universidad de chile estudio funcional de la...
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Universidad de Chile
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Programa de Magíster en Bioquímica Ambiental
ESTUDIO FUNCIONAL DE LA VÍA DE DEGRADACIÓN DE 2-AMINOFENOL
PRESENTE EN Burkholderia xenovorans LB400 Y SUS POSIBLES APLICACIONES EN
BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL.
Tesis presentada a la Universidad de Chile como parte de los requisitos para optar al título
de Bioquímico y grado de Magíster en Bioquímica Ambiental.
BERNARDITA PILAR CHIRINO CHACE
Director de tesis Dr. Michael Seeger Pfeiffer
Valparaíso, Chile
Diciembre, 2009
2
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
INFORME DE APROBACIÓN
TESIS DE MAGÍSTER
Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
que la tesis de Magíster presentada por la candidata:
BERNARDITA PILAR CHIRINO CHACE
Ha sido aprobada por la comisión Informante de Tesis como requisito para optar al grado de
Magíster en Bioquímica, área de especialización Ambiental y al título de Bioquímica, en el
examen de defensa de tesis rendido el día 30 de noviembre del año 2009.
Director de Tesis:
Dr. Michael Seeger Pfeiffer _______________________
Comisión Informante de Tesis:
Dr. Davor Cotoras (Presidente) _______________________
Dr. Jaime Romero _______________________
Prof. Mercedes Zaldívar _______________________
3
Comisión de Tesis
Dr. Davor Cotorás
Dr. Michael Seeger Pfeiffer
Dr. Jaime Romero
Prof. Mercedes Zaldívar
4
DEDICATORIA
"Enseñarás a volar,
pero no volarán tu vuelo.
Enseñarás a soñar,
pero no soñarán tu sueño.
Enseñarás a vivir,
pero no vivirán tu vida.
Sin embargo
en cada vuelo,
en cada vida,
en cada sueño,
perdurará siempre la huella
del camino enseñado."
Madre Teresa De Calcuta
A mis padres,
con Amor
5
AGRADECIMIENTOS
Me gustaría agradecer al profesor Michael Seeger, por creer en mí y ayudarme en mi
formación profesional. A la profesora Myriam González, por todo su apoyo y preocupación.
De forma especial me gustaría agradecer a Loreine Agulló y Carolina Yañez por
ayudarme en este proceso, por su disposición a enserñarme, por el apoyo incondicional y
acompañarme en los momentos más difíciles.
También me gustaría agradecer el apoyo y energía que me entregó Luz Triviño y Maria
jose Romero, generando un un ambiente de trabajo único.
A Pola Miralles, Valentina Mendez, Veronica Morgante, Sebastian Fuentes, Marcela
Hernandez, Bernardita Ponce, Macarena Córdova, por acompañarme en el proceso y por su
amistad.
Finalmente me gustaría agradecer el asesoramiento técnico entregado por Valeria La
Torre y Danilo Pérez, y por contribuir enormemente al desarrollo de esta investigación.
Este trabajo contó con el financiamiento de los proyectos FONDECYT 1070507, USM
130522 y USM 130836.
6
ÍNDICE DE MATERIAS
ÍNDICE DE FIGURAS............................................................................................................ 9
ÍNDICE DE TABLAS.............................................................................................................. 10
ABREVIATURAS…………………………………………………………………………... 11
RESUMEN................................................................................................................................ 12
ABSTRACT.............................................................................................................................. 13
1. INTRODUCCIÓN................................................................................................................ 14
1.1Prólogo.................................................................................................................................. 14
1.2 Los contaminantes orgánicos persistentes ........................................................................... 15
1.3 COPs y cambio climático..................................................................................................... 15
1.4 Contexto internacional y nacional de los COPs................................................................... 15
1.5 Efectos de los COPs sobre la salud ..................................................................................... 16
1.6 Compuestos nitroaromáticos................................................................................................ 16
1.7 Biorremediación................................................................................................................... 17
1.8 Degradación microbiana y vías catabólicas de compuestos nitroaromáticos....................... 18
1.9 2-aminofenol y su metabolismo........................................................................................... 18
1.10 Nitrobenceno y su metabolismo......................................................................................... 19
1.11 Estudio in silico de rutas metabólicas................................................................................ 20
1.12 Burkholderia xenovorans LB400....................................................................................... 21
1.13 Organismos modificados genéticamente............................................................................ 22
1.14 Planteamiento del problema............................................................................................... 22
1.15 Hipótesis de trabajo……………………………………………………………………… 24
1.16 Objetivos…………………………………………………………………………………. 24
2.MATERIALES Y MÉTODOS 25
2.1 Reactivos.............................................................................................................................. 25
2.2 Cepas bacterianas y plásmidos............................................................................................. 25
2.3 Medios y condiciones de cultivo.......................................................................................... 26
2.3.1 Medios y condiciones de cultivo empleados para B. xenovorans LB400........................ 26
2.3.2 Medios y condiciones de cultivo empleado para Eschericha coli..................................... 26
7
2.3.3 Medios y condiciones de cultivo empleados para P. pseudoalcaligenes JS45................. 27
2.4 Conservación de las cepas bacterianas................................................................................. 27
2.5 Antibióticos.......................................................................................................................... 27
2.6 Análisis bioinformático........................................................................................................ 28
2.6.1 Análisis de la organización y vecindario de los genes de la vía de degradación de 2-
aminofenol B. xenovorans LB400..............................................................................................
29
2.6.2 Análisis comparativo de la organización de los genes de la vía de degradación de 2-
aminofenol en diferentes microorganismos................................................................................
29
2.6.3 Búsqueda in silico de la vía de degradación de nitrobenceno en B. xenovorans LB400.. 29
2.7 Crecimiento de Burkholderia xenovorans LB400................................................................ 29
2.8 Experimentos de degradación por células en reposo ........................................................... 30
2.9 Técnicas de biología molecular............................................................................................ 30
2.9.1 Análisis de la expresión del gen amnB......................................................................... 30
Reactivos y soluciones............................................................................................ 30
Partidores................................................................................................................ 31
Amplificación del gen amnB.................................................................................. 32
Inducción de la expresión del gen amnB................................................................ 32
Extracción de RNA total......................................................................................... 32
Purificación de RNA total...................................................................................... 33
Cuantificación de RNA purificado......................................................................... 34
Síntesis de cDNA.................................................................................................... 34
2.9.2 Protocolo construccíon genética…...……………………………………………………. 35
Reactivos y soluciones............................................................................................ 35
Aislamiento de DNA plasmidial............................................................................. 37
Digestión de DNA con enzimas de restricción....................................................... 38
Desfosforilación del plásmido linearizado............................................................. 38
Diseño de partidores............................................................................................... 38
Amplificación de los genes nbzA y habA………………………………………... 39
Ligación de los genes nbzA y habA…………………………………………….... 40
Ligación del DNA plasmidial y fragmentos de DNA............................................. 40
Métodos de transferencia genética.......................................................................... 40
8
Transformación de células de E. coli................................................................. 40
Transferencia de plásmidos por conjugación biparental.................................... 40
3. RESULTADOS 42
3.1 Análisis bioinformático de los genes involucrados en la degradación de 2-aminofenol…. 42
3.1.1 Análisis in silico de los genes que codifican para la vía del 2-aminofenol en B.
xenovorans LB400……………………………………………………………………………..
42
3.1.2 Análisis del vecindario de los genes amn presente en B. xenovorans LB400…………... 42
3.1.3 Análisis comparativo de la organización de la vía de degradación de 2-aminofenol en
diferentes bacterias…………………………………………………………………………….
44
3.1.4 Búsqueda in silico de vía periférica a 2-aminofenol……………………………………. 47
3.2 Análisis funcional de la vía catabólica de 2-aminofenol en B. xenovorans LB400…......... 48
3.2.1 Crecimiento de B. xenovorans LB400 en 2-aminofenol………………………………... 48
3.2.2 Degradación de 2-aminofenol por B. xenovorans LB400............................................. 49
3.2.3 Estudio de la vía central utilizada por B. xenovorans LB400 en el catabolismo de 2-
aminofenol……………………………………………………………………………………..
50
a) Amplificación del gen amnB desde DNA bacteriano……………………………….. 50
b) Extracción y purificación de RNA bacteriano……………………………………… 51
c) Análisis de la expresión del gen amnB…………………………………………….... 52
3.3 Protocolo para generar una cepa modificada de B. xenovorans LB400 capaz de degradar
el nitrobenceno………………………………………………………………………
52
3.3.1 Preparación del vector plasmidial ……………………………………………………… 53
3.3.2 Preparación del inserto con las dos enzimas responsables de la degradación de
nitrobenceno…………………………………………………………………………………...
53
3.3.3 Transformación del cepa E. coli DH5-alfa con el plásmido recombinante.……….......... 56
4.DISCUSION 57
4.1 Análisis in silico de los genes amn en B. xenovorans LB400……………………………. 57
4.2 Análisis funcional de la vía de degradación de 2-aminofenol en la cepa LB400................. 60
5. CONCLUSIONES................................................................................................................ 62
6. PROYECCIONES................................................................................................................ 63
BIBLIOGRAFÍA...................................................................................................................... 64
9
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Vía catabólica de 2-aminofenol.................................................................................. 19
Figura 2. Vía catabólica del nitrobenceno.................................................................................. 20
Figura 3. Representación esquemática del vector pIZ1016........................................................ 37
Figura 4. Organización de los genes amn en la cepa LB400………………………………….. 43
Figura 5. Vecindario de los genes amn……………………………………………………….. 43
Figura 6. Comparación de la organización de los genes amn de la ruta de degradación de 2-
aminofenol en diferentes bacterias…………………………………………………………….
46
Figura 7. Organización de los genes que codifican la ruta de degradación de nitrobenceno en
la cepa JS45. ....................................................................................................................
47
Figura 8. Crecimiento de B. xenovorans LB400 en 2-aminofenol............................................. 48
Figura 9. Crecimiento de B. xenovorans LB400 en diferentes condiciones de cultivo……….. 49
Figura 10. Degradación de 2-aminofenol por B. xenovorans LB400………………………… 50
Figura 11. Amplificación del gen amnB de la cepa LB400………………………………… 50
Figura 12.Digestión enzimática del gen amnB……………………………………………….. 51
Figura 13. Análisis de RNA purificado de B. xenovorans LB400.......................................... 51
Figura 14. Expresión del gen amnB en B. xenovorans LB400………………………………... 52
Figura 15. Digestión enzimática (SalI y PstI) del plásmido pIZ1016……………………….... 53
Figura 16. Amplificación del gen habA de P. pseudoalcaligenes JS45..................................... 54
Figura 17. Amplificación del gen nbzA de P. pseudoalcaligenes JS45..................................... 54
Figura 18. Amplificación de los genes nbzA y habA de P. pseudoalcaligenes JS45…………. 54
Figura 19. Ligación de los genes nbzA y habA. ................................................................... 55
Figura 20. Amplificación del producto de la ligación (nbzAhabA)……………….................... 55
Figura 21. Amplificación del gen habA en la cepa E. coli DH5-alfa………………...……….. 56
10
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Cepas bacterianas utilizadas en esta tesis..................................................................... 25
Tabla 2. Antibióticos utilizados en esta tesis.............................................................................. 27
Tabla 3. Genes involucrados con el catabolismo del compuesto 2-aminofenol presente en B.
xenovorans LB400......................................................................................................................
28
Tabla 4. Partidores utilizados para la amplificación del gen amnB........................................... 32
Tabla 5. Programa de PCR utilizado para la amplificación del gen amnB................................ 33
Tabla 6. Cuantificación de RNA total………………………………………………………… 34
Tabla 7. Programa de RT-PCR utilizado para la amplificación del gen amnB.......................... 35
Tabla 8. Partidores utilizados para la amplificación de los genes nbzA y habA en P.
pseudoalcaligenes JS45..............................................................................................................
39
Tabla 9. Programa de PCR utilizado para la amplificación del gen nbzA y habA..................... 39
Tabla 10. Análisis del vecindario de los genes amn en la cepa LB400...................................... 44
11
ABREVIATURAS
DEPC Dietilpirocarbonato
IPCC Intergovernmental Panel Of Climate Change
kb 1000 pares de bases
LB Medio Luria-Bertani
M9 Medio mínimo M9
M63 Medio mínimo M63
MCS Sitio de múltiple clonación
MW Marcador de peso molecular
NCBI National Center for Biotechnology Information
ORF Marco de lectura abierto
pb Pares de base
PCR Reacción de amplificación en cadena con DNA polimerasa
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RESUMEN
Burkholderia xenovorans LB400 es una de las diez bacterias más importantes descritas
para la degradación de contaminantes orgánicos persistentes (COPs). Su genoma muestra la
presencia de un número importante de genes catabólicos asociados a la degradación de
compuestos aromáticos. Dentro de los genes catabólicos, la cepa LB400 posee genes
relacionados con la degradación de compuestos nitroaromáticos. Uno de los compuestos
nitroaromáticos de especial interés en términos ambientales es el 2-aminofenol, cuya vía de
degradación codificada por los genes amn está presente en B. xenovorans LB400 (Chain et al.,
2006).
El objetivo de este proyecto es realizar un estudio sobre la funcionalidad de la vía
metabólica del 2-aminofenol presente en la bacteria B. xenovorans LB400. Mediante un estudio
in silico en la cepa LB400, se analizó el vecindario del agrupamiento de genes amn y se comparó
la organización de los genes amn con la de otros microorganismos. Se realizó una búsqueda
bioinformática de los genes nbzA y habA involucrados en la degradación de nitrobenceno, vía
periférica que converge a la ruta central de 2-aminofenol. Ensayos de crecimiento mostraron que
la cepa LB400 no puede utilizar 2-aminofenol como única fuente de carbono. No obstante
ensayos de degradación utilizando la técnica de HPLC indicaron que la cepa LB400 degrada
completamente el 2-aminofenol.
Se estudió mediante análisis transcripcional (RT-PCR) la expresión del gen amnB, que
codifica para la subunidad mayor de la 2-aminofenol-1,6-dioxigenasa, en la cepa LB400. La
cepa LB400 crecida en glucosa 5 mM como fuente de carbono, se expuso a 2-aminofenol 1 mM,
nitrobenceno 1 mM o glucosa 5 mM. En todas las condiciones se observó la expresión del gen
amnB. Este estudio demostró la funcionalidad de la vía central del 2-aminofenol en la cepa
LB400.
Además, se estableció un protocolo para generar una cepa modificada de B. xenovorans
LB400 capaz de degradar el nitrobenceno, que es un contaminante ambiental.
Este estudio constituye un aporte a futuras aplicaciones en biotecnológica ambiental de
procesos de descontaminación de compuestos nitroaromáticos.
13
ABSTRACT
Burkholderia xenovorans LB400 is one of the ten most important bacteria for the
degradation of persistent organic pollutants (POPs). Its genome contains an important number of
catabolic genes associated with the degradation of aromatic compounds. The LB400 strain
harbours catabolic genes that are related to the degradation of nitroaromatic compounds. One of
the nitroaromatic compounds of special interest for the environment is 2-aminophenol. B.
xenovorans LB400 possess the 2-aminophenol degradation pathway, which is codified by the
amn genes (Chain et al., 2006).
The objective of this thesis was to study the functionality of the 2-aminophenol
metabolic route of B. xenovorans LB400. By an in silico study, the neighborhood of the amn
gene cluster of the strain LB400 was analyzed and their organization was compared to that of
other microorganisms. A bioinformatic search for the nbzA and habA genes, which are involved
in the degradation of nitrobenzene - a peripheral route that converges in the central route of 2-
aminophenol- was carried out. The LB400 strain was not able to use 2-aminophenol as sole
carbon source for growth. However, the LB400 cells degrade completely 2-aminophenol.
The expression of the amnB gene, which codifies for the large subunit of 2-
aminophenol-1,6-dioxygenase, was analyzed in the strain LB400 by transcriptional analysis
(RT-PCR). LB400 cells grown in glucose as sole carbon source, were exposed to 2-aminophenol
1 mM, nitrobenceno 1 mM or glucose 5 mM. In all the conditions, the amnB gene expression
was observed. This study demonstrates the functionality of the central route of 2-aminophenol in
the strain LB400.
Additionally, a protocol for the generation of a modified strain of B. xenovorans LB400,
capable of degrading nitrobenzene (an environmental pollutant) was proposed.
This study contributes to future applications of biorremediation processes of
nitroaromatic compound-polluted environments.
14
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Prólogo
“¡Triste nuestra época! Es más fácil desintegrar un átomo que un prejuicio”.
Einstein A.
Como bien dice Albert Einstein, resulta más fácil desarrollar grandes avances científicos
que cambiar la forma de pensar. Pero especialmente en nuestra época, es primordial generar un
cambio de actitud que resulte en un mejor entendimiento e interacción con nuestro medio
ambiente. Se debe tomar conciencia del impacto ambiental que estamos generando, sólo por el
hecho de relacionarnos de forma no sustentable con nuestro entorno. Este es el desafío que
enfrentamos como especie para restablecer el equilibrio con nuestro planeta. La contaminación
de la biosfera ya no es sólo una posibilidad inminente, causa de una creciente preocupación en
círculos científicos, sino que se ha transformado en una realidad mundial. El proceso de
industrialización en las grandes urbes ha generado un desequilibrio de los ecosistemas,
ocasionando un dramático impacto para el planeta y la calidad de vida del hombre. Esta
contaminación ambiental no sólo ha afectado a las regiones más industrializadas, sino que se ha
transformando en un problema a nivel mundial (Navia & Seeger, 2006). Como ejemplo, el
último reporte que elaboró el IPCC (Intergovernmental Panel of Climate Change) señala las
evidencias, impacto y mitigación del cambio climático. Se informó sobre el calentamiento global
proporcionando evidencias en el incremento de la temperatura promedio del aire y del océano, el
derretimiento de los hielos, extensión de la nieve, y un aumento del nivel del mar. Se espera que
la temperatura aumente en 1,8-4,0ºC a finales del siglo XXI, bajo un escenario de altas
emisiones de gases invernaderos (IPCC, 2007).
Por lo tanto, nuestra responsabilidad, con nuestro planeta es tomar conciencia del daño
que estamos produciendo. Como bien dice Einstein, se deben derribar los prejuicios y utilizar los
avances científicos que estamos continuamente generando para poder revertir, mitigar y
restablecer el equilibrio con el medio ambiente.
15
1.2 Los contaminantes orgánicos persistentes
Existe un grupo de contaminantes denominados contaminantes orgánicos persistentes
(COPs), que representan un problema de creciente preocupación en el mundo en términos
medioambientales (Navia & Seeger, 2006). Por definición, estos productos químicos poseen
cuatro propiedades: (1) Son altamente tóxicos; (2) son persistentes y tienen una vida media
desde meses hasta décadas; (3) se evaporan y se desplazan largas distancias a través del aire y el
agua (Wania, 2003); (4) son hidrofóbicos y se acumulan en el tejido adiposo. Debido a su
persistencia y movilidad, los COPs están en diversas partes del mundo, incluso en zonas tan
extremas del planeta como el Ártico (Macdonal et al., 2000) y la Antártica (Bargagli et al.,
2008). El transporte de COPs depende de la temperatura; en un proceso conocido como “efecto
saltamontes”, estos compuestos químicos “saltan” alrededor del planeta, en los lugares cálidos,
se dejan llevar por el viento y las partículas de polvo, se precipitan en la tierra en lugares
templados, y luego se evaporan y siguen desplazándose. A medida que estas sustancias se alejan
del Ecuador encuentran climas más templados con menos evaporación. El resultado es un
desplazamiento general de los contaminantes hacia los polos y las zonas montañosas.
1.3 COPs y cambio climático
Existen estudios que describen los efectos que producirá el cambio climático en el
comportamiento y destino de los COPs en el medio ambiente. Existen varios ejemplos que dan
cuenta del problema: (1) un aumento en las temperaturas del océano podría alterar la
biotransformación de los contaminantes a metabolitos bioactivos, siendo estos más tóxicos y
reactivos; (2) el aumento de las precipitaciones en algunas zonas del planeta podría significar un
aumento de las deposiciones de los COPs transportados en el aire y un aumento del drenaje de
otros encontrados en la tierra; (3) o contrariamente una disminución en las precipitaciones podría
aumentar la volatilización de los COPs a la atmósfera; (4) el aumento de la intensidad y
frecuencia de las tormentas podría aumentar los episodios de contaminación de aguas con
compuestos tóxicos y finalmente (5) el aumento del derretimiento de los hielos podría producir
un aumento de los niveles de COPs en el agua (Noyes et al., 2009).
1.4 Contexto internacional y nacional de los COPs
Los COPs plantean amenazas tan importantes a la salud y al medio ambiente, que el 22
de mayo de 2001 muchos gobiernos se reunieron en Suecia y adoptaron un tratado internacional
16
destinado a restringir y eliminar su producción, utilización, emisión y almacenamiento. Este
tratado, llamado el “Convenio de Estocolmo sobre Contaminantes Orgánicos Persistentes”,
tiene como objetivo reducir y, con el tiempo, eliminar totalmente 12 contaminantes orgánicos
persistentes particularmente tóxicos (UNEP, 2005). Nueve son plaguicidas: aldrin, clordano,
diclorodifeniltricloroetano, dieldrin, endrina, heptacloro, mirex y toxafeno. Dos son productos
químicos industriales, el hexaclorobenceno (HCB), que también se utiliza como plaguicida y
puede ser un subproducto de la fabricación de los mismos, y los policloro bifenilos (PCBs).
Además, incluye dos familias de subproductos químicos no deliberados, las dioxinas y los
furanos policlorados. Estos compuestos no tienen utilización comercial. Las dioxinas y los
furanos son generados como subproductos de la combustión y de los procesos industriales tales
como la elaboración de plaguicidas, cloruro de polivinilo y otras sustancias cloradas. Las
dioxinas y los furanos clorados son los productos químicos carcinógenos más potentes que se
conocen (Belpomme et al., 2007).
Nuestro país ratificó el Convenio de Estocolmo el año 2004, Chile se comprometió a
desarrollar el “Plan Nacional de Implementación para la Gestión de los Contaminantes
Orgánicos Persistentes” (PNI, 2007). Actualmente se encuentra en la primera etapa (2006-2010),
y tiene como objetivo principal proteger el medio ambiente y la salud de las personas de los
COPs.
1.5 Efectos de los COPs sobre la salud
En el ser humano, altas dosis de COPs pueden provocar diversos tipos de cáncer
(McGlynn et al., 2008). En concentraciones bajas o medias los COPs afectan al sistema
inmunológico (Stehlik et al., 2007), nervioso (Grandjean et al., 2006) y reproductivo (Bonde et
al., 2008). Entre otras patologías, los COPs pueden provocar diabetes (Carpenter et al., 2008) y
endometriosis (Nicolopoulou-Stamati et al., 2001), daño a nivel renal, y trastornos hormonales
(Brouwer et al., 1998).
1.6 Compuestos nitroaromáticos
Existen un grupo de COPs denominados compuestos nitroaromáticos. Estos son
liberados a la biosfera casi exclusivamente desde fuentes antropogénicas (Spain, 1995). Los
compuestos nitroaromáticos son utilizados como intermediarios sintéticos en la industria
farmacéutica, producción de tinturas (Hao et al., 1997), pesticidas y explosivos (Snellinx et al.,
17
2002; Ye et al., 2004). También son generados por la combustión incompleta de fuentes de
energía fósil (Pitts et al., 1978; Tokiwa et al., 1986). Estos compuestos, al ser utilizados
extensamente en muchos procesos industriales y liberados al medio ambiente, han generado un
serio problema de contaminación ambiental. Algunos pesticidas nitroaromáticos aplicados a
suelos son recalcitrantes y se acumulan como compuestos tóxicos (Holtze et al., 2006). Se han
encontrado lugares de combate que datan de la Segunda Guerra Mundial que están contaminados
con derivados de productos explosivos, y los yacimientos mineros de donde se extraía el
material para la producción de explosivos.
La toxicidad de los compuestos nitroaromáticos y sus metabolitos ha sido estudiada en
una gran variedad de sistemas (Won et al., 1978; Beland et al., 1985; Nishido et al., 2002).
Tanto los grupos nitro como los amino son relativamente estables en los sistemas biológicos. La
interconversión entre ellos, sin embargo, involucra la producción de intermediarios nitroso e
hidroxilamino, los cuales son muy reactivos y muchas veces, más tóxicos que las moléculas
iniciales debido a efectos cancerigenos (Nishido et al., 2002).
La contaminación ambiental con compuestos COPs y específicamente con compuestos
nitroaromáticos ha generado la necesidad de buscar nuevos horizontes en el tema de la
descontaminación.
1.7 Biorremediación
La contaminación ambiental generada por los COPs en la biósfera ha provocado un
aumento en la necesidad de desarrollar nuevas tecnologías relacionadas con la
descontaminación, suscitando el interés tanto de disciplinas del ámbito de las ciencias (biología,
bioquímica, física, geología, microbiología y química, entre otras), como de la ingeniería
(ambiental, bioquímica, civil, hidráulica, mecánica y química, entre otras). El punto de encuentro
de estas disciplinas recae en la biorremediación (Navia & Seeger, 2006). Esta es una tecnología
que utiliza el potencial catabólico de los microorganismos para descontaminar sitios afectados.
Dentro de los organismos con capacidades degradadoras, las bacterias han sido las más
estudiadas y frecuentemente utilizadas en estrategias de biorremediación (Timmis & Pieper,
1999; Wackett et al., 2000; Prieto et al., 2004; Pieper & Seeger, 2008). Un gran número de
microorganismos con capacidades degradadoras han sido aislados y caracterizados. Se ha
descrito la biodegradación de compuestos nitroaromáticos tanto por microorganismos aerobios
como anaerobios (Haidour et al., 1987; Bruhn et al., 1996; Esteve-Nunez et al., 2000).
18
1.8 Degradación microbiana y vías catabólicas de compuestos nitroaromáticos
Los mecanismos de adaptación a diferentes condiciones ambientales y el
aprovechamiento de nutrientes para el crecimiento y subsistencia son claves en la degradación
microbiana de compuestos nitroarómaticos (Spain, 1995). Numerosos compuestos
nitroaromáticos pueden servir como fuente de carbono para bacterias aerobias (Bruhn et al.,
1987). La remoción o producción metabólica de grupos nitro puede ser lograda por diferentes
estrategias. (1) Algunas bacterias pueden reducir compuestos dinitro y trinitro aromáticos por la
adición de un ion hidruro en el anillo, formando el complejo Meisenheimer, el cual es
rearomatizado por la eliminación del nitrito. (2) Las enzimas monoxigenasas pueden adicionar
un átomo de oxígeno y eliminar el grupo nitro de los compuestos nitrofenoles (Spain, 1995). (3)
Las enzimas dioxigenasas pueden insertar dos grupos hidroxilos en el anillo aromático,
generando la eliminación espontánea del grupo nitro de varios compuestos nitroaromáticos
(Seeger et al., 2001). (4) La reducción del grupo nitro produciendo hidroxilamino es la reacción
inicial en el metabolismo de nitrobenceno, 4-nitrotolueno, y 4-nitrobenzoato. La hidroxilamina
sufre un reordenamiento enzimático a hidroxilato, que es el sustrato para producir la ruptura del
anillo aromático (Johnson & Spain, 2003).
Dentro del grupo de compuestos nitroaromáticos existen dos, 2-aminofenol y
nitrobenceno, que son de especial interés en términos de contaminación ambiental.
1.9 2-aminofenol y su metabolismo
El 2-aminofenol es utilizado en la síntesis orgánica de diferentes tipos de pigmentos para
la coloración de plásticos, fibras sintéticas y materiales para cubrir superficies como pinturas y
tintas. Las industrias producen descargas de agua con una alta demanda química y bioquímica de
oxígeno (DQO y DBO), sólidos en suspensión y un intenso color debido a intermediarios de las
tinciones, residuos y químicos auxiliares provenientes del proceso (Kornaros et al., 2006).
La degradación microbiológica del compuesto 2-aminofenol está conformada por 7
enzimas (AmnBA, AmnC, AmnE, AmnD, AmnF, AmnG, AmnH) (Figura 1). La primera
enzima de la vía de degradación es la 2-aminofenol 1,6-dioxigenasa que está conformada por la
subunidad alfa (AmnA) y la subunidad beta (AmnB). La enzima 2-aminofenol 1,6-dioxigenasa,
perteneciente a la familia de dioxigenasas tipo II, cataliza la ruptura en posición meta del anillo
aromático, transformando el 2-aminofenol en 2-aminomucónico semialdehido. El 2-
19
aminomucónico semialdehido es transformado a ácido 2-aminomucónico y luego a ácido 4-
oxacrotonato mediante la acción de las enzimas 2-aminomuconico semialdehido deshidrogenasa
y aminocumanato desaminasa. La enzima 4-oxacrotonato descarboxilasa forma 2-ceto-4-enolato
a partir del ácido 4-oxacrotonato. La enzima acetaldehído deshidrogenada actúa sobre el 2-ceto-
4-enolato generando 4-hidroxi-2-cetovalerato. Por acción de las enzimas 4-hidroxi-2-
cetovalerato aldolasa y acetaldehído deshidrogenada el compuesto piruvato es convertido en
acetil-CoA que son intermediarios derivados al ciclo de Krebs (Park & Kim, 2000). La ruta
central de 2-aminofenol es funcional en numerosos organismos como Comamonas sp. CNB-1,
Pseudomonas putida HS12, y Pseudomonas sp. AP-3 (Park & Kim, 2000; Takenaka et al., 2005;
Wu et al., 2006).
Figura 1. Vía catabólica del 2-aminofenol. Los genes codifican las siguientes enzimas.
amnAB: 2-aminofenol 1,6 dioxigenasa, amnC: 2-aminomuconico semialdehido deshidrogenada,
amnE: aminocumanato desaminasa, amaD: 4-oxacrotonato decarboxilasa, amnF: 2-ceto-4-
enolato deshidrogenada, amnH: acetaldehído deshidrogenada, amnG: 4-hidroxi-2-cetovalerato
aldolasa.
1.10 Nitrobenceno y su metabolismo
El nitrobenceno es un compuesto formado por un anillo aromático y sustituido en uno de
sus carbono con un grupo nitro. Es uno de los 50 químicos industriales producidos en mayor
cantidad por Estados Unidos; en el año 1995 se produjeron sobre 720000 toneladas (Storck et
al., 1996). Debido a su toxicidad está clasificado como contaminante prioritario por la Agencia
COOH
COOH
NH2
COOH
CHO
NH2
COOH
O
amnC amnD NH
2
OH
O
COOHCOOH
2-aminofenol
amnAB amnE
amnF
CH3 O
COOHCH3
O
CH3
S CoA
O
amnG
amnH
2-aminomuconico
semialdehido
Ác. 4-oxacrotonato 2-ceto-4-enolato
4-hidroxi-2-cetovalerato
Ác. 2-aminomuconico
+ Piruvato
Acetaldehído Acetil-CoA
O H
C O O H
O
20
de protección al medio ambiente en Estados Unidos (Keith et al., 1979). El nitrobenceno es
ampliamente utilizado en la producción de anilinas y piroxilinas, refinería de aceites lubricantes,
jabones y caucho utilizado en la industria de zapatos (Johnson et al., 2003; Leungsakul et al.,
2006; Roldan et al., 2008). Las industrias de explosivos generan constantes descargas de agua
contaminada con este compuesto al igual que las industrias de químicos y plásticos (Howard et
al., 1989). Se ha estimado que anualmente se liberaban aproximadamente 8,6 millones de
Kilogramos de nitrobenceno al ambiente (EPA, 1978) proveniente de las diversas aplicaciones
industriales. En Chile existe el Decreto Supremo N°594, donde en el artículo N°66 se describen
los límites permisibles de las concentraciones ambientales de varios compuestos incluido el
nitrobenceno: El límite ponderado es 0,8 p.p.m y el límite temporal es 4 mg/m3.
Como el común de los compuestos aromáticos recalcitrantes, el nitrobenceno puede ser
metabolizado por bacterias aerobias a través de la vía oxidativa (Nishido et al., 1995), o por la
vía parcialmente reductiva (Nishido et al., 1993; He et al., 1997; He et al., 1999; Park & Kim,
1999). En esta última, el nitrobenceno es convertido a 2-aminofenol por la acción de dos
enzimas: nitrobenceno nitroreductasa (NbzA) y hidroxilaminobenceno mutasa (HabA) (Figura
1).
Figura 2. Vía catabólica de nitrobenceno. Los genes codifican las siguientes enzimas. nbzA:
nitrobenceno nitroreductasa. habA: hidroxilamino mutasa. amnABCEDFGH: genes de la vía de
degradación del 2-aminofenol (Figura 1).
1.11 Estudio in silico de rutas metabólicas
La predicción de vías catabólicas de compuestos nitroaromáticos por métodos
bioinformáticos a partir de genomas secuenciados es una herramienta útil para predecir
potenciales aplicaciones biotecnológicas y de biorremediación (Pazos et al., 2005; Ellis et al.,
2006). Sin embargo, la determinación de la funcionalidad de los genes en análisis aún permanece
incompleta. Las aplicaciones bioinformáticas permiten predecir vías degradativas que pueden
presentar las bacterias frente a compuestos tanto tóxicos como inocuos para el medio ambiente
NH2
OH
CH3 O
NO2 NH
OH
+
habA nbzA
amnABCEDFGH
2-aminofenol Nitrobenceno Hidroxilamino-
benceno
Acetaldehído
Piruvato
COOHCH3
O
21
(Jiménez et al., 2002; Chain et al., 2006; Pérez-Pantoja et al., 2008). Las bases de datos
contienen la información necesaria para la predicción de rutas, a partir de secuencias
nucleotídicas o aminoacídicas. Los avances realizados en tecnologías de secuenciación de alto
rendimiento han permitido la secuenciación de un número considerable de genomas de diversos
organismos. Genomas bacterianos del género Pseudomonas, Burkholderia, Cupriavidus han sido
secuenciados (Stover et al., 2000; Chain et al., 2006; Polhmann et al., 2006). La reciente
secuenciación del genoma de Burkholderia xenovorans LB400 permitió realizar la
reconstrucción metabólica para compuestos aromáticos (Chain et al., 2006).
1.12 Burkholderia xenovorans LB400
La bacteria Burkholderia xenovorans cepa LB400 (denominada anteriormente como
Pseudomonas sp. LB400, Burkholderia sp. LB400, Burkholderia fungorum LB400) ha centrado
el foco de atención de muchos científicos, debido a que es una de las bacterias mejor descrita
para la degradación de contaminantes orgánicos persistentes (COPs). Es uno de los
microorganismos que degrada una mayor variedad de policlorobifenilos (Abramowicz, 1990), en
compuestos más simples como los clorobenzoatos. Esta bacteria Gram negativa y aerobia
pertenece al cladograma de Burkholderia graminis. Este género presenta una alta diversidad, ya
que las diferentes especies son capaces de colonizar diversos nichos ecológicos, desde
ecosistemas acuosos hasta terrestres, y pueden ser organismos saprofitos a endosimbiontes
(Landers et al., 2000) y estar asociados a plantas, hongos, amebas, animales y humanos (Coenye
et al., 2003). Los miembros del género Burkholderia han sido utilizados en diversas aplicaciones
biotecnológicas, incluyendo biorremedación de compuestos xenobióticos recalcitrantes (Zhang
et al., 2003) y control biológico de pestes producidas en campos de cultivo (Parke et al., 2001).
En contraste con estas beneficiosas aplicaciones, varias especies de Burkholderia son patógenos
oportunistas en humanos, capaces de causar infecciones en pacientes con fibrosis quística y en
otros pacientes vulnerables (Mahenthiralingam, 2000; 2005). Las diversas especies de
Burkholderia poseen un genoma multirreplicón de gran tamaño y presentan múltiples secuencias
de inserción que le confieren una alta plasticidad, que podrían explicar la versatilidad del género
(Lessie et al., 1994). La reciente secuenciación del genoma de Burkholderia xenovorans LB400
reveló que este organismo posee uno de los genomas bacterianos de mayor tamaño, con 9,7 Mbp
y 9000 genes distribuidos en dos cromosomas (4.87 Mbp, 3,36 Mbp) y un megaplásmido (1,47
Mbp) (Chain et al., 2006). El conocimiento de la secuencia del genoma ha permitido realizar
22
estudios bioinformáticos, mostrando que este organismo posee diversas vías catabólicas para la
degradación de compuestos aromáticos. Se han encontrado alrededor de 11 vías centrales y al
menos 21 vías periféricas para la degradación de compuestos aromáticos, indicando una inusual
alta versatilidad metabólica. La bacteria posee más de 170 genes que codifican para vías
catabólicas compuestos aromáticos, distribuidas en los tres replicones. Burkholderia xenovorans
LB400 presenta varios genes relacionados con vías catabólicas de compuestos nitroaromáticos
como por ejemplo: antranilato, fenilalanina, triptófano, tirosina, benzamida, benzonitrilo y 2-
aminofenol. El 2-aminofenol es un contaminante ambiental, por lo que resulta interesante
estudiar la posible funcionalidad los genes involucrados en la degradación de este compuesto en
la cepa LB400. Por otro lado, a la vía central del compuesto 2-aminofenol no se le asignó
ninguna vía periférica (Chain et al., 2006). Un análisis bioinformaticó de vías periféricas podría
entregar nuevas líneas de estudios.
1.13 Organismos modificados genéticamente
Durante los últimos 20 años, la tecnología de DNA recombinante, ha sido estudiada
intensamente para mejorar la degradación de desechos tóxicos bajo condiciones de laboratorio.
Bacterias recombinantes pueden ser obtenidas con técnicas de ingeniería genética o por
transferencia natural de material genético entre bacterias (van Der Meer et al., 2003). La
aplicación de microorganismos modificados por ingeniería genética (GMO, Genetically
Modified Organism) en biorremediación actualmente ha llamado el foco de la atención, pero
principalmente ha sido confinado a escala de laboratorio, debido a la estricta regulación por los
posibles riesgos relacionados, y al desconocimiento del impacto bajo condiciones de campo.
Existen al menos tres estrategias principales para generar un (GMO) con aplicaciones en el área
de biorremediación: (1) modificación de la especificidad y afinidad enzimática (Cámara et al.,
2007), (2) construcción de vías y su regulación (Brenner et al., 1994; McKay et al., 1997), (3)
aplicación de sensores bioreporteros para el monitoreo químico y de toxicidad. Estos
microorganismos mejorados con ingeniería genética poseen una mejor capacidad degradadora y
han demostrado ser candidatos exitosos en la degradación de contaminantes bajo condiciones
definidas (Menn et al., 2000).
23
1.14 Planteamiento del problema
Considerando que Burkholderia xenovorans LB400 posee los genes amn relacionados
con la degradación de 2-aminofenol, esta investigación propone un estudio sobre la
funcionalidad de estos genes. Además se propone un protocolo para la generación de un
organismo modificado genéticamente capaz de degradar nitrobenceno mediante la vía periférica
que converge a la vía central del 2-aminofenol.
La generación de un microorganismo que sea capaz de degradar este tipo de compuestos
podría tener una futura aplicación biotecnológica en la biorremedación de aguas provenientes de
las industrias involucradas en la producción de nitrobenceno.
24
1.15 HIPOTESIS
“Burkholderia xenovorans LB400 es capaz de degradar 2-aminofenol mediante las enzimas
codificadas por los genes amn presentes en su genoma”
1.16 OBJETIVOS
Objetivos generales
Determinar la funcionalidad de la vía metabólica de 2-aminofenol en la bacteria
Burkholderia xenovorans LB400 y sus posibles aplicaciones en biotecnología ambiental.
Objetivos específicos
1. Análisis bioinformático de los genes amn en Burkholderia xenovorans LB400,
estudiando su organización y vecindario.
2. Determinar la funcionalidad de la vía del 2-aminofenol en Burkholderia xenovorans
LB400 mediante ensayos de crecimiento, degradación y expresión catabólica de sus
genes amn.
3. Establecer una estrategia experimental para generar una plasmidio recombinante que
contengan los genes que codifican las enzimas para la degradación de nitrobenceno.
25
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Reactivos
Los compuestos aromáticos 2-aminofenol y nitrobenceno se obtuvieron comercialmente
de Sigma (Steinhem, Alemania). La pureza de ambos compuestos es > 98%. Se preparó una
solución de 2-aminofenol 1 mM en agua y una solución de nitrobenceno 1 mM en acetona (1 %
v/v concentración final en solución). Para solubilizar el 2-aminofenol en agua se requirió de una
etapa de sonicación a 30ºC durante 40 min.
El beta-mercaptoetanol, TEMED 99%, DNAsa I se adquirieron de Sigma (Steinhem,
Alemania), IPTG se obtuvieron en Bio Rad (Hercules, USA).
Las enzimas de restricción (SalI, HindIII, PstI) y los marcadores de peso molecular (1 kb
DNA ladder, 100 pb DNA ladder, 100 pb + DNA ladder) fueron suministras por Fermentas
(Madison, USA). Las enzimas T4 ligasa y CIP fosfatasa alcalina se adquirieron en Invitrogen
(Carlsbad, USA). La enzima AmpliTaq DNA polimerasa se obtuvo de Applied Biosystems
(California, USA) y la DNA polimerasa Pfu en Biotools, B & M Labs S.A (Philadelphia, USA)
2.2 Cepas bacterianas y plásmidos
Las cepas bacterianas utilizadas en esta tesis se detallan en la Tabla 1.
Tabla 1. Cepas bacterianas utilizadas en esta tesis.
Cepa Genotipo/fenotipo relevante Referencia
B. xenovorans LB400 Silvestre Bopp, 1986
P. pseudoalcaligenes JS45 Silvestre Spain, 1995
E. coli DH5 - (Φ80lacZΔM15) endA1
recA1 hsdR17 (rK-mk
-)
supE44Δ lacU169
Sambrook & Russell, 2001
E. coli S17-1λpir TprSm
rrecA thi hsdRM
RP4::2-Tc::Mu::Km Tn7λpir
lisogénico
De Lorenzo & Timmis,
1994
26
2.3 Medios y condiciones de cultivo
Para el crecimiento de las cepas se utilizaron diferentes medios de cultivo que se detallan
a continuación. Las soluciones y los medios de cultivo se esterilizaron por calor húmedo en
autoclave o mediante filtración (filtros Millipore de 0,2 μm de diámetro).
El medio enriquecido que se empleo para el crecimiento de las cepas fue Luria-Bertani
(LB) (Sambrook et al., 1989). El medio LB contiene 10 g/L de triptona, 5 g/L extracto de
levadura y 5 g/l de NaCl. Para la preparación de cultivos sólido, el medio LB se suplemento con
agar al 1,5 % p/v.
2.3.1 Medios y condiciones de cultivo empleados para B. xenovorans LB400
El medio mínimo utilizado para cultivar la cepa B. xenovorans LB400 fue el medio
mineral M9 (Sambrook et al., 1989), que contiene; Na2HPO4 50 mM, KH2PO4 22 mM, NaCl 85
mM, NH4Cl 7,5 mM. Además este medio fue suplementado con elementos trazas; Solución A en
50 mL (MgCl2·6H2O 0,5375 g, CaCO3 0,1 g, MnSO4·H2O 0,0424 g, CoCl2·6H2O 0,0140 g,
FeSO4·7H2O 0,2250 g, ZnSO4·7H2O 0,0720, CuSO4·5H2O 0,0125 g, H3BO3 0,0030 g, HCl (37%
v/v) 2,565 mL), Solución B (MgSO4·7H2O 1 M) y Solución C (FeSO4·7H2O 36 mM). La
solución A y B se autoclavaron y se almacenaron a 4ºC. La solución C se esterilizó por filtración
y se guardo a -24ºC.
Para 1 L de medio mineral M9 se utilizaron las siguientes concentraciones: 100 mL de
medio M9 (10X); 2,5 mL de solución traza en relación A: B: C (2:1:1). Como fuente de carbono
se empleo glucosa 5 mM o 2-aminofenol 1mM.
La cepa B. xenovorans LB400 se creció a 30ºC con una agitación orbital de 200 rpm en
mínimo M9 suplementado con glucosa 5 mM (Cámara et al., 2004). Para estudiar el crecimiento
de la cepa en compuestos nitroaromáticos el medio se suplemento con 2-aminofenol 1 mM o
nitrobenceno 1 mM.
2.3.2 Medios y condiciones de cultivo empleado para E. coli DH5 - y E. coli S17-1λpir
El medio mínimo utilizado fue el medio M63 (Csonka et al., 1982), que contiene;
KH2PO4 0,1 M, KOH 0,075 M, (NH4)2S04 0,015 M, MgSO4·7H2O 0,16 mM, FeSO4·7H2O 1,8
μM, se debe ajustar el pH a 7,2 con KOH. Se adicionó agar al 1,5 % p/v cuando se realizó
27
crecimiento en medio sólido. La fuente de carbono se suplemento a una concentración de 10
mL/L de 20 % v/v.
Las cepas de E. coli se crecieron a 37ºC con una agitación orbital de 250 rpm, en medio
mínimo M63 suplementado con glucosa 10 mM como fuente de carbono.
2.3.3 Medios y condiciones de cultivo empleados para Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45
El medio mínimo utilizado para crecer P. pseudoalcaligenes JS45 fue el medio mineral
libre de nitrógeno BLK (Bruhn et al., 1987), que contiene (por litro); Na2HPO4·12H20 7 g,
KH2PO4 1 g, CaCl2·2H20 10 mg, citrato férrico 2 mg, MgSO4·7H20 20 mg. Los cultivos en
medio LB sólido se suplementaron con agar 1,5 % p/v. Las fuentes de carbono utilizadas fueron
succinato 3 mM y nitrobenceno 1 mM suplementado en fase gaseosa (Nishido et al., 1993).
P. pseudoalcaligenes JS45 se creció a 30ºC con una agitación orbital de 200 rpm. El
medio mínimo que se utilizó fue BLK y como fuentes de carbono se emplearon nitrobenceno 1
mM y succinato 3 mM.
2.4 Conservación de las cepas bacterianas
Para la conservación de las cepas B. xenovorans LB400, P. pseudoalcaligenes JS45, E.
coli DH5 - y E. coli S17-1λpir por un periodo de meses, las bacterias se congelaron en sus
medios correspondientes, con glicerol al 15 % v/v y se mantuvieron a -24ºC.
2.5 Antibióticos
Los antibióticos gentamicina y polimixina B se prepararon en soluciones 1000X en
agua. Las soluciones fueron esterilizadas por filtración y se almacenaron a -20ºC. Los
antibióticos utilizados se detallan en la siguiente Tabla 2.
Tabla 2. Antibióticos utilizados en esta tesis.
Antibiótico Concentración
Gentamicina (Gm) 10 ug/mL
Polimixina B 24,6 ug/mL
28
2.6 Análisis bioinformático
El genoma de B. xenovorans LB400 se encuentra secuenciado. Los genes amn que
participan en la vía de degradación de 2-aminofenol fueron anotados bioinformaticamente. El
listado de genes amn se encuentra en la Tabla 3 (Chain et al., 2006).
Tabla 3. Genes involucrados con el catabolismo del compuesto 2-aminofenol presente en B.
xenovorans LB400.
aNombre del gen según notificación automática del genoma de B. xenovorans LB400
(http://genome.ornl.gov/microbial/bfun/).
*aa id: Identidad aminoacídica.
Gen LB400a
Anotación Organismo
(BLAST
top hit)
*aa
id.
amnR BxeA1143 Represor del operón 2-aminofenol Pseudomonas
putida
57%
amnB BxeA1145 Subunidad beta de 2-aminofenol 1,6-
dioxigenasa
Comamonas
testosteroni
79%
amnA BxeA1146 Subunidad alfa 2-aminofenol 1,6-
dioxigenasa
Pseudomonas
putida
100%
amnC BxeA1147 2-aminomuconico semialdehido
deshidrogenada
Pseudomonas
putida
99%
amnE BxeA1148 2-aminocumanato desaminasa Pseudomonas
putida
100%
amnF BxeA1149 2-ceto-4-enolato deshidrogenada Pseudomonas
putida
58%
amnD BxeA1150 4- oxacrotonato decarboxilasa Pseudomonas
putida
48%
amnH BxeA1151 acetilaldehido
deshidrogenasa
Pseudomonas
putida
100%
amnG BxeA1152 4-hidroxi-2-cetovalerato aldolasa Comamonas
testosteroni
87%
29
2.6.1 Análisis de la organización y vecindario de la vía de 2-aminofenol en B. xenovorans
LB400
Los genes que codifican las enzimas relacionadas con la vía de degradación del 2-
aminofenol se encuentran agrupados. El análisis del vecindario río arriba y abajo del cluster se
realizó con el software Vector NTI suite 9.0. Primero se determinaron los marcos de lectura
abierta (Open reading frame (ORF)), después se realizó un alineamiento de secuencia utilizando
el servidor National Center for Biotechnology Information (NCBI/ BLAST Home)
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), con el fin de otorgarle alguna función descrita para esa
secuencia que tuviera relación con la vía de degradación de 2-aminofenol.
2.6.2 Análisis comparativo de la organización de la vía del 2-aminofenol en diferentes
bacterias
Para comparar la organización del cluster de genes relacionados con la vía de
degradación de 2-aminofenol en diferentes microorganismos se utilizó el servidor National
Center for Biotechnology Information (NCBI/ BLAST Home)
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), para obtener las secuencias respectivas. Luego con el
software Vector NTI suite 9.0 se determinó la organización de cada cluster de genes.
2.6.3 Búsqueda in silico de la vía de degradación de nitrobenceno en B. xenovorans LB400
Se realizó la búsqueda de las enzimas participantes en la vía reductiva de degradación
del nitrobenceno a través de la base de datos de la University of Minnesota Biocatalysis/
Biodegradation Database (http://umbbd.msi.umn.edu/index.html). En seguida, se buscó la
secuencia aminoacídica de las proteínas participantes en la vía de degradación a través del
servidor National Center for Biotechnology Information (NCBI)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi). El alineamiento de estas secuencias con el
genoma completo de B. xenovorans LB400 (http://genome.ornl.gov/microbial/bfun/) se realizó
empleando los algoritmos TBLASTN y BLASTN.
2.7 Crecimiento de Burkholderia xenovorans LB400
B. xenovorans LB400 se creció en medio mineral M9 (25 mL) empleando glucosa o 2-
aminofenol como fuente de carbono a 30ºC. Las curvas de crecimiento se determinaron por
conteo de unidades formadoras de colonias (UFC) solamente. No se puede medir la turbidez del
30
medio, ya que el compuesto 2-aminofenol es fotosensible y presenta una coloración amarilla que
podría interferir en el análisis de turbidez (595 nm). Alícuotas de cada cultivo se tomaron a
diferentes tiempos. Se realizaron diluciones seriadas con estas alícuotas (100 uL) y se sembraron
en placas Petri con medio LB-agar. La UFC/mL se determinaron por recuento de colonias
después de la incubación a 30ºC por 3 días. Los valores corresponden al promedio del recuento
de UFC/mL ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes.
Para los estudios de degradación por células en reposo el crecimiento se realizó en
medio mineral M9 suplementado con glucosa 5 mM. El crecimiento celular se monitoreó
determinando la turbidez a 595 nm hasta que alcanzó una fase de crecimiento exponencial tardía
(DO=0,6).
P. pseudoalcaligenes JS45 se creció en medio líquido BLK (25 mL) empleando
nitrobenceno 1 mM, nitrobenceno 1 mM más succinato 3 mM a 30ºC. El crecimiento celular se
monitoreó determinando la turbidez a 525 nm.
2.8 Experimentos de degradación por células en reposo
Se cultivó la cepa empleando glucosa 5 mM como única fuente de carbono en medio
mineral M9. El cultivo se cosechó a una turbidez (600 nm) de 0,6. Las células se lavaron con
tampón NaH2PO4 50 mM pH 7,2. Se incubaron las células a una turbidez (600 nm) final de 2
con 2-aminofenol 1 mM. Como control negativo se utilizó el tampón y las células hervidas por
10 min con 2-aminofenol 1 mM. Se tomaron alícuotas a los tiempos 0, 3, 6, 18, 20, 24, 30 horas.
Las células se centrifugaron a 19283 g durante 2 min. y almacenadas a -20ºC. Las muestras
fueron posteriormente analizadas por HPLC. Las condiciones establecidas para la medición del
compuesto 2-aminofenol fueron las siguientes; fase móvil metanol 70%-CH3COONa 90%, flujo
1,0 mL/min, longitud de onda 270 nm, columna RP-C18 (Supelco, USA).
2.9 Técnicas de biología molecular
2.9.1 Análisis de la expresión del gen amnB
Reactivos y soluciones:
a) Preparación de geles
Tampón TAE 1X
Sybr Green (Fermentas, USA)
Agarosa 1 % p/v, preparación con tampón TAE 1X
31
Marcador de peso molecular; PCR DNA ladder 100 pb (Gene choice, USA), Phi X
174 DNA/BsuRI (halII) (Fermentas, USA)
Tampón de carga (Gene choice, USA)
b) Reacción de PCR
Agua MiliQ ultra pura para PCR
Tampón PCR (Invitrogen, USA)
MgCl2 3 mM
BSA 10 mg/μL (5% v/v)
dNTPs 25 mM (Invitrogen, USA)
Taq DNA polimerasa 5 U/ μL (Invitrogen, USA)
c) Extracción y Purificación de RNA bacteriano (Kit QIAGEN)
Tampón RLT, RWI, RPE, RDD (Kit RT-PCR /QIAGEN, USA)
Agua Mili Q libre de RNAsa
DNAsa I, libre de RNAsa (Kit RNAsa-free DNAsa set, Invitrogen, USA). Solución
stock (1500 unidades Kunitz en 550 μL de agua libre de RNAsas)
Proteinasa K (QIAGEN, USA)
Lisozima (Sigma, USA)
14,3 mM beta- mercaptoetanol
Etanol (96-100% v/v)
Tampón TE. Stock 10X de 40 mL, pesando 0,4844 g de Tris HCl y 0.148896 g de
EDTA. Agregar 35 mL de agua MiliQ recién destilada. Ajustar pH y esterilizar con
filtro 0,22 μm. Preparación a concentración 1X agregando 18 mL de agua tratada
con DEPC en frasco Schott más 2 mL de tampón TE 10X. Ajustar nuevamente pH.
Partidores
Los partidores utilizados para la amplificación del gen amnB que codifica la subunidad
beta de la enzima 2-aminofenol 1,6 dioxigenasa fueron descritos previamente se muestran en la
Tabla 4 y fueron descritos (Gaillard et al., 2006).
Los partidores fueron analizados con el programa FastPCR el que permite realizar un
PCR in silico, además de predecir la variación de la energía libre de Gibbs para la formación de
32
horquillas, sitios de auto-alineamiento e interacción partidor/partidor. Las secuencias utilizadas
de cada partidor se indican en la Tabla 4.
Tabla 4. Partidores utilizados para la amplificación del gen amnB.
aNombre del gen según notificación automática del genoma de B. xenovorans LB400
(http://genome.ornl.gov/microbial/bfun/).
Amplificación del gen amnB
Los partidores sintetizados (Invitrogen, USA) fueron probados para el gen amnB
mediante PCR de colonia. B. xenovorans LB400 se creció en medio LB-agar. Se tomó una
colonia y se resuspendió en 50 μL de agua MilliQ ultra pura para PCR. Se hirvió durante 15 min.
a 95ºC. La amplificación del gen se verificó por electroforesis en gel de agarosa 1% p/v. El
programa que se utilizó se detalla en la Tabla 5.
Inducción de la expresión del gen amnB
Se cultivó la cepa B. xenovorans LB400 en medio mineral M9 suplementado con
glucosa (5 mM) como única fuente de carbono. El cultivo se cosechó a una turbidez (595nm) de
0,6. Seguidamente se procedió con el lavado de las células con medio mineral M9 y etapas
sucesivas de centrifugación a 2976 g durante 10 min. El volumen final de resuspensión fue de 5
mL y las células se incubaron con 2-aminofenol 1 mM a 30ºC y 200 rpm. Se tomaron alícuotas
de 700 μL a los tiempos 0 y 15 h y se le adicionó de forma inmediata 1400 μL de RNA Protect
Bacteria (Invitrogen, USA) y las muestras se almacenaron a -20ºC.
Extracción de RNA total
Con el fin de esterilizar el material de vidrio y las soluciones, estos fueron tratados
previamente con dietilpirocarbonato (DEPC). Se preparó 1 mL de tampón TE a pH 8
adicionando lisozima (15 mg/mL). Se agregó proteína K (QIAGEN, USA) a las alícuotas
resultantes del ensayo de inducción. Se mezcló e incubó a temperatura ambiente durante 10 min.
Partidor Secuencia Gena TM (ºC)
amnBFW 5´-CGCATCTGGTCTATGGGGA-3´ BxeA1145 62
amnBRV 5´-GTTGCCAGTGCCGATGAC-3´ BxeA1145 61
33
Se realizó vortex cada 2 min. Posteriormente se adicionaron 700 μL de tampón RLT. Finalmente
se agregó 500 μL de etanol 100 % v/v.
Tabla 5. Programa de PCR utilizado para la amplificación del gen amnB.
Etapa Tiempo/Temperatura
1. Desnaturalización inicial 45 s / a 95ºC
2. Ciclo: Desnaturalización
Alineamiento
Elongación
45 s/ a 95ºC
45 s/ a 58ºC
30 s/ a 72ºC
Número de ciclos 30
3. Elongación final 1 ciclo: 7 min / 72ºC
Purificación de RNA total
Se transfirieron hasta 700 μL del lisado, incluyendo cualquier precipitado que pudo
haberse formado, a una columna RNeasy (provista por el kit RNAsa-free DNAsa set, Invitrogen,
USA). Se centrifugó durante 15 seg. a 9838 g, eliminando el eluído. Se agregaron 350 uL de
tampón RW1 a la columna de RNeasy, y se centrifugó por 15 seg a 9838 g para lavar la
membrana de la columna. Se eliminó el eludido. Se preparó una solución de incubación de
DNAsa I agregando 10 μL de solución stock de DNasa a 70 μL de tampón RDD. Se mezcló
suavemente invirtiendo el tubo, y centrifugando brevemente para recoger el líquido residual de
las paredes del tubo. Se agregó la mezcla de incubación de Dnasa I (80 μL) directamente a la
membrana de la columna RNeasy, se incubó a temperatura ambiente (20-30ºC) por 15 min.
Posteriormente se adicionaron 350 μL de tampón RW1 a la columna RNeasy, y luego de 5 min
se centrifugó durante 15 seg a 9838 g. Se eliminó el eluído y se agregaron 500 μL de tampón
RPE a la columna Rneasy centrifugándose por 2 min a 9838 g para lavar la membrana de la
columna. Se eliminó el eluído. Se adicionó posteriormente 500 μL de tampón RPE a la columna
de RNeasy y se centrifugó por 2 min a 9838 g para lavar la membrana nuevamente. Después de
la centrifugación, se quitó cuidadosamente la columna RNeasy del tubo de recolección, de modo
que la columna no tocara el eluído o las paredes. Se volvió a colocar la columna RNeasy en un
tubo de recolección nuevo de 1,5 ml (provisto) y se agregaron 40 μL de agua libre de RNasas
directamente a la membrana de la columna, ésta se dejo en reposo por 1 min antes de centrifugar
por 1 min a 9838 g para lograr la elución del RNA. Se guardó el RNA purificado a -20ºC.
34
Cuantificación de RNA purificado
La cuantificación del RNA purificado se realizó por fluorimetría con el fluorimetro
Qubit y usando el kit Quant-iTtm
RNA assay. Se utilizaron 2 μL del RNA purificado. Se
obtuvieron ng/mL de RNA de cultivo en cultivo crecido con glucosa, y ng/mL de RNA de
cultivo crecido con glucosa e inducido con 2-aminofenol o nitrobenceno (Tabla 6).
Tabla 6. Cuantificación de RNA total para cada condición establecida.
Síntesis de cDNA
La reacción de trascripción reversa (RT) se realizó utilizando la enzima RT-PCR Super
Script TM One step-Platinium Tag (Invitrogen, USA). La reacción de PCR se realizó utilizando
la Taq polimerasa (Invitrogen, USA). Se preparó la mezcla de reacción con 1 μL de templado de
RNA y los partidores específicos para la amplificación del gen amnB. Como control positivo de
expresión se realizó una muestra con partidores específicos para la amplificación del gen que
codifica el rRNA 16S. Como control de la reacción se preparó una muestra con todos los
componentes menos el templado de RNA. Y como control de contaminación de DNA se utilizó
como enzima la DNA Taq polimerasa. La amplificación del gen se verificó por electroforesis en
gel de agarosa 1% p
/v. El programa de amplificación de RT-PCR se describe en la Tabla 7.
Carril en gel Compuestos
inductor
Fase de
crecimiento
Tiempo (h) RNA (ug/mL)
1 glucosa exponencial 0 96
2 2-aminofenol Exponencial 0 97
3 nitrobenceno Exponencial 0 49,6
4 glucosa Exponencial 24 50
5 2-aminofenol Exponencial 24 57
6 nitrobenceno Exponencial 24 34,6
7 glucosa Estacionaria 0 15,1
8 2-aminofenol Estacionaria 0 63
9 nitrobenceno Estacionaria 0 59
10 glucosa Estacionaria 24 66
11 2-aminofenol Estacionaria 24 84
12 nitrobenceno Estacionaria 24 100
35
Tabla 7. Programa de RT-PCR utilizado para la amplificación del gen amnB.
Etapa Tiempo/Temperatura
1. Síntesis de cDNA y
desnaturalización inicial
30 min/ a 50ºC
5 min/ a 94ºC
2. Ciclo: Desnaturalización
Alineamiento
Elongación
45 s/ a 95ºC
45 s/ a 58ºC
30 s/ a 72ºC
Número de ciclos 30
3. Elongación final ciclo: 7 min / 72ºC
2.9.2 Protocolo construcción genética
Reactivos y soluciones:
a) Aislamiento de DNA plasmidial
AxyPrepTM
Plasmid miniprep kit TM
(Axygen, USA).
b) Digestión y desfosforilación plasmidial
EDTA (0,5 M, pH 8)
EGTA (0,5 M, pH 8)
Etanol (96-100% v/v)
Fenol:cloroformo (1:1, v/v)
SDS (10% v/v)
Acetato de sodio (3 M, pH 5.2 y pH 7.0)
Tampón TE (pH 8)
Tris-HCl (10 mM, pH 8.3)
Fosfatasa alcalina (CIP), (Fermentas, USA)
Proteinasa K (QIAGEN, USA)
Enzimas de restricción SalI, HindIII, y PstI, (Fermentas, USA)
Tampón O 5X para enzimas de restricción (Fermentas, USA)
Vector (pIZ1016) 10 μg
Gel de agarosa (0,7% p/v) en tampón TAE 1X
36
Sybr green (Invitrogen, USA)
Tampón de carga (Gen choice, USA)
Marcador de masa molecular:1 kb DNA Ladder (Fermentas, USA)
c) Reacción de PCR
Agua MiliQ ultra pura para PCR
Tampón de PCR (Invitrogen, USA)
MgCl2 3 mM
BSA 10 mg/μL (5% v/v)
dNTPs 25 mM (Invitrogen, USA)
Taq DNA polimerasa 5 U/ μL (Invitrogen, USA)
d) Ligación entre DNA plasmidial y fragmentos de DNA.
Tampón de reacción 5X (Invitrogen, USA)
Vector de DNA(30 fmoles)
Inserto de DNA(90 fmoles)
T4 DNA ligasa (Invitrogen, USA)
Agua destilada autoclavada
e) Transformación por estrés térmico
Células competentes
Medio LB sólido y líquido/Gm10
f) Células competentes
Medio LB
CaCl2 100 mM
g) Conjugación biparental
Medio LB/agar
Medio LB sólido/Gm10/Polimixina B(Merck, USA)
Filtros millipore 0,2 mM de diámetro de poro
37
Preparación del vector
Aislamiento de DNA plasmidial
La cepa E. coli S17-1 pir contenía el plásmido pIZ1016 (Figura 3). Este es un vector de
clonación de amplio espectro de huésped, Gmr oripBBR1MCS Mob
+, lacZ/Ptac/lacI
q (Moreno-
Ruiz et al., 2003). Para poder clonar los genes en este vector fue necesario la purificación de
DNA plasmidial. Esta se realizó mediante el uso de axyPrepTM
Plasmid miniprep kit TM
.
Figura 3. Representación esquemática del vector pIZ1016. LacZ-alfa, fragmento que codifica
la subunidad alfa de la beta-galactosidasa; GmR, gen que confiere resistencia a gentamicina; rep
y mob, genes de replicación y movilización, respectivamente; P lac, promotor lac; MCS, sitio de
múltiple clonamiento.
Se creció un pre-inoculo de la cepa E. coli S17-1 pir en LB con el antibiótico
especifico (gentamicina 10 ug/mL). Con la ayuda del kit de purificación se resuspendieron, se
lisaron y neutralizaron las células con soluciones tampones S1, S2 y S3. Luego en pasos
sucesivos de centrifugación se logró la separación de las células y retención del plásmido. Para
eliminar impurezas se procedió al lavado (solución tampón W1, W2) de la muestra. El producto
final se resuspendió en 30 μL de agua desionizada. Se guardó el RNA purificado a -20ºC.
38
Digestión de DNA con enzimas de restricción
Se realizó una doble digestión enzimática de DNA plasmidial con las enzimas SalI y
PstI, empleando los tampones, temperatura y tiempos recomendados por el fabricante. La
proporción de digestión utilizada fue de 10 μg del DNA plasmidial con 2 o 3 volumenes de las
respectivas enzimas de restricción, durante 2 h. Para comprobar la digestión se tomó una alícuota
de 0,1 μg y se analizó la digestión por electroforesis en gel de agarosa al 0,7%. Como control de
corrida se utiliza el plásmido sin digerir.
Desfosforilación del plásmido linearizado
Para suprimir la auto-ligación y la circularización del DNA plasmidial se debe
desfosforilar el plásmido con la ayuda de una enzima denominada fosfatasa alcalina (Sambrook
& Rusell 2001). Después de la digestión plasmidial se realizó una extracción-precipitación
(fenol: cloroformo y etanol) de la muestra. Luego de una incubación de 15 min en etanol, se
adicionó la enzima CIP por 30 min a 37ºC. Para inactivar la enzima se adiciono SDS y EDTA.
Finalmente se agregó proteinasa K y se incubó por 30 min a 55ºC. Para recuperar el DNA se
realizó una precipitación con etanol. El DNA se recuperó por centrifugación. El DNA
precipitado se resuspendió en tampón TE y se almacenó a -20ºC.
Preparación del inserto con los genes que codifican dos enzimas responsables de la
degradación de nitrobenceno
Diseño de partidores
Se diseñaron partidores específicos para los genes nbzA y habA de P. pseudoalcaligenes
JS45, que codifican la nitrobenceno nitroreductasa y hidroxilamino mutasa, respectivamente. La
metodología empleada fue manual, dado que los partidores debían contar con fragmentos
reconocidos por enzimas de restricción específicos y además comprender regiones río arriba y
abajo del gen para asegurar su total amplificación, incluyendo la zona de unión a ribosoma que
más adelante permitiría la traducción del gen. Las secuencias utilizadas de cada partidor se
indican en la Tabla 8.
39
Tabla 8. Partidores utilizados para la amplificación de genes nbzA y habA en P.
pseudoalcaligenes JS45.
Partidor Secuencia Enzima TM (ºC)
nbzAFW
5-TGACGTCGACCCGACCAGCCCGTTC-3
SalI
68
nbzARV 5-TGACAAGCTTTGGTAATTGCTGAAACTA-3
HindIII 63
habAFW 5-TGACAAGCTTAAGGAGATCACATTATG-3
HindIII 65
habARV 5-ATGCCTGCAGACTAACGTAGGATACCG-3 PstI 58
XLas secuencias subrayadas corresponden a la secuencia de las enzimas de restricción utilizadas. YLas secuencias en negrita corresponden al codón de inicio. zLas secuencias en itálica corresponden al codón de termino.
Amplificación de los genes nbzA y habA
Los pares de partidores sintetizados (Invitrogen, USA) para la amplificación del gen
nbzA y habA (nbzAFW, nbzARV, habAFW, habARV) presentaban temperaturas de fusión (Tm)
muy distintas entre cada pareja de partidores, por lo que fue necesario realizar un PCR en
gradiente, para determinar la Tm óptima.
Una vez definida la temperatura para el programa de amplificación (Tabla 9) se realizó
la amplificación de los genes habA y nbzA, por PCR de DNA de colonia. Para la amplificación
de los fragmentos de DNA se empleó un termociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf). La
enzima Taq DNA polimerasa se utilizó de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los
productos amplificados se purificaron utilizando Gene-Clean Turbo kit.
Tabla 9. Programa de PCR utilizado para la amplificación del gen nbzA y habA.
Etapa Tiempo/Temperatura
1. Desnaturalización inicial 45 s / a 95ºC
2. Ciclo: Desnaturalización
Alineamiento
Elongación
45 s/ a 95ºC
45 s/ a 50ºC
1min/ a 72ºC
Número de ciclos 30
3. Elongación final 1 ciclo : 7 min / 72ºC
40
Ligación de los genes nbzA y habA
Con el fin de construir un inserto único, se ligaron los genes nbzA y habA. Para esto fue
necesario digerir ambos productos de PCR con la enzima HindIII. Ambos productos de
amplificación poseen en uno de sus extremos, un sitio de corte para HindIII.
Después de realizar la digestión enzimática de los genes nbzA y habA con la enzima
HindIII fue necesario purificar cada fragmento digerido y proceder con la ligación de ambos
productos de PCR. Para mejorar la eficiencia de la ligación entre el fragmento de DNA
(nbzAhabA) y el plásmido pIZ1016, se amplificó por PCR el fragmento del producto ligado
(nbzAhabA).
Ligación del DNA plasmidial y fragmentos de DNA.
Para ligar el producto de PCR nbzAhabA al vector pIZ1016 linearizado previamente, se
utilizó una relación 3:1 (inserto: vector). Se utilizó la T4 DNA Ligasa en base al protocolo
descrito por el fabricante. Para calcular la cantidad de inserto y de vector en la reacción de
ligación se empleó la siguiente fórmula:
ng de inserto = (ng de vector) (tamaño en Kb de inserto)
(Tamaño de vector en kb)
Métodos de transferencia genética
Transformación de células de E. coli
Las células de E. coli DH5α previamente a ser transformadas se hicieron competentes
utilizando el método de preparación de células competentes con Cloruro de Calcio (1 M)
(Sambrook & Rusell 2001). En seguida las células se transformaron por estrés térmico con el
vector (plásmido pIZ1016 con el inserto nbzAhabA). La metodología empleada fue basada en
Sambrook & Rusell, 2001.
Transferencia de plásmidos por conjugación biparental
Las cepas dadora E.coli DH5α (posee el plásmido pIZ1016) y la cepa receptora B.
xenovorans LB400, se incubaron durante toda la noche en 2 ml de medio LB con los
antibióticos; Gm10 y Polimixina B, respectivamente. Se centrifugó 1 ml de cada una de las cepas
durante 1 min a 8000 rpm (microcentrífuga) y se resuspendieron por pipeteo en 1 ml de medio
41
LB. Se colocaron 20 μl de la cepa dadora y 80 μl de la cepa receptora sobre un filtro estéril
(Millipore 0,2 mM) en una placa de agar LB. Los filtros se secaron bajo campana de flujo
laminar, y luego se transfirieron a la estufa a 30ºC por toda la noche. Al día siguiente, el filtro
fue introducido en un tubo de cultivo de 10 ml conteniendo 1 ml de MgSO4 (50 mM). Alícuotas
de 200 μl fueron plaqueadas en placas de LB agar con sus respectivos antibióticos. Las colonias
se transfirieron a un medio líquido de selección con el antibiótico apropiado.
42
3. RESULTADOS
Con el objetivo de estudiar la vía metabólica del 2-aminofenol en la bacteria B.
xenovorans LB400, primero se realizó un análisis in silico de los genes involucrados (amn). Se
determinó la funcionalidad de la vía del 2-aminofenol presente en la cepa LB400. Para esto se
realizaron estudios de crecimiento, degradación y expresión génica por ensayos de RT-PCR.
Además, se estableció un protocolo para generar una cepa modificada de B. xenovorans LB400.
3.1 Análisis bioinformático de los genes involucrados en la degradación de 2-aminofenol
El genoma de B. xenovorans LB400 se encuentra secuenciado (Chain et al., 2006), por
lo que fue posible realizar un análisis bioinformático de los genes involucrados en la
degradación de compuestos nitroaromáticos. Con el objetivo de determinar la funcionalidad de
la vía catabólica del compuesto 2-aminofenol presente en B. xenovorans LB400, se realizó un
análisis bioinformático del agrupamiento de los genes amn, estudiando su organización y
vecindario.
3.1.1 Análisis in silico de los genes que codifican para la vía del 2-aminofenol en B.
xenovorans LB400
Los genes amn se encuentran agrupados en el cromosoma 1 (mayor) de la cepa LB400 y
están localizados en un segmento de DNA de 6875 pb. Estos genes están insertos en una isla
genómica, presentando un 100% de identidad con el agrupamiento y vecindario de genes amn en
Pseudomonas sp. Cepa B13, suponiendo un origen común. El locus de los genes amn se buscó
(Tabla 3) en el genoma de la cepa LB400 que se describió recientemente (Chain et al., 2006). Se
realizó el análisis in silico de sus secuencias vecinas. Primero se identificaron los marcos de
lectura abierta (Open reading frame (ORF)) mediante el software Vector NTI suite 9.0, y se
localizaron los genes que conforman el cluster amn (Figura 4).
3.1.2 Análisis del vecindario de los genes amn presente en B. xenovorans LB400
La reconstrucción metabólica de vías centrales ha demostrado la existencia de genes
vecinos a las vías relacionados con vías periféricas, funciones reguladoras o transportadores
(Chain et al., 2006).
43
Para otorgarle alguna función descrita a las secuencias vecinas de los genes amn que
tuviera relación con la vía de degradación de 2-aminofenol, se realizó un alineamiento de las
secuencias proteicas contra la base de datos, obteniéndose un 100% de identidad con la cepa
Pseudomonas sp. Cepa B13, porcentaje que no se considero en la Tabla 10. No se encontró
ningún gen con función descrita para la vía (Figura 5). Sólo se observaron genes con funciones
potenciales.
Figura 4. Organización de los genes amn en la cepa LB400. El gen amnR codifica un gen
represor del operón y el amnJ una proteína tipo ferrodoxina, amnB, amnA, amnC, amnE, amnF,
amnD, amnH, amnG (Tabla 3).
En el extremo 5´ del agrupamiento de genes amn existen codificados varios genes que
codifican probablemente reguladores transcripcionales. En el extremo 3´ se localizan genes que
codifican proteínas de un transportador relacionado con la resistencia a compuestos
xenobióticos, que fue descrito originalmente en Ralstonia solanacearum GMI1000 (Boucher et
al., 2002). Este transportador estaría codificado por tres genes, los cuales dan origen a los
dominios interno, transmembrana y externo de la estructura de la proteína (Tabla 10).
Figura 5. Vecindario de los genes amn. Los genes vecinos se pueden visualizar en los
recuadros, con sus respectivos posibles genes (Tabla 10).
amnR amnJ amnB amnA amnC amnE amnF amnD amnH amnG
36406888 pb 3633813 pb
5´ 3´
3´
5´
TerR
MarR
LysR
amnR amnJ amnB amnA amnC amnE amnF amnD amnH amnG
XRE
Posible transportador
(resistencia a
xenobióticos)
Proteína
transmembrana
Proteína de
membrana interna Proteína de
membrana externa
44
3.1.3 Análisis comparativo de la organización de la vía de degradación de 2-aminofenol en
diferentes bacterias
Para comparar la organización del cluster amn se utilizaron diferentes bacterias que
presentan los genes amn, pertenecientes a familias Burkholderiaceae, Pseudomonadaceae,
Alcaligenaceae y Comamonadaceae. Los organismos en estudio fueron Pseudomonas putida
HS12 (Park & Kim, 2001), Pseudomonas sp. AP-3 (Takenaka et al., 2005) Pseudomonas
pseudoalcaligenes JS45 (Nishido et al., 1993), Pseudomonas sp. cepa B13 (Gaillard et al.,
2006), Comamonas testosteroni CNB-1 (Wu et al., 2005), Bordetella avium 197N (Sebaihia et
al., 2006) y B. xenovorans LB400 (Chain et al., 2006).
Tabla 10. Análisis del vecindario de los genes amn en la cepa LB400.
Nombre del gen
en cepa LB400
Función acertada
Organismo Numero de
acceso
%
Identidad
(aa)
BxeA1135 Regulador
trascripcional tipo XRE
Ralstonia
metallidurans
CH34
YP_584547.1 83
BxeA1136 Regulador
trascripcional tipo
LysR
Pseudomonas
putida
CAE_92867.1 100
BxeA1137 Regulador
transcripcional tipo
MarR
Pseudomonas
fluorescens
Pf-5
YP_262029.1 34
BxeA1141 Regulador
transcripcional tipo
TerR
Xanthomonas pv.
oryzae
KACC10331
YP_199568 30
BxeA1155 Transportador
(resistencia a
xenobióticos). Proteína
de membrana externa
Ralstonia
solanacearum
GMI1000
NP_522003.1 54
BxeA1156 Transportador
(resistencia a
xenobióticos). Proteína
de membrana interna
Ralstonia
solanacearum
GMI1000
NP_522002.1 57
BxeA1157 Transportador
(resistencia a
xenobióticos). Proteína
transmembrana
Ralstonia
solanacearum
GMI1000
NP_522001.1 57
45
La organización de los genes amn se representa en la Figura 6. La cepa LB400 presenta
el mismo número de genes amn que las bacterias de la familia Pseudomonadaceae. Los genes
amn de la cepa LB400 poseen un 100% de identidad con los genes amn de la bacteria
Pseudomonas sp. cepa B13. Además presenta un 99% de identidad con la isla catabólica clc
donde los genes amn se encuentran insertos en la bacteria Pseudomonas sp. cepa B13 (Gaillard
et al, 2006). En la cepa Pseudomonas putida HS12 se observó una organización idéntica de estos
genes a la presentada en la cepa LB400, con excepción del gen amnE (Figura 4), que se localiza
entre el gen amnD y amnH. El agrupamiento de genes amn en Pseudomonas sp. AP-3 no
presenta los genes amnR y amnJ, y la organización de los genes se diferencia de la cepa LB400
sólo en el gen amnE. En tanto que otras bacterias del mismo orden Burkholderiales como
Comamonas testosteroni CNB-1 y Bordetella avium 197N presentan sólo algunos genes amn. La
bacteria Comamonas testosteroni carece de los genes catabólicos amnD y amnR que codifican
para la enzima 4-oxolcrotoato decarboxilasa y para el regulador de la vía, respectivamente. La
bacteria Bordetella avium 197N sólo presenta los genes amnAB y amnC, que codifican para las
dos primeras enzimas de la vía de degradación del 2-aminofenol.
La bacteria Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45, presenta adicionalmente los genes
nbzA y habA que le confieren la posibilidad de crecer en nitrobenceno, vía periférica que
converge a la ruta central de 2-aminofenol (Figura 1). El nitrobenceno es parcialmente reducido
a hidroxilaminobenceno por la enzima nitrobenceno nitroreductasa y es transformado a 2-
aminofenol por la enzima hidroxilaminobenceno mutasa.
46
amnR amnJ amnB amnA amnC amnE amnF amnD amnH amnG
3´5´
5´
amnR amnJ amnB amnA amnC amnE amnF amnD amnH amnG
B. xenov or ans
LB 400
Pseudom onas
sp . B13
amnR amnJ amnB amnA amnC amnF amnD amnE amnH amnG
amnB amnA amnC amnF amnD amnE amnH amnG
P. putida
HS 12
Pseudom onas
sp . AP - 3
618 414 915 813 1479 438 810 765 942 1038
618 414 915 813 1479 438 810 765 942 1038
591 429 918 816 1476 786 771 432 987 1017
918 816 1476 786 771 429 951 1032
P. pseudoalc aligenes
JS45
amnB amnA amnC
918 816 1629
5´
5´
5´
3´
3´
3´
3´
Burkholderiaceae
Pse
ud
om
ona
da
ce
ae
3´
Figura 6. Comparación de la organización de los genes amn de la ruta de degradación de 2-
aminofenol en diferentes bacterias. El número sobre cada flecha representa el número de pares
de base de cada gen. El nombre de los genes en Tabla 3.
amnC amnE
924 813 1482 436
amnA amnB
Alcaligenaceae
3´ Bordetella avium 197N
3 ´ amnB amnA amnC
Comamonas testosteroni CNB-1
5´
5´
Comamonadaceae
590 923 817 1480
amnR
47
3.1.4 Búsqueda in silico de vía periférica a 2-aminofenol
La vía periférica de nitrobenceno que converge a la ruta de central de 2-aminofenol ha
sido descrita en varias bacterias como Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45, Comamonas sp.
CNB-1, Pseudomonas putida HS12 y Pseudomonas AP-3 (Spain et al., 1997, Park et al., 2000,
Takenaka et al., 2005, Wu et al., 2006).
La búsqueda in silico de genes en la cepa LB400 que codifican para la degradación de
nitrobenceno a 2-aminofenol se realizó tomando como secuencia molde la de los genes nbzA y
habA de Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45. La cepa JS45 es una de las bacterias más
estudiadas para la degradación de compuestos nitroaromáticos (Spain 1995), existen diversos
estudios sobre la funcionalidad de enzimas y genes relacionados (Nishido et al., 1993; He et al.,
1997; He et al., 1999; Park & Kim, 1999). La organización que presentan los genes nbzA y habA
en el genoma de P. pseudoalcaligenes JS45 se puede visualizar en la Figura 7. El gen nbzA, se
encuentra contiguo a una quinona reductasa que podría estar relacionada en generar la
estabilización del compuesto que forma la nitrobenceno nitroreductasa, favoreciendo la reacción
producida por esta última. Estos genes se encuentran dispersos en el genoma de la cepa JS45,
lejos de los genes de la vía del compuesto 2-aminofenol. La ubicación exacta de los genes es
imposible de determinar ya que el genoma de la cepa JS45 no esta secuenciado, sólo fragmentos
de éste. El gen nbzA codifica para la enzima nitrobenceno nitroreductasa y tiene un tamaño de
684 pb. El gen habA codifica para la hidroxilaminobenceno mutasa y tiene un tamaño de 408 pb.
La proteína HabA posee una isoenzima (con 44% de identidad) denominada HabB. El gen habB
se encuentra codificado 2.5 kb río abajo del gen habA en el genoma de la cepa JS45. El gen que
se expresa es el habA (Spain et al., 2000).
Se realizó la búsqueda in silico de los genes nbzA y habA, que codifican las enzimas
nitrobenceno nitroreductasa y hidroxilaminobenceno mutasa, respectivamente en la cepa LB400.
Tanto el gen nbzA como habA no presentan una similitud con el genoma de la cepa LB400.
Figura 7. Organización de los genes que codifican la ruta de degradación de nitrobenceno
en la cepa JS45. El número representa los pares de base de cada gen. Los genes codifican las
siguientes moléculas. habA: hidroxilamino mutasa, habB: hidroxilamino mutasa, tnpR: Tn5501
resolvasa, nbzA: nitrobenceno nitroreductasa.
habA transposase habB tnpR nbzA quinona reductasa
3 ́ 5 ́
408 1548 495 636 684 630
habA habB tnpR nbzA quinona reductasa
3 ́ 5 ́
48
3.2 Análisis funcional de la vía catabólica de 2-aminofenol en B. xenovorans LB400
3.2.1 Crecimiento de B. xenovorans LB400 en 2-aminofenol
Para evaluar el crecimiento de la cepa LB400 en el compuesto 2-aminofenol, se cultivó
en medio mineral mínimo M9 empleando 2-aminofenol (1mM) como única fuente de carbono.
Debido a la toxicidad y a la rápida foto-oxidación del compuestos 2-aminofenol, los ensayos de
crecimiento sólo se realizaron con una concentración final de 1 mM. El crecimiento se
monitoreó por recuento de unidades formadoras de colonias (UFC/mL). El compuesto 2-
aminofenol es fotosensible y presenta una coloración amarilla pálida que podría interferir en el
análisis por turbidimetría. No se observó crecimiento de la cepa LB400 en 2-aminofenol (Figura
8).
0
40
80
120
160
200
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (h)
Cre
cim
ien
to
UF
C/m
L 1
07
Glucosa
Control
2-aminofenol
Figura 8. Crecimiento de B. xenovorans LB400 en 2-aminofenol. Las células se crecieron en
medio mineral M9 empleando como fuente de carbono glucosa ( ) y 2-aminofenol ( ). Control
negativo, sin fuente de carbono ( ).
Para poder estudiar el efecto del compuesto 2-aminofenol sobre la cepa LB400, se
analizaron diferentes condiciones de crecimiento. Por un lado, se estudió el efecto de la
presencia de 2-aminofenol en el crecimiento de la cepa LB400 en glucosa 5 mM. Por otro lado,
se analizó el efecto de la exposición a 2-aminofenol sobre células en fase exponecial media de
crecimiento en glucosa (Figura 9).
En presencia de 2-aminofenol se observó un bajo crecimiento de la cepa LB400. Sin
embargo, células de la cepa LB400 cultivadas en glucosa y expuestas a 2-aminofenol en fase
exponencial media, no ven afectado su crecimiento por presencia de este compuesto
nitroaromático.
49
5,00
5,50
6,00
6,50
7,00
7,50
8,00
8,50
9,00
9,50
0 9 18 20 25Tiempo (h)
Lo
g (
UF
C/m
L)
Glucosa 5 mMGlucosa 5 mM exp 2-AP 1 mMGlucosa 5 mM + 2 -AP 1 mMControl negativo
Figura 9. Efecto de 2-aminofenol sobre el crecimiento de la cepa LB400. La cepa LB400 se
creció en glucosa 5 mM y se expuso con 2-aminofenol 1 mM en fase exponencial media
(indicado con la flecha).
3.2.2 Degradación de 2-aminofenol por B. xenovorans LB400
Como no se observó crecimiento de la cepa LB400 en presencia de 2-aminofenol, para
evaluar la funcionalidad de ésta vía catabólica se realizaron experimentos de degradación por
células en reposo mediante la detección de la separación del 2-aminofenol por HPLC.
Se determinó que la cepa B. xenovorans LB400 degradó más de un 20% del compuesto
2-aminofenol a las 6 h. Entre las 18 y 20 h se observó la degradación del 50 % del compuesto.
Finalmente la completa degradación de éste se observó a las 30 h (Figura 10).
2-AP
50
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
% 2
-am
ino
fen
ol
Cepa LB400
Control
Cepa LB400 inactivada
Figura 10. Degradación de 2-aminofenol por B. xenovorans LB400. Células en reposo
incubadas con 2-aminofenol 1 mM ( ). Como control se utilizaron células inactivadas por calor
(100ºC) durante 15 min ( ) y el medio de cultivo ( ).
3.2.3 Estudio de la vía central utilizada por B. xenovorans LB400 en el catabolismo de 2-
aminofenol.
Para complementar el análisis funcional de la vía de degradación de 2-aminofenol, se
analizó la expresión de los genes amn en la cepa LB400.
a) Amplificación del gen amnB desde DNA bacteriano
Los partidores diseñados para el gen amnB se probaron mediante PCR de colonia. El
tamaño del gen amnB es de 914 pb y el fragmento a amplificar es de 809 pb. La Figura 11
muestra el gen amnB de la cepa LB400.
Figura 11. Amplificación del gen amnB de la cepa LB400. Los productos de PCR se
separaron por electroforesis en gel de agarosa 1%. 1, marcador de masa molecular (MM). 2,
control negativo (sin DNA). 3, control negativo (DNA de Cupriavidus necator JMP134). 4, gen
amnB (DNA de la cepa LB400).
809 pb
MM 2 3 4(pb)
1000
900
800
700
600
400
300
500
200
100
MM 2 3 4(pb)
1000
900
800
700
600
400
300
500
200
100
51
Para verificar que efectivamente se amplificó el gen amnB y no otro, se realizó un corte
enzimatico con Eco321 (EcoRV). Esta enzima generó un corte único produciendo dos
fragmentos de 400 pb (Figura 12).
Figura 12. Digestión enzimática del gen amnB. 1, gen amnB digerido (400 pb). 2, gen amnB
(cepa LB400) sin digerir 809 pb). 3, marcador de masa molecular (MM).
b) Extracción y purificación de RNA bacteriano
Se extrajo RNA total desde la cepa LB400 crecida en glucosa 5 mM como única fuente
de carbono. El RNA se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa. Se observaron dos
bandas correspondientes al RNA 23S y 16S, con un tamaño aproximado de 2,9 kb y 1,5 kb,
respectivamente (Figura 13). En el gel sólo se visualizaron dos bandas únicas que dieron cuenta
del correcto estado del RNA, como también de la ausencia de contaminación por DNA. La
concentración total de RNA se muestra en la Tabla 6, que se encuentra en la sección de
materiales y métodos.
Figura 13. Análisis de RNA purificado de B. xenovorans LB400. Electroforesis en gel de
agarosa 1% de rRNA 23S y 16S de células crecidas glucosa 5 mM como única fuente de
carbono, con diferentes condiciones del ensayo (Tabla 10).
Para validar el posterior ensayo de RT-PCR se realizó un control de contaminación con
DNA, ya que el DNA podría interferir en la obtención de cDNA a partir del RNA total.
3000 2500 1500 2000
(pb) MM
2,9 kb rRNA
1,5 kb rRNA
3000 2500 1500 2000
(pb)
2,9 kb
1,5 kb
3000 2500 1500 2000
(pb) MM
2,9 kb 23S
1,5 kb 16S
3000 2500 1500 2000
(pb) 13 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
809 pb
400 pb
1000 900 800 700 600 500 400
2 1
1000 900 800 700 600 500 400
MM 2 1
1000 900 800 700 600 500 400
2 1
1000 900 800 700 600 500 400
MM 2 1 (pb)
52
c) Análisis de la expresión del gen amnB
Mediante la técnica de RT-PCR se evaluó la expresión a nivel de mRNA de la 2-
aminofenol 1,6 dioxigenasa en cultivos de B. xenovorans LB400. Las células crecidas en glucosa
5 mM se incubaron con 2-aminofenol 1 mM, glucosa 5 mM o nitrobenceno 1 mM, en diferentes
etapas del crecimiento (fase exponecial o estacionaria). Se observó la expresión del gen amnB en
todas las condiciones analizadas, Figura 14.
Figura 14. Expresión del gen amnB en B. xenovorans LB400. Los compuestos inductores
utilizados fueron glucosa (Glu), 2-aminofenol (2-AP) y nitrobenceno (NB). Las fases de
crecimiento analizadas fueron; exponencial temprana (Exp T) y fase estacionaria (E). Se
analizaron las muestras a dos tiempos, a las 0 h y a las 24 h de exposición con los compuestos
inductores. Como control positivo del ensayo de inducción se analizó la expresión del gen rRNA
16S. En cada ensayo se utilizó marcador de masa molecular (MM).
3.3 Estrategia experimental para generar un plasmidio recombinante con los genes nbzA y
habA.
Considerando que B. xenovorans LB400 posee los genes que codifican enzimas de la
vìa de degradación de 2-aminofenol, se propuso una estrategia para la construcción de un
organismo modificado genéticamente capaz de degradar nitrobenceno. La vía periférica de
nitrobenceno converge en la ruta central de 2-aminofenol. Esta estrategia propone la inserción de
los genes nbzA y habA de Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45, que codifican para una
nitrobenceno nitroreductasa e hidroxilaminobenceno mutasa en la cepa LB400.
En este trabajo se definió una estrategia experimental para la construcción de un
plasmidio recombínate que contenga los genes nbzA y habA. En una primera etapa se realizó la
2000
T T T E E E
24 h
1031 900 700 600
1031 900 700 600
800
800 1500
MM MM
rRNA 16S (1500 pb )
Glu 2 - AP NB
Glu 2 - AP NB 0 h
amnB (809 pb )
( pb ) ( pb )
3000 2000 1500
3000 2000
T T T E E E 1031 900 700 600
1031 900 700 600
800
800 1500
Exp Exp Exp
53
preparación del vector plasmidial. En una segunda etapa se construyó el inserto que contiene los
genes nbzA y habA, involucrados en la degradación de nitrobenceno.
3.3.1 Preparación del vector plasmidial
El vector que se seleccionó para el clonamiento de los genes nbzA y habA fue el vector
pIZ1016 debido a su amplio espectro de huésped (Figura 3, Tabla 2).
La digestión del plásmido se verificó por electroforesis en gel de agarosa (Figura 15).
Luego se procedió a purificar desde el gel la banda con el DNA plasmidial digerido. La
concentración final de DNA plasmidial obtenida fue de 31,2 ug/mL.
Figura 15. Digestión con las endonucleasas SalI y PstI del plásmido pIZ1016. Electroforesis
en gel de agarosa 0,7%. 1, plásmido purificado sin digerir. 2, plásmido digerido (6000 pb). 3,
marcador de masa molecular.
3.3.2 Preparación del inserto con los genes de las dos enzimas responsables de la
degradación de nitrobenceno
P. pseudoalcaligenes JS45 posee la vía de degradación de nitrobenceno completa y
funcional, por lo que se utilizó como bacteria donadora de los genes que se incorporaron en el
plasmidio recombinante. Estos genes codifican para las enzimas nitrobenceno nitroreductasa
(nbzA) y la hidroxilaminobenceno mutasa (habA).
Para la amplificación de los genes nbzA y habA se diseñaron partidores específicos.
Estos presentaban temperaturas de fusión (Tm) muy distintas entre cada pareja, por lo que se
realizó un PCR en gradiente, para determinar la Tm óptima. El gen habA amplificado fue de 425
pb (Figura 16) y el gen nbzA amplificado fue de 732 pb (Figura 17).
21226
5148
4973
4268
21226
5148
4973
4268
21226
5148
4973
4268
MM(pb)
1 2
21226
5148
4973
4268
21226
5148
4973
4268
21226
5148
4973
4268
MM(pb)
1 2
54
Figura 16. Amplificación del gen habA de P. pseudoalcaligenes JS45. PCR en gradiente, con
un rango de temperaturas de alineamiento de 40 a 60,6ºC. En el primer carril se puede visualizar
los marcadores de masa molecular (MM).
Figura 17. Amplificación del gen nbzA de P. pseudoalcaligenes JS45. PCR en gradiente, con
un rango de temperaturas de alineamiento de 40 a 60,6ºC. En el primer y último carril se puede
visualizar los marcadores de masa molecular (MM).
En todas las temperaturas probadas se observó un producto de amplificación único. Por
lo que se decidió elegir la Tm=50,7ºC en ambos casos. La amplificación de los genes se puede
visualizar en la Figura 18.
Figura 18. Amplificación de los genes nbzA y habA de P. pseudoalcaligenes JS45. Los
productos se separaron por electroforesis en gel de agarosa 1%. A) 1, marcador de masa
molecular (MM). 2, control negativo (sin DNA). 3, gen nbzA (732 pb). B) 1, marcadores de
masa molecular (MM). 2, control negativo (sin DNA). 3, gen habA (425 pb).
732 pb
425 pb
MM (pb)
1000 900 800 700 600
300 400
200
500
MM (pb)
1000 900 800 700 600
300 400 500
(pb)
1000 900 800 700 600
300 400 500
732 pb
425 pb
MM (pb)
1000 900 800 700 600
300 400
200
500
MM (pb)
1000 900 800 700 600
300 400
200
500
MM (pb)
1000 900 800 700 600
300 400 500
(pb)
1000 900 800 700 600
300 400 500
A) B)
1 2 2 1
40.2 4843.141.3 45.4 5653.550.7 59.858.1MM 60.640900
800
700
(pb)
600
300
400
200
500
Control
mix
425 pb
1353
1078
(pb) 40.2 4843.141.3 45.4 5653.550.7 59.858.1MM 60.640 MM
872
603
1031900800700
(pb)
310
1353
1078
(pb) 40.2 4843.141.3 45.4 5653.550.7 59.858.1 60.640
872
603
1031900800700
(pb)
310
40.2 4843.141.3 45.4 5653.550.7 59.858.1 60.640
872
603
1031900800700
(pb)
310
1353
1078
(pb) 40.2 4843.141.3 45.4 5653.550.7 59.858.1MM 60.640 MM
872
603
1031900800700
(pb)
310
1353
1078
(pb) 40.2 4843.141.3 45.4 5653.550.7 59.858.1 60.640
872
603
1031900800700
(pb)
310
40.2 4843.141.3 45.4 5653.550.7 59.858.1 60.640
872
603
1031900800700
(pb)
310
732 pb
55
Ligación de los genes nbzA y habA.
Con el fin de construir un inserto único, se ligaron los genes nbzA y hab amplificados (Figura
19).
Figura 19. Ligación de los genes nbzA y habA. A) Esquema representativo de la ligación. nbzA
nitrobenceno nitroreductasa, habA hidroxilaminobenceno mutasa, nbzAhabA fragmento ligado
de ambos genes, enzimas de restricción; SalI, HindIII y PstI. Entre paréntesis se indica el largo
del fragmento en pares de bases (pb). B) El producto se separaró por electroforesis en gel de
agarosa 1%. 1, un producto nbzAhabA del tamaño esperado 1157 pb. 2, marcadores de masa
molecular.
Amplificación por PCR del producto de la ligación nbzAhabA.
Para aumentar la concentración del producto ligado nbzAhabA, se realizó una
amplificación por PCR, con la pareja de partidores diseñados (nbzAFW y habARV). Por
electroforesis en gel de agarosa se observó una banda de 1157 pb (Figura 20). Dado que la
amplificación generó también otros productos de menor tamaño, se procedió a la purificación de
la banda desde el gel. Para poder ligar el inserto con el vector fue necesario realizar una doble
digestión con las enzimas de restricción SalI y PstI. La concentración final de DNA obtenida fue
de 20 ug/mL.
Figura 20. Amplificación del producto de la ligación nbzAhabA. 1, marcadores de masa
molecular. 2, control negativo (sin DNA). 3, producto de la ligación nbzAhabA del tamaño
esperado 1157 pb.
MM15331078
872
603
310
2 3MM15331078
872
603
310
MM15331078
872
603
310
2 3
1157 pb
nbzAhabA SalI
nbzAhabA PstI
(732 pb) (425 pb)
(1157 pb)
nbzA habA SalI HindIII HindIII PstI
nbzA habA
nbzAhabA SalI
nbzAhabA PstI
(732 pb) (425 pb)
(1157 pb)
nbzA habA nbzA habA
1157 pb
MM
1533 1078 872
603
310
1
A) B)
(pb)
nbzAhabA SalI
nbzAhabA PstI
(732 pb) (425 pb)
(1157 pb)
nbzA habA nbzA habA
nbzAhabA SalI
nbzAhabA PstI
(732 pb) (425 pb)
(1157 pb)
nbzA habA nbzA habA
1157 pb
MM
1533 1078 872
603
310
1
A) B)
56
3.3.3 Transformación del cepa E. coli DH5-alfa con el plásmido recombinante
Luego de ligar el inserto nbzAhabA con el vector linearizado pIZ1016 se procedió a
transformar la cepa E. coli DH5-alfa por choque térmico. Para poder permeabilizar la membrana
de la cepa primero fue necesario preparar las células competentes. Para seleccionar las bacterias
transformadas, se crecieron en placa LB con gentamicina. Una vez crecidas las colonias
trasformadas se realizó un PCR de DNA de colonia. Para identificar qué colonias contenían el
plásmido, se utilizaron dos parejas de partidores (nbzAFW-habARV y habAFW-habARV), que
amplifican para el gen nbzA y habA, respectivamente. Dado que los partidores nbzAFW-
habARV amplificaron productos inespecíficos, se seleccionaron los partidores habAFW-
habARV para el reconocimiento de las cepas transformantes. En la cepa silvestre se observó un
producto inespecífico de 900 pb (Figura 21). En tres cepas recombinantes se observó un
producto inespecífico de 700 pb. Se seleccionó la colonia número 2 que presentó un producto de
amplificación de 425 pb, correspondiente al gen habA.
Figura 22. Amplificación del gen habA en la cepa E. coli DH5-alfa. 1 al 7, colonias de placas
crecidas en LB/Gm10 transformadas con el plásmido pIZ1016/nbzAhabA. 8, cepa E. coli DH5-
alfa no transformada. 9, cepa JS45 (control positivo). 10, control negativo (sin DNA). 11,
marcadores de masa molecular.
425 pb
21 93 4 5 6 7 8 10 MM
4005006007008009001000
21 93 4 5 6 7 8 10 MM
4005006007008009001000
57
DISCUSIÓN
4.1 Análisis in silico de los genes que codifican para la vía del 2-aminofenol en B.
xenovorans LB400
Los genes amn se encuentran agrupados en el genoma de B. xenovorans LB400 (Chain
et al., 2006). El agrupamiento de genes amn se localiza en una isla catabólica de 125 kb que
presenta 99% de identidad nucleotídica con la isla genómica “clc element” de Pseudomonas sp.
B-13. El tamaño de la isla “clc element” es de 100 kb. Esta isla catabólica presenta genes
relacionados con la degradación de clorocatecol, 2-aminofenol y otros genes posiblemente
relacionados con el transporte de compuestos aromáticos (Gaillard, et al., 2006). La isla
genómica de B. xenovorans LB400 posee dos regiones que están ausentes en la isla de la cepa
B13. La primera es un fragmento de 20 kb, que contiene genes que codifica para dos
subunidades de una orto-halogenobenzoato 1,2 dioxigenasa, dos proteínas transmembranas, y
una proteína de secreción. Esta región de 20 kb esta flanqueada por dos copias de secuencias de
inserción, que sugiere la transferencia de este fragmento a la isla genómica de B. xenovorans
LB400. La segunda región de 2 kb contiene un gen que codifica para una potencial transcriptasa
reversa.
El agrupamiento de los genes amn en la cepa LB400 se encuentra conformado por un
gen amnR, que codifica un regulador, un gen amnJ, que codifica para una potencial ferrodoxina
y los genes amnBACEFDHG que codifican para las enzimas responsables de la degradación del
2-aminofenol (Chain et al, 2006). El gen amnR codifica para una proteína con una posible
función reguladora, que presenta un 57% de identidad con la secuencia del gen amnR de
Pseudomonas putida HS12. Para estudiar el mecanismo regulador del operón amn en la cepa
Pseudomonas putida HS12 (Park & Kim 2001), se construyeron varios plásmidos recombinantes
con fragmentos del operón amn. Estos plásmidos se incorporaron a la cepa HS120, una bacteria
derivada de HS12, que fue curada de los plásmidos que contienen los genes amn. Sólo la
deleción del gen amnR resultó en una expresión constitutiva de la vía de degradación del 2-
aminofenol. Estos resultados sugirieron que la proteína AmnR en la cepa Pseudomonas putida
HS12 cumpliría una función de regulador negativo (Park & Kim 2001). El gen amnR en la cepa
HS12 comparte una baja identidad con un grupo de reguladores transcripcionales negativos de la
familia MarR (Sulavik et al., 1995).
El gen amnJ presenta una identidad aminoácidica de 20% con la ferrodoxina tipo-
cloroplasto (XylT) presente en el operón TOL de la cepa Pseudomonas putida mt-2. Esta
58
ferrodoxina estaría involucrado en la activación de la catecol 2,3-dioxigenasa (Hogu et al.,
1998). La enzima 2-aminofenol 1,6 dioxigenasa de la cepa P. pseudomonas pseudoalcaligenes
JS45 sería inactivada por el compuesto catecol (Spain et al., 1998). Esto sugiere un posible rol
de la proteína codificada por el gen amnJ en la protección y reactivación de la enzima 2-
aminofenol 1,6 dioxigenasa codificada por los genes amnB y amnA (Lendenmann et al., 1996).
Los genes amnBACEFDHG, que codifican para las enzimas responsables de la
degradación del 2-aminofenol, han sido identificadas en la cepa LB400 (Chain et al, 2006). La
funcionalidad de estos genes ha sido descrita y caracterizada en Pseudomonas putida HS12
(Park & Kim, 2000; Park & Kim. et al, 2001), Pseudomonas sp. AP-3 (Takenaka et al, 2005),
Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45 (Nishido et al., 1993; Lendenmann et al., 1996; He et al.,
1998;) y Pseudomonas sp. cepa B13 (Gaillard et al, 2006).
Análisis del vecindario de los genes amn en B. xenovorans LB400
Al realizar el análisis in silico de las secuencias vecinas al agrupamiento de genes amn,
se observaron genes con funciones potenciales no descritos para la vía degradación de 2-
aminofenol. En el extremo 3´ de los genes amn se encontraron genes que codifican tres
componentes de un posible transportador que confiere resistencia a xenobióticos, descrito en
Ralstonia solanacearum GMI1000 (Boucher et al., 2002). Los genes BxeA1157, BxeA1156,
BxeA1155 codificarían polipéptidos interno, externo y transmembrana de la estructura del
transportador (Tabla 2). Sin embargo, no existen estudios que relacionen estos genes con la vía
de degradación del compuesto 2-aminofenol. No se ha descrito la existencia de un transportador
asociado a la vía de degradación del 2-aminofenol (Spain et al., 1997, Park et al., 2000,
Takenaka et al., 2005, Wu et al., 2006; Gaillard et al., 2006). Sin embargo, se han descrito
algunas proteínas transportadoras para otros compuestos aromáticos en distintos
microorganismos; BenK para benzoato en Acinetobacter sp. ADP1 (Collier et al., 1997), PcaK
para 4-hidroxibenzoato y protocatechuato en Pseudomonas putida (Nichols et al., 1997), XylN
para m-xileno en Pseudomonas putida (Kasai et al., 2001). Por tanto, un estudio funcional de los
genes BxeA1157, BxeA1156, BxeA1155 permitiría determinar si existe relación con el trasporte
del compuesto 2-aminofenol o sus derivados.
En el extremo 5´ del vecindario de los genes amn se localizan genes codificando
reguladores transcripcionales. Se desconoce relación entre estos genes y los amn. Sólo un
59
estudio ha descrito la presencia de un factor trascripcional para la regulación del operón 2-
aminofenol en la cepa Pseudomonas putida HS12 (Park & Kim, 2001).
Búsqueda in silico de vía periférica que converge a 2-aminofenol.
La búsqueda in silico de los genes nbzA y habA responsables de la degradación de
nitrobenceno, permitió determinar que la cepa LB400 no posee estos genes. La vía de
degradación de nitrobenceno asociada a la vía de 2-aminofenol ha sido descrita para
Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45, Comamonas sp. CNB-1, Pseudomonas putida HS12 y
Pseudomonas AP-3 (Spain et al., 1997, Wu et al., 2006, Park et al., 2000, Takenaka et al.,
2005). En la cepa LB400 los genes amn se encuentran insertos en una isla genómica, que ha sido
descrita para Pseudomonas sp. B-13 (Gaillard et al., 2006). Por lo tanto, probablemente los
genes amn fueron adquiridos a través de la transferencia horizontal de la isla completa, y ésta no
presenta los genes que codifican para la vía del nitrobenceno. La transferencia horizontal de esta
isla genómica ha sido descrita en varias gamma y beta proteobacterias bajo condiciones
ambientales, incluyendo reactores de membrana, plantas de tratamiento de aguas residuales a
escala de laboratorio e incluso in situ en aguas subterráneas (van der Meer et al., 2003). Además
la adquisición de genes catabólicos por transferencia horizontal de islas genómicas, ha sido
descrita en la cepa Ralstonia eutropha A5 y Burkholderia cepacia R34 para genes relacionados
con la vía de degradación del bifenilo y 2,4-dinitrotolueno, respectivamente (Springael et al.,
2001; Johnson et al., 2002).
Análisis comparativo de la organización de los genes de la vía de degradación de 2-
aminofenol en diferentes microorganismos
Se comparó la organización de los genes amn de la cepa LB400 (Chain et al, 2006) con
Pseudomonas putida HS12 (Park & Kim. et al, 2001), Pseudomonas sp. AP-3 (Takenaka et al,
2005), Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45 (Nishido et al., 1993), Pseudomonas sp. cepa B13
(Gaillard et al, 2006), Comamonas testosteroni CNB-1 y cepa Bordetella avium 197N (Sebaihia
et al, 2006). La organización que presentan los genes amn en la cepa LB400 es idéntica a la de
cepa B-13 (Gaillard et al, 2006). Pseudomonas putida HS12 posee una organización de los
genes amn diferente a la cepa LB400. El gen amnE (Figura 4), se encuentra localizado entre los
genes amnD y amnH. La organización de los genes amn de la cepa Pseudomonas sp. AP-3 se
diferencia de la cepa LB400, pues no presenta los genes amnR y amnJ, y el gen amnE se localiza
60
entre los genes amnD y amnH. Otras bacterias del mismo orden Burkholderiales como
Comamonas testosteroni y Bordetella avium 197N (Sebaihia et al., 2006) presentan sólo algunos
genes amn. La bacteria Comamonas testosteroni CNB-1 posee solo los genes que codifican para
las tres primeras enzimas de la vía (amnB, amnA, amnC) y el regulador (amnR). Esto se puede
explicar debido a que la cepa CNB-1 utiliza p-clorobifenilobenceno como única fuente de
carbono, nitrógeno y energía utilizando las enzimas descritas para la degradación de 2-
aminofenol en este proceso. Como ejemplo; la enzima 2-aminofenol 1,6-dioxigenasa posee una
mayor afinidad por el compuesto 2-amino-5-clorofenol (KM=0,77 uM) que por 2-aminofenol
(KM=0,89 uM) (Wu et al., 2005). La bacteria Bordetella avium 197N sólo presenta los genes
amnAB y amnC que codifican para las dos primeras enzimas de la vía de degradación del 2-
aminofenol. No existen estudios funcionales de la vía de degradación de 2-aminofenol para esta
bacteria.
4.2 Estudio de la vía de degradación de 2-aminofenol en la cepa LB400
B. xenovorans LB400 es capaz de degradar el compuesto 2 aminofenol. Sin embargo, no
es capaz de crecer utilizando el compuesto 2-aminofenol como única fuente de carbono. El no
crecimiento en 2-aminofenol podría estar dado por la toxicidad de este sustrato o por la
acumulación de intermediarios metabólicos tóxicos. Para estudiar la posible toxicidad de este
compuesto se analizó el crecimiento de la cepa LB400 en glucosa en presencia de 2-aminofenol.
Se observó solo un bajo crecimiento, lo que sugiere que el 2-aminofenol es tóxico para la cepa
LB400. Sin embargo, cuando la cepa LB400 es crecida en glucosa hasta una fase exponencial
media y expuesta a 2-aminofenol, el crecimiento no es inhibido. La no inhibición puede deberse
a que las células están metabólicamente muy activas y sugiere cierta una resistencia de la cepa
LB400 frente al compuesto nitroaromático. La cepa LB400 comienza a degradar el compuesto 2-
aminofenol después de 6 h de incubación. La exposición a 2-aminofenol probablemente requiere
que las células adapten su maquinaria metabólica frente a una posible situación de estrés.
Se ha descrito que compuestos aromáticos como clorobenzoato y clorobifenilos inducen
proteínas relacionadas a una respuesta de tipo estrés como DnaK, GroEL y HtpG en B.
xenovorans LB400 (Agulló et al., 2007; Martínez et al., 2007). Durante el crecimiento de la cepa
LB400 en bifenilo, se evidenció la generación de éstres oxidativo por inducción de una alquil
hidroperoxido reductasa AhpC (Agulló et al., 2007). Se ha descrito que la cepa LB400 durante el
61
crecimiento en 3-hidroxifenilacetato induce las chaperonas moleculares DnaK, GroEL y la co-
chaperonina GroES (Méndez, 2008).
Durante el crecimiento en medio mínimo M9 empleando glucosa como fuente de
carbono se observó la expresión del gen amnB, que codifica para la 2-aminofenol 1,6
dioxigenasa. Ademas se observó la expresión del gen amnB durante la exposición con 2-
aminofenol, nitrobenceno y glucosa. Esto correlaciona con lo observado en ensayos de
degradacion, donde la enzima 2-aminofenol 1,6 dioxigenasa cataliza la ruptura del anillo
aromático. Estos resultados sugieren que esta vía presenta una expresión basal durante el
crecimiento en glucosa. Es probable que esta expresión sea inducida en presencia de 2-
aminofenol y nitrobenceno. La técnica de qRT-PCR permitiria cuantificar la expresión
diferencial del gen amnB en diferentes condiciones experimentales. Se ha descrito una expresión
constitutiva de los genes amn en la cepa Pseudomonas sp. AP-3 (Takenaka et al., 2005).
Este estudio confirma que Burkholderia xenovorans LB400 es capaz de degradar 2-
aminofenol mediante las enzimas codificadas por los genes amn presentes en su genoma. La
hipótesis de este estudio resultó ser verdadera.
62
5. CONCLUSIONES
Mediante análisis bioinformático se observó que la bacteria B. xenovorans LB400
presenta una organización de los genes amn similar a la de otras bacterias como
Pseudomonas sp. cepa B13, Pseudomonas sp. AP-3 y P. putida HS12 en los que se ha
descrito la funcionalidad de la vía del 2-aminofenol.
El análisis del vecindario de los genes amn de B. xenovorans LB400 permitió identificar
un transportador que podría estar involucrado en el transporte del compuesto 2-
aminofenol o algún derivado.
Mediante análisis in silico se determinó que los genes nbzA y habA, que codifican para
la vía de degradación de nitrobenceno, no están presentes en el genoma de B.
xenovorans LB400.
Se determinó que B. xenovorans LB400 no es capaz de utilizar 2-aminofenol como
única fuente de carbono para su crecimiento en medio mínimo M9 en las condiciones
probadas.
La presencia de 2-aminofenol inhibió el crecimiento de la cepa LB400 en glucosa.
B. xenovorans LB400 es capaz de degradar 2-aminofenol.
Se observó que la cepa LB400 expresó el gen amnB, que codifica para la enzima 2-
aminofenol 1,6-dioxigenasa, durante el crecimiento en medio mínimo M9 suplementado
glucosa 5 mM, y durante la incubación con 2-aminofenol, nitrobenceno y glucosa.
63
6. PROYECCIONES
Este trabajo constituye uno de los primeros estudios realizados en Burkholderia
xenovorans LB400 sobre el metabolismo de compuestos nitroaromáticos. Este estudio
permitió ampliar el conocimiento de los compuestos aromáticos que la cepa LB400 es
capaz de degradar, para futuras aplicaciones en biotecnología ambiental.
La incorporación de los genes heterólogos nbzA y habA a Burkholderia xenovorans
LB400 por conjugación biparental, permitirá generar una bacteria capaz de degradar
nitrobenceno.
La cepa Burkholderia xenovorans modificada genéticamente podría tener una aplicación
futura en el tratamiento de aguas provenientes de industrias que producen una alta carga
de residuos nitroaromáticos, como nitrobenceno y 2-aminofenol.
64
BIBLIOGRAFIA
Abramowicz D. (1990). Aerobic and anaerobic biodegradation of PCBs: A review.
Biotechnology. 10:241-251.
Bargagli R. (2008). Environmental contamination in Antarctic ecosystems. Sci. Total. Environ.
400:212-226.
Beland F, Heflich R, Howard P, Fu P. (1985). The in vitro metabolic activation of
nitropolycycIic aromatic hydrocarbons. In Polycyclic Hydrocarbons and Carcinogenesis. ACS
Symposium Series, ed. RG Harvey. pp. 371-396.
Belpomme D, Irigaray P, Hardell L, Clapp R, Montagnier L, Epstein S, Sasco A. (2007).
The multitude and diversity of environmental carcinogens. Environ. Res. 105:414-429.
Beltrametti F, Reniero D, Backhaus S, Hofer B. (2001). Analysis of transcription of the bph
locus of Burkholderia sp. strain LB400 and evidence that the ORF0 gene product acts as a
regulator of the bphA1 promoter. Microbiology. 147:2169-2182.
Bopp L. (1986). Degradation of highly chlorinated PCBs by Pseudomonas strain LB400. Ind.
Microbiol. 1:23-29.
Brenner V, Arensdorf J, Focht D. (1994). Genetic construction of PCB degraders.
Biodegradation. 5:359-377.
Brouwer A, Morse D, Lans M, Schuur G, Murk A, Klason-Wehler E, Bergman A, Visser
T. (1998). Interactions of persistent environmental organohalogens with the thyroid hormone
system: mechanisms and possible consequences for animal and human health. Toxicol. Indus.
Health. 14:59-84.
Bruhn C, Lenke H, Knackmuss H. (1987). Nitrosubstituted aromatic compounds as nitrogen
source for bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 53:208-210.
Cámara B, Herrera C, González M, Couve E, Hofer B, Seeger M. (2004). From PCBs to
highly toxic metabolites by the biphenyl pathway. Environ. Microbiol. 6:842-850.
Cámara B, Seeger M, González M, Standfuss-Gabisch C, Kahl S, Hofer B. (2007).
Generation by a widely applicable approach of a hybrid dioxygenase showing improved
oxidation of polychlorobiphenyls. Appl. Environ. Microbiol. 73:2682-2689.
Carpenter D. Environmental contaminants as risk factors for developing diabetes. Rev. Environ.
Health. 2008. 23:59-74.
65
Chain P, Denef V, Konstantinidis K, Vergez L, Agulló L, Reyes V, Hauser L, Córdova M,
Gómez L, González M, Land M, Lao V, Larimer F, LiPuma J, Mahenthiralingam E,
Malfatti S, Marx C, Parnell J, Ramette A, Richardson P, Seeger M, Smith D, Spilker T, Sul
W, Tsoi T, Ulrich L, Zhulin I, Tiedje J. (2006). Burkholderia xenovorans LB400 harbors a
multi-replicon, 9.73-Mbp genome shaped for versatility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103:15280-
15287.
Coenye T & Vandamme P. (2003). Diversity and significance of Burkholderia species
occupying diverse ecological niches. Environ. Microbiol. 5:719-729.
Collier L, Nichols N, Neidle E. (1997). benK encodes a hydrophobic permease-like protein
involved in benzoate degradation by Acinetobacter sp. strain ADP1. J Bacteriol. 179:5943-5946.
Csonka L. (1982). A third L-proline permease in Salmonella typhimurium which functions in
media of elevated osmotic strength. J. Bacteriol. 151:1433-1443.
De Lorenzo V & Timmis K. (1994). Analysis and construction of stable phenotypes in gram-
negative bacteria with Tn5- and Tn10-derived minitransposons. Methods. Enzymol. 235:386-405.
Duetz W, Marques S, De Jong C, Ramos J, van Andel J. (1994). Inducibility of the TOL
catabolic pathway in Pseudomonas putida (pWWO) growing on succinate in continuous culture:
Evidence of carbon catabolite repression control. J. Bacteriol. 176:2354-2361.
Ellis L, Roe D, Wackett L. The University of Minnesota Biocatalysis/Biodegradation Database:
the first decade. Nucleic. Acids. Research. 34:D517-D521.
Esteve-Nunez A, Lucchesi G, Philipp B, Schink B, Ramos J. (2000). Respiration of 2,4,6-
trinitrotoluene by Pseudomonas sp. strain JLR11. J. Bacteriol. 182:1352-1355.
Franklin F, Bagdasarian M, Bagdasarian M, Timmis K. (1981). Molecular and functional
analysis of the TOL plasmid pWWO from Pseudomonas putida and cloning of genes for the
entire regulated aromatic ring meta cleavage pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 78:7458-7462.
Fu P. (1990). Metabolism of nitro-polycyclic aromatic hydrocarbons. Drug. Metab. Rev.
22:209-268.
Gaillard M, Vallaeys T, Vorhölter F, Minoia M, Werlen C, Sentchilo V, Pühler A, van der
Meer J. (2006). The clc element of Pseudomonas sp. strain B13, a genomic island with various
catabolic properties. J. Bacteriol. 188:1999-2013.
Gobierno de Chile. (2007). Plan Nacional de Implementación (PNI) para la gestión de los
contaminantes orgánicos persistentes (COPs) en Chile, CONAMA.
66
Gómez M, Pazos F, Guijarro F, de Lorenzo V, Valencia A. (2007). The environmental fate of
organic pollutants through the global microbial metabolism. Mol Syst Biol. 3:114.
Grandjean P, Landrigan P. (2006). Developmental neurotoxicity of industrial chemicals.
Lancet. 368:2167-2178.
Haidour A & Ramos J. (1996). Identification of products resulting from the biological
reduction of 2,4,6-trinitrotoluene, 2,4-dinitrotoluene, and 2,6-dinitrotoluene by Pseudomonas sp.
Environ. Sci. Technol. 30:2365-2370.
Hao Z & Iqbal A. (1997). Some aspects of organic pigments. Chem Soc Rev. 26:203-213.
He Z & Spain J. (1997). Studies of the catabolic pathway of degradation of nitrobenzene by
Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45: removal of the amino group from 2-aminomuconic
semialdehyde. Appl. Environ. Microbiol. 63:4839-4853.
He Z & Spain J. (1998). A novel 2-aminomuconate deaminase in the nitrobenzene degradation
pathway of Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45. J. Bacteriol. 180:2502-2506.
He Z & Spain J. (1999). Comparison of the downstream pathways for degradation of
nitrobenzene by Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45 (2-aminophenol pathway) and by
Comamonas sp. JS765 (catechol pathway). Arch. Microbiol. 171:309-316.
Hlavica P. (1982). Biological oxidation of nitrogen in organic compounds and disposition of N-
oxidized products. CRC. Crit. Rev. Biochem. 1:39-101.
Hogu N, Armengaud J, Gaillard J, Timmis K, Jouanneau Y. (1998). A novel -2Fe-2S-
ferredoxin from Pseudomonas putida mt-2 promotes the reductive reactivation of catechol 2,3-
dioxygenase. J. Biol. Chem. 273:9622-9629.
Holtze M, Sorensen J, Hansen H, Aamand J. (2006). Transformation of the herbicide 2,6-
dichlorobenzonitrile to the persistent metabolite 2,6-dichlorobenzamide (BAM) by soil bacteria
known to harbour nitrile hydratase or nitrilase. Biodegradation. 17:503-510.
Howard P. (1989). Handbook of environmental fate and exposure data for organic chemicals
environmental toxicology chemistry. Editorial CRC Press. Segunda edición.
Irie S, Doi S, Yorifuji T, Takagi M, Yano K. (1987). Nucleotide sequence and characterization
of the genes encoding benzene oxidation enzymes of Pseudomonas putida. J. Bacteriol.
169:5174-5179.
Jiménez J, Miñambres B, García J, Díaz E. (2002). Genomic analysis of the aromatic
catabolic pathways from Pseudomonas putida KT2440. Environ. Microbiol. 4:824-841.
67
Johnson G, Jain R, Spain J. (2002). Origins of the 2,4-dinitrotoluene pathway. J. Bacteriol.
184:4219-4232.
Johnson G & Spain J. (2003). Evolution of catabolic pathways for synthetic compounds:
bacterial pathways for degradation of 2,4-dinitrotoluene and nitrobenzene. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 62:110-123.
Kasai Y, Inoue J, Harayama S. (2001). The TOL plasmid pWW0 xylN gene product from
Pseudomonas putida is involved in m-xylene uptake. J. Bacteriol. 183:6662-6666.
Keith L & Telliard W. (1979). Priority pollutants. I. A perspective view. Environ. Sci. Technol.
13:416-423.
Kornaros M & Lyberatos G. (2006). Biological treatment of wastewaters from a dye
manufacturing company using a trickling filter. J. Hazard. Mater. 136:95-102.
Landers P, Kerr K, Rowbotham T, Tipper J, Keig P, Ingham E, Denton M. (2000). Survival
and growth of Burkholderia cepacia within the free-living amoeba Acanthamoeba polyphaga.
Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 19:121-123.
Lendenmann U & Spain J. (1996). 2-aminophenol 1,6-dioxygenase: a novel aromatic ring
cleavage enzyme purified from Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45. J. Bacteriol. 178:6227-
6232.
Lessie T, Hendrickson W, Manning B, Devereux R. (1996). Genomic complexity and
plasticity of Burkholderia cepacia. FEMS. Microbiol. Lett. 144:17-28.
Leungsakul T, Johnson G, Wood T. (2006). Protein engineering of the 4-methyl-5-
nitrocatechol monooxygenase from Burkholderia sp. strain DNT for enhanced degradation of
nitroaromatics. Appl. Environ. Microbiol. 72:3933-3939.
Macdonal R, Barrie L, Bidleman T, Diamond M, Gregor D, Semkin R, Strachan W, Li Y,
Wania F, Alaee M, Alexeeva L, Backus S, Bailey R, Bewers J, Gobeil C, Halsall C, Harner
T, Hoff J, Jantunen L, Lockhart W, Mackay D, Muir D, Pudykiewicz J, Reimer K, Smith
J, Stern G. (2000). Contaminants in the Canadian Arctic: 5 years of progress in understanding
sources, occurrence and pathways. Sci. Total. Environ. 254:93-234.
Mahenthiralingam E, Coenye T, Chung J, Speert D,
Govan J, Taylor P, Vandamme P.
(2000). Diagnostically and experimentally useful panel of strains from the Burkholderia cepacia
complex. J. Clin. Microbiol. 38:910-913.
Mahenthiralingam E, Coenye T, Vandamme P, Govan J, LiPuma J. (2005). Taxonomy and
pathogenesis of the Burkholderia cepacia complex. Chron. Respir. Dis. 2:209-217.
68
Martínez P, Agulló L, Hernández M, Seeger M. (2007). Chlorobenzoate inhibits growth and
induces stress proteins in the PCB-degrading bacterium Burkholderia xenovorans LB400. Arch.
Microbiol. 188:289-297.
McGlynn K, Quraishi S, Graubard B, Weber J, Rubertone M, Erickson R. (2008).
Persistent organochlorine pesticides and risk of testicular germ cell tumors. J. Natl. Cancer. Inst.
100:663-671.
McKay D, Seeger M, Zielinski M, Hofer B, Timmis K. (1997). Heterologous expression of
biphenyl dioxygenase-encoding genes from a gram-positive broad-spectrum polychlorinated
biphenyl degrader and characterization of chlorobiphenyl oxidation by the gene products. J.
Bacteriol. 179:1924-1930.
Méndez V. (2008). Reconstrucción metabólica de Burkholderia xenovorans LB400: Estudio in
silico y funcional de vías catabólicas centrales y periféricas de compuestos aromáticos. Tesis
para optar al título de Bioquímico. Valparaíso, Chile. Pontificia Universidad Católica de
Valparaíso, Facultad de Ciencias Básicas y Matemáticas, Instituto de Química, Sección
Bioquímica. 57-60.
Menn F, Easter J, Sayler G. (2000). Genetically engineered microorganisms and
bioremediation. Biotechnology. 11:441-451.
Moreno-Ruiz E, Hernáez M, Martínez-Perez O, Santero E. (2003). Identification and
functional characterization of Sphingomonas macrogolitabida strain TFA genes involved in the
first two steps of the tetralin catabolic pathway. J. Bacteriol. 185:2026-2030.
Muller C, Petruschka L, Cuypers H, Burchhardt G, Herrmann H. (1996). Carbon catabolite
repression of phenol degradation in Pseudomonas putida is mediated by the inhibition of the
activator protein PhlR. J. Bacteriol. 178:2030-2036.
Navia R & Seeger M. (2006). Biorremediación de suelos contaminados con compuestos
orgánicos persistentes (COPs), Ediciones Universidad de la Frontera. 1:87-125.
Nichols N, Harwood C. (1997). PcaK, a high-affinity permease for the aromatic compounds 4-
hydroxybenzoate and protocatechuate from Pseudomonas putida. J Bacteriol. 179:5056-5061.
Nicolopoulou-Stamati P. (2001). The impact of endocrine disrupters on the female reproductive
system. Human. Reprod. Update. 7:323-330.
Nishino S & Spain J. (1993). Degradation of nitrobenzene by a Pseudomonas
pseudoalcaligenes. Appl. Environ. Microbiol. 59:2520-2525.
69
Noyes P, McElwee M, Miller H, Clark B, Van Tiem L, Walcott K, Erwin K, Levin E.
(2009). The toxicology of climate change: Environmental contaminants in a warming world.
Environt. Int. 35:971-986.
Pachauri R & Reisinger A. (2007). Contribution of working groups I, II and III to the Fourth
Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change Core Writing Team.
IPCC. Edición Watson, R.T. y Core Writing Team IPCC. Ginebra, Suiza. pp. 184.
Park H, Lim S, Chang Y, Livingston A, Kim H. (1999). Degradation of chloronitrobenzenes
by a coculture of Pseudomonas putida and Rhodococcus sp. Appl. Environ. Microbiol. 65:1083-
1091.
Park H & Kim H. (2000). Identification and characterization of the nitrobenzene catabolic
plasmids pNB1 and pNB2 in Pseudomonas putida HS12. J. Bacteriol. 182:573-580.
Park H & Kim H. (2001). Genetic and structural organization of the aminophenol catabolic
operon and its implication for evolutionary process. J. Bacteriol. 183:5074-5081.
Parke & Gurian-Sherman. (2001). Diversity of the Burkholderia cepacia complex and
implications for risk assessment of biological control strains. Environ. Microbiol. 39:225-258.
Pazos F, Guijas D, Valencia A, de Lorenzo V. (2005). MetaRouter: bioinformatics for
bioremediation. Nucleic. Acids. Res. 33:D589-D592.
Pérez-Pantoja D, De la Iglesia R, Pieper D, González B. (2008). Metabolic reconstruction of
aromatic compounds degradation from the genome of the amazing pollutant-degrading
bacterium Cupriavidus necator JMP134. FEMS. Microbiol. Rev. 32:736-794.
Pieper D & Seeger M. (2008). Bacterial metabolism of polychlorinated biphenyls. J. Mol.
Microbiol. Biotechnol. 15:121-138.
Pitts I, van Cauwenberghe K, Grosjean D, Schmid J, Filz D. (1978). Atmospheric reactions
of polycyclic aromatic hydrocarbons: facile formation of mutagenic nitro derivatives. Science.
202:515-518.
Pohlmann A, Fricke W, Reinecke F, Kusian B, Liesegang H, Cramm R, Eitinger T,
Ewering C, Pötter M, Schwartz E, Strittmatter A, Voss I, Gottschalk G, Steinbüchel A,
Friedrich B, Bowien B. (2006). Genome sequence of the bioplastic-producing "Knallgas"
bacterium Ralstonia eutropha H16. Nat. Biotechnol. 24:1227-1229.
Prieto M, Galán B, Torres B, Ferrández A, Fernández C, Miñambres B, García J, Díaz E.
(2004). Aromatic metabolism versus carbon availability: the regulatory network that controls
70
catabolism of less-preferred carbon sources in Escherichia coli. FEMS. Microbiol. Rev. 28:503-
518.
Roldán M, Pérez-Reinado E, Castillo F, Moreno-Vivián C. (2008). Reduction of
polynitroaromatic compounds: the bacterial nitroreductases. FEMS. Microbiol. Rev. 32:474-500.
Salanoubat M, Genin S, Artiguenave F, Gouzy J, Mangenot S, Arlat M, Billault A, Brottier
P, Camus J, Cattolico L, Chandler M, Choisne N, Claudel-Renard C, Cunnac S, Demange
N, Gaspin C, Lavie M, Moisan A, Robert C, Saurin W, Schiex T, Siguier P, Thébault P,
Whalen M, Wincker P, Levy M, Weissenbach J, Boucher C. (2002). Genome sequence of the
plant pathogen Ralstonia solanacearum. Nature. 415:497-502.
Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. (1989). Molecular Cloning. A laboratory manual. 2a
edición. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Sambrook J & Russell D. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. 3a edición. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Schell M. (1983). Cloning and expression in Escherichia coli of the naphthalene degradation
genes from plasmid NAH7. J. Bacteriol. 153:822-829.
Sebaihia M, Preston A, Maskell D, Kuzmiak H, Connell T, King N, Orndorff P, Miyamoto
D, Thomson N, Harris D, Goble A, Lord A, Murphy L, Quail M, Rutter S, Squares R,
Squares S, Woodward J, Parkhill J, Temple L. (2006). Comparison of the genome sequence
of the poultry pathogen Bordetella avium with those of B. bronchiseptica, B. pertussis, and B.
parapertussis reveals extensive diversity in surface structures associated with host interaction. J.
Bacteriol. 188:6002-6015.
Seeger M, Cámara B, Hofer B. (2001). Dehalogenation, denitration, dehydroxylation, and
angular attack on substituted biphenyls and related compounds by a biphenyl dioxygenase. J
Bacteriol. 183:3548-3555.
Spain J. (1995). Biodegradation of nitroaromatic compounds. Annu Rev Microbiol. 49:523-555.
Springael D, Ryngaert A, Merlin C, Toussaint A, Mergeay M. (2001).Occurrence of Tn4371-
related mobile elements and sequences in (chloro)biphenyl-degrading bacteria. Appl. Environ.
Microbiol. 67:42-50.
Stehlik C & Dorfleutner A. (2007). COPs and POPs: modulators of inflammasome activity. J.
Immunol. 179:7993-7998.
Storck W, Layman P, Reisch M, Thayer A, Kirschner E, Peaff G, Tremblay J. (1996). Facts
& figures for the chemical industry. Chem. Eng. News. 24:38-79.
71
Stover C, Pham X, Erwin A, Mizoguchi S, Warrener P, Hickey M, Brinkman F, Hufnagle
W, Kowalik D, Lagrou M, Garber R, Goltry L, Tolentino E, Westbrock-Wadman S, Yuan
Y, Brody L, Coulter S, Folger K, Kas A, Larbig K, Lim R, Smith K, Spencer D, Wong G,
Wu Z, Paulsen I, Reizer J, Saier M, Hancock R, Lory S, Olson M. (2000). Complete genome
sequence of Pseudomonas aeruginosa PA01, an opportunistic pathogen. Nature. 406:959-964.
Sulavik M, Gambino L, Miller P. (1995). The MarR repressor of the multiple antibiotic
resistance (mar) operon in Escherichia coli: prototypic member of a family of bacterial
regulatory proteins involved in sensing phenolic compounds. Mol. Med. 1:436-446.
Takenaka S, Murakami S, Shinke R, Hatakeyama K, Yukawa H, Aoki K. (1997). Novel
genes encoding 2-aminophenol 1,6-dioxygenase from Pseudomonas species AP-3 growing on 2-
aminophenol and catalytic properties of the purified enzyme. J. Biol. Chem. 272:14727-14732.
Takenaka S, Setyorini E, Kim Y, Murakami S, Aoki K. (2005). Constitutive synthesis of
enzymes involved in 2-aminophenol metabolism and inducible synthesis of enzymes involves in
benzoate, p-hydroxybenzoate and protocatechuate metabolism in Pseudomonas strain AP-3.
Biosci. Biotechmol. Biochem. 69:1033-1035.
Timmis K & Pieper D. (1999). Bacteria designed for bioremediation. Trends. Biotechnol.
17:200-204.
Tokiwa H & Ohnishi Y. (1986). Mutagenicity and carcinogenicity of nitroarenes and their
sources in the environment. CRC. Crit. Rev. Toxicol. 17:23-60.
UNEP (United Nations Environment Programme). (2005). Ridding the world of POPs: a guide
to the Stockholm convention on persistent organic pollutants, International Environment House.
Ginebra, Suiza. 445.
U.S. Environmental Protection Agency (EPA). (1978). Nitrobenzene. Initial report of the
TSCA Interagency Testing Committee and information dossiers on substances designated.
Estados Unidos. 43: 50629-50635.
van der Meer J & Sentchilo V. (2003). Genomic islands and the evolution of catabolic
pathways in bacteria. Curr. Opin. Biotech. 14:248-254.
Wania F. (2003). Assessing the potential of persistent organic chemicals for long-range
transport and accumulation in polar regions. Environ. Sci. Techno. 37:1344-1351.
Wacketta L & Bruceb N. (2000). Environmental biotechnology: Towards sustainability. Curr.
Opin. Biotechnol. 11:229-231.
72
Weisburger E. (1978). Mechanism of chemical carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.
1:395-415.
Won W, Disalvo L, James N. (1976). Toxicity and mutagenicity of 2,4,6-trinilrololuene and its
microbial melabolites. Appl. Environ. Microbiol. 3:576-580.
Wu J, Sun C, Jiang C, Liu Z, Liu S. (2005). A novel 2-aminophenol 1,6-dioxygenase involved
in the degradation of p-chloronitrobenzene by Comamonas strain CNB-1: purification,
properties, genetic cloning and expression in Escherichia coli. Arch. Microbiol. 183:1-8.
Wu J, Jiang C, Wang B, Ma Y, Liu Z, Liu S. (2006). Novel partial reductive pathway for 4-
chloronitrobenzene and nitrobenzene degradation in Comamonas sp. strain CNB-1. Appl.
Environ. Microbiol. 72:1759-1765.
Yen K & Gunsalus I. (1982). Plasmid gene organization: naphthalene/salicylate oxidation.
Proc. Natl. Acad. Sci. 79:874-878.
Zhang C & Bennett G. (2003). Biodegradation of xenobiotics by anaerobic bacteria. Appl.
Environ. Microbiol. 67:600-618.