lo que
contribuye a la formación de tejido fibrótico a través de la sobreproducción de TGF-β1. (10).
Otros estudios han demostrado también que Ang II produce dos efectos sobre la MEC
cardiaca, induce acumulación de colágeno (aumento en la síntesis de esta proteína) y
disminuye la degradación de colágeno, efecto que estaría mediado por MMPs (17)
1.31 Tratamiento farmacológico
En un intento de reducir la fibrosis cardíaca y sus efectos adversos sobre la forma
y función ventricular, se han utilizado diversos fármacos, como los inhibidores de la ECA
(iECA), los cuales, normalizan la presión arterial, inhiben la producción del anión
superóxido, disminuye la degradación de cininas (18) y aumento de oxido nítrico (NO), que
ejerce acciones vasodilatadoras y disminuye el colágeno de la matriz extracelular (19). La
13
bradicinina aumenta las MMP y disminuye el colágeno, mientras que la adenosina,
aumenta los valores cardíacos de AMPc, GMPc y NO, disminuye la fibrosis (19).
Durante la isquemia coronaria aumenta marcadamente la liberación de cininas que
reducen el área de infarto, el remodelado ventricular, la incidencia y duración de las
arritmias ventriculares (20). Por el contrario, en modelo animal, los ratones que carecen de
receptores de bradicininas subtipo 2 (B2R) presentan dilatación ventricular y
cardiomiopatía.(21)
1.4 Cininas
Las cininas son importantes mediadores peptídicos de diversas respuestas fisio-
patológicas en el organismo, sus acciones son producidas principalmente por dos cininas
endógenas: Bradicinina (BK) y Lis-bradicinina (Lys-BK), también llamada kalidina (KD) (22),
dichos péptidos actúan localmente y producen dolor, vasodilatación, mayor permeabilidad
vascular y síntesis de prostaglandina y oxido nítrico (23). De este modo, integran un
subgrupo de un gran número de mediadores que contribuyen a la respuesta inflamatoria
Bradicinina y kalidina tienen una vida media muy corta (10-50s) en plasma, in-vitro
e in-vivo (22). Ambos péptidos son inactivados por cininasa II, también conocida como
ECA, la cual remueve el C-terminal de BK o KD, generando fragmentos biológicamente
inactivos (50-70%), además la NEP degrada alrededor de un 30% de BK y KD. Menos
de un 10% de BK es degradada por cininasa I, la cual es responsable de la generación de
residuos des-Arg-cininas (24)
1.4.1 Receptores de bradicinina
Se conocen dos receptores diferentes de cininas que han sido llamados B1 y B2
(Regoli y Barabé, 1980). El receptor clásico, llamado ahora B2 (B2R), liga selectivamente
BK y KD, y es constitutivo de casi todos los tejidos normales (22). El receptor B1
normalmente se expresa en pocos tipos de células pero en condiciones tales como
isquemia, ateromatoma, o exposición a citoquinas inflamatorias, rápidamente se induce la
expresión de este receptor (25). Esto ocurre en variados tipos de células, sean estas
provenientes de líneas celulares, animales o humanos (26).
14
B1R está inserto en la superfamilia de receptores acoplados a proteína G, su
activación estimula la hidrólisis de fosfatidil inositol e incrementa el calcio intracelular (24-27-
28) (ver Fig. 1). Este receptor liga de modo selectivo a los metabolitos des-Arg en la
terminación carboxi, de BK y KD. Otra característica del B1R es su up-regulation, la cual
ocurre tanto in-vivo como in-vitro. La up-regulation ocurre bajo el control de citoquinas
liberadas en situaciones de trauma y estrés, las más comunes de este proceso son:
interleukina (IL-1β), factor necrosis tumoral (TNF α) e interferon γ (29).
Fig. 1. Receptores de cininas y vías de transducción implicadas en su efectos fisiológicos. (Adaptado de Madeddu P, Emanueli C, El-Dahr S. Mecanismos de enfermedad: el sistema cininas-kalicreinas en hipertensión y
remodelamiento vascular. Nat Clin Pract Nephrol. 2007 ;4:208-21.)
1.5 Enzima Convertidora de Angiotensina I (ECA)
Los miofibroblastos se caracterizan además, por presentar altos niveles de
actividad de ECA (30). Específicamente, a nivel cardiaco en los primeros días post infarto al
miocardio no hay indicios de actividad ECA en el lugar de la cicatriz, sin embargo, ella
varía considerablemente en las 2 semanas posteriores, durante las cuales, rodeando al
sitio del infarto comienzan a proliferar miofibroblastos (visibles por inmunohistoquímica de
15
α-SMA). Junto con la aparición de miofibroblastos existe un gran aumento de actividad
ECA, la cual persiste hasta el final del proceso de cicatrización (10).
La ECA está presente en 2 vías diferentes, la primera es la conversión del péptido
angiotensina I en angiotensina II (metabolito activo) eliminando el dipéptido terminal
carboxilo (His-Leu). Posteriormente ECA es responsable del paso entre angiotensina (1-7)
y angiotensina (1-5). La segunda vía es la conversión de bradicininas en los metabolitos
inactivos bradicinina (1-7) y bradicinina (1-5), escindiendo los últimos 2 o 4 aminoácidos
del terminal carboxilo, según corresponda (31).
1.5.1 Inhibidores de la Enzima Convertidora de Angiotensina (iECAs)
Los iECA son administrados a decenas de millones de pacientes en todo el mundo
para el tratamiento de la hipertensión arterial, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca,
o la nefropatía diabética (32), los cuales han demostrando reducir la mortalidad y morbilidad
asociada a patologías cardiovasculares (33) .Varios mecanismos pueden dictar el modo de
acción de los iECA a nivel celular y molecular. Mediante la inhibición de la ECA estos
fármacos no sólo suprimen la conversión de Ang I a Ang II, si no que también bloquean la
inactivación de BK (34-35-36) y otros sustratos de ECA (37). Además, los inhibidores de la
ECA también potencian los efectos de la bradicinina (38-39), inducida a través de una
conversación cruzada entre ACE y los B2R de bradicinina (39-40). Recientemente se ha
demostrado un nuevo modo de acción de los iECA los que pueden activar directamente
los receptores B1 en células en cultivo (41). Los iECAs han mostrado modular en forma
positiva el remodelado de la matriz extracelular después del infarto cardiaco evitando la
excesiva acumulación de colágeno (42-43), además estudios en animales corroboran la
atenuación de hipertrofia y fibrosis (31-32).
La mayoría de los iECAs usados actualmente se presentan en forma de pro-droga
(requieren de esterasas para su activación), exceptuando lisinopril y captopril, los cuales
son activos sin necesidad de ser previamente metabolizados.
16
1.6 Nuevo modo de acción iECAs
La nueva modalidad de acción de IECAs demostró que enalaprilato (molécula
activa del enalapril) y captopril, pero no lisinopril, activan B1R (41). Para medir la activación
de B1R se evalúa el aumento de la concentración de calcio intracelular como indicador a
través de una sonda fluorescente, al estimular con enalaprilato o DAKD la fluorescencia
aumenta, señal que es bloqueada al preincubar con Leu 8-BK, antagonista especifico de
B1R
La activación de B1R por iECAs se realiza por la unión de estos al segundo loop
extracelular en una secuencia de unión a zinc (HEXXH, secuencia de consenso entre
aminoácidos 180-200 aprox), Esta acción se comprobó con receptores B1 mutados en
esta secuencia, células en las cuales el receptor no fue activado. Esta secuencia está
ausente en el receptor B2, debido a esto los iECAs no tienen efectos en dicho receptor. En
resumen, los iECAs afectan indirectamente la acción de BK en B2R (impidiendo
degradación de BK) (38).
En tratamientos prolongados con iECAs se induce expresión de eNOS (44),
posiblemente la liberación de NO gatillada por la activación de B1R podría contribuir al
tratamiento con iECAs al infarto al miocardio y enfermedades cardiacas, sean estas
crónicas o agudas.
Los antecedentes anteriormente sugieren que los miofibroblastos (células que se
presentan en condiciones de daño por mediadores pro-inflamatorios; TGF-β1) podrían
presentar receptores tipo B1 de bradicininas, por lo tanto, se esperaría un efecto de los
iECA y residuos del tipo des-Arg-cinina, mediando las acciones de síntesis de proteínas
de la MEC, y comportamiento celular a través de este receptor
17
2. HIPÓTESIS
TGF-β1 induce la expresión del receptor B1 de bradicininas en miofibroblastos
cardiacos de ratas neonatas, los cuales al ser activados por agonistas selectivos (DAKD o
DABK) o fármacos iECAs modulan la secreción de proteínas de la matriz extracelular.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Demostrar que la activación de B1R tiene un efecto antifibrótico en miofibroblastos,
disminuyendo la secreción de proteínas de la matriz extracelular.
3.2 Objetivos específicos
1. Demostrar que TGF-β1 induce el receptor B1 de cininas en miofibroblastos
cardiacos
2. Demostrar la funcionalidad del B1R en miofibroblastos cardiacos y su respuesta a
agonistas selectivos B1R e iECAs
3. Determinar efectos de agonistas selectivos B1R en la secreción de proteínas de la
matriz extra celular, proliferación y actividad gelatinásica de metaloproteasas.
4. Determinar efectos de iECAs en la secreción de proteínas de la matriz extra
celular, proliferación y actividad gelatinásica de metaloproteasas.
18
4. MATERIALES Y METODOS
4.1 Reactivos
De Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EEUU): MTT, Tritón X-100, azul de tripán,
De Gibco BRL (Carlsbad, California EEUU): tripsina-EDTA, estándares para
masas moleculares de proteínas pre-teñidas, suero fetal de bovino (FBS).
De MERCK (Darmstadt, Alemania): compuestos inorgánicos y orgánicos, sales,
ácidos y solventes
De Perkin Elmer Life Sciences, Inc. (Boston, MA, EEUU):. El reactivo
quimioluminiscente para Western blot (Western Lightning)
De Falcon (USA): material de plástico estéril para la obtención y cultivo de
fibroblastos cardíacos.
De Chemicon (Tamecula, USA): TGF-β1
De Calbiochem (La Jolla, CA, EEUU): Los anticuerpos secundarios anti-IgG de
conejo y ratón conjugado a peroxidasa
4.2 Modelo animal
Ratas Sprague-Dawley neonatas (2 a 3 días de edad), provenientes del bioterio de
la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile, en cumplimiento
de todas las normas éticas referidas a la utilización de animales.
4.3 Aislamiento y cultivo de fibroblastos cardíacos de ratas neonatas
Se utilizó el procedimiento descrito por Foncea y cols (45), con leves
modificaciones. Las ratas se decapitaron e inmediatamente se les removió el corazón bajo
condiciones de asepsia, se retiraron las aurículas y los ventrículos se cortaron en
pequeños pedazos para facilitar las sucesivas digestiones posteriores con pancreatina y
19
colagenasa II. El producto de las digestiones se sometió a un preplaqueo por 2 h a 37ºC
en medio de cultivo conteniendo 5% FBS y 10% FCS en frascos para cultivo de plástico.
Por adhesión diferencial al plástico se separaron fibroblastos de cardiomiocitos. Luego de
las 2 h, se cambió el medio por DMEM-F12 + 10% FBS, los fibroblastos se dejaron
proliferar hasta confluencia y los cambios de pasaje se realizaron mediante tripsinización
(hasta pasaje 2 como máximo).
4.4 Diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos
Se utilizaron fibroblastos cardiacos neonatos (FCN) en pasaje 2, los cuales se
cultivaron por 84 h en medio DMEM-F12 suplementado con TGF-β1 5 ng/mL. En estas
condiciones cerca del 100% de los fibroblastos se diferenciaron a miofibroblastos. Una
vez cumplido el tiempo se retiró el medio suplementado y los miofibroblastos se
mantuvieron por 24 h con DMEM-F12, los miofibroblastos obtenidos se utilizaron para los
ensayos posteriores.
5.5 Preparación de extractos celulares totales
Se prepararon extractos de proteínas totales para evaluar la expresión del receptor
de bradicininas tipo 1, y de ECA. FCN se sembraron en placas de 100 mm a una
densidad de 2x104 cel/cm2., las células se lavaron tres veces con PBS frío y luego se
lisaron con 100 µL de tampón de lisis RIPA (Tris-HCl 10 mM pH 7,2; EDTA 5 mM; NaCl
150 mM; Tritón X-100 1% v/v; SDS 0.1% v/v; deoxicolato 1% v/v; leupeptina 2 µg/mL;
benzamidina 10mM; PMSF 1 mM y Na3VO4 100 µM). El homogeneizado se centrifugó a
10.000 rpm durante 10 min a 4°C. El sobrenadante se recuperó en un tubo nuevo, se
determinó la concentración de proteínas por el método de Bradford (Bio-Rad protein
assay) y se desnaturó en tampón SDS-PAGE 4X (glicerol 20 mL, 2-mercaptoetanol 10
mL, SDS 5 g, Tris base 1,51 g, Azul de bromofenol 0,01 g, Agua csp. 100 mL, pH 6.8),
para ser almacenado a –20°C. El procedimiento se repite de la misma forma en el
caso de MCN.
20
4.6 Electroforesis en geles de poliacrilamida
La separación de las proteínas de acuerdo a su masa molecular se realizó
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida según Laemmli, 1970. Para la
detección se cargaron 75 µg de extracto proteico para B1R y 50 µg para ECA;.Los geles
concentrador y separador fueron al 5 y 8%, respectivamente, La electroforesis se realizó a
un voltaje constante de 90 Volt en tampón de electroforesis (Tris base 30,25 g, glicina 144
g, SDS 10 g, agua 1000 mL para tampón de electroforesis 10X).
4.7 Electrotransferencia de proteínas
Una vez realizada la electroforesis, las proteínas se electrotransfirieron a una
membrana de nitrocelulosa (BioRad) de 0,2 µ a 0,35 Amperes durante 90 min en tampón
de transferencia.
4.8 Inmunowestern blot
Una vez transferidas, la membranas se bloquearon con tampón de bloqueo (TBS;
Tween-20 0,1% (TBS-T); leche sin grasa 6% p/v) durante 1 h a temperatura ambiente y
posteriormente se incubaron con los anticuerpos primarios correspondientes según
ensayo. B1R en tampón de incubación (TBS-T 0,1%) a una dilución 1:1000 toda la noche
a 4°C con agitación suave. Para ECA se usó tampón de incubación (TBS-T 0,1%) a una
dilución 1:5000 durante 4 h a temperatura ambiente con agitación suave. Posterior a la
incubación, las membranas se lavaron 3 veces por 10 min en TBS–T al 0,1%, e incubadas
durante 2 h a temperatura ambiente con el segundo anticuerpo anti-IgG de conejo o ratón
conjugado con peroxidasa, a un título de 1:5000 en tampón de bloqueo TBS-T al 0,1%.
Para detectar las proteínas, las membranas, previamente lavadas, se incubaron
durante 1 min con el sustrato quimioluminiscente “Western Lightning” y se expusieron a la
película de fotografía Kodak-Biomax. Las películas se digitalizaron y las imágenes fueron
sometidas a densitometría con ayuda de los programas computacionales Corel ® Paint
Shop Pro Photo X2 y USI. Después de realizar los ensayos de inmunowestern blot, las
membranas de nitrocelulosa se incubaron por 45 min en una solución de rojo Ponceau
(rojo Ponceau 2%, TCA 30%, ácido sulfosalicílico 30%) para desprender los anticuerpos,
21
posteriormente se lavaron en TBS–T al 0,1% por tres veces. Luego de este tratamiento,
las membranas pudieron ser reutilizadas para ensayos de Western blot con vimentina
como control de carga .
4.9 Análisis de morfología por microscopía de transmisión y epifluorescencia
Para analizar la morfología celular, los niveles de confluencia y la eficiencia de la
transducción adenoviral de la proteína fluorescente verde (GFP) se utilizó un microscopio
epifluorescente Axiovert, Carl Zeiss a un objetivo 40X. Las imágenes fueron registradas
con una cámara digital Olympus C-4000, de 4.0 megapixeles.
4.10 Determinación de niveles intracelulares de Ca2+
Las imágenes de calcio intracelular se obtuvieron a partir de MCN sembrados en
cubreobjetos. MCN se preincubaron con fluo-3-acetoximethylester (Fluo-3 AM,Molecular
Probes, Eugene, OR) en Krebs buffer (145 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.6 mM CaCl2, 1 mM
MgCl2, 10 mM HEPES-Na, 5.6 mM glucosa, pH 7.4) por 20 minutos en incubadora (37°C,
5%, CO2) usando un microscopio de epifluorescencia (Olympus Diaphot-TMD, Nikon
Corporation) equipado con una cámara CCD enfriada y un sistema de adquisición de
imágenes que comandaba las secuencias fotográficas desde un computador (Spectra
Source MCD 600).
Los miofibroblastos se incubaron por 20 minutos con 200μL de Fluo-3 AM,
volumen que permanecía en la placa por tensión superficial, constatándose que era una
cantidad suficiente de sonda para cargar a la totalidad de la población celular analizada
en cada experimento.
Posterior a la carga, se trasladaba el cubreobjeto a la cámara del microscopio de
epifluorescencia (volumen final: 1mL) donde se lavaron tres veces con medio Krebs con
Ca2+ para remover el medio de cultivo (DMEM-F12) y la sonda que podría quedar en
solución generando un aumento de la fluorescencia basal del medio afectando la nitidez
de las adquisiciones.
22
Cada vial de Fluo-3 AM, fue preparado en 30 μL de ácido plurónico en DMSO
(20% p/v) para luego ser llevado a un volumen final de aproximadamente 8 mL de la
solución Krebs con calcio antes señalada, logrando la concentración deseada de la sonda
(5.4μM). Los cubreobjetos montados en la cámara del microscopio fueron excitados a
una longitud de onda de 488 nm proveniente de un sistema de filtros. La totalidad de las
imágenes de fluorescencia fueron capturadas como campo reducido (sub frame) para
captar movimientos rápidos de calcio intracelular (duración de la adquisición de cada
imagen: 1.8s). Las imágenes fueron analizadas cuadro a cuadro con el programa de
adquisición de imágenes del equipo (Spectra-Source).
El calcio intracelular se expresa como porcentaje de fluorescencia relativa respecto
a la fluorescencia basal Fo: (ΔF = (F – Fo) /Fo ). Ya que estamos utilizando una sonda
fluorescente sensible a calcio, la intensidad de la fluorescencia es proporcional al
aumento en los niveles de calcio intracelular (27).
4.10.1 Procesamiento digital de las imágenes (Ca2+)
La secuencia fotográfica capturada en cada experimento fue corregida mediante la
substracción de la fluorescencia basal correspondiente a una imagen fluorescente anterior
al estímulo. La intensidad promedio de la región de interés (normalmente correspondiente
a la superficie del núcleo) localizada tanto en núcleo como citoplasma fue recogida para
representar F(t). La señal fue normalizada como (F(t)-Fo)/Fo. Valores de P <0.05 fueron
considerados como estadísticamente significativos (test de ANOVA, test de t).
4.11 Colágeno soluble
Se preparó medio de cultivo de FCN MCN para evaluar secreción de colágeno
soluble. Las células se sembraron en placas de 60 mm a una densidad de 2x104 cel/cm2 y
fueron incubadas en DMEM-F12 durante 48 hrs, placas controles y en presencia de
estímulos (DAKD, captopril, lisinopril, Ang II, TGFβ1), se tomó el medio de cultivo celular y
se centrifugó a 10.000 rpm durante 5 min a 4°C. El sobrenadante se recuperó en un tubo
nuevo. Colágeno soluble en medio de cultivo fue medido según indicaciones de “Sircol ®
soluble collagen assay” con modificaciones al protocolo.
23
En un tubo epperndorf se tomó 300uL de medio de cultivo ya preparado y 500 uL
de Dye Reagent, se homogeniza durante 30 minutos en mezclador mecanico a
temperatura ambiente, cumplido el tiempo se centrifuga a 15.000 RPM durante 10
minutos, posteriormente el sobrenadante es descartado. El pellet es resuspendido en
500uL de Alkali reagent, homogenizando en mezclador de vortex. La solución es medida
por espectrofotometría a una longitud de onda de 540 nm.
4.12 Proliferación
Se utilizaron FCN y MCN obtenidos como se describe en el punto 5.4. Se
sembraron 3x105 células en placas de 60 mm, fueron incubadas en DMEM-F12 durante
24 y 48 hrs. en presencia de los estímulos (DAKD, captopril), cumplidos estos tiempos, las
células fueron lavadas con PBS, 3 veces y luego fueron tripsinizadas y posterior
neutralizado con FBS 10%. El número de células fue determinado mediante conteo celular
con azul de tripán. Los procedimientos de lavado, tripsinización, neutralización y conteo
fueron ocupados para placas sin estímulos (controles) en tiempos de 0, 24 y 48 horas
4.13 Zimografía
Las células se sembraron en placas de 60 mm a una densidad de 2x104 cel/cm2.
Una vez estimuladas, se tomó el medio de cultivo celular y se centrifugó a 10.000 rpm
durante 5 min a 4°C. El sobrenadante se recuperó en un tubo nuevo, se agregó tampón
no denaturante SDS-PAGE 5X (glicerol 20 mL, 10 mL, SDS 5 g, Tris base 1,51 g, Azul de
bromofenol 0,01 g, Agua csp. 100 mL, pH 6.8), para ser almacenado a –20°C. La
separación de las proteínas de acuerdo a su masa molecular se realizó mediante
electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de gelatina soluble (200 mg/mL).
Para la detección se cargaron 40 µL de medio de cultivo. Los geles concentrador y
separador fueron al 5 y 8%, respectivamente. La electroforesis se realizó a un voltaje
constante de 90 Volt en tampón de electroforesis (Tris base 30,25 g, Glicina 144 g, SDS
10 g, agua 1000 mL para tampón de electroforesis 10X).
Luego de realizar la corrida electroforética el gel se lavó 3 veces por 15 min. en
una solución de Tritón X100 al 2,5% y luego se incubó en un tampón que contenía (NaCl
24
5 M, Tris-HCl, CaCl2 1 M, ZnSO4) por 24 h. a 37 °C, lo que favorece la actividad de las
proteasas. El resultado de este tipo de geles, se visualiza por la degradación la gelatina
en la zona donde se ubicó una proteasa. Esta degradación se revela tiñiendo el gel con
una solución de azul de Coomassie (metanol 20%, ácido acético 50 %, H2O y azul de
Coomassie) con agitación constante, por un periodo de 48 h., luego el gel se destiñe con
una solución de metanol 20% - ácido acético 50%, observándose una zona blanca donde
hubo degradación. Los geles se digitalizaron y las imágenes fueron sometidas a
densitometría con ayuda de los programas computacionales Corel ® Paint Shop Pro
Photo X2 y USI.
4.14 Análisis estadístico
Los resultados mostrados corresponden al promedio ± SD de, al menos, tres
experimentos independientes. Los datos se analizaron por ANOVA y la prueba Tuckey
para determinar la significancia estadística de los resultados
25
5. RESULTADOS 5.1 Diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos por efecto de TGF-β1
En este trabajo se utilizó TGF-β1 a una concentración de 5 ng/mL para diferenciar
fibroblastos a miofibroblastos. La diferenciación se analizó por la presencia de la proteína
alfa-actina del músculo liso (a-SMA) por Western Blot e inmunocitoquímica. Nuestros
resultados por Western blot, indicaron que TGF-β1 induce un aumento en la expresión de
a-SMA dependiente del tiempo, alcanzando el máximo a las 84 h (6,4 ± 3,0 veces
respecto el control) (fig. 2),. Como control de carga se utilizó vimentina, una proteína del
citoesqueleto utilizada como marcadora de fibroblastos y miofibroblastos. Los resultados
por inmunocitoquímica mostraron que α-SMA se localiza solamente en las fibras de estrés
de los miofibroblastos (fig. 3), estas estructuras se caracterizan por formar haces
filamentosos (detectada por un segundo anticuerpo conjugado a fluoresceina
isotiocianato). Estas fibras de estrés no se observan en fibroblastos. Como control interno
se inmunodetectó vimentina. Los resultados muestran además, que el miofibroblasto tiene
un mayor tamaño celular que el fibroblasto.
Otra proteína característica de la diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos
es el aumento en la expresión de la enzima convertidora de angiotensina (ECA).
Resultados por Western blot para la expresión de ECA (fig. 4) indican un aumento de 25,4
± 3,9 veces en miofibroblastos respecto de los fibroblastos.
________________________________________________________________________Fig. 2. Efecto de TGF-β1 sobre la expresión de la proteína a–SMA. Fibroblastos cardiacos neonatos
fueron privados de suero y estimulados con TGF-β1 5 ng/mL por 24, 48, 72 y 84 h. en DMEM-F12. IWB
representativo de a–SMA y vimentina. En el panel inferior se observa el análisis gráfico de la expresión en el
tiempo de a–SMA normalizada por vimentina. Se muestra la cuantificación de cuatro experimentos
independientes expresados como el promedio ± SD. *** p < 0.001 vs 0 h
26
Fig.3.. Inmunolocalización de α-SMA en fibroblastos cardiacos neonatos estimulados con TGF-β1.
Fibroblastos fueron privados de suero y estimulados con TGF-β1 5 ng/mL por 84 h. en DMEM-F12.
Inmunodetección de α-SMA (FITC) y vimentina (FITC) en fibroblastos y en miofibroblastos. Los núcleos se
identificaron con Topro (azul). Se muestra una figura representativa de tres experimentos independientes
(magnificación 40X)
_______________________________________________________________________ Fig. 4. Expresión de la ECA en Fibroblasto y Miofibroblasto. Fibroblastos se privaron de suero y
estimularon con TGF-β1 5 ng/mL por 84 h. en DMEM-F12. Panel superior: IWB para ECA, se observa la
expresión de ECA en miofibroblastos y escasamente en fibroblastos. Panel inferior: se observa el análisis
gráfico de la expresión de ECA. Se muestra la cuantificación de tres experimentos independientes expresados
como el promedio ± SD (miofibroblasto 5,5 ± 2,0 y fibroblasto 0,21±0,01)
27
5. 2 Expresión del receptor B1 de bradicininas en miofibroblastos.
El análisis de la expresión de B1R se realizó por Western blot. Los fibroblastos
fueron tratados con TGF-β1 5 ng/mL durante 84 h, tiempo necesario para su diferenciación
a miofibroblastos. Los resultados indicaron que este receptor no se encuentra presente en
fibroblastos, sin embargo lo está en miofibroblastos. (fig. 5). Como control de carga se
utilizó β-tubulina.
5.3 Funcionalidad del receptor B1 de bradicinina.
Una vez demostrada la presencia de B1R en miofibroblastos se evaluó la
funcionalidad de este receptor. Para ello los miofibroblastos fueron estimulados con los
respectivos agonistas del receptor B1 y se analizó el aumento en la concentración de
calcio intracelular utilizando la sonda FLUO-3AM. Para ello los fibroblastos fueron
deprivados de suero por 24 horas e incubados en medio DMEM F-12 con calcio,
posteriormente, se incubaron con la sonda FLUO-3AM. Como controles positivos para
verificar la capacidad del miofibroblasto para producir una respuesta positiva en la señal
de calcio, se ocuparon como estímulos Ang II 100nM y BK 1 uM, esto debido a
antecedentes de la literatura que indican la presencia de esos receptores en
miofibroblastos. En ausencia de estímulos (condición basal) no se observa aumento en la
señal de calcio intracelular, sin embargo, con Ang II o BK se observó una respuesta
rápida y de corta duración en la señal, indicando un aumento rápido y transitorio en la
concentración de calcio intracelular (fig. 6).
La funcionalidad del receptor B1R se realizó ocupando los agonistas específicos de
este receptor: des-Arg10-kalidina (DAKD) y des-Arg9-bradicinina (DABK) ambos en
concentración 1uM. La respuesta de la señal de fluorescencia fue rápida y transitoria, lo
que indica que el aumento en los niveles intracelulares concentración de calcio fue
también rápido y transitorio. Con ambos estímulos (DAKD y DABK), se observaron
señales similares en duración e intensidad (fig. 7).
Para verificar la especificidad de la acción de BK, DAKD y DABK sobre los
receptores B2 y B1 respectivamente, se utilizó des-Arg9[Leu8]BK (1 uM), un antagonista del
receptor B1 de bradicinina. BK en presencia del antagonista específico del receptor B1
(Leu8-BK), indujo un aumento en la concentración de calcio intracelular en
28
miofibroblastos, el cual fue retrasado respecto de BK sola, aunque también fue transitorio
y rápido, indicando que BK actúa a través del receptor B2 y no del B1. De la misma
manera, los resultados muestran que DAKD y DABK en presencia del antagonista del
receptor B1 (Leu 8 - BK), no inducen en los miofibroblastos un aumento en la
concentración de calcio intracelular, lo que indicaría que ambos agonistas actúan de
manera específica sobre el receptor B1 (fig. 8).. Estos ensayos corroboran que el receptor
B1 inducido por TGF-β1 en miofibroblastos es funcional al ser capaz tanto con DABK y
DAKD de activar la vía transduccional que lleva a un aumento en la concentración de
calcio intracelular.
_______________________________________________________________________
Fig. 5. Niveles de expresión del receptor B1 cininas en miofibroblastos cardiacos. Fibroblastos fueron
privados de suero y estimulados con TGF-β1 5 ng/mL por 84 h. en DMEM-F12. Panel superior: IWB para B1R,
se observa la presencia del receptor B1 de bradicininas en miofibroblastos y no en fibroblastos. Panel inferior:
se observa el análisis gráfico de la expresión de B1R normalizada por β-tubulina. Se muestra la cuantificación
de tres experimentos independientes expresados como el promedio ± SD
29
________________________________________________________________________
Fig. 6. Ang II y BK aumentan los niveles intracelulares de calcio en miofibroblastos. Los miofibroblastos
se pre incubaron 20 minutos con la sonda Fluo 3-AM, y posteriormente estimulados con Ang II 100nM y
bradicinina 1 uM. Ambos estímulos inducen un aumento temprano y transitorio en la señal de calcio al activar
los receptores AT1 y B2 respectivamente. Se muestra la cuantificación de tres experimentos independientes
expresados como el promedio de fluorescencia relativa ((F-F0) / F0)*100 ± SD
_______________________________________________________________________
Fig. 7. DABK y DAKD aumentan los niveles intracelulares de calcio en miofibroblastos. Los
miofibroblastos se pre incubaron 20 minutos con la sonda Fluo 3-AM y luego estimulados con DABK y DAKD.
Ambos estímulos (en concentración 1 uM) producen un aumento en la concentración de calcio intracelular. Se
muestra la cuantificación de tres experimentos independientes expresados como el promedio de fluorescencia
relativa ((F-F0) / F0)*100 ± SD
30
_______________________________________________________________________
Fig. 8. Aumento en la concentración de calcio intracelular por BK, DABK y DAKD en miofibroblastos en presencia de (Leu 8-BK) un antagonista específico de B1R. La especificidad de la acción de BK, DABK
y DAKD y funcionalidad de los receptores B2 y B1 de miofibroblastos se evaluó midiendo el aumento en la
concentración de calcio intracelular. Los miofibroblastos fueron pre incubados 20 minutos con la sonda Fluo 3-
AM y luego preincubados con Leu 8-BK (1uM) y posteriormente estimulados con BK, DABK o DAKD (1uM).,
Se muestra la cuantificación de tres experimentos independientes expresados como el promedio de
fluorescencia relativa ((F-F0) / F0)*100 ± SD
5.4 Efecto de DAKD sobre la secreción de colágeno en fibroblastos y miofibroblastos.
Se evaluó el efecto de DAKD sobre la secreción de colágeno al medio de cultivo
celular (DMEM F-12) de fibroblastos y miofibroblastos a las 48 horas de incubación, Para
ello se utilizó el kit para medición de colágeno Sircol ® (soluble collagen assay). Los
resultados muestran que DAKD (100nM) redujo la secreción de colágeno soluble en
miofibroblastos en un 34% ±1 (p<0.0001) (fig. 9), mientras que en los fibroblastos DAKD
no disminuyó la secreción de colágeno.
31
_______________________________________________________________________
Fig. 9. Efecto de DAKD sobre la secreción de colágeno al medio de cultivo de fibroblastos y miofibroblastos. Las células se deprivaron de suero por 24 horas y luego se estimularon con DAKD 100 nM,
el medio de cultivo se recolectó a las 48 horas. El colágeno soluble se determinó por kit de colágeno Sircol ®
soluble collagen assay. Los resultados muestran el promedio ± SD para cuatro experimentos independientes
(*** P<0.0001)
5.5 Efecto de DAKD sobre la viabilidad de fibroblastos y miofibroblastos
Se evaluó el efecto de DAKD (100nM) en la sobrevida de fibroblastos y
miofibroblastos a los tiempos de 24 y 48 horas. Para ello se utilizó el método de conteo
celular con azul de tripán Los resultados muestran que en ambos tipos celulares DAKD
no tiene efectos inductores de muerte o efectos proliferativos respecto de los controles en
ambos tiempos de ensayo (fig. 10).
32
_______________________________________________________________________
Fig. 10. Efecto de DAKD sobre la viabilidad de fibroblastos y miofibroblastos. La viabilidad de
fibroblastos y miofibroblastos se determinó por conteo celular usando azul de tripán. Las células se deprivaron
24 h de suero e incubadas en DMEM-F12, y posteriormente se estimularon con DAKD 100nM por los tiempos
que se indican. Los resultados muestran el promedio ± SD para cuatro experimentos independientes.
5.6 Efecto de DAKD sobre la actividad gelatinásica de la metaloproteasa-2 de la matriz extracelular (MMP-2) en fibroblastos y miofibroblastos.
Se evaluó el efecto de DAKD (100nM) sobre la actividad gelatinásica de pro-MMP-
2 y la MMP-2 activa, en el medio de cultivo celular de fibroblastos y miofibroblastos a los
tiempos de 24 y 48 h. Para ello se realizó zimografía con muestra del medio de cultivo.
Los resultados muestran que el DAKD no afecta significativamente la actividad
gelatínásica de pro-MMP-2 y de MMP-2 activa, con respecto a muestras controles, tanto
en fibroblastos como en miofibroblastos (fig. 11-12). La actividad gelatinásica de la MMP-2
activa aumentó a lo largo del tiempo experimental, tanto en controles como en los tratados
con DAKD.
33
________________________________________________________________________
Fig. 11. Actividad gelatinásica de pro MMP-2 en fibroblastos y miofibroblastos. Fibroblastos y
miofibroblastos se deprivaron de suero por 24 h, y luego se estimularon con DAKD (100nM) por los tiempos
que se indican. El análisis se realizó a través zimografia de actividad gelatinásica en medio de cultivo
recolectado a los tiempos de 0, 24 y 48 horas. Los resultados muestran el promedio ± SD para cuatro
experimentos independientes.
________________________________________________________________________
Fig. 12. Actividad gelatinásica MMP-2 activa en fibroblastos y miofibroblastos. Fibroblastos y
miofibroblastos se deprivaron de suero por 24 h, y luego se estimularon con DAKD (100nM) por los tiempos
que se indican. El análisis se realizó a través zimografia de actividad gelatinásica en medio de cultivo
recolectado a los tiempos de 0, 24 y 48 horas. Los resultados muestran el promedio ± SD para cuatro
experimentos independientes.
34
5.7 Captopril activa receptor B1 de bradicininas en miofibroblastos
Existiendo antecedentes que iECAs activan el receptor B1 de bradicininas, se
decidió investigar si este fenómeno ocurre en miofibroblastos cardiacos, para este objetivo
se utilizaron 2 inhibidores de la ECA: captopril y lisinopril ambos en concentración 10 uM.
La elección se basó en el hecho que ambos fármacos son activos sin necesidad de
hidrólisis. Para evaluar la activación del receptor B1 se utilizó microscopía de
epifluorescencia para observar cambios en la concentración de calcio intracelular. De los
dos iECAs utilizados solo captopril dió origen a una señal de calcio (fig. 13), mientras que
lisinopril no indujo un aumento en la concentración de calcio intracelular. Para corroborar
que la señal de calcio inducida por captopril se debe a la activación del receptor B1, se
utilizó el antagonista de B1R des-Arg9 (Leu8-BK) (1uM). En miofibroblastos pre tratados
(20 min), con el antagonista de B1R, captopril no fue capaz de inducir un aumento rápido
y transitorio en la concentración de calcio intracelular (fig. 14).
________________________________________________________________________
Fig. 13. Efecto de iECAS sobre la concentración de calcio intracelular en miofibroblastos. Los miofibroblastos fueron pre incubados 20 minutos con la sonda Fluo 3-AM y luego estimulados con Captopril o
lisinopril (ambos en concentración 10 uM). Captopril produjo un aumento en la concentración de calcio
intracelular. Se muestra la cuantificación de tres experimentos independientes expresados como el promedio
de fluorescencia relativa ((F-F0) / F0)*100 ± SD
35
_______________________________________________________________________
Fig. 14. (Leu-8BK) un antagonista específico de B1R bloquea el aumento en la concentración de calcio intracelular inducido por por captopril en miofibroblastos. La especificidad de la acción de captopril
(10uM) se evaluó midiendo el aumento en la concentración de calcio intracelular. Los miofibroblastos fueron
pre incubados 20 minutos con la sonda Fluo 3-AM y luego preincubados con Leu 8-BK (1uM) y posteriormente
estimulados con captopril. Se muestra la cuantificación de tres experimentos independientes expresados
como el promedio de fluorescencia relativa ((F-F0) / F0)*100 ± SD
5.8 Efecto de iECAs sobre la secreción colágeno soluble en FCN y MCN
Se evaluó el efecto de captopril (10uM) y lisinopril (10uM) sobre la secreción de
colágeno soluble al medio de cultivo celular (DMEM F-12) de fibroblastos y
miofibroblastos a las 48 horas de incubación (fig. 15). Los resultados muestran que en
fibroblastos, ambos iECAs redujeron significativamente la secreción de colágeno soluble
0,66±0,048 y 0,75 ±0,076 v/s control, para lisinopril y captopril respectivamente (P<0.001
en ambos casos). En miofibroblastos, lisinopril y captopril redujeron la secreción de
colágeno desde un valor control de 1,7 hasta 1,2±0,2 y 1,2±0,1 respectivamente ( P<0,01)
36
________________________________________________________________________
Fig. 15. Efecto de iECAs sobre la secreción de colágeno soluble en fibroblastos y miofibroblastos. Las
células se deprivaron de suero por 24 horas y luego se estimularon con lisinopril 10 uM y captopril 10 uM, el
medio de cultivo se recolectó a las 48 horas. El colágeno soluble se determinó por kit de colágeno Sircol ®
soluble collagen assay. Los resultados muestran el promedio ± SD para cuatro experimentos independientes.
(*** P<0.001 y ** P<0.01)
5.9 Efecto de iECAs sobre la viabilidad de fibroblastos y miofibroblastos
Se evaluaron los efectos de captopril (10uM) y lisinopril (10uM) sobre la viabilidad
de fibroblastos y miofibroblastos a los tiempos de 24 y 48 horas, por el método de conteo
celular con azul de tripán. Los resultados muestran que captopril o lisinopril no tienen
efectos sobre proliferación o muerte celular de fibroblastos o miofibroblastos en los
tiempos de 24 y 48 horas (fig. 16 A-B).
37
_______________________________________________________________________
Fig. 16. Efecto de iECA sobre la viabilidad de fibroblastos y miofibroblastos. La viabilidad de fibroblastos
y miofibroblastos estimulados con Lisinopril y Captopril ambos en concentración 10µM, se determinó por
conteo celular usando azul de tripán.. Los resultados muestran el promedio ± SD para cuatro experimentos
independientes. No existen diferencias significativas entre controles y estimulos (p>0.05), excepto captopril
en fibroblastos (** p<0.01).
5.10 Efecto de iECAs sobre la secreción de MMP-2 en fibroblastos y miofibroblastos
Se evaluó el efecto captopril (10uM) y lisinopril (10uM) sobre la secreción de MMP-
2 al medio de cultivo celular de fibroblastos y miofibroblastos a los tiempos de 0, 24 y 48
horas. Para ello se realizó zimografía de medio de cultivo. Los resultados muestran que
ambos estímulos no afectaron significativamente la actividad de la MMP-2 con respecto a
muestras controles, ya sea en fibroblastos o miofibroblastos. Se evaluó la actividad de
MMP-2 en su forma precursora (pro-MMP-2) (fig. 17) y la actividad de MMP-2 en su forma
activa (fig. 18)
38
_______________________________________________________________________
Fig. 17. Actividad gelatinásica pro MMP-2 Determinación a través de zimografia de actividad gelatinásica en
medio de cultivo (DMEM F12) de FCN y MCN estimulados con Lisinopril y Captopril, ambos en concentración
10 uM .El medio de cultivo fue recolectado a los tiempos de 0, 24 y 48 horas. Los resultados muestran el
promedio ± SD para cuatro experimentos independientes. No existen diferencias significativas entre controles
y estimulos (p>0.05).
_______________________________________________________________________
Fig. 18. Actividad gelatinásica MMP-2 activa Determinación a través de zimografía de actividad
gelatinásica en medio de cultivo (DMEM F12) de FCN y MCN estimulados con Lisinopril y Captopril, ambos en
concentración 10 uM .El medio de cultivo se recolectó a los tiempos de 0, 24 y 48 horas. Los resultados
muestran el promedio ± SD para cuatro experimentos independientes. No existen diferencias significativas
entre controles y estimulos (p>0.05).
39
5.11 Efecto de Leu 8-BK en la secreción de colágeno soluble
Se evaluó el efecto de captopril (10uM), DAKD (100nM) y su pre incubación con el
antagonista B1R selectivo Leu 8-BK (1uM) sobre la secreción de colágeno soluble al
medio de cultivo celular (DMEM F-12) en miofibroblastos a las 48 horas de incubación (fig.
19). Los resultados muestran que la disminución de colágeno soluble inducida por
captopril y DAKD fue prevenida al pre incubar con Leu 8-BK. Para las células estimuladas
con DAKD, la reversión fue completa, captopril en presencia de Leu 8-BK no revirtió
completamente la disminución en la secreción de colágeno.
__________________________________________________________________________________________________
Fig. 19. Colágeno soluble miofibroblastos: Efecto de Leu 8BK. MCN fueron deprivados de suero por 24
horas y luego estimulados con captopril 10 uM, DAKD 100 nM y Leu8-BK 1uM. El medio de cultivo se
recolectó a las 48 horas. El colágeno soluble se determinó por kit de colágeno Sircol ® soluble collagen assay.
Los resultados muestran el promedio ± SD para tres experimentos independientes (control vs capto, capto vs
leu8+DAKD, leu8+capto vs DAKD, DAKD vs leu8+DAKD P < 0.001*** - capto vs leu8+captopril P < 0.01** -
control vs leu8+capto P < 0.05 *).
40
6. DISCUSIÓN
Los principales resultados de esta memoria son: a) TGF- β1 induce la
diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos caracterizada por el aumento en la
expresión de α-SMA, ECA y tamaño celular, b) TGF- β1 induce en miofibroblastos la
expresión del receptor B1 de bradicinina, c) DAKD, DABK y captopril inducen en
miofibroblastos un aumento en los niveles de calcio intracelular, los cuales fueron
bloqueados por el antagonista del receptor B1 (Leu 8-BK), d) DAKD y captopril reducen la
secreción de colágeno al medio de cultivo, efecto que fue bloqueado por Leu 8-BK.
6.1 Efecto de TGF beta sobre la diferenciación de fibroblasto a miofibroblasto
En condiciones patológicas específicamente luego de un infarto cardiaco la
presencia de TGF β1 está asegurada, ya que el sitio del infarto es invadido por células
pro-inflamatorias como monocitos y macrófagos, estos últimos son activados y comienzan
a liberar grandes cantidades de esta citoquina al medio. Consecuentemente los
fibroblastos son atraídos al sitio del infarto y por acción del TGF- β1, liberado por los
macrófagos, se diferencian a miofibroblastos (16).
La diferenciación celular de fibroblasto a miofibroblasto requiere de tres factores:
tensión mecánica (aportada por las condiciones de cultivo sobre una matriz rígida, como
lo es la placa de cultivo plástica), fragmento ED-A de fibronectina producido por los
propios fibroblastos y secretado hacia el medio extracelular, y un factor de crecimiento (en
las condiciones de cultivo in vitro se encuentran en el suero aquellos necesarios como
PDGF y principalmente TGF-β1. Este último es también secretado por los fibroblastos
hacia el medio extracelular, actuando de manera autocrina) (16). Por lo anterior, el tiempo
de cultivo y el pasaje celular de los fibroblastos es crucial para obtener cultivos puros (46).
Como se muestra en nuestros resultados la estimulación de fibroblastos con TGF- β1
produce un aumento en la expresión de α-SMA (proteína marcadora de miofibroblastos)
en el tiempo. Este resultado fue muy marcado a las 84 h, mientras que células que no
recibieron el estímulo no expresan la proteína (fig. 2). Este aumento está descrito en la
literatura (47-48), sin embargo, el tiempo necesario para alcanzar la máxima expresión de
esta proteína depende de la concentración de TGF-β1, en muestro modelo la
41
concentración usada fue de 5 ng/mL. Por otro lado, la sola expresión de esta proteína no
es suficiente para afirmar que ocurrió la diferenciación, por lo que se realizó un estudio
inmunocitoquímico de α-SMA, constatándose su presencia en las fibras de stress y un
aumento del tamaño celular (fig. 3). Una característica importante de los miofibroblastos
obtenidos por este método, es que ellos mantienen su forma característica hasta por siete
días en un medio libre de suero (49). Al mismo tiempo, recientemente Lijnen et al., han
mostrado que los miofibroblastos obtenidos por este método no proliferan por poseer
daño en el DNA. (50).
6.2 Receptores de Bradicininas en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos.
Inducción del receptor B1 de bradicininas
Está ampliamente aceptado que el receptor B1 de cininas se expresa en bajas
cantidades en condiciones fisiológicas pero se induce fuertemente en estados
patológicos. Varios autores han demostrado la inducción del receptor B1 bajo diferentes
estímulos tales como trauma (51), LPS (52), adrenalectomía, interleuquina 1-β (53) o TNF α (
54).
Sin embargo, los mecanismos precisos de regulación del sistema cinina-kalicreina
(KKS) en el corazón aún no esta completamente clarificado (55).. Al respecto se ha descrito
que la expresión de ambos receptores, B1 y B2 está aumentada después de la isquemia
miocárdica (IM) (56). Por otra parte, Xu et al., demostraron que la deficiencia del B1R no
conduce a la alteración del miocardio después de IM (57). Phagoo et al., puso de
manifiesto que la citoquina IL-1β activa los componentes de la KKS (58). Curiosamente, la
inducción y la liberación de esta citocina es constante en modelos experimentales de
isquemia miocárdica y en pacientes con MI (59-60-61). Por otra parte, la IL-1β es también
conocida por mediar directamente el remodelado del ventrículo izquierdo (62). De forma
paralela, TGF-β1 también se expresa altamente en condiciones de infarto cardiaco y es un
fuerte agente profibrótico.
La expresión del receptor B1 se ha demostrado en vasos sanguíneos, y células
endoteliales de venas y arterias de algunas especies (24). Riad et al., encontraron que la
expresión de mRNA del B1R y B2R posterior al estimulo con IL-1β es de manera dosis
dependiente de IL-1β en cardiomiocitos y en musculatura vascular, siendo mínima la
42
expresión de B1R en condiciones basales, mientras que B2R presenta elevados niveles de
expresión en condiciones basales. Específicamente en fibroblastos cardiacos se ha
descrito la presencia del receptor B2 de bradicininas de forma constitutiva (63). Por otro
lado, Imai et al., han demostrado que IL-1β induce la expresión de B1R en fibroblastos
cardiacos de ratas adultas (64). Sin embargo, esta es la primera evidencia que indica que
TGF-β1 modula la expresión del receptor B1 de bradicininas en miofibroblastos cardiacos
o en otros tipos celulares. Nuestro estudio indica que el estimulo de carácter pro-
inflamatorio TGF- β1, junto con inducir el cambio fenotípico de fibroblasto cardiaco a
miofibroblasto, induce la expresión de B1R. Una directa relación de causalidad entre
ambas entidades aún no se ha demostrado, puesto que, no deberíamos descartar que la
estimulación con TGF-β1 durante 84 horas podría también inducir la expresión de algún
otro mediador quien a su vez en forma autocrina podría ser el efector final del aumento de
B1R. De hecho, se ha demostrado en fibroblastos sinoviales que TGF-β1 induce la
expresión de IL-1β y TNF-α, dos fuertes inductores de la expresión de B1R (65-67). Por lo
tanto, si TGF-β1 induce la secreción de IL-1β y TNF α en miofibroblastos debería ser
demostrada, a fin de comprobar si el mecanismo es directo o indirecto. Por otro lado, Kim
et al, describieron que TGF-β1 induce de forma directa la expresión del receptor B2 de
bradicininas en células de músculo liso bronquial, resaltando la participación de
bradicininas en hiperreactividad bronquial (68). Por lo anterior, es posible también que ello
pudiera ocurrir en miofibroblastos en los cuales TGF-β1 de forma directa module la
expresión de B1R, y de esta forma también pudiese exacerbar la respuesta inflamatoria
que es modulada por la activación de B1R en condiciones patológicas.
Se ha demostrado que el aumento en la expresión de B1R por exposición a
citoquinas pro inflamatorias es regulado a través de la activación transcripcional y
estabilización post-trasnsduccional del mRNA de B1R. Estos componentes hacen que la
expresión de B1R pueda ser diferente en distintas células de un mismo organismo, e
incluso variar de un organismo a otro (69).
Aún no hemos evaluado aún si el efecto inductor de B1R por TGF- β1 se debe
posiblemente a la activación de las vías de transducción smad (vía clásica) o MAPK. Sin
embargo, Phagoo et al., demostraron que la vía MAPK lleva a la expresión y up-
regulación de receptores de cininas, puesto que al inhibir p38 MAP kinasa disminuye el
binding de DAKD con B1R indicando una disminución en los receptores B1 (70).
43
6.3 Funcionalidad de los receptores B1 y B2 de bradicininas en miofibroblastos.
6.3.1 Vías transduccionales de receptores de cininas
Las vías de transducción estimuladas por las cininas han sido ampliamente
investigadas en células endoteliales, en las cuales B1R interactúa con proteínas Gq y Gi,
utilizando las mismas vías de señalización que el B2R: hidrólisis de fosfatidil inositol,
aumento de calcio intracelular, liberación de acido araquidónico, producción de
eicosanoides, activación de NOS y producción de oxido nítrico (71). El B1R presenta
actividad proliferativa y antiproliferativa (72), la actividad proliferativa involucra la activación
temprana de MAPK, mientras que la actividad antiproliferativa se debe a la estimulación
prolongada de MAPK (73).
Aún cuando B1R y B2R poseen vías de transducción similares, en músculo liso
vascular sus patrones de señalización son diferentes. Mathis et al., plantearon que la
estimulación de B2R por BK produce un aumento transitorio de calcio, mientras que en
B1R, DAKD produce un aumento transitorio y a la vez sostenido (74). Para ambos
receptores el aumento transitorio depende de la liberación de calcio desde
compartimentos intracelulares, mientras que la fase sostenida en B1R depende del influjo
de calcio desde el medio extracelular.
Nuestros resultados de aumento en la concentración de calcio intracelular
estimulados por los agonistas específicos BK, DAKD y DABK indican que los
miofibroblastos cardiacos neonatos expresan ambos subtipos de receptores. Nuestros
resultados muestran que en presencia de calcio extracelular tanto la activación de B2R por
BK y de B1R por DABK y DAKD respectivamente, lleva a un aumento rápido y transitorio
en la señal de calcio intracelular, sin observar una fase sostenida. Por otro lado, la
cinética de la señal de calcio obtenida al estimular con agonistas específicos para B1R en
ausencia de calcio extracelular, fueron idénticas aunque de menor magnitud, no
observándose una fase sostenida (resultado no mostrado), no concordando así con el
requerimiento de calcio externo para desencadenar una respuesta por B1R planteado por
Mathis et al., Del mismo modo Ignjatovic et al., han sugerido que la estimulación de B1R
por sus agonistas requiere de la presencia de calcio extracelular. Sin embargo, la
44
diferencia en la cinética del aumento de calcio intracelular puede deberse al diferente tipo
celular utilizado entre nuestros estudios y los de Mathis et al., e Ignjatovic et al.
Aun no concordando las cinéticas de movimientos de calcio obtenidas en este
trabajo con lo planteado en la literatura, el aumento de calcio intracelular, al estimular B1R
con DAKD y DABK, indica inequívocamente la presencia y funcionalidad de este receptor,
dado que al antagonizar con Leu 8-BK, no se observó aumento en calcio intracelular con
ambos agonistas. Por otro lado, el receptor B2 también se encuentra en estado funcional,
respondiendo positivamente a la estimulación de este con BK, y en presencia de Leu 8-
BK, BK indujo un aumento en la concentración de calcio intracelular. Sin embargo, la
señal de calcio fue desplazada respecto de la condición control, ello podría indicar la
dimerización del B2R lo que podría producir un desplazamiento en la cinética de calcio
intracelular.
Finalmente, en nuestro estudio no se realizaron experimentos en presencia de
HOE-140, un antagonista específico de los B2R a fin de descartar que efectivamente el
aumento de calcio intracelular fuera mediado por B2R, sin embargo, los datos de
constantes de afinidades de los agonistas o antagonistas de BK, DAKD y DABK por sus
receptores B2 y B1 respectivamente, obtenidos por Marceu et al (24)., indican que para
estimular B2R con DAKD es necesaria una concentración 30 veces mayor a la utilizada
(1uM), siendo la respuesta y el consiguiente aumento de calcio intracelular una respuesta
selectiva por B1R, descartando así una posible interferencia en la señal de calcio causada
por la activación del receptor B2.
6.3.2 Efecto de iECAs sobre el receptor B1
En los trabajos previos de Ingjatovic et al., se ha demostrado que los iECA activan
el receptor B1 de bradicininas, induciendo un aumento en la concentración de calcio
intracelular (41). La activación de B1R por los iECA dió lugar a una prolongada liberación de
óxido nítrico (NO) desde cultivos de células endoteliales (75), lo que indica que los B1R
contribuyen ampliamente a los efectos beneficiosos de los iECA. Nuestros resultados
indican que Captopril activa el receptor B1 de bradicininas, induciendo un aumento
transitorio en la concentración de calcio intracelular semejante a los observados con
DAKD y DABK en este mismo tipo celular. Este resultado no se observó en presencia del
45
antagonista del B1R, lo que confirma que el efecto es específico. La metodología usada
para evaluar la activación de B1R por captopril excluye la posibilidad de que mediadores
endógenos liberados por los miofibroblastos pudiesen actuar de forma autocrina, o que la
inhibición de la ECA y con ello el aumento de los niveles de bradicininas endógenas sean
las responsables de este efecto. En conclusión, estos estudios corroboran el nuevo modo
de acción de los inhibidores de la ECA para activar directamente receptores B1
independiente de la ECA y de las cininas endógenas en miofibroblastos cardiacos de
ratas.
Por otro lado, parte importante de los efectos de los iECA han demostrado liberar
NO (76-41), ya sea por liberación directa de la activación de los receptores B1 (41) o
indirectamente, a través de la potenciación de los efectos de la bradicinina en el receptor
B2 (34-38-39). Ignjatovic et al., informaron que ambos tipos de agonistas de los receptores B1,
los iECA y DAKD producen la liberación de NO en células endoteliales pulmonares de
bovino que expresan constitutivamente los receptores B1, vía eNOS e iNOS. Mientras que
en células estimuladas para inducir la expresión del B1R (células endoteliales de pulmón
humano), DAKD y los iECA liberan NO por mecanismos similares e independiente de
calcio, esto es vía iNOS (75). Nuestros resultados son coincidentes con los de Ignjatovic et
al., por lo anterior, es que proponemos realizar en un futuro cercano ensayos para evaluar
si DAKD, DABK y captopril son capaces de inducir en miofibroblastos el aumento en la
secreción de NO vía eNOS y no iNOS debido a que TGF-β1 reprime la expresión de iNOS,
al menos en células sinoviales. Finalmente, ello indicaría que existen diferentes
mecanismos de segundos mensajeros entre los miofibroblastos cardiacos y las células
endoteliales de pulmón, corroborando el hecho de que las acciones mediadas vía B1R son
específicas dependiendo del tipo celular y especie.
46
6.4 Efecto de DAKD y Captopril sobre la secreción de colágeno
Es sabido que sustancias vasoactivas como angiotensina II, endotelina, bradicinina
y oxido nítrico pueden también actuar como factores tróficos y ser importantes
moduladores de la producción de matriz extracelular, postulándose que Ang II y BK son
reguladores recíprocos de la producción de colágeno en el corazón (16). Es interesante
notar el hecho de que pocos factores tienen la habilidad de producir una regulación
negativa en la producción de matriz extracelular. Kim et al., demuestran que los
vasodilatadores bradicinina y oxido nítrico son reguladores negativos de la función
secretora de fibroblastos cardiacos, disminuyendo mRNA de colágeno I, III y de
fibronectina, efecto revertido al estimular con el inhibidor de la óxido nítrico sintasa (L-
NAME), disminuyendo colágeno I y fibronectina, no habiendo efecto significativo en
colágeno III. La disminución en proteínas de matriz también fue obtenida en forma dosis
dependiente con el dador de oxido nítrico DETA NONOato (77). Por otro lado, Gallagher et
al., proponen que BK produce una disminución del mRNA de colágeno mediado en parte
por la ciclooxigenasa y la formación de prostaglandinas, específicamente PGI2 (78).
En este trabajo se observó que tanto DAKD como captopril producen una
disminución en la secreción de colágeno soluble al medio extracelular, independiente de
la actividad de las gelatinazas pro-MMP2 y de su forma activa MMP-2, e independiente
del número celular, puesto que nuestros resultados indican que tanto DAKD como
captopril no afectan la viabilidad celular y la actividad de las metaloproteasas de matriz.
Previamente ha sido demostrado por Kim et al., que BK produce una disminución en el
colágeno debido a un aumento de oxido nítrico, la activación de cGMP (77) y disminución
de cAMP debido a la activación de PDE2 por cGMP (79). La disminución de colágeno
soluble observada al estimular con el iECA captopril puede deberse tres posibles modelos
de acción: 1) activación directa del receptor B1 de bradicininas por iECAs semejante a los
descrito por Ignjatovic et al (41), 2) los iECAs impiden la degradación de bradicinina, y
éstas a su vez activan el receptor B2 (22), y 3) menor generación de Ang II por impedir su
síntesis desde Ang I (77). Todas estas vías pueden ser factibles y llevan a una disminución
de proteínas de matriz. En miofibroblastos la disminución de colágeno soluble inducida
por captopril y DAKD fue prevenida al preincubar con Leu 8-BK. Para las células
estimuladas con DAKD, la prevención fue completa, en cambio al estimular con captopril,
en presencia de Leu 8-BK la prevención en la secreción de colágeno no fue completa,
sugiriendo así que la disminución en colágeno soluble no se debería únicamente a la
47
acción de captopril sobre B1R, existiendo también una baja en colágeno debido a la
disminución en la degradación de bradicinina, o bien que esta disminución sea producida
por un descenso en la concentración de angiotensina II . Estas últimas posibilidades no
fueron exploradas a fondo en este trabajo, siendo posible su verificación utilizando un
antagonista del receptor B2 como HOE-140, bloqueando el efecto de BK y utilizando los
antagonistas del receptor AT1 de angiotensina II. Estos hallazgos en fibroblastos
cardiacos estimulados con captopril también se apreciaron con lisinopril ya sea en
fibroblastos o miofibroblastos, por lo tanto, las teorías de una disminución de Ang II y
disminución en la degradación de bradicinina y consecuentemente un aumento en la
concentración de BK pueden ser la explicación para este descenso en colágeno soluble,
teniendo en cuenta que lisinopril no activa el receptor B1 de cininas en miofibroblastos (41).
Ignjatovic et al., también demostraron que no todos los derivados activos iECA son
capaces de activar el B1R. Enalaprilato y captopril derivados activos son capaces de
activar B1R, mientras que lisinopril no tuvo ese efecto a pesar de ser un derivado activo
que no necesita de metabolización previa para demostrar su efecto. En el presente trabajo
no se exploró la potencia inhibitoria de la ECA por parte de captopril y lisinopril, pudiendo
ser esta otra posible explicación al descenso de colágeno inducido por lisinopril, quien
podría inhibir de mejor forma la ECA que captopril, compensándose de esta forma el
hecho de no activar B1R.
En conclusión, nuestros resultados indican que los iECA participarían
activamente en el remodelado después de un daño cardiaco, previniendo una secreción
excesiva de colágeno, principal proteína de la MEC, la que secretada en abundancia lleva
a fibrosis cardiaca, con el consecuente deterioro en la función de ese órgano. Al mismo
tiempo, este resultado abre expectativas de tener fármacos iECA de acción definida, esto
es bloquear la ECA, o de acción dual, esto es bloquear la ECA y activar el B1R. El autor
de esta memoria de título cree que la segunda opción es la más promisoria debido a que
el uso crónico de estos fármacos en pacientes con hipertensión arterial o en pacientes
infartados, dos condiciones en la cuales existe un remodelamiento patológico, el uso de
estos tipos de fármacos tendría a largo plazo efectos beneficiosos por sobre los sólo
inhibidores de la ECA.
48
7. CONCLUSIONES
1. Al estimular los fibroblastos cardiacos neonatos con TGF-β1 5 ng/mL por 84 h. se
produce la diferenciación a miofibroblastos cardiacos neonatos caracterizada por
un aumento en la expresión de α-SMA, ECA y en el tamaño celular.
2. El estímulo TGF-β1 5 ng/mL por 84 h es capaz de inducir la expresión del receptor
de bradicininas subtipo 1 (B1R). La detección de B1R por Western-blot indica su
presencia en miofibroblastos y su ausencia en fibroblastos cardiacos neonatos
3. El receptor B1 de bradicinina es un receptor funcional capaz de activar una vía
transduccional que lleva a un aumento de calcio intracelular al ser estimulado con
agonistas selectivos B1R.
4. La secreción de colágeno soluble en miofibroblastos cardiacos neonatos
disminuye al utilizar el estimulo DAKD, agonista selectivo B1R, efecto
independiente de la actividad de metaloproteasas.
5. El inhibidor de la ECA captopril activa directamente B1R, observándose un
aumento de calcio intracelular, este efecto fue revertido al utilizar Leu 8-BK
(antagonista selectivo B1R).
6. La secreción de colágeno soluble en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos
neonatos disminuye al utilizar los iECAs, debido a la disminución en la
degradación de bradicinina en el caso de fibroblastos, en miofibroblastos se suma
la respuesta por activación de B1R
49
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