técnicas en diagnóstico de meningitis tuberculosa y farmacogenética

Técnicas en Diagnósticode Meningitis Tuberculosa

Alejo Albornóz

Diagnóstico IndirectoNo investigan presencia del agente en sí, sino la huella que dejó éste al

pasar por su huésped en términos de una respuesta inmune contra el

agente y que indirectamente permite suponer que el agente en cuestión

estuvo presente en el huésped en algún momento.

Diagnóstico DirectoInvestigan la presencia del agente etiológico o, uno de sus componentes.

MicobacteriasPertenecen a la familia deMycobacteriaceae , son bacilos grampositivos aeróbicos obligados, ácido-alcohol resistentes. La fuerza del ácido es una característica de las micobacterias y se detecta en latinción de Ziehl-Neelsen. Las micobacterias son gram-positivos con un alto contenido de G + C

genómico (59-66%). La presencia de ácidos micólicos de cadena larga en la pared celular favorece lafuerza del ácido y justificó la resistencia de las micobacterias.

El géneroMycobacterium comprende más de 120 especies diferentes del complejoM. tuberculosis. Lasbacterias pueden causar enfermedades graves en humanos y animales, tales como la tuberculosis, la

lepra o Micobacteriosis. Debido a su patogenicidad se distinguen los siguientes tres grupos:

M. tuberculosis complex (cepas estrechamente relacionadas):M. tuberculosis

M. bovis ssp. bovis y ssp. capraeM. bovis BCG (Bacilo de Calmette-Guérin)

M. africanumM. canettiiM. microtiM. pinnipedii

NTM (”micobacterias no tuberculosas o atípicas”)

M. lepraeM. lepraevacuna BCG para niños menores de las áreas de riesgo de tuberculosis un año.

M. microti pueden infectar a los roedores con tuberculosis. Desde se han reportado infecciones en humanos, sin embargo, casi no. La cepa patógena humana M. canetii es raro.M. pinnipedii infecta principalmente focas.

Las bacterias de la M. tuberculosis complejo puede crecer en medios de cultivo líquidos y sólidos. Sin embargo, se puede esperar sólo después de seis semanas para el cultivolíquido y ocho semanas para el festival de la cultura debido a la lentitud del crecimiento, con un resultado negativo. Un resultado positivo es posible dentro de dos a cuatrosemanas. Con el Geno Tipo MTBC la diferenciación simultánea de los representantes más importantes de la de M. tuberculosis compleja en tan sólo unas horas.pruebas de resistencia convencional requiere adicionales 12 a 42 días. Los sistemas de pruebas de genética molecular Geno Tipo MTBDR plus y Geno Tipo MTBDR slentregan dentro de un día de la declaración sobre la presencia de resistencia a los antibióticos.

Micobacterias no tuberculosasAdemás de los representantes de M. tuberculosis complejo puede provocar en los seres humanos también no tuberculosas micobacteriosis crónica micobacterias. Comosinónimos también utiliza los siguientes términos: “Las micobacterias no tuberculosas” (MOTT) o micobacterias atípicas.

Las micobacterias no tuberculosas son omnipresentes en el medio ambiente. Ellos pueden ser detectados en las aguas naturales, los musgos, los suelos, sino también en el aguadel grifo. Patógenos oportunistas NTM infecta principalmente las personas que ya tienen una enfermedad de los pulmones o el sistema inmunológico debilitado. Sin embargomicobacteriosis también se producen en individuos sanos. Micobacterias del M. avium compleja causa la tuberculosis, principalmente en pacientes inmunocomprometidos,mientras que M. kansasii , M malmoense y M. xenopi puede ocurrir en personas sanas. Los síntomas clínicos más comunes son la neumonía, las infecciones granulomatosas dela piel y la linfangitis.

NTM se puede cultivar en medios de cultivo líquidos y sólidos. Se puede, debido a su tasa de crecimiento y su capacidad para formar pigmentos, se puede dividir en cuatrogrupos de acuerdo con RUNYON:

Grupo I photochromogen: formación de pigmentos sólo cuando la exposiciónGrupo II skotochromogen: formación de pigmentos con o sin exposiciónGrupo III no hay formación de pigmentosGrupo IV de crecimiento rápido

Ya sea que requiera tratamiento micobacteriosis presente, debe pasar a través del aislamiento en tres ocasiones desde el material del paciente, una diferenciación de especiesfiable y se deciden sobre la base de los síntomas clínicos.

Métodos bioquímicos convencionales consumen mucho tiempo y requieren de personal capacitado y con experiencia. Por lo tanto, los métodos de detección genética molecularson el método de elección. El Geno Tipo Mycobacterium CM y el Geno Tipo Mycobacterium AS permiten la detección fiable de M. la tuberculosis complejo y 43 NTMclínicamente relevante de muestras de cultivo.

Mycobacterium lepraelepra, enfermedad de Hansen , es por este medio por Mycobacterium leprae causa. Esta bacteria fue identificada en 1873 por Gerhard Hansen Armauer en los nódulos de lapiel de pacientes con lepra. Por lo tanto, fue la primera bacteria, que se identificó como un patógeno humano. M. leprae multiplica exclusivamente intracelularmente en losmacrófagos y en las células de Schwann del sistema nervioso periférico. Gewebsauflösungen la cara y las extremidades, y daños en los nervios son el resultado. La cultura de laM. leprae fuera del cuerpo humano hasta ahora logrado sólo en el modelo de las “patas de ratón” y el armadillo de nueve bandas. El cultivo en medios artificiales permanecióhasta ahora sin éxito. Por esta razón, sólo la evidencia microscópica, tal como a partir de muestras de piel o secreciones nasales o la identificación genética molecular.El Geno Tipo LepraeDR permite la detección de M. leprae y su resistencia a los antibióticos comunes dentro de un día.

FIGURE 2.1

Coverage of country consultations on estimates of TB disease burden, 2008–2013

A.1.4 Classification based on drug resistance

Cases are classified in categories based on drug susceptibility testing (DST) of clinical isolates confirmed to be M. tuberculosis:

WHO Library Cataloguing-in-Publication Data

Definitions and reporting framework for tuberculosis – 2013 revision.

1.Tuberculosis – classification. 2.Tuberculosis – drug therapy. 3.Tuberculosis, Multidrug-Resistant. 4.Disease notification. 5.Medical records systems, Computerized. 6.Registries. I.World Health Organization.

FIGURE 4.7

MDR-TB cases (orange) and additional rifampicin-resistant TB cases (blue) detected compared with TB cases enrolled on MDR-TB treatment (green) 2009–2012, globally and in 27 high MDR-TB burden countries, 2009–2012

Num

ber o

f cas

es

200

800

600Armenia Azerbaijan Bangladesh Belarus

0

100

200

300

200

400

600

800

0

5000

10000

15000

0

100

200

300

400

500Ethiopia Georgia India Indonesia

0

2000

4000

6000

8000

0

250

500

750

1000

0

50

100

150

250

270

290

310

330

350Kazakhstan Kyrgyzstan Latvia Lithuania

0

200

400

600

800

0

100

200

300

0

500

1000

1500

2000Myanmar Nigeria Pakistan Philippines

500

1000

1500

2000

2500

300

500

700

900

1100

5000

10000

15000

20000

0

5000

10000

15000

0

200

400

600

800Republic of Moldova Russian Federation South Africa Tajikistan

2000

4000

6000

8000

0

500

1000

1500

2000

0

200

400

600

800

2009 2010 2011 2012 2009 2010 2011 2012 2009 2010 2011 2012 2009 2010 2011 2012

Ukraine Uzbekistan Viet Nam Global

2000

2500

0

20 000

40 000

60 000

80 000

100 000

MDR-TB cases (orange) and additional rifampicin-resistant TB cases (blue) detected compared with TB cases enrolled on MDR-TB treatment (green) 2009–2012, globally and in 27 high MDR-TB burden countries, 2009–2012

MDR-TB cases (orange) and additional rifampicin-resistant TB cases (blue) detected com-pared with TB cases enrolled on MDR-TB treatment (green) 2009–2012, globally and in 27 high MDR-TB burden countries, 2009–2012

Resistencia a Drogas

Técnica Cinético-colorimétricaDiagnóstico Indirecto

Es una enzima esencial para el metabolismo de las purinas y principalmente de ciertos tipos de células del organismo, en especial, de las células qque se ocupan del desarrollo del sistema inmune, como por ejemplo de los linfocitos T.

La adenosina deaminasa(ADA)se encuentra en los eritrocitos, leucocitos, pulmón, hígado, estómago, tracto genitourinario y suero. La enzima contiene dos grupos tiol reactivos. Se afirma qque las actividades de la enzima son mucho más altas en la tuberculosis qque en otras enfermedades.

La adenosina deaminasa es una de las pocas enzimas del suero qque se encuentra consistentemente baja en enfermedades del tracto biliar y frecuentemente altas en enfermedad hepática crónica.

La adenosina deaminasa(ADA)se encuentra elevada en el suero en enfermedades como la hepatitis, cirrosis, hemocromatosis, ictericia obstructiva asociada con enfermedad neoplásica, cancer de próstata y vejiga, anemia hemolítica, fiebre reumática, fiebre tifoidea, gota, talasemia mayor, leucemia mieloide, tuberculosis, enfermedades autoinmunes, mononucleósis infecciosa, falla cardiaca.

La ADA tiene varias isoenzimas: ADA 1 es fundamentalmente intracelular y ADA 2 predomina en plasma y suero, el sistema monocito-macrófago puede ser la principal fuente de ADA2

La isoenzima 2 del enzima ADA, se considera un indicador del recambio de la línea monocito/macrófago y por lo tanto, la determinación de la actividad del ADA en fluídos biológicos se emplea en el diagnóstico de la tuberculosis pleural y peritoneal, así como en la meningitis tuberculosa. La medida de la actividad de ADA se realiza habitualmente mediante métodos espectrofotométricos qque pueden ser facilmente utilizados en los analizadores de bioquímica clínica.

Las muestras hemolizadas presentan valores falsamente elevados, probablemente debidos a un aumento del isoenzima 1 del ADA o también llamado eritrocitario, por ser la única forma que posee el hematíe.

ADA en sangre, tiene utilidad como marcador para enfermedades infecciosas tales como: Mononucleosis, Fiebre tifoidea y Hepatitis. Valores de ADA muy bajos, reflejan una inmunodeficiencia.

Adenosin Deaminasa (ADA)

Determinación cuantitativa de Adenosina Deaminasa (ADA)

PRINCIPIO DEL MÉTODO

La prueba de ADA se basa en la desaminación enzimática de adenosina a inosina que se convierte en hipoxantina por purina

nucleósido fosforilasa (PNP). A continuación la hipoxantina se convierte en ácido úrico e hidrógeno peróxido (H2O2) por xantina

oxidasa (XOD). H2O2 se reactiva con N-Etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina (EHSPT) y 4-aminoantipirina (4-AA) en

presencia de peroxidasa (POD) para generar tinte quinona que se monitoriza de forma cinética.

ADA

Adenosina + H2O Inosina + NH3

PNPInosina + Pi Hipoxantina + Ribosa 1-fosfato

XOD Hipoxantina + 2H2O + 2O2 2H2O2 + Ácido úrico

POD 2H2O2 + 4-AA + EHSPT 4H2O + tinte quinona (máx. 556nm)

Una unidad de ADA se define como la cantidad de ADA que genera un μmol de inosina a partir de adenosina por min. a 37ºººCCC.

patients. These observations were countered by

Burgess et al.21 when they evaluated cirrhotic patients

with tuberculous peritonitis and reported a sensitivity

of 94 percent. At present, an ascites ADA activity of

≥ 30 U/L is generally accepted as the cut-off level

expected to yield the best results.16

In Thailand, a retrospective study regarding

ascitic ADA testing by using Giusti’s method for the

Lakkana Boonyagars, M.D., Sasisopin Kiertiburanakul, M.D., MHS J Infect Dis Antimicrob Agents 2010;27:111-8.

Cerebrospinal fluid

A study comparing the ADA activity in cerebrospinal fluid (CSF) between patients with tuberculous and non-tuberculous meningitis was conducted.

The ROC curve identified a CSF ADA level of 15.5 U/l as the best cut-off value to differentiate between the 2 groups, with a sensitivity of 75 percent, specificity of 93

percent and area under the curve of

0.92.24 In bacterial meningitis, mean ADA is quite high when compared with non-tuberculous and non-bacterial meningitis group. The yield of ADA may be low in

setting to differentiate bacterial from tuberculosis meningitis. The possible explanation may be from ADA value in most assays detected total ADA which includes ADA-1

and ADA-2. Thus, fluid with high cell counts (e.g. bacterial meningitis) can have high total ADA and may be undifferentiated from tuberculous meningitis.

ADA activity in the CSF of HIV-infected patients had limited value for diagnosis of tuberculous meningitis. A retrospective study was conducted to determined ADA

levels in 417 CSF samples from HIV-infected patients with neurological symptoms. HIV-associated neurological disorders and progressive multifocal leukoencephalopathy

were not associated with elevated ADA in CSF. When using a cut-off point of 8.5 IU/l for the diagnosis of tuberculous meningitis, sensitivity was only 57 percent and

specificity was 87 percent. A cut-off value of 10 IU/l gave a specificity of 90 percent but very low sensitivity (36%). False-positive results were found in patients with

neurological cytomegaloviral disease, cryptococcal disease, lymphomatous and probable candidal meningitis. The results of this study indicated that ADA determination in

CSF has limited utility for the diagnosis of tuberculous meningitis in HIV-infected patients.

Recommendation from British Infection Society for the diagnosis and treatment of TB of the central nervous system in adults and children26 suggests that the

activity of ADA is raised in the CSF of patients with tuberculous meningitis and has been evaluated as a diagnostic assay. The major problem was lacking of specificity.

High CSF ADA activity has been reported from patients with lymphomas, malaria, brucellosis and pyogenic meningitis. Thus, CSF ADA activity is not recommended as a

routine diagnostic test for TB of the central nervous system. However, prevalence of tuberculous meningitis in Thailand is high and positive predictive value for ADA in

diagnosis of tuberculous meningitis is much higher than that of European countries. The value of CSF ADA may have usefulness in Thailand.

Adenosine deaminase versus polymerase chain reaction

Nucleic acid identification by PCR is a rapid, sensitive and specific tool for the detection of Mycobacterium tuberculosis. It permits direct identification of the M. tuber-

culosis complex and results are available in a day or two. However, sensitivity depends on a target site. PCR targets such as IS6110 and hsp65 kDa yield a sensitivity of

42-100 percent and a specificity of 85-100 percent.29 Sensitivity of PCR was achieved when devR and IS6110 test results were combined; the sensitivity and specificity

values were 83 percent and 94 percent respectively in pleural fluid.30

A cross-sectional study was performed in a total of 179 body fluid samples. All specimens were analyzed for AFB smear, ADA activity (by a method based on the Berthlot

reaction) and multiplex PCR using amplicons such as IS6110, dnaJ gene and hsp65 genes. On comparing AFB and ADA results with PCR, the PCR is clearly more

effective than AFB smear (p < 0.001) and ADA estimation (p < 0.02) in all types of body fluids.

Disadvantages for PCR are; it needs more resources and sophisticated equipments than ADA, price is higher, needs longer time for test results and not every hospitals can

set PCR lab (especially small to medium sizes hospitals).

Lakkana Boonyagars, M.D., Sasisopin Kiertiburanakul, M.D., MHS

In this study sensitivity and specificity

of ADA in comparison with culture

were 41.6% and 80% respectively. Our

data also showed that sensitivity and

specificity of ADA in comparison with

PCR were 100% and 85% respectively.

Discussion

In the interpretation of CSF-ADA

levels for diagnosis of TBM two

Chotmongkol et al in their study(16) reported 75% sensitivity and 93%

specificity for CSF-ADA level in diagnosis of TBM with a 15.5IU/L

cutoff

Kashyap et al(17) in their study reported that with a 11.39 IU/L cut-off ,

the sensitivity and specificity of ADA measurement in diagnosis of

TBM in CSF samples of their patients were 82% and 83% respectively.

Corral et al.(18) reported a 57% sensitivity and 87% specificity

with a 8.5IU/L cut-off for CSF-ADA level in the diagnosis of TBM in

HIV infected patients and

Gautam etal.(19) in their study reported the sensitivity and specificity of

85% and 88.0% respectively for CSFADA levels in diagnosis of

TBM with a 6.97IU/L cutoff value.

COMPARACIÓN ENTRE DIFERENTES ESTUDIOS DE LA SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD, VPP Y VPN PARA LAMEDICIÓN DE ADA EN LCR EN EL DIAGNÓSTICO DE MT.

AUTOR NUMERO DE POBLACIÓN ADA EN SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD VPP VPNPACIENTES LCR (UI/L)CON MT

MISHRA ET AL (1996) (10) 27 NIÑOS >5 89% 92% SD SD

BARO ET AL (1996) (12) 12 ADULTOS >6.5 83% 85% SD SD

MANN ET AL (1982) (22) 33 ADULTOS >5 85% 84% SD SD

ZUÑIGA-RAMIREZ ET AL (2005) (23) 23 ADULTOS >7 39% 96% 42 96

GAMBHIR ET AL (1999) (8) 36 ADULTOS >=8 44% 75% SD SD

LÓPEZ L.F-CORTÉS ET AL (1995) (24) 20 ADULTOS >10 48% 96% 1 0,91

COOVADIA ET AL (1986) (25) 38 NIÑOS >=10 73% 71% SD SD

KASHYAP RS ET AL (2006) (20) 27 ADULTOS >11.39 82% 83% SD SD

MT MENNGITIS TUBERCULOSA; VPP VALOR PREDICTIVO POSITIVO; VPN VALOR PREDICTIVO NEGATIVO

. Resultados de la ADA con punto de corte de 9U/L en algunas enfermedades

neurológicas en pacientes VIH positivos (IC 95%)

Etiología de la

infeccion del

SNC en

pacientes VIH

positivos

Sensibilidad Especificidad VP + VP – RV + RV -

Tuberculosis

meníngea

n= 23

73,9

(53,8-94,0)

70,5

(61,3-79,7)

35,4

(20,8-50,0)

92,5

(86,1-98,9)

2,5

(1,7-3,7)

0,37

(0,2-0,7)

Criptococosis

meníngea

n= 34

58,8

(40,8-76,8)

70,2

(60,4-80,0)

41,7

(26,7-56,7)

82,5

(73,6-91,5)

1,97

(1,3-3,0)

0,59

(0,38-0,9)

Toxoplasmosis

cerebral

n= 15

40

(11,9-68,1)

62,8

(53,5-72,3)

12,5

(2,1-22,9)

88,7

(81,2-96,3)

1,08

(0,5-2,1)

0,95

(0,6-1,5)

Neurolúes

n=10

10

(0-33,6)

60,2

(50,9-69,4)

2,1

(0-7,2)

88,7

(81,2-96,3)

0,25

(0-1,6)

1,5

(1,2-1,9)

Otros Dx

neurológicos

n= 46

8,7

(0-17,9)

46,3

(34,9-57,7)

8,3

(0-17,2)

47,5

(35,9-59,1)

0,16

(0-0,4)

1,97

(1,5-3,5)

VP: Valor predictivo

RV: Razón de verosimilitud

29. Faucy AS, Clifford HL. Human inmunodeficiency virus

disease: AIDS and related disorders. In: Principles of

Internal Medicine. 16 th ed. McGraw-Hill; 2005. p. 1076-

Velasquez G, Betancur J, Estrada B, Ospina S y

colaboradores. Infecciones em 193 pacientes com SIDA.

Acta 18: 56-65.

Lizarazo J, Castro F, De Arco M, Chaves O, Peña M.

Infecciones oportunistas del sistema nervioso central en

pacientes com VIH atendidos en el hospital Erasmo Meoz,

Cucuta, 1995 – 2005. Infectio. 2006; 10(4): 226 – 31.

Castañeda E, Torrado E, Arango M, De Bedout C,

Tobón AM, Restrepo A. Grupo Colombiano de estúdio de

la criptococosis. Criptococosis en Colombia: estudio

interinstitucional. Inf Quinc Epidemiol Nac. 2000; 5: 115-9

Plan nacional de respuesta ante el VIH-SID A Colombia 2008-2011. Ministerio de Protección Social. Dirección general de salud pública. ONUSIDA.

Valores de ADA, glucosa y proteínas en LCR por enfermedad neurológica.

ENFERMEDAD ADA (U/L)

GLUCOSA

(mg/dl)

PROTEINAS

(mg/dl)

Tuberculosis

meníngea

16,0 ± 9,8 30,8 ± 12,2 134,0 ± 93,0

Criptococosis

meníngea

10,4 ± 6,0 33,8 ± 15,7 95,2 ± 63,1

Toxoplasmosis

cerebral

9,4 ± 7,2 41,8 ± 5,7 88,4 ± 75,1

Neurolúes 5,3 ± 3,5 48,6 ± 18,8 42,8 ± 16,2

Otros diagnósticos * 5,7 ± 8,4 46,2 ± 13,6 50,1 ± 49,4

Total 9,3 ± 8,5 39,8 ± 15,2 81,1 ± 71,2

* Encefalopatía asociada al VIH, encefalitis por histoplasma, meningitis aséptica y sin diagnóstico definido

Velasquez G, Betancur J, Estrada B, Ospina S y

colaboradores. Infecciones em 193 pacientes con SIDA.

Acta 18: 56-65.

Lizarazo J, Castro F, De Arco M, Chaves

Infecciones oportunistas del sistema nervioso

pacientes com VIH atendidos en el hospital

Cucuta, 1995 – 2005. Infectio. 2006; 10(4): 226 – 31.

Castañeda E, Torrado E, Arango M, De

Tobón AM, Restrepo A. Grupo Colombiano de

la criptococosis. Criptococosis en Colombia:

interinstitucional. Inf Quinc Epidemiol Nac. 2000; 5: 115-9

Plan nacional de respuesta ante el VIH-SIDColombia 2008-2011. Ministerio de Protección SDirección general de salud pública. ONUSIDA.

Técnicas de Biología MolecularDianóstico Directo

Xpert MTB/RIF

En el “Xpert MTB/RIF”, el único paso que se realiza de forma manual, es la adición del reactivo bactericida a la muestra (esputo) antes de introducirlo en la máquina, elimina así el inconveniente de necesitar laboratorios de alta bioseguridad ya que todas las reacciones se realizan después de inactivar los

gérmenes presentes en el esputo.

El test automático MTB/RIF integra una modificación de la reacción convencional de polimerasa en cadena, PCR, con la que se reduce la contaminación del producto amplificado, en este caso el gen llamado rpoB ; mutaciones en este gen, que codifica para la subunidad beta de la ARN polimerasa, están implicadas en la resistencia a rifampicina, además también amplifica las secuencias que rodean el gen que son específicas

del complejo M. tuberculosis. Contiene además todos los reactivos necesarios para la lisis bacteriana, extracción del ADN y detección del producto amplificado.

En el “Xpert MTB/RIF” los pasos finales del ensayo, los que dependen de la reacción en cadena de la polimerasa, un procedimiento muy sensible pero que es muy propenso a las contaminaciones de la

muestra, tienen lugar en un recipiente herméticamente sellado, lo que elimina la posibilidad de contaminación, y por ello de falsos positivos.

Otra ventaja del “Xpert MTB/RIF” es que para su manipulación no se necesita personal especializado, lo que supone una gran ventaja para realizar el diagnóstico en las áreas rurales mal comunicadas y con

pocos recursos de los países con mayor índice de esta enfermedad, puesto que el entrenamiento que se necesita para llevar a cabo el test es mínimo.

Por otra parte, el tiempo que tarda la máquina en dar el resultado del análisis es de menos de 2 horas, esto es otra ventaja en comparación con la técnica utilizada hoy en día, el crecimiento de la muestra en medio selectivo y la tinción de Ziehl-Neelsen que, además del peligro que acarrea su manipulación, tarda como

mínimo unas 2 semanas en obtener resultados.

GRADE summary of findings – Diagnostic accuracy of the Xpert MTB/RIF assay in multi-centre clinical validation studies

Review question: What is the diagnostic accuracy of Xpert MTB/RIF for i) detection of pulmonary tuberculosis; and ii) detection of resistance to rifampicin? Patients/population: Adult pulmonary TB suspects (for TB detection); Confirmed TB cases (for rifampicin resistance detection) Setting: Multi-centre clinical validation studies Index test: Conventional culture and DST Importance: A rapid, accurate, simple test could replace conventional culture and DST and expand testing to lower levels of the health service Reference standard: Conventional microscopy, culture, drug susceptibility testing, clinical diagnosis of pulmonary TB Studies: Cross-sectional or cohort Outcomes: TP, TN, FP, FN Effect %

(95% CI) No. of participants (studies)

What do these results mean given 10% prevalence among suspects being screened for TB?


Quality of evidence

Diagnostic accuracy for M. tuberculosis

All specimens

AFB smear positive/culture positive

AFB smear negative /culture positive

Sensitivity 92% (90, 94)Specificity 99% (98, 100)

Sensitivity 98% (97, 99)


1,341 (5) With a prevalence of 10%, 100/1000 will have TB. Of these, 92 (TP) will be identified; 8 (FN) will be missed by Xpert MTB/RIF. Of the 900 patients without TB, 891 (TN) will not be treated; 9 (FP) may be unnecessarily treated.

With a prevalence of 30%, 300/1000 will have TB. Of these, 276 (TP) will be identified; 24 (FN) will be missed by the Xpert MTB/RIF. Of the 700 patients without TB, 693 (TN) will not be treated; 7 (FP) may be unnecessarily treated.

Moderate

Diagnostic accuracy for rifampicin resistance

Effect % (95% CI)

No. of participants (studies)

What do these results mean given 10% prevalence of rifampicinresistance among persons with TB?

What do these results mean given 30% prevalence of rifampicin resistance among persons with TB?

Quality of Evidence

All specimens Sensitivity 98% (94, 99)

Specificity 98% (96, 99)

720 (5) With a prevalence of 10%, 100/1000 will have rifampicin resistance. Of these, 98 (TP) will be identified; 2 (FN) will be missed by Xpert MTB/RIF. Of the 900 patients with TB susceptible to rifampicin, 891 (TN) will not be treated for MDR; 9 (FP) may be unnecessarily treated.

With a prevalence of 30%, 300/1000 will have rifampicin resistance. Of these, 294 (TP) will be identified; 6 (FN) will be missed by Xpert MTB/RIF. Of the 700 patients with TB susceptible to rifampicin, 693 (TN) will not be treated for MDR; 7 (FP) may be unnecessarily treated for MDR.

Moderate

WHO/HTM/TB/2011.4

GRADE summary of findings – Diagnostic accuracy of the Xpert MTB/RIF assay in multi-centre demonstration studies

Review question: What is the diagnostic accuracy of Xpert MTB/RIF for i) detection of pulmonary tuberculosis; and ii) detection of resistance to rifampicin?Patients/population: Adult pulmonary TB suspects (for TB detection); Confirmed TB cases (for rifampicin resistance detection) Setting: Multi-centre clinical validation studies Index test: Conventional culture and DST Importance: A rapid, accurate, simple test could replace conventional culture and DST and expand testing to lower levels of the health service Reference standard: Conventional microscopy, culture, drug susceptibility testing, clinical diagnosis of pulmonary TB Studies: Cross-sectional or cohort

Outcomes: TP, TN, FP, FN Effect % (95% CI)



What do these results mean given30% prevalence among suspects being screened for TB?

Quality of Evidence

Diagnostic accuracy for MTB

All specimens

AFB smear positive/culturepositive

AFB smear negative/culturepositive

Sensitivity 91% (88, 93)Specificity 99% (98, 99)

Sensitivity 99% (97-100)


2,530 (6) With a prevalence of 10%, 100/1000will have TB. Of these, 91 (TP) willbe identified; 9 (FN) will be missedby Xpert MTB/RIF. Of the 900patients without TB, 891 (TN) willnot be treated; 9 (FP) may beunnecessarily treated.

With a prevalence of 30%, 300/1000will have TB. Of these, 273 (TP) will beidentified; 27 (FN) will be missed bythe Xpert MTB/RIF. Of the 700 patientswithout TB, 693 (TN) will not betreated; 7 (FP) may be unnecessarilytreated.

Moderate

Diagnostic accuracy for Rifampicin resistance

Effect % (95% CI)




Quality of Evidence

All specimens Sensitivity 95% (91, 97)

Specificity 98% (97, 99)

2,530(6) With a prevalence of 10%, 100/1000will have rifampicin resistance. Ofthese, 95 (TP) will be identified; 5(FN) will be missed by XpertMTB/RIF. Of the 900 patients withTB susceptible to rifampicin, 882(TN) will not be treated for MDR; 12(FP) may be unnecessarily treatedfor MDR.

With a prevalence of 30%, 300/1000will have Rifampicin resistance. Ofthese, 285 (TP) will be identified;15(FN) will be missed by Xpert MTB-RIF. Of the 700 patients with TBsusceptible to rifampicin, 686 (TN) willnot be treated for MDR; 14 (FP) maybe unnecessarily treated for MDR.

Moderate

WHO/HTM/TB/2011.4

GRADE summary of findings – Diagnostic accuracy of the Xpert MTB/RIF assay in single-centre unpublished studies1

Review question: What is the diagnostic accuracy of Xpert MTB/RIF for i) detection of pulmonary tuberculosis; and ii) detection of resistance to rifampicin? Patients/population: Adult pulmonary TB suspects (for TB detection); confirmed TB cases (for rifampicin resistance detection) Setting: Multi-centre clinical validation studies Index test: Conventional culture and DST Importance: A rapid, accurate, simple test could replace conventional culture and DST and expand testing to lower levels of the health service Reference standard: Composite reference standards (LJ culture, histology/cytology, ADA for CSF and fluids, CT for CSF, follow-up at 3 months) Studies: Cross-sectional or cohort Outcomes: TP, TN, FP, FN Crude pooled effect %1 No. of

participants (studies)



Quality of Evidence

Diagnostic accuracy for MTB

All specimens pulmonary and extrapulmonary

Sensitivity 92.5%

Specificity 98.0%

4,373 (10) With a prevalence of 10%, 100/1000 will have TB. Of these, 92 (TP) will be identified; 8 (FN) will be missed by Xpert MTB/RIF. Of the 900 patients without TB, 882 (TN) will not be treated; 18 (FP) may be unnecessarily treated.

With a prevalence of 30%, 300/1000 will have TB. Of these, 278 (TP) will be identified; 12(FN) will be missed by the Xpert MTB/RIF. Of the 700 patients without TB, 686(TN) will not be treated; 14 (FP) may be unnecessarily treated.

Moderate

Diagnostic accuracy for rifampicin resistance

Pooled effect % No. of participants (studies)



Quality of Evidence

All specimens (pulmonary and extrapulmonary)

Sensitivity 98.6%

Specificity 98.8%

917(3) With a prevalence of 10%, 100/1000 will have rifampicin resistance. Of these, 98 (TP) will be identified; 2 (FN) will be missed by Xpert MTB/RIF. Of the 900 patients with TB susceptible to rifampicin, 889 (TN) will not be treated for MDR; 11 (FP) may be unnecessarily treated for MDR.

With a prevalence of 30%, 300/1000 will have rifampicin resistance. Of these, 296 (TP) will be identified; 4(FN) will be missed by Xpert MTB/RIF. Of the 700 patients with TB susceptible to rifampicin, 692(TN) will not be treated; 8 (FP) may be unnecessarily treated for MDR.

Moderate

1 These studies were evaluated individually and crude pooled sensitivity and specificity estimates calculated since meta-analyses was not possible given variability in study design, use of various reference standards and availability of preliminary data only. The quality of evidence was consequently downgraded (on directness) by 1 point.

WHO/HTM/TB/2011.4

TUBERCULOSIS DIAGNOSTIC Xpert M

S TB/RIF Test

WHO RECOMMENDATIONS

For diagnosis of pulmonary TB and rifampicin

resistance:

Strong recommendation:

• Xpert MTB/RIF should be used as the initial

diagnostic test in adults and children presumed to

have MDR-TB or HIV-associated TB

Conditional recommendations (recognising major

resource implications):

• Xpert MTB/RIF may be used as the initial

diagnostic test in adults and children presumed to

have TB

• Xpert MTB/RIF may be used as a follow-on test to

microscopy in adults presumed to have TB but not

at risk of MDR-TB or HIV-associated TB, especially

in further testing of smear-negative specimens

The rapid TB test – known as Xpert MTB/RIF- is a fully-

automated diagnostic molecular test. It has the potential to

revolutionize and transform TB care and control. The test:

• simultaneously detects TB and rifampicin drug resistance

• provides accurate results in less than two hours so that

patients can be offered proper treatment on the same day

• has minimal bio-safety requirements and training needs, and

can be housed in non-conventional laboratories

For diagnosis of extrapulmonary TB and

rifampicin resistance:

Strong recommendation:

• Xpert MTB/RIF should be used as the initial diagnostic test in testing cerebrospinal fluid specimens from patients presumed to have TB meningitis

Conditional recommendation:

• Xpert MTB/RIF may be used as a replacement test

for usual practice (including conventional microscopy,

culture, and/or histopathology) for testing of specific

non-respiratory specimens (lymph nodes and other tis-

sues) from patients presumed to have extrapulmonary

TB

For all WHO TB diagnostics policy documents: http://

www.who.int/tb/laboratory/policy_statements/

UPDATED WHO RECOMMENDATIONS AS OF OCTOBER 2013


S TB/RIF Test


S TB/RIF Test

Time to detection Multidrug-resistant tuberculosis

Solid culture

6-8 weeks

1st line DST

3-4 weeks

2nd line DST

3-4w

Microscopy

24 hrs

Liquid culture

2-3 weeks

1st line DST

1-3 weeks

2nd line DST

1-2w

Microscopy

24hrs

Microscopy

24 hrs

Line probe assay

2-4 hrs

MDR-TB diagnosis with solid culture and DST

MDR-TB diagnosis with liquid culture and DST

2nd line DST

1-2w

1st line DST

1-2w

MDR-TB diagnosis with line probe assay, liquid culture and DST

Line probe assay

2-4 hrs

+

- 2nd line DST

1-2w

line DST 1st

1-3 weeks

Liquid culture

2-3 weeks

MDR-TB diagnosis

after 9 to 12 weeks

MDR-TB diagnosis

after 3 to 5 weeks

MDR-TB diagnosis

after 3 to 5 weeks

MDR-TB diagnosis after 2 to 4 hours

Fluoroquinolonas

Aminoglucósidos Péptidos Cíclicos

Etambutol

Resistencia a fármacos

LPA technology involves the following steps: First, DNA is extracted from M. tuberculosis isolates (indirect testing) or directly from clinical specimens (direct testing). Next, polymerase chain reaction (PCR) amplification of the resistance-determining region of the gene under question is performed using biotinylated primers. Following amplification, labeled PCR products are hybridized with specific oligonucleotide probes immobilized on a strip. Captured labeled hybrids are detected by colorimetric development, enabling detection of the presence of M. tuberculosis complex, as well as the presence of wild-type and mutation probes for resistance. If a mutation is present in one of the target regions, the amplicon will not hybridize with the relevant probe. Mutations are therefore detected by lack of binding to wild-type probes, as well as by binding to specific probes for the most commonly occurring mutations. The post hybridization reaction leads to the development of coloured bands on the strip at the site of probe binding.

Hain Lifescience new LPA, the Genotype MTBDRsl®®® test, for the rapid determination of genetic mutations associated with resistance to fluoroquinolones, aminoglycosides (kanamycin, amikacin), cyclic peptides (capreomycin), ethambutol, and streptomycin. The identification of resistance to fluoroquinolones is enabled by the detection of the most significant mutations of the gyrA gene (coding for DNA gyrase). For the detection of resistance to aminoglycosides/cyclic peptides, the 16S rRNA gene (rrs) and for detection of resistance to ethambutol the embB gene (which, together with the genes embA and embC, codes for arabinosyl transferase) are examined. The assay format is similar to the Geno-type MTBDRplus assay for the detection of mutations conferring rifampicin and isoniazid resistance, endorsed by WHO in 2008, and allows for testing and reporting results within 24 hours.

THE USE OF MOLECULAR LINE PROBE ASSAY FOR THE DETECTION RESISTANCE TO SECOND-LINE ANTI-TUBERCULOSIS DRUGS

Farmacogenética:El Futuro de la Medicina

con Técnicas de Biología Molecular

Estudia las variaciones genéticas que determinan el efecto farmacológico de una droga: eficacia, rango terapéutico, efectos adversos, toxicidad.

FARMACOGENÉTICA

•FARMACOS MAS PODEROSOS

•DROGAS MAS SEGURAS Y MEJORES, EN LA PRIMERA VEZ

•METODOS MAS PRECISOS PARA DETERMINAR LAS DOSIS APROPIADAS

•MEJORAS EN EL DESCUBRIMIENTO DE DROGAS Y PROCESOS DE APROBACION

•DISMINUCION DEL COSTO GENERAL DEL CUIDADO DE LA SALUD

CITOCROMO P-450

ENZIMA FENOTIPO FARMACOS EFECTO

CYP2C9METABOLIZADOR

lento

AINES – WARFARINA – FENITOINA –

losartan - torasemida

RIESGO DE TOXICIDAD

CYP2C19METABOLIZADORES lentos Y RAPIDOS

antidepresivos – DIAZEPAM - OMEPRAZOL

lentos: RIESGO DE TOXICIDAD

RAPIDOS: DISMINUCION

EFICACIA

CYP2D6

Antidepresivos -Antipsicoticos –

antiarritmicos Antianginosos

lentos: RIESGO DE TOXICIDAD

RAPIDOS: DISMINUCION

EFICACIA

HAY POR LO MENOS 12 FAMILIAS DE GENES P-450

HAY ALELOS POLIMORFICOS EN CASI TODAS LAS FAMILIAS

METABOLIZADORESlentos Y RAPIDOS

GEN FARMACO EFECTO ASOCIADO CON POLIMORFISMOS

ECAINHIBIDORES DE LA

ECA

DISMINUCION DE LA PRESION ARTERIAL – TOS SECA

RECEPTOR BKB2

TOS SECA

RECEPTOR 2

AGONISTAS 2

BRONCODILATACION – AUMENTO DE LA FRECUENCIA CARDIACA –

SUCEPTIBILIDAD A LA DESENSIBILIZACION INDUCIDA POR

AGONISTAS

INHIBIDORES DE LA ECA

GenBank

www.ncbi.nlm.nih.gov

Tengamos ideales elevados y pensemos en alcanzar grandes cosas, porque como la vida rebaja siempre y

no se logra sino una parte de lo que se ansía, por eso soñando alto alcanzaremos mucho más.

Para una voluntad firme, nada es imposible, no hay fácil ni difícil; fácil es lo que ya sabemos hacer,

difícil, lo que aún no hemos aprendido a hacer bien”.

Bernardo Houssay (1887 – 1971) Premio Nobel de Medicina y Fisiología -1947

Muchas gracias por su atención!

técnicas en diagnóstico de meningitis tuberculosa y farmacogenética

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