studio delle proteine. cromatografia
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STUDIO DELLE PROTEINE
cromatografia
Frazionamento
Metodi non meccanici:
:
centrifugazione
Chiarificazione dell’estratto
• L’estratto grezzo deve essere “pulito” prima di procedere al frazionamento
• Conviene allontanare subito gli acidi nucleici, ribosomi mediante precipitazione (protamina solfato)
• Nel caso contiene molto materiale insolubile si può centrifugare
• Molto efficaci sono le tecniche che sfruttano la diversa solubilità delle singole proteine
• Solubilità differenziale
Sviluppo passaggi di purificazione
= 1/2ciZ2i
• Punto isoelettrico
• Calore
• Precipitazione frazionata con Sali (salting-in/salting out)
• Solventi organici
• Con polimeri organici (PEG)
• pH estremi
METODI DI PRECIPITAZIONE DELLE PROTEINE
Esempio di precipitazione frazionata
• Sviluppo di passaggi cromatografici
• Per stabilire la tecncica cromatografia più utile per la nostra proteina bisogna tenere conto di alcuni parametri generali:
-la capacità e la resa del processo cromatografico;
-la diluizione della proteina nel passaggio cromatografico;
-la velocità,-la conservazione dell’attività durante il passaggio;-il costo dell’intero processo.
Criterio generale: assemblare una serie di passaggi che separano le proteina secondo proprietà diverse.
Concentrazione per ultrafiltrazione e conservazione• La concentrazione si realizza forzando acqua e piccole
molecole attraverso una membrana semipermeabile usando alta pressione o centrifugazione.
• • Sono disponibili commercialmente diverse membrane
con intervallo di peso molecolare tra 500 e 300.000 (Amcon, Millipore) con dimensioni di pori 0,1-10 mm.
• Le proteine purificate in genere vengono conservate a basse temperature (-80°C). Spesso si aggiungo agenti criogeni (glicerolo, glicole etilenico, DMSO) per stabilizzare la proteina durante il congelamento e scongelamento.
Dialisi