SEPARACION DE CARBOHIDRATOS POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

CROMATOGRAFIA.- La cromatografía es una técnica de separación extraordinariamente versátil que presenta distintas variantes. En toda separación cromatográfica hay dos fases (sólida, líquida o gas) una móvil y otra estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto íntimo. La muestra se introduce en la fase móvil y los componentes de la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación. Si un componente está la mayor parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve rápidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho más lenta.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Las capas finas preparadas sobre vidrio se denominan cromatoplacas o placas simplemente.Se usan dos tipos de capas: capa compacta que se adhiere a la placa de vidrio por medio de un agente aglomerante incorporado al adsorbente o por las cualidades adherentes del propio material, y capa suelta.Estas últimas sólo se emplean en la determinación de la actividad de los adsorbentes y en uno o dos casos especiales.

REACTIVOS UTILIZADOS PARA REVELAR CARBOHIDRATOSReactivos más específicos dan manchas coloreadas con diversos azúcares, entre ellos el ftalato de anilina (en n -butanol saturado de agua) y naftoresorcinol (en acetona, agua y ácido fosfórico)Diversas técnicas han sido empleadas en la detección de los carbohidratos después de la separación cromatográfica. Aquí se incluyen las revelaciones con sprays o inmersiones de tiras de papel en paltos de capa fina conteniendo diversos reactivos de coloración. Aunque se trata de métodos sensitivos, resulta muy difícil realizar un análisis cuantitativo.Dentro de los sprays cromogénicos se mencionan: el ácido tiobarbitúrico para la determinación de ácidos siálicos; el orcinol-ácido sulfúrico para determinar galactosa; antrona para hexosas; carbazol para ácidos urónicos; el resorcinol para residuos de ácidos siálicos unidos, y otros generales y específicos.

CLASES DE SOPORTE QUE SE UTILIZANLa hidroxiapatita, celulosa microcristalina, sílica y soportes de mezclas de carbón activado.

MECANISMO DE REACCION ENTRE LOS CARBOHIDRATOS Y EL REACTIVO DE MOLISCHLa presencia de carbohidratos en una muestra se pone de manifiesto por la reacción de Molisch, que a cierto punto es la reacción universal para cualquier carbohidrato.Se basa en la acción hidrolizante y deshidratante del ácido sulfúrico sobre los hidratos de carbono. En dicha reacción el ácido sulfúrico cataliza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos de la muestra y la deshidratación a furfural (en las pentosas) o hidroximetilfurfural (en las hexosas).Estos furfurales se condensan con el alfa naftol del reactivo de Molisch (reacción de Molisch) dando un producto coloreado.

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFIA DE CAPA FINALas separaciones sobre capa fina se parecen en muchos aspectos a la del papel, pero es posible la elección de muchos más medios, ya que con esta técnica pueden realizarse separaciones por reparto, filtración sobre gel, adsorción e intercambio ióni co. Las propiedades particulares de la cromatografía en capa fina permiten desarrollar el fraccionamiento en un periodo de tiempo mucho menor. Por ejemplo, es frecuente conseguir magníficas separaciones sobre capas entre veinte y cuarenta minutos. Incluso empleando como adsorbente celulosa, el desarrollo de la placa es mucho más rápido que el papel. Una razón de esto es el tamaño tan fino de las partículas que constituyen los medios empleados en cromatografía en capa fina, por lo que se consiguen mejores resoluciones y manchas más compactas.La gran rapidez y versatilidad de la cromatografía en capa fina la hace ideal para la enseñanza.

FUNDAMENTO.- Las propiedades particulares de la cromatografía en capa fina permiten desarrollar el fraccionamiento en un periodo de tiempo mucho menor. Por ejemplo, es frecuente conseguir magníficas separaciones sobre capas entre veinte y cuarenta minutos.

OBJETIVOS.-- Aplicar la cromatografía en la detección de carbohidratos.- Realizar los cálculos del RF.

MATERIALES Y SUSTANCIAS- Placa de vidrio con sílica gel- Cámara cromatográfica- Pipetas- Pera para pipetear- Regla- Estufa- Solvente de desarrollo (50 ml Butanol, 30 ml propanol, 20 ml Ac Bórico

0,5%)- Muestra (CHO #1; CHO#2)- Carbohidratos patrón (xilosa, lactosa, sacarosa, glucosa, galactosa,

ribosa, fructosa).

PROCEDIMIENTO:En la placa de vidrio trazar una línea a 1.5 cm de la base, que servirá como punto de origen para la aplicación de las muestras, luego aplicar las muestras y los carbohidratos patrones con un capilar, mas o menos con separaciones de unos 0,5 cm, calentar en la estufa a unos 120 ºC por unos 2 minutos, luego agregar 50 ml del solvente de desarrollo en la cámara cromatográfica.

Poner la placa en la cámara cromatográfica y esperar hasta que ascienda el solvente de desarrollo por la placa de vidrio hasta unos 7 cm de la base. Una vez ascendido el solvente sacar la placa y tirar una ralla con cuidado hasta donde llegó el solvente, calentar en la estufa por unos minutos.

Luego sacamos la placa de la estufa y con una brocha con cuidado pasamos el reactivo de Molisch para el revelado, una vez hecho esto secamos en la estufa a 120 o 140 ºC de 1 a 5 minutos, tener cuidado de que las manchas no se vayan a dañar, observar de rato en rato hasta que aparezcan las manchas coloreadas.

Medir la distancia desde el punto de origen hasta la mitad de la mancha, y luego desde el punto de origen hasta el frente del solvente y calcular el RF.

RESULTADOS:

RF = distancia del punto origen (O) al centro de la muestra (CM) Distancia del punto de origen (O)al frente del solvente (FS)

En el revelado se forman derivados del furfural, las hexosas van a formar hidroxi metil furfural y las pentosas forman furfural y estas son incoloras, pero como el reactivo de Molisch tiene α naftol van a formar complejos coloreados de violeta púrpura rosado.

CARBOHIDRATOS P. O. – C. M.(cm) P. O. – F. S .(cm) RFXILOSA 2.5 5.7 0,439LACTOSA 0.9 5.7 0,158SACAROSA 1.5 5.7 0,263GLUCOSA 1.8 5.7 0,316GALACTOSA 1.6 5.7 0,281RIBOSA 2.3 5.7 0,404FRUCTOSA 1.4 5.7 0,246CHO #1 1.8 5.7 0,316CHO #2 2.3 5.7 0,404

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

ESCUELA DE QUIMICA Y FARMACIA

LABORATORIODE

BIOQUIMICA

TEMA:SEPARACION DE CARBOHIDRATOS

POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

GRUPO #1

INTEGRANTES:NAHUM MALDONADO

LUIS TOALAGERARDO GUERREO

JAIME CAMINO VALDEZJAVIER MURILLO MERO