trabajo tecnicas separacion

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1. Por desplazamiento de gas: con membrana de separación o con pistón impulsado por un gas. 2. Bombas eléctricas: el movimiento de pistón lo obtiene de un motor eléctrico. Pueden ser de tipo jeringa o de tipo alternativo. Los modelos más frecuentes son de este último tipo. Consisten en un pistón que se mueve hacia adelante y hacia atrás, de forma cíclica, dentro de una cámara que puede tener una capacidad entre 35 y 400 microlitros. Durante el proceso de retroceso del pistón, este aspira a la fase móvil al interior de la cámara. La utilización de este tipo de bombas conlleva de forma imprescindible al empleo del atenuador de pulsos. A. Gradientes Las separaciones cromatográficas pueden realizarse sin variar las condiciones de composición de fase móvil y caudal. A este tipo de separaciones se las denomina separaciones isocráticas, si las condiciones van variando a lo largo del proceso de separación se las denomina separaciones en gradiente. Existen dos tipos de gradientes: Gradientes de elución y Gradientes de caudal . 1. Formadores de gradientes de elucción Puede suceder que para unas determinadas separaciones se necesite variar de forma continua la composición de la fase móvil, es decir realizar la separación en gradiente de elución. Para ir variando la composición de forma exacta y reproducible existen los formadores de gradiente. Los gradientes pueden formarse de dos maneras: a presión baja o a presión alta. Los formadores de presión baja pueden a su vez ser de dos tipos, uno de ellos, el más sencillo, que consiste en la adición

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1. Por desplazamiento de gas: con membrana de separación o con pistón impulsado por un gas.

2. Bombas eléctricas: el movimiento de pistón lo obtiene de un motor eléctrico. Pueden ser de tipo jeringa o de tipo alternativo. Los modelos más frecuentes son de este último tipo. Consisten en un pistón que se mueve hacia adelante y hacia atrás, de forma cíclica, dentro de una cámara que puede tener una capacidad entre 35 y 400 microlitros. Durante el proceso de retroceso del pistón, este aspira a la fase móvil al interior de la cámara. La utilización de este tipo de bombas conlleva de forma imprescindible al empleo del atenuador de pulsos.

A. Gradientes

Las separaciones cromatográficas pueden realizarse sin variar las condiciones de composición de fase móvil y caudal. A este tipo de separaciones se las denomina separaciones isocráticas, si las condiciones van variando a lo largo del proceso de separación se las denomina separaciones en gradiente. Existen dos tipos de gradientes: Gradientes de elución y Gradientes de caudal.

1. Formadores de gradientes de elucción

Puede suceder que para unas determinadas separaciones se necesite variar de forma continua la composición de la fase móvil, es decir realizar la separación en gradiente de elución. Para ir variando la composición de forma exacta y reproducible existen los formadores de gradiente. Los gradientes pueden formarse de dos maneras: a presión baja o a presión alta. Los formadores de presión baja pueden a su vez ser de dos tipos, uno de ellos, el más sencillo, que consiste en la adición controlada de los solventes A y B en una cámara de mezclas situada antes de la bomba del cromatógrafo (fig. 28.9); el otro tipo puede describirse de forma parecida a la anterior ya que lo único que varía son el tipo de válvulas proporcionales que varían el flujo muy rápida y exactamente, este tipo de formador de gradiente necesita el control proporcionado por microprocesadores.

El formador de gradiente a presión alta necesita la participación de dos bombas que están situadas delante de la cámara de mezcla y ambas están controladas por un microprocesador, al exigir para la formación del gradiente dos bombas hace que el equipo tenga un coste más elevado.

Si se presenta la variación de la composición de los componentes de las fases móviles respecto al tiempo obtendremos lo que se denomina perfil de gradiente. Como se observa el gradiente de elución se puede realizar de

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tres formas distintas, para que nos de tres perfiles uno cóncavo, lineal y convexo. Hay que tener siempre en cuenta que cuando ha terminado el gradiente de elución hay que volver a las condiciones primitivas y que la columna esté equilibrada ( línea base recta horizontal) antes de inyectar otra muestra.

2. Gradientes de caudal

En algunas separaciones tales como ciertas vitaminas hidrosolubles es precios variar el caudal durante el proceso cromatográfico, para mejorar la resolución de los picas y sobre todo para acortar el tiempo de análisis de los últimos picos. El gradiente puede realizarse en forma lineal o exponencial. La forma de obtener este tipo de gradientes no es demasiado compleja. Hay que tener en cuenta que al variar el caudal varía la presión y por lo tanto la línea base aportada por los detectores, hay que tener en cuenta que como en el caso del gradiente de elución, no todos los detectores pueden emplearse, por ejemplo el que basa su respuesta en la medida del índice de refracción.

B. Atenuadores de pulsos

Su empleo reside en el acondicionamiento de una línea base estabilizada, al emplear detectores muy sensibles, se verían reflejados los pulsos, resultando imposible la utilización. Los sistemas más utilizados son un entubado con un diafragma o una columna rellena de cristales pequeños.

C. Inyectores

Aunque en la actualidad ya se puede disponer de inyectores automáticos, los clásicos responden a dos sistemas: de bucle y de resistencia hidrodinámica.

D. Columnas

Según sea su constitución, la clasificación de las columnas en la actualidad se realiza atendiendo a cuatro criterios relativos a las características del relleno:

1. En función de su consistenciaa) Sólidos rígidos: básicamente consisten en una matriz de SiO2.

Fueron los primeros en usarse e incluso hoy su uso está

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Figura 28.8.- Distintos equipos de formadores de gradiente de elución.

ampliamente difundido. Pueden resistir presiones elevadas, del orden de 10.000- 15.000 psi (libras por pulgada cuadrada) cuando están constituidas por partículas de relleno muy pequeñas. Se las puede ligar químicamente con distintos grupos funcionales, lo que implica multiplicar las aplicaciones de estas columnas.

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b) Geles duros: su constitución es de partículas porosas de polilestireno cuya superficie se ha rodeado con divinilbenceno. Su máxima limitación de presión es de 5000 psi. Se usan con fases móviles orgánicas, así como en IEC.

c) Geles blandos: pertenecen a este tipo los conocidos rellenos de Agarosa y Sephadex, que no pueden resistir las altas presiones de la técnica de HPLC, y por tanto no son usadas en ella.

2. Según la porosidad de las partículasLas partículas, básicamente, son esféricas, se fabrican sobre lechos de cristales también esféricos; según las variantes del método de producción emplead, se obtendrán lechos porosos, superficialmente porosos o nada porosos ( peculiares).

3. En función de la forma de las partículasEn la actualidad existe la tendencia a usar columnas constituidas por partículas irregulares, para lograrse mayor compacidad.

4. En función del diámetro medio de partículasModernamente, en HPLC, es posibles encontrar rellenos de 5 micrómetros de diámetro de partícula, en adelante. En general, es aconsejable trabajar con partículas de tamaño pequeño y que además presenten una dispersión de tamaño pequeño, para lograr mayor resolución. Al disminuir el tamaño de partícula se necesitará aumentar la presión requerida para conservar el flujo constante.Una columna de las usadas en HPLC, podría pensarse que estará construida por un cilindro de acero uniformemente liso en su interior: pero esto supondría una menor capacidad, justamente al lado de la pared, por lo que constituiría un canal “preferencial”. La existencia de canales preferenciales contribuye a aumentar el ancho de banda, por tanto, a disminuir la eficiencia de la columna.Es por esta razón que las primeras columnas lisas utilizadas han sido sustituidas en la moderna HPLC por cubiertas rugosas, de forma que así se logra aumentar la capacidad y por tanto la eficiencia de la columna.Aún con paredes rugosas e irregulares no se ha logrado que el compactado de las partículas de los laterales de la columna sea tan uniforma como el de las del centro. Por ello se ideó actuar sobre la pared de la columna con un sistema de fuerzas radiales y homogéneas para que el compactado fuera más uniforme. Así nacieron las llamadas columnas de compresión radial, una de las aportaciones más recientes de HPLC (fig. 28.9).

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Figura 28.9.- Columna de compresión radial.

Su fundamento es crear las fuerzas de compresión radial sobre la pared deformable de la columna mediante un baño de glicerina que la rodea a toda ella; pues si ejerce una presión sobre la glicerina, ésta crearía indirectamente una presión sobre la columna, que será homogénea y radial, puesto que la glicerina baña longitudinalmente la columna. En teoría bastaría con un pequeño orificio por donde se ejercería la presión, afectando por igual a toda la columna.Se utiliza glicerina por ser un fluido viscoso, capaz de transmitir cualquier presión ejercida en ella por igual. Inicialmente la glicerina se presurizaba con gas N2 suministrado por una bombona, pero por razones de comodidad y espacio actualmente se comprime mecánicamente.Realizando estas modificaciones, se pueden observar ciertas ventajas de las columnas de compresión radial, sobre las clásicas:

Aumenta la homogeneidad del relleno, pues evita los canales preferenciales por los laterales.

Ejerciendo esta compresión radial sobre las paredes de la columna se consigue directamente hacerlas rugosas, pero no solo a nivel macroscópico, sino en las magnitudes microscópicas de las partículas del relleno.No solamente se consigue una ondulación que acopla perfectamente a las partículas sino que además esta ondulación es reversible, evitando la posible creación de huecos( si alguna de las partículas que formaban el relleno dejó de ocupar su sitio) donde se disiparía la presión.

Permite trabajar con flujos mayores, puesto que requieren una presurización mucho menor ( 300 psi) que las clásicas ( 3500 psi), en función de que su relleno es más homogéneo y, por tanto, se fabrican de diámetro mucho mayor.

Por todos estos motivos se obtienen valores mucho más reproducibles y se optimiza la separación.

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Como se trabaja a menor presión y a mayor flujo, los análisis son más rápidos.

La resolución lograda resulta ser muy parecida empleando flujos altos o bajos, con lo cual, se obtienen análisis rápidos pero con resolución muy alta.

No necesitan reducir el flujo para efectuar cambios de la composición, operación que es precisa con columna clásicas.

Por todo lo dicho, su fabricación puede ser menos sofisticada, lo cual hace que sean más económicas.

E. Sistemas de detección

Está situado a la salida de la columna, origina una señal eléctrica continua, que una vez amplificada y registrada da lugar al cromatograma. Como hemos indicado anteriormente el cromatograma proporciona información continua acerca de los que circula dentro de la célula del detector.

1. Características del detector que no afectan la eficacia de la columna

Respuesta. Es la señal producida por el detector a una determinada variación de la propiedad física, que está midiendo. Esta propiedad física es proporcional a la variación de masa. La señal generada por este varía linealmente con la concentración o cantidad de masa que sale pro unidad de tiempo de la columna.

y= A C r (Ec. 28.32.)donde y es la señal producida, A la constante de proporcionalidad, r el índice de respuesta que mide el grado de linealidad de la respuesta del detector.

Ruido del detectorComo ya se ha comentado anteriormente, ruido instrumental es cualquier perturbación de la señal producida por el detector que no es debida a la presencia de soluto.En cromatografía de líquidos existen tres tipos de ruido. Ruido de corto alcance, ruido de largo alcance y deriva (fig. 28.10.). El ruido de corto alcance es debido al componente electrónico del detector, puede evitarse mediante el empleo de filtros electrónicos. Su manifestación consiste en un perturbación de la línea base cuya frecuencia es mayor que la inversa del ancho del pico de soluto expresado en segundos.

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Figura 28.10.- Ruidos que pueden presentarse en los detectores cromatográficos.

El ruido de largo alcance. Es la perturbación que presenta la línea base, tiene una frecuencia del mismo orden que la inversa del ancho del pico del soluto expresado en segundos; al contrario que el caso anterior este si dificulta la interpretación del cromatograma. Su existencia es debido a componentes del detector tales como la lámpara, circuitos, etc. No puede evitarse con filtros electrónicos.Deriva es al perturbación de la línea base con una frecuencia mucho mayor que la inversa del ancho del pico de soluto expresado en segundos. Puede ser debida a la variación de la temperatura del detector, a cambios de la composición de la fase móvil.Se denomina ruido de fondo a la señal producida por el detector a la acción conjunta del ruido de corto alcance y del ruido de largo alcance.

SensibilidadSe define como la mínima concentración de soluto o la mínima cantidad de soluto, que de una señal dos veces mayor que la señal procedente del ruido. Depende del ruido del detector y nos indica la cantidad mínima de soluto que podemos detectar en un problema.

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Intervalo dinámico de un detectorComo hemos visto anteriormente la respuesta del detector ha de ser dependiente de la cantidad de soluto que pasa por el detector. El intervalo dinámico es pues, el intervalo de concentraciones de soluto entre las que el detector produce una respuesta dependiente. El mismo estaría comprendido entre el valor de la sensibilidad (concentración mínima) y el valor máximo (concentración de saturación).Existe un intervalo dinámico lineal, que es el intervalo de concentraciones en las que la respuesta del detector sea lineal. En cualquier detector siempre nos interesa que este intervalo sea lo mayor posible.

2. Características del detector que pueden modificar la eficacia de la columna

El detector puede modificar la eficacia de la columna (ensanchando el pico correspondiente) por dos motivos: por el volumen de la célula de medida, ya que al ser grande puede producir el ensanchamiento, el detector puede actuar como un diluidor exponencial y producir la mezcla de dos solutos que han sido separados por la columna y al tiempo de respuesta debido al retraso del registro de la señal debido a la electrónica del instrumento.Existe una distorsión entre el cromatograma debido al desfase existente entre lo que está sucediendo en la célula de flujo y los datos obtenidos. Se debe al tiempo que se necesita en amplificar la señal y a la parte de los circuitos eléctricos del detector ( tiempo de respuesta). Se define como la constante de amplificación ( en segundos) y es característica del detector. También se conoce como constante de tiempo del detector.Si la constante de tiempo es grande, un pico que sale de la columna se verá ensanchado. Para obtener toda la eficacia que son capaces de suministrar las columnas, la constante de tiempo debe ser inferior de 100 ms.

3. Condiciones que debe reunir el detector

Un detector ideal debe cumplir ciertas condiciones tales como: Respuesta universal con todos los solutos. Sensibilidad alta por ejemplo con concentraciones de 10 elevado a -

12 y a -11 g/ml de soluto.

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Que el ruido de fondo del detector sea muy bajo. La célula de medida del detector debe tener un volumen muy

pequeño para evitar un mayor ensanchamiento de los picos. No debe ser destructivo, es decir no debe destruir la muestra. Debe ser capaz de funcionar durante mucho tiempo seguido y ser de

manejo fácil y cómodo.

4. Clasificación de los detectores

Se pueden clasificar como detectores de concentración y detectores de masa. Los detectores de concentración originan una señal proporcional a la concentración de soluto en la fase móvil se utilizan mucho en cromatografía de alta eficacia HPLC. Los detectores de masa relacionan la cantidad absoluta de soluto independientemente del volumen del elemento de fluido.También se puede clasificar como:Detectores universales: Acusan los cambios en una propiedad física muy común a todas las moléculas, por ejemplo la medida del índice de refracción. Detectores selectivos: Detectan una serie de propiedades muy específicas que no las tienen todas las moléculas, por ejemplo la adsorción ultravioleta-visible. Detectores específicos: Responden solo a un número muy limitado de moléculas, por ejemplo medidas de fluorescencia , electroquímicas…Finalmente también pueden clasificarse dependiendo de la forma de detección en : Detectores ópticos: Refractómetros, fotómetros, espectómetros, fluorímetros, fotómetros de llama, fotómetros de adsorción atómica. Detectores eléctricos: Amperímetros, conductímetros, polarografos y otros detectores: Espectómetros de masa, radiómetros, detectores de ionización de llama. Siguiendo ésta última clasificación distinguiremos los siguientes:

a) Detectores espectrofotométricos

Miden el cambio de la adsorbancia A, definida por la ley de Lambert-Beer. Las fuentes de radiaciones son lámparas que puede proporcionar espectro discontínuo ( longitudes finasl), por ejemplo, la lámpara de vapor de mercurio a 254 nm y lámparas que suministren un espectro continuo, utilizándose para la selección de radiaciones un monocromador( detectores de longitud de onda variable) o filtros ( detectores de longitud de onda fija), la celda de flujo por su parte es de pequeño volumen, generalmente la más

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utilizadas de 10 microlitros. La disposición experimental de estas celdas de flujo adoptan dos diseños principalmente, en forma de Z o en forma de doble T (fig.28.11 y 28.12). Es un detector específica ya que los solutos deben adsorber a la longitud de onda en que se está midiendo, aunque este hecho con el proceso de derivatización estaría ya superado, uno de los posibles problemas es la posible adsorción por parte de la fase móvil, este problema puede solventarse como veremos en el capítulo siguiente por variación de la naturaleza de los componentes de las fase móviles o el empleo de detectores de flujo continuo de doble haz. Este tipo de detectores tiene un intervalo lineal de 10 elevado a -5 a 2x 10 elevado a -10 g/ml de sensibilidad y es compatible con las separaciones en gradiente. Su utilización es muy generalizada ya que es raro encontrar moléculas que no adsorban en el intervalo de longitudes de onda que pueda prestar el detector. Los azúcares son una excepción para este tipo de moléculas pueden derivatizarse con marcadores para que adsorban a una determinada longitud de onda, por ejemplo los aminoácidos haciéndoles reaccionar con el 2,4 dinitrofluorobenceno hacen que adsorban fuertemente en el ultravioleta.

b) Detectores de diodos en serie

Estos detectores han supuesto en muchos casos un avance muy importante, ya que puede obtener una detección simultánea de dos tipos de compuestos que pueden adsorber a distintas longitudes de onda, pueden realizar un espectro de adsorción del correspondiente compuesto, con ello se pueden realizar muy adecuadamente análisis de pureza, desarrollar métodos amplificación y dilución.

La muestra problema recibe una radiación pocromática, una vez atravesada la célula del detector, un sistema de dispersión de radiaciones las conduce a un sistema de diodos, entre 500 y 1000 diodos de silicio colocados en fila y separados unos de otros 2nm, recibiendo simultáneamente un espectro comprendido entre 200 y 800 nm; como puede comprenderse es necesario estar provisto de un microprocesador para captar y procesar las señales recibidas. Este instrumento puede determinar moléculas que adsorban en el ultravioleta-visible, la gran ventaja que tiene el instrumento es la determinación simultánea de sustancias que adsorban a distintas longitudes de onda, por ejemplo extractos vegetales.

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Figura 28.11.- Esquema de un detector de flujo continuo cuya célula tiene una disposición en forma de Z.

Figura 28.12.- Esquema de un detector de flujo continuo cuya célula tiene una disposición en forma de T.

c) Espectrofluorímetros

Detecta la fluorescencia emitida por cada soluto en una celda de flujo continuo, de 5 a 8 microlitros de volumen. Para ello, habrá que excitar la molécula en solución a una determinada longitud de onda, recogiendo por un microdetector, colocado generalmente a 90º respecto al haz excitador, la radiación emitida por la muestra, se pueden seleccionar las distintas longitudes de onda mediante filtros o aún mejor con el empleo de monocromadores de red de defracción (fig.22.13). Otra de las ventajas de estos detectores es su sensibilidad unas 10 a 100 veces más sensible que el UV, debemos tener en cuenta la posibilidad de que los componentes de la fase móvil tengan fluorescencia. Presenta una linearidad de 10 elevado a 3 y como el UV es compatible con las separaciones en gradiente. Dada la gran sensibilidad de la fluorimetría es muy utilizado para la determinación de fármacos y sus correspondientes metabolitos en

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el organismo, determinación de toxinas tanto en los alimentos como en el organismo, por ejemplo las aflatoxinas.

Figura 28.13.- Esquema de un detector cromatográfico de medida de la fluorescencia.

d) Conductímetros

Miden una propiedad muy universal, que exhiben las sustancias al pasar por la célula de flujo. Se aplica una diferencia de potencial a los electrodos, la resistencia se mide por un puente de Whetstone, son poco sensibles y al ser un detector muy universal, mide todo lo que pasas y aún las impurezas (fig. 28.14). Su sensibilidad es algo mejor que el detector de índice de refracción (10 elevado a -8), su linearidad es prácticamente igual. Tiene una gran aplicación en cromatografía de intercambio iónico y en la cromatografía iónia.

Figura 28.14.- Esquema de un detector cromatográfico de medida del índice de refracción.

e) Espectrómetros de masas

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Esta idea de combinar un método analítico universal para elucidación de estructuras con otro separativo es muy atrayente, aunque en cromatografía de gases este detector está muy bien conseguido, en líquidos no lo está, ya que es preciso recoger el líquido eluido en una cámara de vaporización. Si los compuestos de las fases móviles son volátiles el problema ya es menor, aunque surgen otros inconvenientes, pero como veremos más tarde, existen muchas fases móviles, muy utilizadas, cuyo componente principal es el agua que no es muy volátil. Una de las interfases cromatógrafo-detector se muestra en la figura 28.15.

Figura 28.15.- Sistema de conexión LC/MS. LC: Entrada líquido procedente del cromatógrafo de líquidos. C.P.: Cinta transportadora móvil de poliamida. C1: Calefactor infrarrojo para evaporación del disolvente. C2: Calefactor de vaporización de la muestra. C3: Calefactor de residuos de la cinta transportadora. C.V.: Cámara de vacío, MS: Salida de la muestra vaporizada hacia la cámara de ionización del espectrómetro de masas.

f) Detector de radiaciones gamma

Es un tipo de detección utilizado para la medida de marcadores radiaciones gamma que se utilizan en radiofarmacia.

La mayor parte de los detectores manufacturados están diseñados como detectores de scintillación de los rayos X y radiaciones gamma. Constan de un cristal de ioduro de sodio activado con talio, que produce una radiación electromagnética cuya intensidad es proporcional a la energía de la emisión y a su velocidad. La señal es recogida por un fotomultiplicador, que amplía la señal y se puede

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procesar de diversas formas (fig.28.16). Las células de medida están construidas por bucles de longitudes y diámetros internos distintos, el volumen activo que normalmente se utiliza es el de 10 microlitros. Las posibilidades de cambio se realizarán para aumentar la sensibilidad y exactitud.

Otro de los métodos de detección que tiene un gran potencial de utilización es el que utiliza las transformadas de Fourier. Como hemos comprobado en el capítulo correspondiente a la espectroscopía de radiación infrarroja, el gran número de bandas de adsorción ofrece una gran posibilidad de obtener un detector tanto a nivel universal como selectivo ofreciendo una gran cantidad de información estructural, pudiéndose utilizar en las cromatografías de fluidos supercríticos.

Figura 28.16.- Esquema de un detector cromatográfico de radioactividad empleado para la valoración de radiofármacos.