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UNIVERSIDAD DE CHILEFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

EVALUACIÓN DEL EFECTO ANALGÉSICO Y TÓXICO DELEXTRACTO ACUOSO DE CORTEZA DE QUILLAY, ÁCIDO

QUILLAICO Y DERIVADOS

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctora en Ciencias

Farmacéuticas por:

SYLVIA ARRAU BARRA

Directores de tesis:

Dra. Carla Delporte Vergara

Dr. Hugo F. Miranda Guzmán

SANTIAGO- CHILE

2012

UNIVERSIDAD DE CHILEFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

INFORME DE APROBACIÓNTESIS DE DOCTORADO

Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas yFarmacéuticas que la Tesis de Doctorado presentada por la candidata:

SYLVIA ARRAU BARRA

Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar algrado de Doctora en Ciencias Farmacéuticas, en el examen de defensa de Tesis rendidoel día

Directores de Tesis:

Dra. Carla Delporte ___________________________

Dr. Hugo F. Miranda ___________________________

Comisión Informante de Tesis:

Dra. Inés Ruíz (Presidenta) ___________________________

Dra. María Nella Gai ___________________________

Dr. Guillermo Díaz ___________________________

Dr. Humberto Dôlz ___________________________

Dr. Carlos Valdovinos ___________________________

Dedicatoria

ii

DEDICATORIA

Dedico este trabajo de tesis a mis padres, Raúl Arrau y Sylvia Barra; mis hermanos, Raúl y

Felipe Arrau, porque me están acompañando en este momento trascendente de mi vida.

A Sandra y a Héctor López, por su noble e incondicional apoyo en este largo y duro camino

recorrido.

Al Señor que ha permitido que yo exista, me haya desarrollado y haya llegado a esta

instancia final.

Creo firmemente que todo parte en nuestra mente y que luego se concreta en esta realidad

“Tú eres lo que es el profundo deseo que te impulsa”

“Tal como es tu deseo es tu voluntad”

“Tal como es tu voluntad son tus actos”

“Tal como son tus actos es tu destino”

Brihadaranyaka Upanishad IV.4.5.

Agradecimientos

iii

AGRADECIMIENTOS

Mis agradecimientos son muchos, tantos que quizás no podría nombrar a todas las personas

que han estado presentes durante todo este tiempo y que de alguna forma me han ayudado a

terminar con éxito este doctorado. No quisiera dejar a ninguna persona sin nombrar, pero si así

ocurriese le pido disculpas porque es solo producto de mi limitación humana.

Primero que todo quiero agradecer a la Profesora Dra. Carla Delporte V., profesora de la

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, dedicada y entregada con profesionalismo a su

actividad docente, que me recibió amablemente cuando llegué por primera vez a esta Facultad y

me ha apoyado desde entonces, por su cariño, amistad, apoyo, comprensión y mucha paciencia

en la revisión de los escritos.

Agradecer a la Dra. Nadine Backhouse, ex profesora de la Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacéuticas gran persona que me incentivó a postular al programa el año 2007 y entregó sus

valiosos conocimientos con generosidad.

A mis amigas y compañeras de programa de Doctorado, Tatiana Tobar, Mirta Parada y

Victoria Burtch, que me hicieron sentir como si yo hubiese sido una Q.F. más de esta Facultad.

Gracias por haber compartido conmigo todo este período tan lindo de nuestras vidas.

A mi querida amiga Maité Rodríguez, que tantas veces me apoyó con sus conocimientos y

cariño.

Al Profesor Dr. Hugo F. Miranda G. que me acogió en su laboratorio y me dio todas las

facilidades para realizar los ensayos in vivo, igualmente a los ayudantes de su laboratorio los

señores Alejandro y José que en todo momento me hicieron sentir como en casa y me ayudaron

en todas las pruebas de analgesia.

Al Profesor Dr. Javier Morales de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la

Universidad de Chile, que con la mejor disposición colaboró en mi tesis, entregándome su

Agradecimientos

iv

gran apoyo y conocimientos y que muy generosamente colaboró en el estudio del reparto de las

muestras.

A la ex Profesora Dra. Rosa Negrete del Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad

de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile por su cariño, amistad y

apoyo.

A David Aravena., ayudante del Laboratorio de Productos Naturales, que siempre tuvo una

palabra amable y sobre todo gran disposición para colaborar en todo.

A todos mis compañeros del Laboratorio de Productos Naturales: Consuelo Castro, Gabriela

Valenzuela, León Goiti, Marcelo Peña, Pamela Zapata, Gabriel Castro, Patricio Torres, Carlos

Cartagena, Mariela Farías, que desde que llegué a esta gran familia del laboratorio de Productos

Naturales siempre estuvieron presentes para a aclarar las dudas y por su gran compañerismo.

A Ximena Silva, QF y a la Médico Veterinaria a cargo de la Unidad de Mantención de

Animales del Instituto de Salud Pública de Chile por las facilidades otorgadas para la

realización de los ensayos de toxicidad aguda en dicha institución.

A todos los integrantes de la comisión, Dra. Inés Ruiz, Dr. Guillermo Díaz, Dra. Nella Gay,

Dr. Humberto Dölz, Dr. Carlos Valdovinos, que en todo momento mostraron una gran

disposición, colaboración y valiosas sugerencias a mi trabajo.

A los Profesores Drs. Bruce Cassels y Marcelo Asencio, por su aporte en aclarar mis dudas y

entrega de sus conocimientos.

A la Sra. María Isabel Pino, secretaria de pregrado de esta Facultad, que siempre tuvo una

palabra de aliento y de amistad.

A la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile, que me apoyó

desde el principio con la Beca Facultad y rebajas de arancel, lo cual me permitió hacer posible

este doctorado.

Índice de materias

v

ÍNDICE DE MATERIAS

Página

Título i

Dedicatoria ii

Agradecimientos iii

Publicaciones derivadas de la Tesis iv

Índice de materias v

Índice de anexos vii

Índice de figuras viii

Índice de tablas ix

Índice de fórmulas x

Índice de abreviaciones xi

Resumen xvi

Abstract xviii

1.0 Introducción 1

2.0 Hipótesis 15

3.0. Objetivos 15

.1. Objetivo general 15

.2 Objetivos específicos 15

4.0 Metodología 16

4.1. Estudio químico 16

.1.2 Aislamiento, purificación y cuantificación de QA 17

.1.4 Identificación de Q2 por RMN Y MS 18

.1.5 Cuantificación de QA en el H-100Q por CLAE 18

4.2. Preparación de derivados a partir de QA 19

4.3. Determinación del coeficiente de reparto QA, ME y MO 20

4.3. Preparación de la solución octanol y tampón fosfato 21

.3.3 Preparación de las soluciones patrones de las muestras 22

.3.4 Determinación de Log P de QA, ME y MO 23

4.4. Determinación de los compuestos por CLAE en las contrafases 24

Índice de materias

vi

4.5. Estudio farmacológico 24

4.5. Ensayos farmacológicos in vivo 24

5.2. Animales de experimentación 25

4.6. Evaluación de la toxicidad aguda en ratones 26

.6.1 Distribución aleatoria de los animales 27

.6.2 Evaluación del efecto analgésico tópico frente al LC 27

4.7. Evaluación del efecto analgésico vía i.p. frente a la PC 28

4.8. Evaluación del efecto analgésico vía i.p. frente a CFA 29

4.9. Evaluación del efecto antiinflamatorio vía i.p. frente a CFA 30

.9.1 Evaluación de la extravasación de plasma (ensayo crónico) 32

.9.1. Calculo de la inhibición de la extravasación de plasma 32

4.9.2. Determinación del edema frente a CFA 33

4.9.2. Calculo de la inhibición del edema 34

5. 0. Resultados y discusión 35

5.1. Estudio químico 35

.1.1. Obtención del H-100Q a partir del EUD 35

.1.2. Obtención y purificación del Q2 desde el H-100Q 35

.1.3. Determinación de la pureza de Q2 por CLAE 35

.1.4. Identificación de Q2 por RMN Y MS 35

.1.5. Cuantificación de QA en el H-100Q por CLA 36

5.2. Preparación de derivados a partir de QA 36

5.3. Determinación del coeficiente de reparto QA, ME y MO 38

.3.1. Cálculo del coeficiente de reparto para QA 38

.3.2. Cálculo del coeficiente de reparto de ME 39

.3.3. Cálculo del coeficiente de reparto para MO 40

5.4. Análisis teórico de las estructuras de QA, ME y MO 40

.4.1. Datos teóricos del reparto de QA 40

.4.2. Datos teóricos del reparto de ME 41

.4.3. Datos teóricos del reparto de MO 42

Índice de materias

vii

5.5. Estudio farmacológico in vivo 43

.5.1. Toxicidad aguda vía oral y RAM 43

.5.2. Determinación del efecto analgésico tópico frente al LC 44

.5.3. Determinación del efecto analgésico vía i.p. frente a la PC 48

.5.4. Determinación del efecto analgésico vía i.p. frente a CFA/PC 51

.5.5. Evaluación de la inhibición de la extravasación de plasma (ensayo crónico) 54

.5.6. Determinación de la inhibición del edema frente a CFA (ensayo crónico) 55

6.0. Conclusiones 56

7.0 Referencias bibliográficas 58

8.0 Anexos 66

Anexo 1: Cromatogramas CLAE para Q2 (=QA) 66

Anexo 2: Cromatograma CLAE para el H-100Q 67

Anexo 3.: Variaciones del Log D según pH, para QA, Chemaxon® 68

Anexo 4: Cromatograma CLAE del patrón de QA y su espectro de absorción. 69

Anexo5: Cromatogramas CLAE del reparto para QA 70

Anexo 6: Variaciones del Log D según pH, para ME, Chemaxon® 71

Anexo 7: Cromatograma CLAE del patrón de ME y su espectro de absorción. 72

Anexo 8: Variaciones del Log D según pH, para MO, Chemaxon® 73

Anexo 9: Pka y distribución de micro especies de QA 74

Anexo 10: Pka y distribución de micro especies de ME 75

Anexo 11: Pka y distribución de micro especies de MO 76

Anexo 12: Planilla de registros de RAM 77

Anexo 13: Publicación de Tesis en J.E.P, Diciembre del 2010. 78

Índice de tablas

viii

INDICE DE FIGURAS

Página

Fig. 1: Estructura química del ácido quillaico 2

Fig. 2: Clasificación de los tipos de dolor 4

Fig. 3: Dolor causado por un cuadro inflamatorio 6

Fig. 4: Cambios vasculares que promueven extravasación y edema 12

Fig. 5: Curva de calibración del ácido quillaico 18

Fig. 6: Absorbancia vs concentración de azul de Evans 31

Fig. 7: CCF de los distintos extractos y fracciones de las CC de Seph. LH-20 36

Fig. 8: Estructura química de ácido quillaico y del éster metilado 37

Fig. 9: Estructura química de MO obtenido de la oxidación de ME 38

Fig. 10: Estructura molecular predominante de QA en fase octanol 40

Fig. 11: Estructura molecular predominante de ME en la fase octanol 41

Fig. 12: Estructura molecular predominante de MO en la fase octanol 41

Fig. 13: Ensayo del latigazo de la cola vía tópica 45

Fig. 14: Ensayo de la plancha caliente de la cola vía i.p. 50

Índice de fórmulas

ix

INDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1: Tr y áreas bajo la curva de CLAE de solución patrón de QA 22

Tabla 2: Tr y áreas bajo la curva de CLAE de solución patrón de ME 23

Tabla 3: Tr y áreas bajo la curva de CLAE de solución patrón de MO 23

Tabla 4: Medianas de pesos de ratones en ensayo de toxicidad aguda vía oral 43

Tabla 5: Evaluación de efecto analgésico tópico de EUD, QA y derivados frente al LC 45

Tabla 6: Potencia relativa de de EUD, QA y derivados frente al LC 46

Tabla 7: Evaluación de efecto analgésico i. p. de EUD, QA y derivados frente a la PC 49

Tabla 8: Potencia relativa de de EUD, QA y derivados frente a la PC 50

Tabla 9: Evaluación de efecto analgésico i. p. de QA, ME y MO frente a la PC/CFA 53

Tabla 10: Resultados del % de inhibición de extravasación i.p. para QA, ME y MO 54

Tabla 11: Resultados del % de inhibición del edema i.p. para QA, ME y MO 55

Abreviaturas

x

ÍNDICE DE FÓRMULAS

Página

Fórmula 1: Cálculo de P octanol 20

Fórmula 2: Cálculo del % del máximo efecto posible (MPE o % de antinocicepción) 27

Fórmula 3: % Promedio de extravasación de los animales controles 32

Fórmula 4: % Promedio de extravasación de los animales tratado 32

Fórmula 5: % Inhibición de la extravasación (% IEX) 32

Fórmula 6a:% Promedio de edema de los animales controles (EDc) 33

Fórmula 6b:% Promedio de edema de los animales tratados (EDt) 34

Fórmula 7: % Promedio de inhibición de edema (IED) 36

Abreviaturas

xi

ÍNDICE DE ABREVIATURAS

AA Ácido araquidónico

AINES Antiinflamatorios no esteroidales

ANOVA Análisis de varianza

ATP Adenosin trifosfato

AE Colorante azul de Evans

BHE Barrera hematoencefálica

CC Cromatografía en columna

CCF Cromatografía en capa fina

CE50 Concentración que produce el 50% del efecto máximo

CFA Coadyuvante completo de Freund

CH2CL2 Diclorometano

CLAE Cromatógrafo líquido de alta eficiencia

CS2CO3 Carbonato de Cesio

COX-1 Ciclooxigenasa 1

COX-2 Ciclooxigenasa 2

Da Dalton

DCM Diclorometano

DE50 Dosis que produce el 50% del efecto máximo

DL50 Dosis que produce la muerte del 50% de los animales tratados

DMF Dimetil formamida

DMSO Dimetilsulfóxido

EDC Edema de animales controles

EDt Edema de animales tratados

EtOAc Acetato de etilo

EUD Extracto seco enriquecido de saponinas

PLA2 Fosfolipasa A2

Abreviaturas

xii

HCl Ácido clorhídrico

HEX Hexano

HPLC Cromatografía líquida de alta resolución

H-100Q Hidrolizado de geninas

IASP Asociación internacional para el estudio del dolor

IBU Ibuprofeno

% IE Inhibición de la extravasación, porcentaje

% IED Inhibición del edema, porcentaje

iNos Óxido nítrico sintasa inducible

ISP Instituto de Salud Pública

KH2PO4 Fosfato dihidrógeno de potasio

LC Latigazo de la cola

LPS Lipopolisacáridos bacterianos

MEI Yoduro de metilo

MeOH Metanol

% MPE Máximo posible efecto, porcentaje

NMDA N- metil- D aspartato

ME Metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato

MS Espectrometría de masas

MO Metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato

NaCl Cloruro de Sodio

Na OH Hidróxido de Sodio

Na2SO4 Sulfato de sodio

NO Óxido nítrico

PAS P-Anisaldehído en sulfúrico

PC Plancha caliente

PC/CFA Plancha caliente/ CFA

PGE2 Prostaglandina E2

Abreviaturas

xiii

PGS Prostaglandinas

pKA Constante de disociación

PLA2 Fosfolipasa A2

QA Ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico

Q2 Compuesto identificado como QA

RAM Reacción adversa al medicamento

Rf Factor de retención

RMN Resonancia magnética nuclear

RPM Revoluciones por min.

ROS Especies reactivas del oxígeno

SNC Sistema nervioso central

TPA 12-O-tetradecanoil forbol 13-acetato

Tr Tiempo de retención

VR1 Receptor vanilloide tipo 1

Resumen

xiv

RESUMEN

El quillay (Quillaja saponaria Mol., Quillajaceae) es una especie autóctona, de amplia

distribución geográfica. Su corteza, hojas y ramas presentan un alto contenido de saponinas

triterpénicas, cuya sapogenina mayoritaria es el ácido quillaico. Por medio del presente trabajo

se logró optimizar el rendimiento del producto de hidrólisis obtenido desde el extracto acuoso

rico en saponinas, obteniéndose un rendimiento de 39 %, con una disminución total del tiempo

de hidrólisis de 1 h. Desde el producto de hidrólisis y por repetidas CC con silicagel 60 y

Sephadex LH-20 fue aislado e identificado por completos estudios espectroscópicos el ácido

quillaico (ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico). Se demostró por CLAE que el

ácido quillaico está presente en un 68,9 % en el extracto acuoso de Q. saponaria. Se sintetizaron

derivados del ácido quillaico, identificados como metil 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-

oato (ME) y metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato (MO). A través del estudio de toxicidad

aguda vía oral del ácido quillaico y de su éster metilado (ambos a 1 g/kg) se demostró la

seguridad de estos triterpenoides en ratones. Se determinó la actividad antinociceptiva del

extracto acuoso rico en saponinas, ácido quillaico y dos de sus derivados (ME y MO) usando 2

modelos de dolor agudo térmico en ratones (plancha caliente y latigazo de la cola). En ambos

modelos, las diferencias entre las latencias basales y experimentales entre los animales controles

y tratados, permitió determinar el % de efecto máximo posible (% MPE). Todas las muestras

presentaron actividad en ambos ensayos algesiométricos de forma dosis dependiente. El más

activo frente al latigazo de la cola fue el extracto acuoso rico en saponinas, obteniéndose una

EC50 de 27,9 mg % p/v, siendo la potencia de este extracto acuoso mayor que la del fármaco de

referencia (ibuprofeno sódico). Los resultados del extracto acuoso frente al latigazo de la cola,

nos permiten plantear la hipótesis que el o los componente (s) activo (s) de dicho extracto

actuaría (n) principalmente por vía periférica. Sin embargo, en la plancha caliente, el derivado

oxidado del éster metílico del ácido quillaico (MO), fue el más potente y el más eficaz, con una

DE50 de 12,2 mg/kg, potencia mayor que ibuprofeno sódico, estos resultados permiten plantear

que uno de los posibles mecanismos de acción inhibitoria el dolor de MO sería de origen central.

Con respecto de la prueba plancha caliente/ CFA en el dolor agudo y crónico (24 h y 7 días

respectivamente), todas las muestras fueron activas, sin embargo el MO fue el más potente y

eficaz como analgésico. Las modificaciones estructurales realizadas al ácido quillaico mejoraron

Resumen

xv

levemente el efecto antiedematoso sólo en el ensayo crónico, sin embargo, no se observaron

efectos inhibitorios de la extravasación frente a las muestras estudiadas en esta tesis. Los

resultados de la evaluación del efecto antiedematoso fueron leves tanto para el ME (18 % a 10

mg/kg) como para el MO (26,7 % a 50 mg/kg), ambos resultados se observaron en el ensayo

crónico de 7 días. El derivado metilado del ácido quillaico tuvo que ser evaluado a dosis

inferiores de 30 mg/kg por su toxicidad neurológica en el modelo PC/CFA de 7 días. Con el fin

de determinar la permeabilidad a través de membranas biológicas (BHE), se determinó el

coeficiente de partición del ácido quillaico (Log P), cuyo valor final fue de 1,65, valor

experimental comparable con el valor teórico (1,68) obtenido con el Programa Chemaxon ®. En

lo que respecta al éster metilado del ácido quillaico y su derivado oxidado, ambos resultaron ser

altamente liposolubles y utilizando Chemaxon ®, se pudo obtener el Log D, teórico para ambos

derivados, para ME fue de 4,54 y para MO de 5,67, respectivamente.

Resumen

xvi

ABSTRACT

The Quillaja (Quillaja saponaria Mol., Quillajaceae) is a native species of a wide geographic

distribution. Its bark leaves and branches have a high content of triterpene saponins, which is the

quillaic acid the majority sapogenin. Through this thesis we managed to optimize the

performance of the hydrolysis product obtained from the aqueous extract rich in saponins,

obtaining a yield of 39%, with a total decrease of hydrolysis time of 1 h. Since the hydrolysis

product and with repeated CC silica gel 60 and Sephadex LH-20 was isolated and identified by

complete spectroscopic studies, the quillaic acid (acid 3, 16 -dihydroxy-23-oxoolean-12-en-

28-oic acid). It was demonstrated by HPLC that the quillaic acid is present in 68.9% in the

aqueous extract. Were synthesized quillaic acid derivatives and identified as methyl 3, 16 -

dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oate (ME) and methyl 4-nor-3, 16-dioxoolean-12-en-28- oate

(MO). Through the acute oral quillaic acid toxicity study and its methyl ester (both 1 g / kg) was

showed the safety use of these triterpenoids in mice. Antinociceptive activities were determined

in the aqueous extract rich in saponins, quillaic acid and two of its derivatives using 2 thermal

acute pain models in mice (hot plate and tail flick tests). In both models, the differences between

baseline and experimental latencies time between controls and treated animals, allowed to

determined the % maximum possible effect (% MPE). All samples showed activity in both

algesiometer assays in a dose-dependent manner. The most active against the tail flick test was

the aqueous extract rich in saponins, yielding an EC50 of 27.9 mg% w / v, where the potency of

this aqueous extract was higher than the reference drug (ibuprofen sodium). The results of the

aqueous extract against the tail flick assay, allow us to hypothesize that the activity (s) of the

component (s) of the aqueous extract is mainly by the peripheral route. However, in the hot plate

test, the oxidized quillaic acid methyl ester (MO), was the most potent and most effective, with

an ED50 of 12.2 mg / kg, presented a higher power comparing with ibuprofen sodium, these

results allow argue that one of the possible mechanisms of pain inhibitory action of MO would

be of central origin. With respect to the hot plate test / CFA in acute and chronic pain (24 h and 7

days respectively), all samples were active, but the MO was the most potent as an analgesic.

Structural modifications made quillaic acid improved slightly inhibitory effects of edema only in

the chronic test, however, no significant inhibitory effects of extravasation compared to the

samples studied in this thesis. The results of the evaluation of the antiedematous effect were mild

for both quillaic acid methyl ester (18% at 10 mg / kg) for MO (26.7% at 50 mg / kg), both

Resumen

xvii

results were observed at chronic assay. The methylated derivative quillaic acid had to be

evaluated at lower doses of 30 mg / kg for neurological toxicity in the model PC / CFA (7 days).

In order to determine the permeability through biological membranes (BBB), we determined the

partition coefficient of the quillaic acid (log P), whose final value was 1.65, comparing them to

experimental value theory (1.68) ® using the Chemaxon program. In regard to quillaic acid

methyl ester and its derivative oxidized, both were highly soluble and using Chemaxon ®, we

could get the theoretical Log D, from both, ME and MO, was 4.54 and 5.67, respectively.

Introducción

1

1. INTRODUCCIÓN

El quillay (Quillaja saponaria Mol., Quillajaceae) es una especie nativa de Chile, China,

Perú y Bolivia (Leung y Foster, 1996; Resnik, 2004), de amplia distribución, abarcando desde la

provincia del Limarí (IV Región) hasta la del Bío Bío (VIII Región), tanto en la costa, como al

interior, llegando a altitudes de 1.600 m en la pre cordillera de Los Andes (Rodríguez et al.,

1983; Hoffmann et al., 1992; Montenegro, 2000). Existe un uso tradicional de la corteza de

quillay por los pueblos mapuches, los cuales lo utilizaban como analgésico para el alivio de los

dolores odontológicos y también como agente detergente (Zin y Weiss, 1981).

Su corteza es rica en saponinas triterpénicas de uso industrial, utilizada desde hace muchos

años como fuente de agentes espumantes (Reyes, 2006; Rigano et al., 2009) y emulsificantes

(San Martin y Briones, 1999), su extracto acuoso contiene más de 100 saponinas triterpénicas,

predominantemente glucósidos del ácido quillaico ampliamente distribuidos en el reino vegetal

y animal, polifenoles, taninos, algunas azúcares simples y oxalatos (Resnik, 2004). La mayoría

de las saponinas se encuentra como mezcla; debido a su estructura compleja es difícil

caracterizarlas, para esto las mezclas crudas son sometidas a hidrólisis dando como resultado

uno o varios azúcares y una mezcla de geninas que es la parte de mayor interés, que reciben el

nombre de sapogeninas (Montenegro, 2000).

El ácido quillaico (QA ácido 3β, 16α-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico) es la

sapogenina mayoritaria de la mezcla de saponinas que contiene la corteza de quillay. Este

triterpeno pentacíclico tiene una similitud estructural con el ácido oleanólico, ver Figura Nº 1

(Guo y Kenne, 2000; Brinker et al., 2007). La presencia en la estructura del ácido quillaico de

una función ácido carboxílica, una aldehídica y de dos hidroxilos secundarios ecuatoriales,

permitió realizar modificaciones estructurales con la obtención de derivados como metil

3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato (ME) y metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-

oato (MO), con el fin de evaluar en forma comparativa su actividad analgésica y tóxica junto

con la evaluación del extracto rico en saponinas (EUD) y de su sapogenina mayoritaria (QA).

Introducción

2

A. B.

Figura Nº 1. A.- Estructura química del ácido quillaico, (ácido 3ß, 16α-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-

oico) y B.- ácido oleanólico (ácido 3ß -hidroxi-olean-12(13)-en-28-oico).

Los glicósidos triterpénicos, tienen una gran variedad de actividades biológicas que se

manifiestan en procesos patológicos como el cáncer (Dzuback et al., 2006), inflamación

(Brinker et al., 2007), reacciones alérgicas (Ríos, 2010), también se les describen efectos

larvicidas (Pelha et al., 2002), antifúngicos (Rivera, 2007) inmunomoduladores (Ríos, 2010)

(Brinker et al., 2007), antivirales (Roner et al., 2007), molusquicidas (Lacaille-Dubois y

Wagner ,1996), citotóxicas (Roner et al., 2007) y como coadyuvante de vacunas de humanos y

animales (Roner et al., 2007).

En diversos estudios se ha demostrado que el ácido oleanólico tiene efectos

antiinflamatorio y analgésico, ambos determinados en ensayos in vivo en los que se indujo

inflamación dérmica significativa con ácido araquidónico (AA) o 12 O-tetradecanoilforbol-13

acetato (TPA) en orejas de ratón; incluso en uno de estos trabajos, este ácido triterpénico resultó

tener un efecto más intenso que la indometacina usada como fármaco de referencia (Singh et al.,

1992; Banno et al., 2004). Además se demostró que el ácido oleanólico inhibía las

ciclooxigenasas (COX-1 y COX-2) que intervienen en el proceso inflamatorio (Brinker et al.,

2007).

Muchas saponinas han demostrado significativos efectos antinociceptivos,

antiinflamatorios y antipiréticos, dichos efectos se deben a las sapogeninas (Hostettmann y

HOH3C

H

CH3

CH3

H

H3C CH3

CH3

CH3

H

3029

27

2625

24

23

22

2120

19

1817

1615

14

13

12

11

10

9

8

7

6

54

21

3

COOH28

HO

CH3H

CH3

CHO

H

3029

27

2625

24

23

22

2120

19

1817

1615

14

13

12

11

10

9

8

765

4

21

3

COOH28

OH

Introducción

3

Marston, 1995; Milgate y Roberts, 1995; Lacaille-Dubois y Wagner, 1996). Es así como, se ha

demostrado la actividad antinociceptiva de extractos ricos en sapogeninas en modelos de

nocicepción en animales, como ejemplo podemos citar a Bauhinia racemosa (Rinaldi et al.,

2009), Buddleja globosa (Backhouse et al., 2008), Tribulus terrestris (Heidari, et al., 2007),

Ugni molinae (Delporte et al., 2007), Cipura paludosa (Greice et al., 2007), Kalopanax pictus

(Choi et al., 2005).

Choi et al. (2002) reportaron que las propiedades antinociceptiva y antiinflamatoria de la

corteza de Akebia quinata (Lardizabalaceae), demostrada en las pruebas de plancha caliente

(PC) y latigazo de la cola (LC) en ratas, podrían ser atribuidas a su contenido en sapogeninas

como el ácido oleanólico y hederagenina. Se demostró que las fracciones ricas en saponinas y

en sapogeninas (ambas obtenidas desde el material vegetal a partir del producto de hidrólisis)

tienen efectos antiinflamatorios en modelos de artritis crónicas en ratones (Singh et al., 1992).

El dolor crónico es considerado uno de los mayores problemas de salud en la actualidad y

aunque no hay datos epidemiológicos exhaustivos, se estima que el 11 a 35% de la población

mundial sufre de dolor crónico no oncológico (Verhaak et al., 1998). Según la Organización

Mundial de la Salud (OMS) en el año 2000 ya existían 600 millones de personas mayores de 60

años con dolor crónico, una cifra que se doblaría en el año 2025. Los tipos de dolor más

comunes descritos son el dolor lumbar, la artritis y la cefalea recurrente, son tan frecuentes, que

a veces se consideran como una parte normal e inevitable de la vida del ser humano. La

importancia fisiológica del dolor es su función de preservación de la integridad del individuo.

Es una estrategia adaptativa que le permite protegerse de las agresiones de medio externo o

interno, produciendo una reacción del sujeto para eliminar de manera oportuna el estímulo

doloroso. Sin embargo, en algunas circunstancias el dolor pasa de tener una función benéfica a

convertirse en una patología en sí mismo, que debe ser suprimida para permitirle al organismo

sobrevivir (Bonica, 1990).

De acuerdo a la asociación internacional para el estudio del dolor (IASP), el dolor se define

como: “una sensación desagradable y una experiencia emocional asociada con un daño tisular

actual o potencial, o descrito en términos de dicho daño” (Mello y Dickenson, 2008). Esta

definición establece que el dolor compromete un componente fisiológico significativo, que

Introducción

4

puede alterar su percepción y por lo tanto, requiere de un extenso proceso a través del sistema

nervioso y particularmente en el cerebro. Desde el punto de vista fisiopatológico puede dividirse

en cuatro categorías, que son el dolor nociceptivo, inflamatorio, neuropático y funcional

(Besson, 1999), ver Figura Nº 2.

Figura Nº 2. Clasificación de los tipos de dolor, vías comprometidas y estímulos. Fuente: Ortega, 2007

Debido a la dificultad para interpretar las reacciones del animal de experimentación al

estímulo doloroso, Zimmerman (1986) adaptó la definición de dolor de la IASP para que se

pudiera aplicar a los animales. Así, el dolor en animales sería: “una experiencia sensorial

aversiva causada por una lesión real o potencial que produce reacciones motoras y vegetativas

progresivas que desencadenan un comportamiento aprendido de evitación y puede modificar

Introducción

5

comportamientos específicos de la especie, incluyendo los sociales”. Es un hecho reconocido

que los vertebrados en general, poseen estructuras y mecanismos necesarios para detectar y

procesar estímulos nocivos, que pueden desencadenar en experiencias dolorosas que son

comunes al hombre y animales. Se ha demostrado que entre ambos grupos existe una gran

similitud de estructuras del sistema nervioso central, sistema nervioso periférico, receptores

superficiales y profundos del dolor como de las fibras sensitivas. En definitiva con respecto de

la respuesta dolorosa frente al calor, no hay diferencias entre las especies animales y el hombre

(Flecknell, 2008).

El dolor agudo es producido por un daño tisular importante y su duración depende del lapso

estimado como suficiente para que los tejidos sanen y generalmente desparece cuando la

afección que lo origina llega a término. Constituye un mecanismo fisiológico de alarma para

limitar el daño e iniciar los procesos de reparación. Su curso temporal es propio de la lesión que

lo originó. Este es el dolor observado después de un trauma, intervenciones quirúrgicas y en

algunas enfermedades (Warner y Mitchell, 2004). El dolor crónico, por otro lado, es aquel que

tiene una duración de más de tres meses, o que por las características de su origen, sobrepasa el

tiempo que habitualmente podría definir al dolor agudo. Tiende a aumentar lentamente su

frecuencia e intensidad y carece de propiedades biológicas reparadoras (Mello y Dickenson,

2008). La lesión inflamatoria articular puede ofrecer un modelo intermedio entre agudo y

crónico, mientras que la inducción de inflamación crónica músculo esquelética con adyuvante

completo de Freud (CFA) es un modelo de dolor crónico (Micó y Ortega, 2006).

El dolor crónico neuropático, es de carácter irreversible o muy difícil de tratar, su origen

puede estar ubicado en los nervios periféricos o en alguna estructura del sistema nervioso

central (S.N.C.), se le asocia a un proceso patológico crónico que provoca dolor continuo; se

relaciona con las estructuras profundas del cuerpo; no está bien localizado y es capaz de

producir un sufrimiento continuo e insoportable. Se desencadena por mecanismos

independientes del proceso nociceptivo en sí, incluso sin estímulo ninguno de por medio, va

acompañado de percepciones sensoriales anormales como alodinia (sensación dolorosa sin

estimulo previo o muy leve, causada por la lesión de algunas de las estructuras en las vías

aferente o eferente) e hiperalgesia (sensación dolorosa con estimulo no nociceptivo que puede

ser producido por un cuadro inflamatorio) (Costigan y Wolff, 2000), ver Figura N º3.

Introducción

6

Figura Nº 3. Dolor causado por un cuadro inflamatorio frente a un estimulo nocivo y la interface

química. Fuente: Ortega, 2007.

Las estructuras periféricas comprometidas en el desencadenamiento del dolor son las

terminales nerviosas sensibles a estímulos nocivos o nociceptores, pertenecientes a las fibras

sensoriales especializadas de los tejidos periféricos llamadas Aδ y C, activadas solo por

estímulos nocivos mecánicos, térmicos o químicos. Estas fibras conducen el estímulo eléctrico a

una gran velocidad hasta el ganglio sensorial craneal y hasta llegar al asta dorsal de la médula

(Le Bars et al., 2001). Las fibras tipo A están correlacionadas con el dolor agudo; son delgadas

(1-5 μm) y de una alta velocidad de conducción (5- 35 m/s), mientras que las fibras de tipo C,

aunque también son delgadas (0,2 -1,5 μm) son responsables del dolor crónico y conducen a una

velocidad menor (0,5- 2 m/s) (Markenson, 1996).

Introducción

7

El mecanismo periférico de generación de dolor puede ser desencadenado después de

una lesión tisular lo que induce un proceso inflamatorio durante el cual se liberan una serie de

mediadores de diferentes orígenes, tales como bradiquinina, serotonina, histamina, factores de

coagulación, potasio, ATP, prostanoides, interleuquinas, neuropéptidos y factor de crecimiento

nervioso, entre otros, los cuales cumplen un papel decisivo en el desarrollo de la inflamación

aguda.

Los nociceptores son sensibles a muchas de estas moléculas con las cuales pueden

interaccionar en la biofase, como lo que sucede con los mediadores inflamatorios que pueden

modificar la actividad de las neuronas primarias, activándolas directamente o disminuyendo su

umbral de respuesta, a esta concatenación de eventos se le denomina sensibilización periférica

(Chen y Levine, 1999).

La característica principal de un nociceptor es que éste posee un umbral alto de desafío,

por lo cual no responde a estímulos de baja intensidad. En la medida en que es continuamente

estimulado tiende a hacerse más sensible, bajando su umbral a medida de que la noxa persiste,

de esta forma es que se puede explicar el fenómeno de hiperalgesia, producto por ejemplo de un

fenómeno inflamatorio (Lavich et al., 2005).

El receptor VR1 (vanilloide), responde también a la estimulación térmica dolorosa

cuando éste es estimulado repetidamente, generando una corriente iónica de sodio en el terminal

axónico, lo que provoca una hipersensibilidad en el receptor provocando cambios en las

moléculas receptoras o en los canales de sodio en el terminal axónico sensibilizando las fibras

del dolor (Stander et al., 2005). La piel recibe la mayoría de las proyecciones desde las neuronas

sensoriales primarias y en estudios anteriores se ha descrito la expresión de la sensación

dolorosa por estímulo térmico de este receptor VR1 en la piel, el cual está localizado en las

terminaciones nerviosas de las fibras intracutáneas intra dermales (Nolano et al., 1999). La

activación del receptor VR1 induce la formación de eicosanoides y la liberación de otros

mediadores inflamatorios en los terminales, modulando así la señalización nociceptiva en las

terminaciones cutáneas por efecto hiperalgésico (Southall et al., 2003). La prostaglandina E2

(PGE2) es la principal prostaglandina (PG) presente en la piel, y aumenta la liberación de

sustancia P por parte de las neuronas sensitivas por activación del receptor VR1 (Stander et al.,

Introducción

8

2005) que por otra parte es modulado también por receptores opioides periféricos.

Por otro lado, los cambios ocurridos en la actividad de las neuronas primarias originan a

su vez, cambios en las sinapsis espinales, generando una hiperexcitabilidad de las neuronas del

asta dorsal de la médula, fenómeno llamado sensibilización central (wind-up) el cual contribuye

al dolor crónico (Woolf, 1986). Para evaluar las sensaciones dolorosas del animal de

experimentación, es necesario estudiar sus reacciones a diversos tipos de estimulación por

medio de diferentes modelos nociceptivos, en los cuales se mide el tiempo de respuesta ante un

estimulo nociceptivo.

Con respecto del ensayo de la PC descrito por primera vez por Woolfe y McDonald

(1944), se ha probado que es un método útil y sensible para detectar analgesia e hiperalgesia

(Rupniak et al., 1997; Sammons et al., 2000), cuya respuesta está integrada a nivel supraespinal

(central) (Dogroul et al., 2007; Miranda et al., 2007).

Debido a la complejidad del dolor en el ser humano, es muy difícil implementar un

modelo que pueda valorar perfectamente todos sus componentes. Por ello, los modelos animales

suelen estudiar algunos aspectos concretos y muy específicos del proceso doloroso. En la

actualidad se dispone de una gran variedad de modelos farmacológicos in vivo que permiten

evaluar el efecto analgésico y determinar los distintos mecanismos de acción. Es necesario tener

una visión crítica de los modelos, ya que en ellos valoramos fundamentalmente la dimensión

somática de la respuesta nociceptiva a un estímulo nocivo en el animal, sin embargo no

podemos valorar la dimensión afectivo-emocional inherente al dolor en el ser humano y

probablemente también en los animales (Micó y Ortega, 2006). Finalmente en base a estos

antecedentes se puede aseverar que el modelo más válido para una enfermedad será siempre la

propia enfermedad (Baños y Ruíz- Barría, 2006).

En mamíferos el estímulo térmico es siempre de carácter progresivo y aumenta con la raíz

cuadrada del tiempo (Lavich et al., 2005). La latencia de la respuesta es el tiempo que transcurre

desde el inicio del estimulo periférico, transducción de éste en un estimulo eléctrico que es

conducido por las fibras Aδ (mielinizadas) y C (no mielinizadas) desde la periferia hasta el SNC

y se mide en segundos. Las fibras Aδ tipo I se activan a temperaturas comprendidas entre los 42

Introducción

9

a 44°C, a diferencia de las de Aδ tipo II, que son sensibles a temperaturas mayores de 52°C

(Stander et al., 2005). Esta latencia es la suma de una serie de latencias fisiológica, física y del

comportamiento o reacción del animal.

El estímulo térmico de la prueba del LC está focalizado tanto en la piel del animal,

activando nociceptores ubicados en las capas superficiales de la piel como también en

estructuras centrales (Benoist, 2010). A pesar de que muchos modelos preclínicos están

diseñados para evaluar la actividad analgésica de los antiinflamatorios no esteroidales (AINES),

la prueba del LC ha resultado reiteradamente insensible a esta clase de fármaco (Lavich et al.,

2005). Estudios preclínicos han demostrado que los AINES no suben el umbral del dolor en los

modelos térmicos en ratones, sin embargo, normalizarían la respuesta exagerada producida por

la injuria térmica tisular y el mecanismo inflamatorio (Stander et al., 2005). Los AINES

constituyen un grupo farmacológico muy heterogéneo que tienen en común su mecanismo de

acción, caracterizado por inhibir la síntesis de PG, las cuales se liberan cuando hay daño tisular

y están presentes en los exudados inflamatorios, ejerciendo así un papel tanto en la

sensibilización de los nociceptores, como en la mediación de procesos de inflamación, fiebre e

interferencia en los mecanismos de agregación plaquetaria (Pinardi et al., 2001).

Los AINEs son fármacos que comparten en grado diverso propiedades analgésicas y

antipiréticas que se dividen tradicionalmente en dos grupos; aquellos de efectos centrales y los

de efectos periféricos. De esta clasificación, que depende del lugar del organismo donde

desarrollan principalmente su acción, se desprende que los analgésicos centrales, también

llamados narcóticos u opiáceos, actúan principalmente sobre receptores específicos del sistema

nervioso central (Baños y Ruiz- Barría, 2006).

Para que los AINEs puedan producir sus efectos terapéuticos deben concentrarse en el sitio

apropiado y así lograr el paso a través de las membranas biológicas (Noguéz et al., 2009). La

capacidad de una sustancia para atravesar membranas biológicas es uno de los aspectos

fundamentales dentro de las características farmacocinéticas de una droga, ya que le permite

acceder al sitio de acción y así, generar el efecto biológico (terapéutico o tóxico). Las

propiedades fisicoquímicas como la constante de disociación pKA, el coeficiente de partición o

reparto (Log P), y sus propiedades estéricas y electrónicas, tienen un impacto decisivo en la

Introducción

10

velocidad de absorción, transporte de una droga y su afinidad por el receptor (Brzezińska y

Stolarska, 2005).

El mecanismo más importante involucrado en la respuesta antiinflamatoria, es la

inhibición de enzimas tales como la fosfolipasa A2 (PLA2) generadora de eicosanoides, la COX-

2 productora de cantidades significativas de la PGE2 (Cryer y Feldman, 1998; Mitchell y

Warner, 1999; Warner et al., 1999; Paik et al., 2000) y la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS,

productora de óxido nítrico). Dichas enzimas participan en el complejo proceso de la

inflamación y dolor, cuyo objetivo es liberar al organismo de la causa inicial de la lesión. No

obstante, cuando se alteran los mecanismos reguladores encargados de mantener bajo control

dicha respuesta, el proceso se vuelve patológico. La COX-2 es prácticamente indetectable en

tejidos sanos, excepto en el SNC, parece expresarse en situaciones patológicas en determinadas

células en el foco inflamatorio, donde su expresión aumenta hasta 20 veces (Simmons et al.,

2004).

Los niveles elevados de COX-2 en macrófagos y células endoteliales debido a la acción

de lipopolisacáridos bacterianos (LPS) y citoquinas proinflamatorias, da lugar a una producción

excesiva de PGs, mayoritariamente PGE2, responsable de la vasodilatación y dolor (Mitchell y

Warner, 1999). Por otra parte, la sobreproducción de óxido nítrico (NO) por activación de iNOS

está altamente asociada con inflamación y dolor (Boscá et al., 2005). Existe evidencia de que la

inhibición de COX-2 media la inhibición de la síntesis de PGs en el SNC y periférico, pero

además es probable de que estén involucrados otros mecanismos más complejos de inhibición

del dolor (Miranda et al., 2001; Pinardi et al., 2003).

Existen mecanismos que producirían efectos antinociceptivos en neuronas periféricas o

centrales involucradas en la transmisión de señales dolorosas adicionales a las anteriormente

nombradas. Se ha propuesto como posible mecanismo la neuromodulación que ocurre a nivel de

la información nociceptiva ejercida por los sistemas adrenérgico, colinérgico y serotoninérgico,

tanto a nivel espinal como supraespinal (Jurna y Brune, 1990). Existiría además la concurrencia

de mecanismos de transducción celular, con la participación de sustancias inhibidoras de

receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) y de aminoácidos excitatorios (Miranda et al.,

2001).

Introducción

11

En las pruebas de dolor crónico donde se utiliza el coadyuvante completo de Freund

(CFA), se trata de asemejar a lo que ocurre en condiciones clínicas humanas de alodinia o

hiperalgesia a raíz de una inflamación articular crónica, a este respecto se ha determinado que el

miembro inyectado con el CFA tiene una temperatura mayor al miembro inyectado con solución

salina sola, lo cual hace acortar el período de latencia en la PC. Al inyectar CFA en la región

intraplantar del ratón, se produce un dolor más persistente que con carragenina o zimosan (Ren

y Dabner, 1999). En condiciones de inflamación aguda provocada por la administración del

CFA, el estudio de la extravasación aguda de fluidos desde la circulación sanguínea hasta los

espacios extravasculares, se realiza empleando como marcador proteico, el colorante azul de

Evans (AE). La capacidad de este colorante para unirse de manera estable a la albúmina,

permite su empleo en estudios de permeabilidad vascular, cuantificándose por

espectrofotometría visible a 620 nm (Udaka et al., 1970).

Es necesario diferenciar entre edema y extravasación, ambos parámetros son empleados

en la evaluación de la inflamación desencadenada por la administración del CFA intraplantar en

ratones. A este respecto se puede establecer que el edema significa acumulación de fluido

plasmático en el espacio intersticial y se produce por cambios en el flujo sanguíneo, como vaso

dilatación de los extremos arteriolares y la modificación de la tensión vascular, ver Figura Nº 4.

La extravasación sin embargo, requiere que la permeabilidad a la albúmina del endotelio

vascular desde las vénulas pos capilares, se vea modificada y más concretamente que aumente

el diámetro de los poros que se forman en los espacios intercelulares, de manera que permita la

extravasación de proteínas al extravascular (Romero, 2003).

Introducción

12

Figura Nº 4.:Se observan los cambios en el calibre vascular producto de la inflamación, aumento del

flujo sanguíneo y de la permeabilidad vascular producto de las presiones que actúan dentro y fuera de los

vasos sanguíneos promoviendo la extravasación. Fuente: Romero, 2003.

Para que una sustancia presente efecto analgésico in vivo, ésta debe ser capaz de atravesar

membranas biológicas y este paso es favorecido cuando se presenta al estado no ionizado. El

pKA de una sustancia representa el log negativo de la constante de disociación según la

variación del pH del medio donde ella se encuentre. Dependiendo de la naturaleza de un

compuesto, cuando este se distribuye en una mezcla de líquidos inmiscibles, como por ejemplo

el sistema octanol-agua, se produce un reparto de las fracciones ionizadas y no ionizadas en

ambos líquidos, de la siguiente manera: la fracción ionizada permanecerá en la fase acuosa en su

mayor parte, y bajo condiciones normales solamente la fracción no ionizada de dicho compuesto

penetrará la fase orgánica (Neubert, 1989).

El sistema octanol-agua es el más empleado desde hace muchos años para determinar la

capacidad de una sustancia de permear las membranas biológicas, de esta forma este sistema es

utilizado para determinar el Log P, el cual representa la lipofilicidad intrínseca de los grupos

funcionales del esqueleto carbonado que estructura la molécula de una sustancia en ausencia de

Introducción

13

disociación o ionización, una excepción lo constituyen las sustancias que son de naturaleza

anfipática. El conocimiento del grado de lipofilia de una determinada sustancia permite

relacionar algunas propiedades biológicas como la unión a enzima receptor, absorción,

distribución, metabolismo, penetración al SNC, unión a proteína plasmática y la unión a tejidos

(Noguéz et al., 2009).

El Log D, coeficiente de distribución, representa la cantidad de sustancia ionizada y no

ionizada presente en dos líquidos inmiscibles (Brzezińska y Stolarska, 2005). Para determinar el

Log D en términos prácticos, se utiliza el sistema tampón fosfato para representar la fase acuosa

a pH fisiológico (pH 7,4). Este sistema combina el empleo de técnicas analíticas como es la

cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE) (Valvani et al., 1980).

Un cambio de pH altera la distribución de las micro especies ionizadas y las no ionizadas

entre las fases acuosa y oleosa (Noguéz et al., 2009), debido a la presencia de grupos

funcionales que son ionizables en la molécula.

Se ha demostrado que los compuestos hidrofóbicos tienen valores de log P mayores que

aquellos más hidrofílicos y atraviesan con mayor facilidad las membranas biológicas,

alcanzando mayores concentraciones en el sitio de acción, lo que teóricamente favorecería la

interacción de dichos compuestos hidrofóbicos con su blanco, aumentando la actividad

biológica (Patrick, 2009).

Para que una molécula atraviese la barrera hemato-encefálica (BHE), debe ser una sustancia

liposoluble, con valores de Log P cercanos a 2 (Bellavance et al., 2008), por este motivo, existe

un número reducido de sustancias que pueden alcanzar concentraciones detectables en el líquido

céfalo-raquídeo. Además del grado de liposolubilidad, existen otros factores que determinan el

paso a través de la BHE, uno de ellos es el porcentaje de unión a proteínas plasmáticas, en este

contexto, las sustancias que presenta una gran afinidad con la albúmina plasmática tienen un

volumen de distribución menor y por lo tanto su paso a través de la BHE es menor (Patrick,

2009). Pardridge (2005), enfatiza que para que un fármaco cruce la BHE debe poseer una masa

de alrededor de 550 Da.

Introducción

14

Hasta hace poco tiempo atrás se aceptaba que solamente los compuestos neutros y apolares

eran capaces de penetrar los fosfolípidos de las membranas, sin embargo, actualmente se sabe

que las especies iónicas son también capaces de difundir a través de las membranas biológicas.

Esto se explicaría por la formación de pares iónicos lipofílicos neutros provenientes de drogas

ionizadas (Neubert, 1989).

Basado en todos los antecedentes previos, en el presente estudio de tesis se trabajó con el

producto de hidrólisis (H-100Q) obtenido de las saponinas contenidas en un extracto acuoso de

quillay (EUD). Se demostraron por primera vez los efectos analgésicos y antiinflamatorios del

EUD, QA, y dos de sus derivados (ME) y (MO), en 2 modelos de dolor térmico validados

internacionalmente en ratones. Se evaluó además la seguridad de la administración oral de QA y

ME. Además y con el fin de determinar la permeabilidad a través de membranas en especial a

través de la BHE de las muestras, se determinaron el Log P para QA y el Log D para ME y MO.

Los resultados esperados en este estudio, permitirán en el futuro comprobar la factibilidad de

utilizar la corteza de quillay como fuente de nuevos agentes analgésicos, y de esta manera

proporcionar un valor agregado a esta especie autóctona, para cuya producción Chile cuenta con

ventajas comparativas únicas.

Hipótesis y objetivos

15

2. HIPÓTESIS

El extracto acuoso obtenido desde la biomasa de Q. saponaria, además de su principal

sapogenina (ácido quillaico) y sus derivados metilado y oxidado, presentan efecto analgésico

frente al dolor agudo y crónico, y además muestran efecto antiinflamatorio mediante la

inhibición de edema y extravasación plasmática.

El ácido quillaico y su éster metilado presentan efecto tóxico agudo y reacciones

adversas en ratones de laboratorio.

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivos generales:

Obtener, la sapogenina mayoritaria a partir del EUD

Demostrar los efectos analgésicos y antiinflamatorios del EUD, QA, y dos de sus

derivados (ME y MO)

Determinar la toxicidad aguda de QA y ME

3.2. Objetivos específicos

1. Optimizar la obtención del H-100Q a partir del EUD

2. Aislar y purificar QA en forma eficiente a partir del H-100Q. Cuantificar el QA en

el H-100Q

3. Determinar el efecto analgésico vía tópica e i.p.de EUD, QA y derivados (en caso

de disponer de cantidad suficiente)

4. Demostrar el efecto antiinflamatorio vía i.p. de QA y derivados

5. Evaluar la toxicidad aguda y reacciones adversas, vía oral, de QA y derivados (en

caso de disponer de cantidad suficiente).

6. Determinar el grado de hidrofobicidad relativa de QA y derivados (Log P) (en

caso de disponer de cantidad suficiente).

Metodología estudio químico

16

4. METODOLOGÍA

4.1. Estudio Químico

4.1.1. Optimización de la obtención del H-100Q a partir del EUD

Se reprodujo una metodología propuesta por (Palatnik de Sousa, 2004). Ésta consistió en

hidrolizar el EUD (20 g) calentando bajo reflujo con ácido sulfúrico (2 N) durante 1 h. Al cabo

de ese tiempo la solución se tornó rojiza y se produjo un precipitado. Esta mezcla de geninas fue

filtrada, obteniéndose un sólido color rojo-café el cual se secó en la estufa y se guardó en

desecadora; el rendimiento del producto de hidrólisis fue menor al 29%. Con el objetivo de

optimizar el rendimiento del producto de hidrólisis se modificó la metodología anterior y es así

como se evaluaron dos metodologías distintas:

1. Se pesaron 20 g del EUD y se mezclaron con una solución acuosa de 500 mL de HCl al

9%. Se llevó a ebullición por calentamiento a reflujo durante 3 h. El sólido remanente se filtró al

vacío, se lavó con abundante agua y se llevó hasta sequedad en estufa para calcular rendimiento.

2. Se pesaron 20 g del EUD y se mezclaron con una solución acuosa de 500 mL de HCl al

18%. Se llevó a ebullición por calentamiento a reflujo durante 2 h. El sólido remanente se filtró

al vacío, se lavó con abundante agua y se llevó hasta sequedad en estufa para calcular

rendimiento.

4.1.2. Aislamiento y purificación del ácido quillaico desde el H-100Q

El H-100Q fue sometido a un fraccionamiento en columnas cromatográfícas (CC) de sílica gel

60. La muestra a fraccionar (5,6 g) se mezcló con 6,0 g de sílica gel y se homogenizó con ayuda

de acetona en un mortero.

Una vez que el disolvente se volatilizó, el sólido se secó en estufa hasta completa sequedad. A

continuación la muestra se homogenizó en un mortero y se hizo pasar por un tamiz, originando

la “cabeza” de la CC.

Por otra parte, se pesó una cantidad de sílica gel 60 al menos 5 veces mayor a la utilizada para

formar la “cabeza” con el fin de dar origen al cuerpo de la CC y cuya altura fue de 11, 6 cm, se

agregó un papel filtro sobre la frica y se conectó la columna a un matraz Kitasato. A

Aislamiento, purificación, cuantificación de QA

17

continuación se mezcló el cuerpo con diclorometano (DCM) y se agregó en forma de papilla a

la columna. Una vez que este proceso se realizó, se esperó que la sílica gel decantara y que su

superficie fuese plana. Recién en ese momento se añadió vacío para eliminar completamente el

DCM, compactar la sílica y dejar la columna seca.

Luego se agregó un segundo papel filtro, seguido de la cabeza, y se homogenizó con ayuda de

presión mecánica y vacío (sin solvente). Una vez que la superficie de la cabeza no presentó

irregularidades, se agregó un tercer papel filtro y algodón.

Para eluir la primera fracción se activó el sistema de vacío, se agregaron 200 mL de fase móvil

(DCM) y cuando la columna ya no eluyó más se cortó el vacío. La columna fue eluida

primeramente con DCM y posteriormente con mezclas de DCM: EtOAc para finalizar con

EtOAc (100%). El volumen de elución fue de 200 mL.

Las distintas fracciones se monitorearon por medio de cromatografías en capa fina (CCF),

usando un patrón ácido quillaico para detectar las fracciones ricas en este triterpenoide y

revelando con p-anisaldehído sulfúrico (PAS), el medio de desarrollo de las CCF fue de DCM:

EtOAc (1:1). Aquellas fracciones ricas en el posible ácido quillaico (Q2) se reunieron en una y

se les eliminó el disolvente mediante un rotavapor. Todas las CCF fueron realizadas en las

mismas condiciones señaladas en este párrafo.

Las fracciones que contenían el Q2 fueron sometidas a un nuevo fraccionamiento en una

segunda CC de Sephadex LH-20. Con este fin fueron disueltas en una mezcla de HEX: DCM:

MeOH (6:2:1) y esta misma mezcla fue utilizada para eluir la CC.

Las dimensiones de la CC fueron las siguientes: altura de 33,5 cm y un diámetro interno

aproximado de 4,6 cm. La muestra (195 mg) fue agregada a la CC disuelta en 20 mL de fase

móvil saturada con muestra. Se recolectaron aproximadamente 60 fracciones de eluyente, cada

una de un volumen de aproximadamente 40 mL. Cada fracción recolectada se monitoreó

mediante CCF y se identificaron las fracciones ricas en Q2. Dichas fracciones se reunieron en

una y se concentraron a presión reducida, siendo sometidas a una tercera CC en Sephadex LH-

20 bajo las mismas condiciones de la segunda CC. De esta forma se obtuvo 17 mg de Q2.


18

Después de comprobar que Q2 corresponde a ácido quillaico (QA) (4.1.4.), el procedimiento

descrito en este punto fue repetido al menos 6 veces con el fin de reunir la cantidad necesaria de

Q2 para los ensayos farmacológicos y la obtención de derivados.

4.1.3. Determinación de la pureza de Q2

Para determinar la pureza de Q2 aislado se utilizó un CLAE Waters 600 con detector fotodiodo

Waters 996 y una columna Purospher STAR (LiChro CART 250x4 RP-18 (5 µm) y eluyendo

con acetonitrilo: ácido ortofosfórico 0,1% v/v = 60:40 con un flujo de 1,0 mL/min.

4.1.4. Identificación de Q2 mediante métodos espectroscópicosPara la elucidación estructural de los compuestos en estudio se usaron técnicas de resonancia

magnética nuclear (RMN), comparando los datos obtenidos con los de la literatura. Como se

verá en los resultados Q2 fue identificado como QA.

4.1.5. Cuantificación de QA en el H-100Q por CLAE

Utilizando como patrón secundario el ácido quillaico aislado e identificado, se obtuvo la curva

de calibración y a partir de ésta, se determinó el porcentaje de QA presente en el H-100Q (ver

Figura Nº 5).

Figura Nº 5. Curva de calibración de ácido quillaico área vs concentración (ppm)

Preparación de derivados a partir de QA

19

4.2. Preparación de derivados a partir del QA

A partir de QA con un 95% de pureza, se prepararon mediante reacciones de metilación y

oxidación los compuestos metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato (ME) y metil 4-

nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato (MO) respectivamente (Honda et al., 2000). Los disolventes

utilizados para las reacciones de semisíntesis fueron destilados previamente a su utilización (la

parte experimental de este objetivo fue realizado por la Dra. Maité Rodríguez).

(A) Éster metílico del ácido quillaico (ME)

En un balón se colocaron 200 mg de QA (0,41 mmol) y DMF 10,3 mL). A esta solución a 0o C

se le añadió MeI: 25 µL, 0,41 mmol, 1 equivalente y Cs2CO3:401 mg, 1,23 mmol, 3

equivalentes. La mezcla de reacción se dejó bajo agitación durante 45 min y luego fue

concentrada a presión reducida. El producto obtenido fue purificado en CC de gel de sílice,

CH2Cl2: EtOAc 1:1, para dar el compuesto metilado ME (metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-

12-en-28-oato).

(B) Oxidado del éster metílico del ácido quillaico (MO)

En un balón se colocaron 100 mg de ME (0,199 mmol) con 9,7 mL de acetona en un baño a 0o

C durante 20 min con agitación constante fue añadido el reactivo de Jones

(CO3 en H2SO4) (0,54 mL/mmol sustrato; 1,75 mL) hasta que el color de la solución cambió de

verde a pardo. La mezcla se mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante 10 min.

Para eliminar el exceso del reactivo de Jones fue añadido 2-propanol (10 mL) y la acetona fue

evaporada a presión reducida. Luego se añadió agua destilada (20 mL) y esta mezcla acuosa fue

extraída tres veces con EtOAc; 10 mL. El extracto fue lavado tres veces con agua (10 mL) y tres

veces con solución acuosa saturada de NaCl; 10 mL.

La fase orgánica fue secada sobre Na2SO4 y filtrada. El filtrado fue concentrado a presión

reducida para dar un residuo que fue purificado en columna CC de gel de sílice (CH2Cl2: EtOAc

2:1) para obtener el compuesto MO (metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato).

Determinación del coeficiente de reparto de QA, ME y MO

20

4.3. Determinación del coeficiente de reparto de QA, ME y MO

Con el objetivo de conocer el grado de lipofilicidad de QA, se realizó la determinación del Log

P, el cual suele expresarse como coeficiente de partición de un compuesto entre dos fases

inmiscibles entre sí, una fase polar (acuosa) y una no polar (orgánica) en equilibrio (Comini et

al., 2006).

En el caso de un ácido débil (HA) esta situación se puede representar en la siguiente ecuación:

HA H+ +A - en medio ácido

En un medio ácido, HA representa al fármaco no disociado, la ecuación anteriormente descrita

se desplaza hacia la izquierda, de manera que un ácido débil en un medio ácido está

prácticamente no disociado y por lo tanto apto para penetrar barreras celulares. Toda vez que el

pH del medio es inferior al pKA de la droga, predomina la fracción no ionizada de los ácidos y

la ionizada de las bases. Lo contrario sucede cuando el pH es superior al pKA.

Esto puede explicarse mediante la ecuación de Henderson- Hasselbalch:

Para un ácido débil: pH = pKa + Log⟦ ⟧⟦ ⟧

El concepto de reparto de una sustancia en 2 fases inmiscibles como octanol y agua (ambas

fases en estado de saturación con la contrafase) se puede representar en el equilibrio, de acuerdo

a la Fórmula Nº 1:

Formula N 1 = P octanol =( )( )

P octanol: representa el grado de lipofilicidad de una sustancia

C: corresponde a la concentración de la sustancia ya sea en la fase acuosa o en octanol

Para poder determinar esta característica fisicoquímica de una sustancia, es necesario

previamente preparar 2 fases opuestas: una solución tampón a pH fisiológico (fase acuosa), y

una solución de octanol (fase apolar). De acuerdo con la metodología


21

señalada por Lide et al. (2003), la determinación del log P se lleva a la práctica en soluciones

saturadas en las contrafases de octanol y solución tampón pH 7,4.

4.3.1. Preparación solución tampón

Para la solución buffer fosfato pH 7,4; se prepararon soluciones acuosas de NaOH (0,1 M) y

KH2PO4; (0,1M) (Lide, 2003). En un matraz se mezclaron 50 mL de solución de la solución de

KH2PO4 con 39,1 mL de la solución de NaOH. Posteriormente, se ajustó a pH 7,4 lo que se

verificó con un peachímetro. Esta solución fue guardada en refrigeración a 5ºC, para ser

utilizada en un plazo máximo de 1 semana.

Como se verá más adelante, no se pudo determinar el Log P de ME y MO, por lo tanto se

determinó el Log D, utilizando el programa Chemaxon ® (versión libre). Para corroborar los

datos experimentales obtenidos con QA se calculó el Log D de esta última sapogenina. En

términos prácticos Log D se determina en medio acuoso a pH 7,4 vs octanol y para una

determinada sustancia es similar a Log P.

4.3.2. Preparación de soluciones saturadas

Se prepararon soluciones saturadas de octanol y de una solución tampón pH 7,4. Con este fin, se

agregaron en un matraz Erlenmeyer 10 mL de octanol y 10 mL de dicha solución tampón. El

matraz se selló en forma rigurosa con papel parafilm y tapa. Luego se sometió a agitación

controlada y constante a una temperatura de 37º C durante 24 h. Se separaron las fases mediante

suave centrifugación (1500 rpm/1,5 min).

Finalmente, se recolectaron las fases en forma separada y se guardaron a 5º C.

Las fases así obtenidas fueron las siguientes:

Solución tampón pH 7,4 saturada con octanol

Octanol saturado con solución tampón pH 7,4.


22

4.3.3. Preparación de las soluciones patrones de las muestras

En una balanza analítica se pesaron cantidades exactas en mg de QA, ME y MO y se llevaron a

un matraz volumétrico. Para la preparación de la solución de QA se utilizó etanol. Para ME y

MO se agregó previamente un volumen de octanol necesario para su disolución, proceso que se

favoreció con agitación en un baño de ultrasonido, luego se completó el volumen con etanol

debido a la dificultad de inyectar octanol en el CLAE. Las soluciones fueron protegidas de la

luz cubriendo el matraz con papel aluminio. En las Tablas Nº 1 a 3 se presenta la metodología

de la preparación de las soluciones patrones de QA, ME y MO y los resultados después del

análisis por CLAE.

En la Tabla Nº1 se describe el método de la preparación de la solución patrón de QA en etanol

y las lecturas de los tiempos de retención (Tr= tiempo de retención) de las áreas

correspondientes a las 3 inyecciones realizadas en el CLAE, con las cuales se calculó el

promedio de áreas.

Tabla Nº 1. Tiempo de retención y áreas bajo la curva obtenidos desde los cromatogramas del CLAE de

la solución patrón de ácido quillaico

Compuesto Masa Volumen(mL)

Concentración InyeccionesCLAE

Tiempo deretención (min)

Área

QA 4,10 mg 2 mLetanol

2,05mg / mL

1 5,177 27451342

2 5,148 27487205

3 5,126 27392664

promedio 27443737

QA= ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico

En la Tabla Nº 2 se describe la preparación de la solución patrón de ME en octanol la que

posteriormente fue diluida en etanol, además del Tr y las áreas correspondientes a las 2

inyecciones realizadas en el CLAE, con las cuales se calculó un promedio. Debido a que se

realizó posteriormente una dilución con etanol las aéreas deben ser multiplicadas por 2, para así

obtener las concentraciones reales obtenidas de ME.


23

Tabla Nº 2.Tiempo de retención y áreas bajo la curva obtenidos desde los cromatogramas del CLAE de

la solución patrón del derivado metilado del ácido quillaico

ME = metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato*Corresponde a la mitad de la concentración y área debido a la dilución con etanol (50:50)

En la Tabla Nº 3 se describe la preparación de la solución patrón de MO en octanol la que

posteriormente fue diluida en etanol, además del Tr y las áreas correspondientes a las 2

inyecciones realizadas en el CLAE, las que fueron promediadas. Debido a que se realizó

posteriormente una dilución con etanol, cada una de las aéreas debe ser multiplicada por 2, para

así obtener las concentraciones reales obtenidas de MO.

Tabla Nº 3. Tiempo de retención y áreas bajo la curva obtenidos desde los cromatogramas del

CLAE de la solución patrón del derivado oxidado del éster metilado del ácido quillaico

MO = metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato*Corresponde a la mitad de la concentración y área debido a la dilución con etanol (50:50)

4.3.4. Procedimiento utilizado para la determinación del Log P de QA, ME y MO.

Se prepararon dos soluciones (solución A y B) de concentraciones conocidas para cada una de

las muestras disueltas en octanol, que fue la fase que solubilizó completamente las muestras. A

continuación se colocaron en dos tubos de ensayo de 10 mL, con tapa rosca y sello.

A continuación, se agregó a cada tubo un volumen similar y exacto de la solución tampón pH

7,4 (saturada). Esta mezcla se agitó en vórtex. Los tubos con las soluciones A y B, se pusieron


*Concentración InyeccionesCLAE


*Área

ME 4,29 mg 5 mLetanol

*0,86mg/mL

1 26,003 *461883

2 25,975 *462948

promedio *462415


*Concentración InyeccionesCLAE


*Área

MO 4,17 mg 5 mLEtanol

*0,83mg/mL

1 28,329 *2006822 27,498 *205082

promedio *202882


24

en un baño de agitación durante 24 h a 37 ºC. Luego de transcurrido este tiempo, los tubos se

dejaron reposar durante 5 min y luego, se sometieron a una leve centrifugación (1500 rpm;

1,5min).

Se extrajo la fase acuosa ubicada en la parte inferior de cada tubo, la cual se inyectó al CLAE.

Para la fase octanol, se tomó una alícuota la cual se diluyó en igual volumen de etanol. Se tuvo

la precaución de que el volumen extraído de ambas fases, fuera obtenido del seno de la solución.

Además, se evitó contaminar esta muestra con volúmenes de la otra contrafase.

4.4. Determinación de los compuestos por CLAE en las contrafases

4.4.1. Para desarrollar la técnica se utilizaron los siguientes equipos y materiales:

Se utilizó un cromatógrafo de alta precisión Waters 600 con bomba cuaternaria,

acoplado a un detector de arreglo de diodos Waters 996, controlados por un computador con el

programa Millenium. Este cromatógrafo se encuentra en el laboratorio de Cinética y

Fotoquímica de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile

Columna ODS Hypersil (20 cm × 4,6 mm) de Hewlett Packard

Fase móvil: acetonitrilo/solución ácido fosfórico (60:40). Flujo: 0,8 mL / min a 20º C

Volumen de inyección: 20 μL

4.5. Estudio farmacológico: Evaluación de la toxicidad aguda, analgésica y

antiinflamatoria

4.5.1. Ensayos farmacológicos in vivo

Las pruebas in vivo se realizaron en la Unidad de Pruebas Biológicas del Instituto de Salud

Pública (ISP), que proporcionó una parte de los animales de experimentación y en el

Laboratorio de Neurofarmacología, Sede Norte (Facultad de Medicina), U. de Chile,

que proporcionó el resto de los animales. Las evaluaciones in vivo quedaron sujetas a los

rendimientos de cada uno de los derivados obtenidos a partir de QA.

Ensayos farmacológicos in vivo, toxicidad aguda oral

25

Los estudios de toxicidad aguda fueron llevados a cabo respetando las recomendaciones éticas y

de trato humanitario, elaboradas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de Ciencias

Médicas en Ginebra, que incluyen criterios de reducción, refinamiento y reemplazo (Mrad de

Osorio, 2006), que son aplicadas por la unidad de pruebas biológicas del ISP.

Los ensayos de analgesia se realizaron de acuerdo a las recomendaciones entregadas por la guía

del manejo cuidadoso y ético de animales de laboratorio en las investigaciones relacionadas con

dolor experimental aprobado por el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina de la

Universidad de Chile (Miranda et al., 2001; Lolas, 2007).

Inmediatamente finalizados los ensayos se procedió a sacrificar los animales de forma

humanitaria por medio de dislocación cervical (luxación atlanto- occipital) (Muralidhara et al.,

2001; Mrad de Osorio, 2006).

Se utilizó el ibuprofeno (IBU) como fármaco de referencia para todas los ensayos

algesiométricos (Miranda et al., 2001), excepto en los ensayos de edema y extravasación donde

se utilizó como patrón de comparación QA respecto de sus derivados.

4.5.2. Animales de experimentación

Para las pruebas de toxicidad aguda se utilizaron ratones albinos de la cepa CF-1 de 6 a 7

semanas de edad, 3 machos y 3 hembras de 18 a 21 g de peso promedio para cada muestra a

evaluar. Para las pruebas de analgesia se utilizaron solamente machos de 30g de peso promedio.

Los ratones fueron aclimatados durante la semana previa al estudio, en ciclos de luz-oscuridad

de12/12 h y a una temperatura ambiental de 22 º C 1 con humedad controlada (Muralidhara et

al., 2000). Durante el período del ensayo los animales se mantuvieron en ayunas y agua ad

libitum 18 h antes del estudio, confinados en jaulas adecuadas, y alimentados con concentrados

estándar y agua a discreción.

Ensayo del latigazo de la cola tópico

26

4.6. Evaluación de la toxicidad aguda vía oral en ratones. Determinación de la dosis

letal cincuenta (DL50) y reacciones adversas (RAM)

La prueba de toxicidad aguda quedó sujeta a los rendimientos de cada uno de los derivados del

ácido quillaico. Por esta razón fueron evaluados QA y ME, a la dosis única máxima de 1g/kg,

que es la cantidad más alta que se pudo disolver (en 0,4 mL). Ambos compuestos se

administraron por vía oral, con sonda orogástrica de 4 french para recién nacidos, a 6 ratones en

ayuno de 12 h, en bolos de 0,4 mL disueltos en el vehículo de administración como es la goma

arábiga salina al 5%, (Delporte et al., 2003). El MO, se obtuvo con muy bajo rendimiento, de

modo que no se pudo evaluar su toxicidad aguda vía oral.

4.6.1. Los animales se distribuyeron aleatoriamente de la siguiente forma:

Un grupo control, al que se les administró solamente el vehículo

Un grupo tratado, al que se les administró las muestras disueltas en el vehículo en dosis

de 1 g/kg.

Los resultados fueron analizados mediante el método estadístico Kruskall- Wallis, seguido del

método estadístico de comparaciones múltiples de Dunnett, usando el software estadístico

Graph-Pad Prism versión 5.00 para Windows, Graphpad Software, San Diego, California, USA

(version libre). Se consideraron significativos todos aquellos resultados que presentaron un p ≤

0,05 comparando los grupos tratados con los controles.

4.6.2. Evaluación del efecto analgésico tópico en ratones frente al dolor agudo mediante el

ensayo del LC vía tópica

El ensayo del LC consistió en que al animal ligeramente restringido en sus movimientos por un

dispositivo plástico especial, se le aplicó calor radiante en forma de un haz de luz en el tercio

proximal de la cola, por medio de un algesiómetro automático (U. Basile, Comerio, Italia), el

que midió el tiempo en que el animal fue capaz de soportar el

calor (tiempo de latencia), lo que es proporcional al efecto analgésico de la muestra (Miranda et

al., 2001; 2007).

Ensayo del latigazo de la cola tópico

27

Para este ensayo, cada una de las muestras en estudio (EUD, QA, ME y MO) fueron aplicadas

en forma tópica a un grupo de 6 ratones machos adultos, los cuales fueron ambientados a las

condiciones del laboratorio 2 h previas al ensayo. IBU se utilizó como fármaco de referencia.

Los animales se distribuyeron aleatoriamente en los grupos asignados para cada muestra.

Se determinaron y compararon los valores de los tiempos de latencia de los animales antes de

aplicar las muestras en estudio (T basal) y después de aplicar las muestras (T experimental), por

lo que, cada animal fue su propio control. Previamente se seleccionaron los animales que dieron

un tiempo de latencia basal de 2 a 3 s ajustando la intensidad de la luz.

Las muestras fueron evaluadas en distintas concentraciones con el fin de determinar la relación

dosis efecto y solubilizadas en una solución del DMSO al 5 %. Se construyeron los gráficos %

MPE vs Log de la concentración (Log mg %, p/v), con al menos 4 concentraciones y a partir de

dichos gráficos, se determinó la CE50. Con el objetivo favorecer la absorción de las muestras en

la piel de la cola del animal, estas fueron colocadas en un tubo de ensayo en donde fue

introducida la cola por un tiempo de 3 min y posteriormente, se esperó 5 min antes de realizar la

evaluación algesiométrica.

Se estableció un tiempo de corte de 8 s para evitar daño en la piel del animal. El tiempo de

latencia basal (T basal) se registró 2 veces con una diferencia de 15 min entre cada medición y

se promediaron los valores registrados.

El tiempo de latencia experimental (T experimental), que es el tiempo de reacción después de la

administración de las diferentes muestras fue determinada nuevamente y se calculó la diferencia

con respecto al T basal ( latencia). En base al T basal y T

experimental se calculó el % del máximo efecto posible (MPE o % de antinocicepción) de

acuerdo a la Fórmula Nº 2:

Formula N 2: % MPE =( )( ) × 100

Ensayo de la plancha cliente i.p.

28


método estadístico Dunnett de comparaciones múltiples, usando el software estadístico Graph-

Pad Prism versión 5.00 para Windows, Graphpad Software, San Diego, California, USA


0,05 comparando los T basal y T experimental.

4.7. Evaluación del efecto analgésico vía intraperitoneal (i.p.). Ensayo de la PC

Este ensayo consistió en la aplicación a los animales de calor radiante sobre la superficie plantar

de las extremidades del ratón, con este fin los ratones se colocaron en una placa metálica

llamada plancha caliente. Ésta consiste en un dispositivo metálico que contiene agua circulante

a 44º C que es alimentado por mangueras plásticas desde un baño maría a temperatura regulable

(Miranda et al., 2007), en cuya superficie es depositado el ratón para observar su tolerancia al

calor.

Los animales de experimentación fueron ambientados a las condiciones del laboratorio 2 h

previas al ensayo y fueron distribuidos aleatoriamente en los grupos asignados para evaluar el

efecto analgésico de cada muestra.

Según lo descrito Le Bars et al.( 2001) el estímulo térmico desencadenado por la placa caliente

a 44º C provoca en el ratón la activación de nociceptores periféricos correspondientes al tipo Aδ

y también reflejos mediados por estructuras supra espinales, lo que se evidencia en la

observación de signos de dolor como son lamerse los cojinetes de las extremidades posteriores o

anteriores, incluso saltar de la plancha caliente. Se midió también el tiempo de latencia de la

respuesta o el tiempo que demoró cada ratón en responder al estímulo doloroso. El punto de

corte se fijó en el tiempo máximo de exposición al animal al efecto térmico de 30s en sus patas.

lo que corresponde al punto de corte de la prueba (tiempo de corte o cut- off).

Se determinaron y compararon los valores de los tiempos de latencia de los animales antes de

aplicar las muestras en estudio (T basal) y después de aplicar las muestras (T experimental), por

lo que cada animal fue su propio control. Se seleccionaron los animales que presentaron un T

basal menor a 30 s de reacción al estímulo térmico, el resto de los ratones fue retirado del

estudio. El IBU se utilizó como fármaco de referencia.

Ensayo de la plancha cliente i.p.

29

Luego de este primer ensayo se dejaron descansar los animales durante 30 min y se repitió el

experimento. El mismo grupo de ratones, se sometió a la prueba de dolor luego de 30 min de la

administración i.p. de la muestra en estudio y se registró la diferencia del T basal y T

experimental ( latencia). Los tiempos de latencia fueron transformados en % MPE o % de

antinocicepción de acuerdo con la Fórmula Nº 2. Ver punto 4.6.2.

Para cada muestra evaluada se construyó la correspondiente curva efecto vs Log dosis, con al

menos 4 dosis y a partir de dichos gráficos se determinó la DE50.


método estadístico de Dunnett de comparaciones múltiples, usando el software estadístico



0,05 comparando los T basal y T experimental.

4.8. Evaluación del efecto analgésico por vía i.p. frente al dolor muscular esquelético

agudo y crónico frente al CFA

El ensayo consistió previamente en determinar el T basal por el método de la PC a 6 ratones

controles y un grupo de 6 ratones por cada muestra. Fueron seleccionados los ratones que

presentaron un tiempo de latencia de menos de 30s. Inmediatamente después se les administró

en forma intraplantar el CFA a los ratones de ambos grupos, a la dosis de 50 µg/mL en un

volumen de 30 µL de solución salina en la pata derecha, lo que indujo una reacción inflamatoria

aguda localizada en la pata inyectada (Larson et al., 1986). Este ensayo se realizó en forma

aguda y crónica, siendo el ensayo agudo aquel en que el CFA fue administrado por única vez 24

h antes de la administración de la muestra en estudio (QA o ME o MO) y en el ensayo crónico

el CFA fue administrado por única vez 7 días antes de administración de la muestra en estudio.

Tanto para el ensayo agudo como crónico frente a CFA, se procedió a determinar el T basal por

el método de la PC de los 6 ratones de los grupos controles y tratados antes de la administración

de la muestra en estudio y después de 30 min de administrada dicha muestra por vía i.p. se

determinó el T experimental. Se registró la diferencia entre los T basal y T experimental (

latencia) y se calculó % MPE o % de antinocicepción de acuerdo a la Fórmula Nº 2.Ver punto

4.6.2. Las dosis evaluadas se muestran en la Tabla Nº 9.

Ensayo de la plancha cliente/ CFA

30

En ambos ensayos (agudo y crónico) se utilizó IBU como fármaco de referencia a la dosis que

correspondió a su DE50 (97,1 mg/kg) determinada en el ensayo de la PC (Cheppudira, 2006;

Fernández-Dueñas et al., 2007).






4.9. Evaluación del efecto antiinflamatorio i.p. en base a la determinación de la

extravasación de plasma y edema frente a PC/CFA

En este ensayo no se utilizó IBU como fármaco de referencia debido a los bajos valores

obtenidos con este fármaco en el ensayo de PC/CFA, por lo tanto los resultados obtenidos con

los derivados fueron comparados con los valores obtenidos con QA.

4.9.1. Evaluación de la extravasación de plasma inducido por CFA

Para cuantificar la albúmina que extravasa desde el tejido inflamado, por el aumento de

permeabilidad vascular, fue llevada a cabo la técnica descrita por Udaka et al. (1970), que

utiliza el AE, que se fija a la albúmina (proteína mayoritaria del plasma), formando un complejo

proteína/colorante, que se mide espectrofotométricamente a 620 nm (Fernández-Dueñas et al.,

2007).

Para poder llevar a cabo este ensayo, fue necesario previamente montar el método y además

construir la curva de calibración del AE para determinar la concentración del colorante como

medida de extravasación (Figura Nº 6).

Ensayo frente al dolor crónico músculo esquelético y CFA

31

0.000 0.002 0.004 0.006 0.0080.0

0.2

0.4

0.6

0.8

y =119x -0.05R2 = 0.999

concentración de azul de Evans (mmol/L)

abso

rban

cia

Figura Nº 6. Absorbancia vs concentración de azul de Evans

Para realizar el ensayo con AE, se dispuso de un grupo de 6 animales controles y 6 tratados para

cada muestra, los cuales fueron inyectados con CFA, 24 h y 7 días antes de las muestras (ver

punto 4.8). En el ensayo agudo después de la 24 h de aplicado el CFA, se administró la muestra

en estudio vía i. p. al grupo de animales tratados. En el ensayo crónico después de 7 días de

aplicado el CFA, se administró la muestra en estudio al grupo de animales tratados.

Posteriormente tanto los grupos tratados como grupo control, fueron anestesiados con tiopental

sódico i. p. a la dosis de 60 mg/kg y después de 5 min se procedió a inyectarlos en el plexo

retroorbital con AE (50 mg/kg), en volúmenes de 0,1 mL en solución salina (Planas, 1995).

Los animales controles y tratados, fueron sacrificados por dislocación cervical 15 min después

de la inyección de AE. Inmediatamente se procedió a la amputación (a 0,5 cm de la articulación

tibiotarsal) de ambos miembros posteriores tanto de los grupos de ratones tratados como

controles, y la extremidad posterior (izquierda) no inyectada con CFA sirvió de autocontrol. A

continuación dichas extremidades, fueron colocadas en

Cálculo de la inhibición de la extravasación

32

tubos eppendorf de 1,5 mL, donde se incubaron en 1 mL de formamida a temperatura ambiente

durante 24 h. Posteriormente, las muestras fueron filtradas y la concentración de AE extraído se

determinó por espectrofotometría a una absorbancia de 620 nm (Cheppudira, 2006; Fernández-

Dueñas et al., 2007).

Cálculo de la extravasación de plasma

Para determinar el incremento neto de la proteína plasmática se utilizaron las Fórmulas 3 y 4:

Formula N 3: EXC =(% .([ ] . )–% .([ ] . ))% .[ ] . × 100

EXC = % promedio de la extravasación de los animales controles

ext. clt ═ extremidad sin CFA, contralateral

ext.cfa ═ extremidad con CFA, derecha

Formula N 4: EXT =(% prom.([AE]ext.cfamt)–% prom.([AE] ext.clt))% prom.[AE]ext.clt ×100

EXT = % promedio de la extravasación de los animales tratados

ext. clt ═ extremidad sin CFA, contralateral

ext. cfamt ═ extremidad con CFA y muestra

Para determinar el efecto inhibitorio sobre la extravasación del plasma producido por la muestra

se utilizó la Fórmula Nº5: (IEX)

Formula N 5: IEX. =( – ) × 100

IEX= % promedio de la inhibición de la extravasación

EXC = % promedio de la extravasación de los animales controles

EXT = % promedio de la extravasación de los animales tratados

Cálculo del edema frente al CFA

33






4.9.2. Determinación del edema frente a CFA (ensayo crónico)

Para cuantificar el efecto antiedematoso se empleó la técnica volumétrica de desplazamiento

conocida como pletismografía (Larson, 1986, modificado por Damas y Remacle – Volón, 1992)

que usa el pletismómetro Ugo – Basile 7150. En este ensayo se utilizaron grupos de 24 h y otro

de 7 días con ratones controles y tratados para cada muestra, a los cuales se les administró CFA

intraplantar en la extremidad derecha.

A los animales controles a los cuales sólo se les administró CFA, la extremidad izquierda quedó

como autocontrol. A las 24 h y 7 días después del CFA, utilizando el pletismómetro, se

determinó el volumen de la extremidad contralateral sana (Vclt izquierda) utilizándose como

valor basal, y la segunda correspondió a la medida del volumen de la extremidad con CFA.

A los ratones tratados 24 h y 7 días después de haber administrado el CFA, se les administró la

muestra en estudio por vía i.p. y después de 30 min se realizaron nuevamente las mediciones de

volumen.

La determinación del porcentaje de edema promedio de los animales controles y de los animales

tratados fueron calculados según las Fórmulas Nº 6 a y b:

Formula N 6 a: EDc =(% . – % . )% . × 100

EDc.= % promedio edema de los animales controles

vcfa ═ volumen extremidad con CF

vclt ═ volumen extremidad contralateral

Determinación de la inhibición del edema frente a CFA

34

Formula N 6 b: EDt =(% . / – % . )% . × 100

EDt = % promedio edema de los animales tratados

vcfa/mt ═ volumen extremidad con CFA y muestra

vclt ═ volumen extremidad contralateral

La Fórmula Nº 7: fue utilizada para determinar el % promedio de inhibición del edema de las

muestras en estudio.

Formula N 7: EID =(% – % )% × 100

EID = % promedio de la inhibición del edema

% EDc ═ promedio de los edemas de los animales controles

% EDt ═ promedio de los edemas de los animales tratados






Resultados y discusión

35

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1. Estudio Químico

5.1.1. Obtención del H-100Q a partir del EUD

Fue optimizado el rendimiento de la obtención del H-100Q con una disminución del tiempo de

hidrólisis. El rendimiento neto de la hidrólisis al usar HCl al 18% fue del 39 %, siendo éste

mayor que el rendimiento obtenido que cuando se utilizó HCl al 9% (rendimiento 30%).

Además, el tiempo de hidrólisis fue menor, disminuyendo de 3 a 2 horas. Por lo tanto, ésta fue

la metodología utilizada para la obtención del H-100Q.

Las condiciones de hidrólisis del EUD utilizadas en este tesis fueron distintas a las descritas

previamente por otros autores que emplearon el ácido sulfúrico (2N) para dicha hidrólisis y un

tiempo de una hora (Palatnik de Sousa et al., 2004). Dicho ácido presenta un fuerte efecto

oxidante lo que puede dar origen a artefactos y por esta razón se utilizó HCl.

5.1.2. Obtención y purificación del Q2 desde el H-100Q

Respecto del fraccionamiento del H-100Q mediante sucesivas CC de silicagel 60 y finalmente

en CC de Sephadex LH-20, es importante señalar que la composición química de cada una de

las fracciones ricas en sapogeninas fue monitoreada por CCF, tal como se detalló en la

metodología. Se observó un precipitado en las fracciones que eluyeron con HEX, DCM y

MeOH (6:2:1) que se presentó en forma de agujas blancas muy delgadas que fue soluble en

EtOAc.

En la CCF de dicho precipitado se observó una mancha de color morado con un RF = 0,7;

idéntica a la de un patrón de QA usando como fase móvil DCM: EtOAc (1:1) y revelando con

PAS, (ver Figura Nº 7). El patrón de QA utilizado fue identificado previamente mediante

completos estudios espectroscópicos en el laboratorio de productos naturales de esta Facultad.


36

1. 2. 3. 4.

Figura Nº 7. Cromatografía en capa fina de los diferentes extractos y fracciones de la CC de Sephadex

LH-20: 1. EUD; 2. H-100Q; 3. Fracciones de la columna cromatográfica de Sephadex LH-20 desde las

cuales precipitó el Q2; 4. Patrón de QA. Sistema de desarrollo empleado: DCM: EtOAc (1:1) y revelado

con p-anisaldehído-ácido sulfúrico.

QA= ácido quillaico; EUD = extracto acuoso de saponinas; H-100Q: producto de hidrólisis.

El Q2 obtenido desde el H-100Q fue identificado por completos estudios espectroscópicos

como el ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico (QA) y su peso molecular es de

486, 33 g/mol (Rodríguez et al., 2011).

5.1.3. Determinación de la pureza de QA por CLAE

Los resultados demostraron que el QA aislado presentó un tiempo de retención de 11,8 min y

una pureza de 95% (anexo Nº 1).

5.1.4. Cuantificación de QA en el H-100Q por CLAE

A partir de la curva de calibración de QA (Figura Nº 5) se determinó que este compuesto está

presente en un 68,9 % en el H-100Q (Anexo Nº 2).

5.2. Preparación de derivados a partir del QA

(A) Éster metílico del ácido quillaico (ME)

Por medio de la metodología previamente descrita en el punto 4.2. (A), fueron obtenidos a

partir de QA, 190 mg (95% de rendimiento) del compuesto identificado como metil 3,16-

dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato (ME), con un peso molecular de 500,3 g/mol (ver


37

Figura Nº 8). Desde el punto de vista químico la idea de obtener el éster metílico del ácido

quillaico persigue un objetivo de factibilidad en la purificación, pues con derivados metilados se

hace menos complicada la purificación por CC empleando gel de sílice en comparación con los

derivados que mantienen el carboxilo libre.

QA ME

Figura Nº 8. Estructura química de QA y de ME.

QA = ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico; ME = metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato

(B) Oxidado del éster metílico del ácido quillaico (MO)

Por medio de la metodología previamente descrita en el punto 4.2 (B), fueron obtenidos 25 mg

(25% de rendimiento) del compuesto identificado como metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-

oato (MO), con un peso molecular de 468, 3 g/mol.

El compuesto denominado MO se formó mediante la oxidación no selectiva de ME empleando

el reactivo de Jones. Inicialmente se obtuvieron 2 derivados, los cuales se formaron mediante la

oxidación no selectiva de ME empleando el reactivo de Jones (Figura Nº 9). Los aldehídos

fueron rápidamente oxidados para producir ácidos carboxílicos, ya que estos tienen un protón

que puede ser extraído con facilidad durante la oxidación, lo que los diferencia de las cetonas.

Las oxidaciones de Jones ocurrieron con rapidez a temperatura ambiente y se obtuvieron buenos

rendimientos (Honda et al., 2000). Posteriormente estos compuestos fueron separados mediante

CC sucesivas, aislándose finalmente el compuesto denominado MO.


38

ME MO

Figura Nº 9. Reacción no selectiva de ME con el reactivo de Jones

ME = metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato; MO = metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-

oato.

5.3. Determinación del coeficiente de reparto de QA, ME y MO

5.3.1. Cálculo del coeficiente de reparto para QA

El cálculo del coeficiente reparto de QA, se hizo de acuerdo a lo descrito en el punto 4.3.4. El

porcentaje de QA recuperado desde la fase octanol fue de un 97,8 % ± 0,1 y de la fase tampón

fosfato un 2,2 % ± 0,1.

Para la determinación de la constante de partición (P) se utilizó la Fórmula Nº 1 (ver punto

4.3):

P =,, = 45,1

Donde 2,03 mg/ mL corresponde a la concentración en la fase octanol y 0,045 mg/ mL a la

concentración en de QA en la fase tampón fosfato.

Por lo tanto el valor final del Log P es igual a 1,65 (valor experimental).

Para corroborar los datos experimentales obtenidos con QA se utilizó el programa Chemaxon ®,

los datos teóricos indican que el grupo ácido de la molécula de QA tiene un pKA de 4,61, es

decir, su KA es de 4,07 x 10-4. Por otra parte, el medio utilizado fue tamponado a pH 7,4; lo que

corresponde a una concentración de H+ de 2,5 x107. El Log D para QA fue de 1,68 a pH 7,4;


39

este valor teórico respalda los resultados encontrados en el cálculo experimental (1,65). En el

Anexo Nº 3 se muestran los valores de Log D según las variaciones de pH.

El cromatograma CLAE de la solución patrón de QA en octanol y su espectro de absorción UV

a 210 nm se muestran en el Anexo Nº 4. El tiempo de retención correspondiente al patrón de

QA fue de 5,11 min.

En el cromatograma CLAE de la solución de octanol se observó un peak a los 5,11 min y cuyo

espectro de absorción a 210 nm correspondió al de QA. En el cromatograma CLAE de la

solución recuperada desde la fase tampón fosfato, se observó un pequeño pick a los 5,11 min y

cuyo espectro de absorción a 210 nm correspondió al de QA.

5.3.2. Cálculo del coeficiente de reparto de ME

En relación a la determinación del Log P de ME, los resultados determinan que ME no está

presente en la fase tampón, este derivado al ser un ácido muy débil (densidad de carga - 6,81) no

tiene grupos ionizados, los cuales serían solubles en esta fase acuosa. Como ya se describió

anteriormente el cálculo del Log P mediante la Fórmula Nº 7, requiere del conocimiento de los

valores de distribución del compuesto en la fase octanol y en la fase tampón fosfato a pH 7,4.

En el caso de ME, sólo fue detectado en la fase octanol, no recuperándose nada de la fase

tampón fosfato, por lo tanto no se pudo calcular el Log P de ME.

El Log D de ME, fue obtenido mediante datos teóricos entregados por el programa

Chemaxon®. Según estos datos el Log D de ME a pH 7, 4 corresponde a 4,54; lo que indica que

es una molécula altamente hidrofóbica. En el Anexo Nº 5 se muestra los valores de Log D

según las variaciones de pH.

El cromatograma CLAE de la solución patrón de ME presentó un peak con un tiempo de

retención de 27 min, además se muestra su espectro de absorción a 210 nm (Anexo Nº 6).

Con respecto del cromatograma CLAE de ME en octanol, se pudo observar que apareció un

pick a 27 min y cuyo espectro de absorción a 210 nm correspondió a ME. Sin embargo, el

cromatograma de la fase el tampón fosfato, no evidenció la presencia de este derivado.

Análisis teórico de las estructuras predominantes de QA, ME y MO según pH

40

5.3.3. Cálculo del coeficiente de reparto para MO

Respecto de la determinación del Log P de MO, los resultados muestran que no se detectó por

CLAE el MO en la fase tampón, al ser un ácido muy débil (densidad de carga - 6,79) no tiene

grupos ionizados. Como ya se señaló anteriormente, el cálculo del Log P de acuerdo a la

Fórmula Nº 7 requiere del conocimiento de los valores de distribución del compuesto en la fase

octanol y en la fase tampón fosfato a pH 7,4; en el caso de MO, éste sólo fue detectado en la

fase octanol, no recuperándose nada de la fase tampón fosfato, por lo tanto no se pudo calcular

el Log P para MO.

El Log D para MO, fue obtenido con el programa Chemaxon®, según los valores entregados

por el programa este valor corresponde a 5,67 a pH 7,4 de manera que se puede concluir que

MO es una molécula altamente hidrofóbica. En el Anexo Nº 7 se muestran los valores de Log D

según las variaciones de pH.

5.4. Análisis teórico de las estructuras predominantes de las moléculas en estudio (QA,

ME y MO) según el pH

Según Chemaxon ® la estructura predominante en la fase octanol pH 7,5 de QA: se representa

en la Figura Nº 10.

Figura Nº 10. Estructura molecular predominante de ácido quillaico en fase octanol.

Al comparar los valores experimentales con los datos entregados por el programa, se puede

concluir que la molécula de QA, estaría predominantemente en su forma no ionizada en un

rango de pH de 1 a 7,5. En un rango de pH de 7,5 a 13,5 estaría en un 97,8 % repartida en la

fase octanol en su forma no ionizada y en un 2,2 % en la fase tampón fosfato, en su forma

ionizada. Según el programa Chemaxon ® son 5 las posibles estructuras del QA y la especie


41

predominante es la Nº 1 en un rango de pH de 1 a 7,2 aproximadamente y es altamente

hidrofóbica. La micro especie N° 2 se distribuiría entre un pH 2,0 hasta más de 12.

Las micro especies Nº 3, 4 y 5 se distribuirían en un pH entre 12 y 13 aproximadamente, siendo

4 y 5 las menos abundantes (Anexo Nº9).

Según Chemaxon ® la estructura predominante en la fase octanol de ME se representa en la

Figura Nº 11.

Figura Nº 11. Estructura molecular predominante del éster metilado en la fase octanol.

La molécula estaría principalmente en su forma no ionizada en el rango de pH de 1 a 11

aproximadamente. Es una sola la posible estructura de ME, denominada micro especie Nº 1, y

es altamente hidrofóbica (Anexo Nº 9).

Finalmente, según Chemaxon ® la estructura predominante en la fase octanol de MO se

representa en la Figura Nº 12.

Figura Nº 12. Estructura predominante del derivado oxidado en la fase octanol


42

La molécula de MO estaría principalmente en su forma no ionizada en todo el rango de pH de 1

a 14. Es una sola la posible estructura de MO, la micro especie Nº 1 y es altamente hidrofóbica

(Anexo Nº 10).

La mayoría de los triterpenos pentacíclicos como los ácidos ursólico, oleanólico y betulínico son

ácidos débiles con un pKa aproximadamente de 5. Desde el punto de vista farmacocinético esto

significa que necesitan un medio a pH ligeramente ácido para que el equilibrio químico se

desplace a su forma no ionizada y puedan atravesar las membranas biológicas (Du y Chen,

2009). Debido a los resultados aquí obtenidos en la determinación de Log D sumado a la gran

similitud estructural entre QA, ME, MO y el ácido oleanólico, es factible predecir con certeza,

que estos triterpenoides pueden atravesar las membranas como por ejemplo la BHE y por lo

tanto absorberse tanto por vía tópica como oral, alcanzado con relativa facilidad

concentraciones detectables en el LCR de los ratones en estudio.

Resultados de la toxicidad aguda vía oral

43

5.5. Estudio farmacológico in vivo

5.5.1. Toxicidad aguda vía oral y RAM

QA y ME no presentaron toxicidad aguda evidente a la dosis evaluada (1 g/kg), no se

produjeron muertes de los animales ni RAMs en los 14 días de observación. MO no pudo ser

testeado ya que no fue obtenido en cantidad suficiente.

Con el fin de determinar si se produjo un cambio significativo en los pesos de los animales, se

calcularon las medianas de los pesos de ratones machos y hembras, desde el día 1 al 14 del

estudio, como se puede observar, en la Tabla Nº 4.

Tabla Nº 4. Evolución de las medianas de los pesos (g) de los ratones controles y tratados con

ácido quillaico y su derivado metilado en el estudio de toxicidad aguda vía oral durante 14 días

Días QAmedianas pesos

machos± SEM

QAmedianas pesos

hembras± SEM

MEmedianas pesos

machos± SEM

MEmedianas pesos

hembras± SEM

Controlesmedianas pesos

machos± SEM

Controlesmedianas pesos

hembras± SEM

1 19,5 ± 3,0 19,3 ± 2,8 18,7 ± 2,8 19,1 ± 2,8 19,8 ± 3,0 21,2 ± 3,32 20,5 ± 3,0 21,8 ± 3,5 19,6 ± 2,9 20,5 ± 3,1 20,5 ± 3,0 21,8 ± 3,23 21,0 ± 3,2 22,3 ± 3,3 20,4 ± 3,0 21,0 ± 3,1 20,6 ± 3,2 22,3 ± 3,44 23,5 ± 3,4 22,6 ± 3,4 20,8 ± 3,1 21,1 ± 3,2 24,2 ± 3,6 20,7 ± 3,15 27,6 ± 4,0 25,3 ± 3,8 26,1 ± 3,9 23,8 ± 3,6 28,7 ± 4,0 24,2 ± 3,66 28,5 ± 4,2 25,7 ± 3,9 23,5 ± 3,6 22,6 ± 3,4 29,5 ± 4,7 23,7 ± 3,57 29,3 ± 4,6 26,7 ± 4,0 23,6 ± 3,4 23, 0 ± 3,3 30,1 ± 4,1 24,2 ± 3,78 30, 0 ± 4,7 26,6 ± 3,9 28,5 ± 3,9 26,2 ± 4,0 30,6 ± 5,1 23,9 ± 4,09 30,9 ± 5,0 26,7 ± 3,8 29,8 ± 4,4 27,2 ± 3,8 32,0 ± 4,7 26,7 ± 3,110 31,2 ± 5,4 26,4 ± 3,5 30,1 ± 4,5 25,7 ± 4,0 31,2 ± 5,0 26,4 ± 3,911 31,8 ± 5,5 26,8 ± 3,6 30,4 ± 4,6 27,9 ± 4,1 34,0 ± 5,1 25,3 ± 3,912 30,2 ± 4,6 26,5 ± 3,6 31,6 ± 4,7 29,5 ± 4,6 33, 0 ± 5,0 26,5 ± 3,613 30,0 ± 4,4 27,7 ± 4,0 32,0 ± 4,8 29,8 ± 5,0 37,6 ± 5,6 27,0 ± 4,014 30,3 ± 4,3 27,8 ± 4,2 32,4 ± 4,9 30,2 ± 4,2 37,8 ± 5,8 27,5 ± 4,2

QA = ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico; ME = metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato; p ≥ 0,05 con respecto al control; SEM= error medio estándar.

Mediante el método estadístico de Wilcoxon se compararon los pesos de los animales tratados y

los animales controles no observándose diferencias estadísticamente significativas, (p ≥ 0,05)

para ambos grupos (Hollander y Wolfe, 1973).

Toxicidad aguda vía oral y latigazo de la cola i.p.

44

Tanto los animales tratados como los animales controles, fueron observados permanentemente

durante las primeras 4 h posteriores a la administración de las muestras, para pesquisar los

primeros signos de toxicidad (efectos adversos) que podrían aparecer tempranamente y que se

describen en la planilla especialmente diseñada para consignar las RAMs (Anexo Nº 12).

Los ratones fueron observados diariamente en su comportamiento, condiciones generales,

variaciones de su peso corporal. Además de los aspectos de la piel y pelaje, alteraciones de

mucosa ocular y ótica, alteraciones podales, tamaño del abdomen, aspecto de genitales, cavidad

bucal, signología digestiva, respiratoria y neurológica. No se observaron alteraciones atribuibles

a RAMs. Los pesos fueron medidos y registrados diariamente.

Aunque que la biodisponibilidad de estos compuestos es relativamente buena, su toxicidad es

prácticamente nula a la dosis evaluada. Estos resultados permiten concluir que QA y ME no son

tóxicos por vía oral a las dosis de 1 g/kg.

5.5.2. Efecto analgésico frente al dolor agudo mediante el ensayo del LC por vía tópica

Los resultados se presentan en Tabla Nº 5 y en la Figura Nº 13. De acuerdo a los resultados

obtenidos es importante destacar que todos los efectos fueron dosis dependiente y que el EUD

fue el que presentó una mayor potencia relativa y una eficacia mayor que el fármaco de

referencia. Le sigue en potencia relativa el triterpenoide ME (Arrau et al., 2010).

Latigazo de la cola vía i.p.

45

Tabla Nº 5. Resultados de la evaluación del efecto analgésico tópico mediante el ensayo del latigazo de

la cola del EUD, ácido quillaico y derivados

QA= ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico; ME = metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato;MO = metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato; EUD = extracto seco de saponinas; IBU = ibuprofeno.*Resultadossignificativos p ≤ 0,05 con respecto al control ; SEM= error medio estándar.

A partir de los gráficos presentados en la Figura Nº 13 se determinaron las CE50 y en la Tabla

Nº 6 se presentan las CE50 de cada una de las muestras y del IBU y además de la potencia

relativa (P.R.).

A. B.

Concentraciónmg % p/v

Logconcentración

QA% MPE ± SEM

MO% MPE± SEM

ME% MPE± SEM

EUD% MPE ± SEM

IBU% MPE ± SEM

0,023 -1,68 *19,0 ± 4,50,075 -1,12 *23,6 ± 4,00,75 -0,12 4,7 ± 1.9 *32 ± 5,02,25 0,35 *15,3 ± 4.0 *14,0 ± 4,0 7,0 ± 1,62,81 0,44 9,4 ± 3,95,60 0,748 *23 ± 4,97,50 0,87 *23 ± 2.9 *23,3 ± 6,2 *43,0 ± 4,5 *20,7 ± 4,611,25 1,051 *37,3 ± 2,318,75 1,27 *35,0 ± 6,022,5 1,35 *34,3 ± 3.1 *47,9 ± 4,1 *43,8 ± 4,3 *43,0 ± 3,037,5 1,57 *41,7 ± 9,556,3 1,75 *44,6 ± 6,475,0 1,87 *74,1 ± 8,7 *54,6 ± 5,3


46

Figura Nº 13. A. Máximo posible efecto (% MPE) del QA y EUD vs log concentración frente al latigazo

de la cola vía tópica. B. Máximo posible efecto (% MPE) del ME, MO e IBU vs log concentración frente

al latigazo de la cola vía tópica. QA = ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico; ME = metil

3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato; MO = metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato; IBU =

ibuprofeno.

Tabla Nº 6. Resultados de la determinación de CE50 del efecto analgésico y de la potencia relativa (P.R.)

del EUD, ácido quillaico, éster metilado, derivado oxidado e Ibuprofeno frente al dolor agudo vía tópica

en el ensayo del latigazo de la cola

QA= ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico; ME = metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato; MO = metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato; EUD = extractoseco rico en saponinas; IBU = ibuprofeno.

Existen evidencias que confirman que frente al ensayo del LC, los AINES presentan baja

potencia, siendo este ensayo sensible a las sustancias opiáceas (Lavich et al., 2005). Se ha

demostrado que el efecto de los opiáceos se ve incrementado, si estos son administrados

localmente mediante infiltración, de esta forma alcanzan mayores concentraciones que cuando

ellos son administrados sistémicamente (Le Bars et al., 2011; Lavich et al., 2005).

Sin embargo, Dogrul et al., (2007), señala que los compuestos activos frente al LC pueden

actuar mediante la disminución de PGE2 liberadas en la cola por el efecto térmico del rayo

infrarrojo focalizado en la piel, las que sensibilizarían al receptor VR1 a una respuesta

canalizada a través de la activación de cascadas intracelulares desencadenadas por el calor. Por

lo tanto, las diferencias en la capacidad antinociceptiva de las muestras en el modelo del LC,

Muestra CE50 (mg% p/v) Potencia relativa Ranking

EUD 27,9 ± 0,7 1,5 1

ME 32,8 ± 0,6 1,3 2

IBU 42,5 ± 0,7 1,0 3

QA 69,3 ± 0,8 0,6 4

MO 77,3 ± 0,5 0,5 5


47

podrían estar relacionadas con la capacidad inhibitoria de las COXs y adicionalmente por la

inhibición de los receptores periféricos.

Con respecto de los excelentes resultados obtenidos con ME, se puede postular que debido a su

condición de liposolubilidad atravesaría fácilmente la barrera de la piel de la cola del animal,

este hecho también se refuerza por lo descrito por Paduch et al. (2007), que afirma que

compuestos terpenoides apolares son utilizados con éxito en la cosmética para promover la

absorción de otras sustancias a través de la piel. La explicación de este hallazgo se basa en que

provocarían alteraciones reversibles en la capa lipídica del estrato córneo, facilitando así su

absorción.

Tal y como se describió en el punto 4.6.2, las muestras en estudio se disolvieron en una solución

de DMSO al 5 %, y se sumergió la cola del animal por un tiempo de 3 min, facilitando así la

penetración de la muestra a través del estrato córneo de la piel. Las drogas que son absorbidas a

través de esta vía pueden traspasar fácilmente la barrera de la piel, proceso favorecido por este

compuesto (Patrick, 2009). El DMSO por si mismo se absorbe rápidamente a través de la piel,

al ser una sustancia altamente liposoluble, de baja toxicidad sistémica para los animales en esta

concentración.

El uso de DMSO en los ensayos tópicos en esta tesis, podría explicar en parte los buenos

resultados en la actividad analgésica, ya que aunque las muestras no fueron infiltradas, todas

ellas y especialmente EUD y ME demostraron un efecto analgésico destacable (Arrau et al.,

2010), es importante remarcar también que ambos derivados mejoraron su efecto analgésico con

respecto a QA, esto puede observarse claramente en los gráficos de la Figura Nº 13.

Cabe destacar los importantes resultados obtenidos con EUD que corresponde al extracto

acuoso rico en saponinas cuya sapogenina mayoritaria es QA. La mezcla de saponinas

triterpénicas puede mostrar un efecto analgésico sinérgico frente a este modelo.

La relación de la actividad analgésica de las muestras evaluadas con la potencial inhibición de

PGE2 se ve respaldada por los resultados obtenidos por Rodríguez et al, 2011, ya que en esta

tesis se demostró la actividad antiinflamatoria tópica frente al edema de la oreja del ratón, de

Plancha caliente vía i.p.

48

QA, ME y MO frente a AA y TPA. Está demostrado que el efecto antiinflamatorio y analgésico

pueden tener un mecanismo de acción en común como lo es la inhibición de la PGE2 (Costigan

y Woolf, 2000).

Se consideraron significativos todos aquellos resultados que presentaron un p ≤ 0,05 con

respecto al control negativo.

5.5.3. Efecto analgésico frente al dolor agudo mediante el ensayo de la PC vía i.p.

Estos resultados se expresan en la Tabla Nº 7 y en la Figura Nº 14, donde se muestran los

efectos analgésicos de QA, EUD, ME, MO e IBU frente a la prueba de la PC vía i.p.

Todas las muestras presentaron un efecto analgésico dosis – dependiente. A partir de los

gráficos de la Figura Nº 14 se calcularon las DE50 y el ranking de potencia fue:

MO>QA>EUD>ME> IBU. Contrariamente a los resultados obtenidos frente al modelo del LC,

MO fue el más potente frente a la PC por vía i.p y el IBU mostró la menor P.R. (ver Tabla Nº

7).

QA y EUD, ambos a la dosis de 100 mg/kg, presentaron un efecto del 73,0 % y 70,2 %,

respectivamente. Respecto del fármaco de referencia (IBU) y ME a las dosis de 200 mg/kg

(dosis máxima evaluada), presentaron un 68 y 77,3 % de efecto analgésico, respectivamente.

Respecto de MO, éste demostró un efecto de 90,6 % a 50 mg/kg, dosis máxima utilizada.

Lo que demuestra que el MO fue el compuesto más potente y eficaz en este ensayo (Arrau et

al., 2010).

Ya que los analgésicos centrales son muy activos frente al modelo de la PC, nos hace postular

que uno de los posibles mecanismos de acción inhibitoria de MO sea de origen central mediante

la inhibición de un fenómeno denominado “sensibilización central” (wind-up). Este mecanismo

inhibitorio estaría estrechamente relacionado con la inhibición de la síntesis de PGS,

especialmente de la PGE2 (Costigan y Wolf, 2000) a nivel de estructuras espinales y supra

espinales del SNC de los ratones.


49

Cabe resaltar que el EUD fue la muestra más activa y más potente frente al LC (74,1 % a 75 mg

% p/v), lo que indicaría que podría presentar un mecanismo principalmente de tipo periférico,

sin embargo, la principal sapogenina como lo es el QA, sin embargo, fue más potente en el

ensayo de la PC, lo que nos permite plantear que la sapogenina podría actuar a través de

estructuras centrales debido a sus características farmacocinéticas que le permiten presentar una

mejor absorción a través de membranas.

Por último es importante recordar que en el modelo de dolor térmico utilizado en este estudio

los ratones fueron sometidos a temperaturas de máximo 44°C, temperatura a la cual responden

las fibras Aδ de tipo I (Stander et al., 2005), sin riesgo de dañar la piel del animal. Este hecho

demuestra que este estudio fue llevado a cabo respetando las normas éticas y de buenas

prácticas de laboratorio con animales de investigación.

Se consideraron significativos todos aquellos resultados que presentaron un p ≤ 0,05 con

respecto de los animales controles.

Tabla Nº 7. Resultados de la evaluación del efecto analgésico i.p. mediante el ensayo de la plancha

caliente vía i.p. del EUD, ácido quillaico y derivados.

QA= ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico; ME = metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato; MO = metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato; EUD = extracto acuoso seco rico ensaponinas; IBU = ibuprofeno; * p ≤ 0,05 comparando el tiempo de latencia experimental con respecto delbasal, SEM= error medio estándar.

Dosismg/kg

Log dosis QA% MPE± SEM

MO% MPE± SEM

ME% MPE± SEM

EUD% MPE± SEM

IBU% MPE± SEM

1 0 11,3 ± 6,0%3 0,47 *16,0 ± 4,4% *16,2 ± 9,2% *15,9 ± 3,4%10 1 *33,3 ± 4,4% *40,3 ± 11,4% 2,0 ± 1,0% *31,4 ± 6,9% 5,1 ± 1,2%25 1,39 *67,2 ± 8,7%30 1,47 *61,5 ± 1,9% *18,0 ± 4,4% *43,3 ± 7,7% *24,8 ± 5,5%50 1,69 *90,6 ± 10,0% *44,4 ± 4,0%100 2 *73,0 ± 5,5% *58,4 ± 7,4% *70,2 ± 15,8% *47,0 ± 9,5%200 2,30 *77,3 ± 8,8% *68,0 ± 9,0%


50

A. B.

Figura Nº 14. A. Máximo posible efecto (% MPE) del MO, EUD e IBU en la plancha caliente. B.Máximo posible efecto (% MPE) del QA y ME, en el ensayo de la plancha caliente.

QA = ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico; ME = metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato; MO = metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato; IBU = ibuprofeno.

Tabla Nº 8. Determinación de la DE50 del efecto analgésico i.p. y potencia relativa en el ensayo de la

plancha caliente del extracto seco, Ibuprofeno y ácido quillaico sus derivados.

QA = ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico; ME = metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato; MO = metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato; IBU = ibuprofeno.

5.5.4. Efecto analgésico frente al dolor muscular esquelético crónico (ensayo de PC/CFA)

Se determinó que QA a la dosis de100 mg/kg presentó a las 24 h y 7 días efectos analgésicos de

69,6 % y 68,5 %, respectivamente. Con respecto a MO, a la máxima dosis evaluada (50 mg/kg),

se obtuvo un efecto analgésico de 81,4 % y 78,5 % a las 24 h y 7 días, respectivamente. En este

ensayo MO fue el más eficaz.

Muestra DE50 ( mg/kg) Potencia relativa Ranking

MO 12,2 ± 0,7 7,9 1QA 20,7 ± 0,7 4,7 2EUD 32,8 ± 0,6 3,0 3ME 72,7 ± 0,8 1,3 4IBU 97,1 ± 0,9 1,0 5

Ensayo crónico de PC/CFA

51

Respecto de ME, a dosis igual y superiores a 30 mg/kg a los 7 días, se murieron todos los

ratones y su muerte estuvo acompañada de sintomatología neurológica (torneo, ataxia,

contorsiones abdominales violentas y convulsiones) razón por la cual fue necesario repetir el

ensayo a dosis inferiores a 30 mg/kg. En el ensayo de la PC/CFA en la prueba de 24 h, ME se

evaluó hasta una dosis máxima de 100 mg/kg y se obtuvo un 59,9 % de efecto, sin embargo, 2

ratones de este último grupo presentaron torneo, ataxia, contorsiones abdominales violentas y

convulsiones y finalmente murieron, el resto de los animales se consideraron aptos para

terminar la prueba sin problema.

IBU sódico fue evaluado a 97,1 mg/kg lo que corresponde a su DE50, frente al ensayo de la

PC/CFA (24 h y 7 días), éste fármaco de referencia no presentó efecto analgésico a las 24 horas

y a los 7 días su efecto fue muy leve (14,5 %) en comparación con las muestras en estudio. Este

resultado es muy importante ya que pone en evidencia que la actividad de las muestras en este

ensayo es muy superior al fármaco de referencia, tanto en el estudio agudo como crónico.

Es importante señalar que MO provocó signos de toxicidad en los animales de experimentación

a dosis de 25 y 50 mg/kg en el ensayo crónico, no obstante, no se produjo la muerte de los

animales. ME y MO son molécula apolares y muy liposolubles tanto como es QA (ver punto 5.

3), por lo cual todas tendrían la capacidad de atravesar libremente la BHE. En la literatura se

describe que la mayoría de los triterpenos pentacíclicos como los ácidos ursólico, oleanólico y

betulínico son ácidos débiles con un pKa aproximadamente de 5 (Du y Chen, 2009). Desde el

punto de vista farmacocinético esto significa que necesitan un medio ó pH ligeramente ácido

para que el equilibrio químico se desplace a su forma no ionizada y puedan atravesar las

membranas biológicas.

La ausencia de signos de toxicidad de QA para los ratones en la prueba de CFA de 7 días, podría

explicarse farmacocinéticamente ya que la función ácida de la molécula podría facilitar su

metabolismo y por lo tanto la concentración que alcanza este triterpenoide en el LCR podría ser

menor a la alcanzada por ME y MO, excreción y unión a proteínas (Booth, 2000), además es

importante considerar que el ME y MO pueden ser metabolizados a compuestos más tóxicos

que el original.


52

Sin embargo es importante recordar que en los estudios que tienen por objetivo el

descubrimiento de nuevas moléculas farmacológicamente activas, que sin embargo atraviesan la

BHE y pueden causar problemas de toxicidad en el SNC de los animales de experimentación, se

llevan a cabo ciertas estrategias tales como su ingreso en forma de prodrogas (modificando las

estructuras moleculares) evitando de esta forma sus efectos tóxicos o en forma de fármacos de

liberación prolongada (Patrick, 2009), de tal forma que no se alcancen concentraciones tóxicas

en el LCR.

La vía empleada es muy importante en el efecto farmacológico de una sustancia, en el presente

trabajo para evaluar el efecto analgésico y antiinflamatorio frente al ensayo PC/CFA

empleamos la vía i.p. para QA, ME y MO, ya que a pesar de que la absorción de los fármacos

administrados por esta vía se ve afectada por el efecto de primer paso( lo que puede disminuir

su biodisponibilidad), sin embargo, en términos de tiempo existe la ventaja de que el efecto se

manifiesta más rápido que por otras vías como la oral o subcutánea (Patrick, 2009).

Los resultados se presentan en la Tabla Nº 9.

Todos los efectos fueron dependientes de la dosis. EUD no fue evaluado debido a la falta de

disponibilidad de animales de experimentación. En esta tabla se puede observar que todas las

muestras presentan una importante actividad frente a PC /CFA, destacándose el derivado

oxidado a las 24 h y 7 días con un MPE de 81, 4 y 78,5 % a 50 mg/kg respectivamente, el QA a

100 mg/kg obtuvo un MPE de 69,5 y 68,5 % respectivamente, sin embargo el fármaco de

referencia solamente a la dosis de 97, 1 mg/kg presenta un efecto de 14,5 %.

ME fue tóxico a 10 mg/kg, sin embargo, a esta misma dosis este derivado presentó importantes

efectos analgésicos, presentando un MPE a las 24 h y 7 días de 20,6 y 28,8 %, respectivamente.


53

Tabla Nº 9. Resultados de la evaluación del efecto analgésico i.p. frente al ensayo agudo y crónico deLa plancha caliente/coadyuvante completo de Freund, de ácido quillaico, éster metilado y derivado

oxidado.

QA= ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico; ME = metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato;MO = metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato; EUD = extracto seco rico en saponinas; IBU = ibuprofeno.*p≤0,05comparando los animales tratados y los animales controles;† Dosis a las cuales los ratones manifestaron signos detoxicidad vía i. p; ♦DE50 en el ensayo de la PC, SEM= error medio estándar.

5.5.5. Determinación de la extravasación de plasma frente a CFA en modelos agudos ycrónicos

Las muestras evaluadas (QA, MO y ME) a las 24 h y 7 días no presentaron efecto inhibitorio de

la extravasación, tal como se observa en la Tabla Nº 10. Las modificaciones estructurales

realizadas a QA no lograron traducirse en un efecto antiinflamatorio en términos de disminuir la

extravasación y por el contrario, se puede concluir que hubo un aumento de la extravasación en

presencia de ambos derivados.

Ya se planteó anteriormente que los fenómenos de edema y extravasación pueden ocurrir de

forma independiente, ya que si bien los mecanismos que los producen pueden ser comunes, la

intensidad de los eventos inflamatorios y sus consecuencias en el territorio vascular son

diferentes. Para producir extravasación y edema al mismo tiempo el estimulo inflamatorio debe

ser muy intenso, como es el que produce la administración del CFA, por otro lado para inhibir la

extravasación, el compuesto tiene que ser más activo que el que produce un efecto anti

edematoso solamente ( Romero, 2003). En este estudio se pudo comprobar que efectivamente se

Dosismg/kg

QA24 h± SEM

QA7 días± SEM

MO24 h± SEM

MO7 días± SEM

ME24 h± SEM

ME7 días± SEM

IBU24 h± SEM

IBU7días±SEM

0,3 9,5 ± 0,7

1 *15,9 ± 2,0

3 *21,3 ± 7,3 *12,9 ± 3,0 4,4 ± 7,0 *16,2 ± 2,0 *13,5 ± 1,4 *25,6 2 ± 3,0

10 *30 ± 11,5 *15, 3± 5,2 *16,0 ± 2,0 *23,4 ± 4,0 *20,6 ± 2,0 *28,8 ± 3,4

♦12,1 ♦23,5 ± 5,0 ♦34,8 ± 6,0

♦20,5 ♦33,33 ± 5,6 ♦47,80 ± 9,0

25 *34,5 ± 8,0 *51,1 ± 8,0

30 *65,0 ± 11,4 *53,4 ± 8,0 *36,6 ± 6,0 †D. tóxica50 *81,4 ± 14,0 *78,5 ± 12,0

♦72,7 †D. tóxica

100 *69,6 ± 7,0 *68,5 ± 11,0 *59,9 ± 11,0† D. tóxica

†D. tóxica

♦97,1 -22,6 ± 6,5 *14,5 ± 2,0

Resultados de la inhibición de la extravasación frente a CFA

54

puede producir un cierto grado de inhibición del edema pero no de la extravasación

necesariamente con las mismas muestras.

Tabla Nº 10. Resultados del % de inhibición de la extravasación frente a coadyuvante completo de

Freund vía i.p. para ácido quillaico y derivados

Muestra Promedio extravasaciónanimales controles

± SEM

Promedio extravasaciónanimales tratados

± SEM

% Inhibición promedioextravasación

± SEM

Dosis mg/kg 24 h 7 días 24 h 7 días 24 h 7 días

QA 100 0,045 ± 0,07 0,033 ± 0,03 0,137 ± 0,02 0.,06 ± 0,03 -417 ± 4,5 - 133 ± 5,0

QA 30 0,046 ± 0,08 0,040 ± 0,04 0,293 ± 0,05 0,185 ± 0,04 -660 ± 3,2 - 876 ± 4,0QA 10 0,049 ± 0,06 0,033 ± 0,03 0,472 ± 0,09 0,264 ± 0,05 -1296 ± 5,0 - 7560 ± 3,6

QA 3 0,042 ± 0,05 0,035 ± 0,03 0,287 ± 0,06 0,253 ± 0,04 -705 ± 4.3 - 1357 ± 4,2

MO 50 0,055 ± 0,04 0,045 ± 0,04 0,56 ± 0,08 0,236 ± 0,05 -1330 ± 5.3 - 764 ± 3,0

MO 25 0,056 ± 0,05 0,040 ± 0,05 0,54 ± 0,07 0,373 ± 0,08 -1342 ±6,0 - 9933,8 ± 4,8

MO 10 0,055 ± 0,04 0,044 ± 0,04 0,56 ± 0,07 0,545 ± 0,10 -1412±5,5 - 14656 ± 10MO 3 0,06 ± 0,050 0,045 ± 0,05 0,284 ± 0,06 0,400 ± 0,08 -1095±4,8 - 967 ± 5, 0

ME 100 0,085 ± 0,06 0,035 ± 0,03 0,87 ± 0,2 †muertos -20506± 11 † muertos

ME 30 0,060 ± 0,04 0,033 ± 0,03 0,284 ± 0,05 †muertos -826±2,3 †muertos

ME 10 0,056 ± 0,05 0,045 ± 0,05 0,334 ± 0,06 0 ,471 ± 0,09 -972 ± 4,2 - 725 ± 2,8

ME 3 0,067 ± 0,05 0,37 ± 0,040 0,338 ± 0,86 0,460 ± 0,08 -913 ±4,6 - 1125,0 ± 5,0

ME 1 0.055 ± 0,05 no se hizo 0,805 ± 0,2 no se hizo -141±1,2 no se hizoME 0,3 0.066 ± 0,06 no se hizo 0,02 ± 0,01 no se hizo -39,25±11 no se hizo

QA= ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico; ME = metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato; MO = metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato; EUD = extracto seco rico en saponinas; IBU =ibuprofeno.*p≤0,05 comparando los animales tratados y los animales controles; †ratones muertos por éstermetilado; SEM= error medio estándar.

5.5.6. Resultados de la determinación de edema frente a CFA en modelos agudos y

crónicos

Los resultados se presentan en la Tabla Nº 11. Por la complejidad de dicha tabla se destacaron

con negrilla los efectos antiedematosos significativos. Ambos derivados tuvieron un efecto de

disminución del edema sólo a los 7 días después de inyectado el CFA. Honda et al. (2000 a y b),

describen que algunos derivados del ácido oleanólico recientemente obtenidos demostraron la

importancia del grupo carboxilo en su estructura para que se manifieste un efecto

antiinflamatorio, para dichos triterpenoides así como para sus derivados, este autor destaca un

mecanismo relacionado con la inhibición directa de la producción de PGS. Si bien estos ensayos

Resultado de la inhibición del edema frente al CFA

55

fueron in vitro, demostraron la importancia de mantener ciertos grupos estructurales con

respecto a otros en la actividad antiinflamatoria. En este estudio, sin embargo QA fue inactivo y

ambos derivados demostraron leve actividad antiedematosa.

ME a la dosis de 10 mg/kg presentó un efecto inhibitorio del edema significativo de un 18 % a

los 7 días. MO presentó un % de inhibición del edema significativo del 26,7 % a la dosis de 50

mg/kg a los 7 días.

Es importante señalar que QA administrado por vía i.p. no disminuyó el edema a ninguna de las

dosis evaluadas. En base a esto antecedentes se puede concluir que ambos derivados tienen una

leve capacidad antiinflamatoria en este modelo, sin embargo ME no pudo ser evaluado a dosis

más altas por su toxicidad.

Tabla 11. Resumen de los resultados del % de inhibición de edema vía i. p. frente al coadyuvante

completo de Freund para ácido quillaico, éster metilado y derivado oxidado

MuestraDosis

% edema animales controles± SEM

% edema animales tratados± SEM

% inhibición edema animales tratados± SEM

mg/kg 24 h 7 días 24 h 7 días 24 h 7 días

QA 100 54,4 ± 10,9 69,2 ± 15,2 172,0 ± 34,4 172,7 ±2 6,0 -72,32 ± 11,0 - 31,8 ± 5,0QA 30 51,8 ± 9,3 76,9 ± 19,2 182,0 ± 27,3 190,9 ± 28,0 -81,7± 12 - 25,0 ± 4,0

QA 10 50,8 ± 10,1 76,9 ± 18,4 230,0 ± 34,5 200,0 ± 31,2 -92,4 ± 13,9 - 44,2 ± 6,0

QA 3 53,3 ± 10,1 84,7 ± 17,8 200,0 ± 30,0 175,0 ± 26,2 -102±15,3 - 47,5 ±7,0ME 100 53,4 ± 11,5 †muertos 166,6 ± 3,0 †muertos -42,9 ± 6,4 †muertos

ME 30 50,2 ± 10,6 †muertos 181,8± 27,3 †muertos -20,3 ± 3,0 †muertos

ME 10 50,3 ± 7,5 63,6 ± 19,0 163,6 ± 24,5 73,0 ± 11,0 -17,3 ± 3,0 *18,0 ± 3,0

ME 3 58,6 ± 12,8 65,2 ± 16,3 175,0 ± 26,3 81,8 ± 12,3 -12,6 ± 2,0 8,7 ± 2,0ME 1 56,5 ± 12,4 6 0,6 ± 18,1 90,0 ± 13,5 no se hizo -8,0 ± 1,2 no se evaluó

ME 0,3 56,6 ± 9,4 63,3 ± 14,5 82,0 ± 12,3 no se hizo -7,8 ± 1,2 no se evaluó

MO 50 50,5 ± 11,1 68,0 ± 20,0 154,5± 23,0 80,0 ± 12,0 -60,0± 9,0 *26,7 ± 4,0MO 25 51,7 ± 15,5 76,0 ± 22,0 125,0 ± 18,0 63,6 ± 9,5 -56,2±8,0 *20,0 ± 3,0

MO 10 50,7 ± 12,6 75,4 ± 19,6 90,0± 14,0 89,0 ± 13,3 -34 ± 5,1 *15,2 ± 3,0

MO 3 51,4 ± 11,3 74,6 ± 18,6 67,0 ± 10,0 7 0,0 ± 10,4 -30,0 ± 5,0 *14,0 ± 2,1

QA= ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico; ME = metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-

oato; MO = metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato; EUD = extracto seco rico en saponinas; IBU =

ibuprofeno, *p≤0,05 comparando los animales tratados y los animales controles; †ratones muertos por éster

metilado; SEM= error medio estándar.

Conclusiones

56

6. CONCLUSIONES

El producto de hidrólisis obtenido desde el extracto acuoso proveniente de la biomasa

de Quillaja saponaria Mol. es una buena fuente de ácido quillaico, tritepenoide con excelente

actividad analgésica aguda y crónica.

Se confirmó la hipótesis de que el ácido quillaico pudo ser obtenido con un mayor

rendimiento, a partir de un extracto acuoso estandarizado, obtenido de la biomasa de Quillaja

saponaria, mediante la hidrólisis con HCl al 18 %. Se logró disminuir el tiempo de hidrólisis

del extracto acuoso rico en saponinas (EUD) de 3 a 2 h.

Se aisló y caracterizó el ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico (QA), a

partir del producto de hidrólisis. Se demostró por cromatografía líquida de alta eficiencia que

este triterpenoide es la sapogenina mayoritaria del producto de hidrólisis.

La determinación del Log P para ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico

(QA), y Log D para metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato (ME), y MO (metil 4-

nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato), a pH 7,4, demostró que son triterpenoides muy

liposolubles.

Se evaluó la toxicidad aguda del ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-28-oico

(QA) y metil 3,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato (ME), por vía oral. Se demostró

que ambos triterpenoides no presentan toxicidad aguda por esta vía y RAMs a la dosis de 1

g/kg.

Se manifestaron signos de toxicidad aguda con sintomatología neurológica y resultado

de muerte de todos los ratones que recibieron por vía i. p. el metil 3 ,16-dihydroxy-23-

oxoolean-12-en-28-oato (ME), a las dosis de 30 y 100 mg/kg en la prueba de CFA de 7 días. La

toxicidad de MO (metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato), fue menor, lo que se puede

explicar por diferencias en sus parámetros farmacocinéticos.

Conclusiones

57

El extracto seco rico en saponinas en el ensayo del latigazo de la cola fue el que

presentó una mayor potencia relativa y una eficacia mayor que el fármaco de referencia y ambos

derivados, lo que nos llevaría a concluir, que el extracto rico en saponinas, actuaría

principalmente por vía periférica. Sin embargo el ácido 3,16-dihidroxi-23-oxoolean-12-en-

28-oico (QA), la principal sapogenina, actuaría más bien por vía central, ya que fue muy activa

frente a la plancha caliente.

Las modificaciones estructurales realizadas al ácido quillaico elevaron la potencia del

derivado MO (metil 4-nor-3,16-dioxoolean-12-en-28-oato) en el ensayo de la plancha caliente.

Este derivado fue prácticamente 8 veces más potente que el ibuprofeno sódico, este fármaco de

referencia fue el de menor potencia relativa.

Las modificaciones estructurales realizadas al ácido quillaico mejoraron levemente el

efecto antiedematoso, en el modelo crónico frente al coadyuvante completo de Freund. Ambos

el metil 3 ,16-dihydroxy-23-oxoolean-12-en-28-oato (ME), (10 mg/kg) y (metil 4-nor-3,16-

dioxoolean-12-en-28-oato) (MO) (50 mg/kg), presentaron una disminución significativa de 18

% y 26,7 % respectivamente, sin embargo, ambos derivados no inhibieron la extravasación

plasmática.

Los métodos in vivo utilizados en esta tesis permitieron establecer que los triterpenoides

evaluados son analgésicos, al igual que el extracto acuoso rico en saponinas (EUD).

El método in vivo de la prueba la plancha caliente que se utilizó en el presente trabajo

de tesis, avala la utilización de la plancha caliente máximo a 44 ºC, para así evitar producir

injuria térmica en la piel plantar del ratón, sin desmedro de los resultados del ensayo.

Estos resultados justifican futuras investigaciones de los mecanismos de acción de estos

agentes analgésicos y antiinflamatorios, así como particularmente determinar cual/cuales vías de

administración son las más adecuadas.

Referencias

58

7.0. REFERENCIAS

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Anexo 1: cromatograma CLAE para QA

66

8.0 ANEXOS

Anexo1: Cromatograma CLAE para Q2 (= QA), cuyo tiempo de retención fue de 11,8 min

Anexo 2: cromatograma CLAE para H-100Q

67

Anexo 2: Cromatograma CLAE para el H-100Q con los respectivos espectros de absorción UV

Anexo 3: Variaciones teóricas de Log D según pH para QA

68

Anexo 3: Variaciones teóricas del Log D según pH para QA

Anexo 4: Variaciones teóricas de Log D según pH para QA

69

Anexo 4: Cromatograma CLAE de la solución patrón de QA en etanol, triterpenoide que presentó

un tiempo de retención de 5,11 min y su espectro de absorción UV

Anexo 5: Cromatogramas CLAE del reparto de QA

70

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Cromatograma ácido quillaicoreparto en sln. tampón pH 7,4

sat

211 nm

UA

tiempo/ min

Anexo 5: Cromatogramas CLAE del reparto para QA en octanol y tampón fosfato pH 7,4

Anexo 6: Variaciones teóricas del Log D según variaciones del pH para ME

71

Anexo 6: Variaciones teóricas del Log D según pH para ME

Anexo 7: Cromatograma CLAE de la solución patrón de ME

72

Anexo 7: Cromatograma CLAE de la solución patrón deME, este derivado presentó un tiempo deretención 27 min y su espectro de absorción UV.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16211 nm

Cromatograma metilado de ácido quillaico en etanol

UA

tiempo/ min

Anexo 8: Variaciones teóricas del Log D según pH para MO

73

Anexo 8: Variaciones teóricas del Log D según pH para MO

Anexo 9: Pka y distribución teórica de microespecies de QA según pH

74

Anexo 9: Pka y distribución de micro especies de QA según pH

Anexo 10. Pka y distribución teórica de microespecies de ME según pH

75

Anexo 10: Pka y distribución de micro especies de ME

Anexo 11: Pka y distribución teórica de microespecies de MO según pH

76

Anexo 11: Pka y distribución de micro especies de MO

Anexo 12: Planilla de registro de RAM

77

Anexo 12: Planilla de registro de signos clínicos posibles de detectar por RAM

SIGNOS CLINICOS DIAS1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

EVALUACIÓNMUCOSAS

HIPEREMICACIANOTICAPÁLIDAEVALUACIONRESPIRATORIATAQUIPNEASECRECIONESNASALESTOSDISNEAEVALUACIÓNNEUROLOGICATEMBLORESMUSCULARESCONVULSIONESDEPRESIONATAXIAEVALUACIÓNDERMATOLOGICAPRURITOALOPECIAERITEMAEVALUACIÓNDIGESTIVA

VOMITOSDIARREACONSISTENCIAFECALASPECTOGENITALESPESO CORPORALMUERTE

Anexo 13. Publicación en revista Journal of Ethnopharmacology, Diciembre del 2010.

78

Anexo 13: Publicación de trabajo de tesis en la revista Journal of Ethnopharmacology. Diciembre

del 2010.

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