Micro Biologic A

Aplicao de mtodos rpidos para controle microbiolgico

Neliane F.A.SilveiraITAL

SEMINRIO FOOD DESIGN: TENDENCIAS EM HACCP

28 DE SETEMBRO DE 2006

Mtodos rpidos ou alternativos

Para que servem? Usados em que situaes?

O que seriam?

Grandes tendncias

Hoje: Todos preocupados com :

Inocuidade e Qualidade dos alimentos: Monitoramento e Anlise Microbiologicas

QUALIDADE DOS ALIMENTOS

Verificado por : Indicadores Bactrias totais Mesfilos Psicrotroficas Termofilas S. aureus - homem- portador Fungos- limpeza do local Contaminao fecal_ Totais- Termotolerantes e E. coli Enterobacteriaceae

Inocuidade Verificada pelos patogenos: Gram-positivos-( Intoxicao)-Listeria

monocytogenes, S. aureus, C. perfringens, Bacillus cereus

Gram negativos: (Infeco) Salmonella, Vibrio, E coli patogenicas, Campylobactyer, E,sakazakii,Shigella Aeromonas, etc,.

Verificao:

Mtodos tradicionais, culturais, clssicos

Mtodos alternativos ou rpidos : Porque a procura??????

Culturais: Problemas: pouco elaborados, trabalhosos, demorados, muito material de laboratrio, requer pessoal treinado, sujeito a falhas humanas.

Problemas com os mtodos tradicionais:

Sensibilidade insuficiente- capacidade de detectar o que o mtodo prope,

Especificidade:Detecta so microrganismo procurado- nem sempre ocorre!- da falso negativos

Repetitividade: Se o operador fizer 50 vezes-ele obtem o mesmo resultado- no ocorre

Reprodutibilidade: Gerar resultados estatisticamente iguais - nem sempre ocorre!!

Mtodos novos no mercado

No perodo de 1993 ate 2000- houve uma exploso no mercado de testes alternativos comeando em pases desenvolvidos : ate o ano 2000- muita confuso na rea!!!

Atualmente: O mercado filtrou os que no funcionavam e hoje os que esto ai, so mtodos confiveis!

Objetivos dos mtodos rpidos em anlises microbiologicas

1.Melhorar a eficincia dos laboratrios, simplificando trabalhos, reduzindo o custo no geral, aumentando a capacidade analtica

2. Aumentar confiabilidade dos resultados_ no preparado pelo analista- kit vem pronto

3. Aumentar a preciso dos resultados Mesmo assim: deve ter um microbiologista

treinado

Mtodos Rpidos- 3 grupos

1. Automao laboratorial

2. Mtodos rpidos para avaliar a qualidade

3.Mtodos rpidos para avaliar inocuidade

1. Automao laboratorial

Utilizado nas etapas da analise: a . Pesagem- Por ex, atravs de um

aparelho chamado DILUTER - ajustado que ao colocar a amostra, pesa a aliquota desejada, e j dilui acrescentando a gua necessaria para a diluio!

b . Homogeneizao- Uso do stomacher-homogeneizador de pisto

Continuao: automao laboratorial

c .Semeadura - Utilizao de um aparelho chamado- spiral plater- a amostra semeada na placa, atraves de uma canula, que verte o inoculo, e a placa fica numa superficie que gira.

d .Plaqueamento-Contagens no geral - Com novos meios como os cromogenicos - uteis para identificar certos microrganismos - j seleciona melhor, evitando testes bioquimicos inteis

2. Mtodos para avaliao da qualidade

Mtodos de contagem- direta e indireta

Contagem Direta 1. Membrana filtrante_ Utilizada para lquidos onde grande

quantidade necessitada para amostra : utilizada em gua, refrigerantes,

2. Mtodos de contagem fluorogenicos_ como LST MUG-no caso-baseada na propriedade da E coli- o indicador procurado- adiciona-se MUG (u-metil umbeliferil beta-d-glico

rondeo) ao caldo da cultura (presuntivo)- O nmero de tubos com gs e fluorescentes apos 24 h, ou 48- sob luz ultra-violeta visvel,da o numero mais provvel de E.coli por grama

E coli- tem a enzima glucoronidase que degrada o MUG e da fluorescncia

Um exemplo:Colilert

Vantagens: SimplesNo requer trabalho de preparoExecuo rpidaNao exige confirmaoNo requer equipamento de leitura

Desvantagem: ser aprovado s p/ gua

Existem testes de outras marcas comerciais semelhantes(mesmo principio) a este aqui exposto,

esse foi citado como exemplo por ter sido o primeiroconhecido no mercado.

1 . Galactopiranosdeo ortonitrofenilONPG

ortonitrofenil ortonitrofenol

(Cor amarela)

oxidao

( P = reagente Colilert )

Onde , ONPG = enzima presente nos coliformes totais orto nitro fenil galacturonidase

2. 4-metil umbeliferil glucorondeoglucoronidase

( P = reagente Colilert )

4 metil umbeliferil

oxidao

4-metil umbeliferona

Produo de brilho fluorescente

Onde, glucoronidase = enzimas presentes nas E. coli

COLILERT

VANTAGENS DESVANTAGENS

Resultado em 24h

Praticidade na inoculao: placa de Petri, pipeta,...

Economia de tempo

Leitura aps 28h fornece resultado no confivel devido

ao efeito limitado do antibitico Solanium: leitura deve ser efetuada entre 24 -

28h aps a incubao.

Apenas para amostras de gua.

QUANTI-TRAY/2000 Fabricante = IDEXX Laboratories Inc.

uma adaptao do sistema dos tubos mltiplos (NMP) , envolvendo , portanto, uma tabela de leitura com base estatstica.

100ml de amostra de gua

+ Colilert Distribuio na cartela contendo os tubos

Leitura sob luz UV Selagem da cartelaincubao

Tabela Resultado em NMP

Contagem direta- continuao-

3. Sistemas prontos para uso- Ex: Placas de simplate_ 1 placa so- com

sulcos- amostra diluida-Ex:Contagem total Placas de Petrifilm-3M - cartes-Coliformes,

S. aureus, Fungos, Contagem total, etc. Placas de compact dry- Verus-Madasa- idem Ilustrao:

PETRIFILM COLIFORMES (AOAC 991.14)

Coliformes totais e E. coli em amostras de alimentos em geral

Fabricante= 3M Prods para Microbiologia

Princpio de funcionamento Modificao do mtodo tradicional de contagem de clulas viveis em placas

Placas de Petrifilm

Vista Superiorou planta

Filme de polipropileno

Adesivo c/ corante indicador

Gis hidrossolveis a frio

Nutriente e gis hidros. A friadesivo

Papel quadriculado c/ polietileno

Vista lateral

Amostra diluda 1ml

Espalhar o inculo com um difusor

1 minuto

Gelificao do meio de cultura

Incubao

Contagem de Aerbios colnias vermelhasContagem de coliformes colnias vermelhas com gs

Contagem de Bolores e Leveduras

Contagem de E. coli colnias azuis com gs

Placas para:

Leveduras = Colnias pequenas , rosa escuro a azul esverdeada;

Bolores = colnias grandes , colorao variada

SIMPLATE Fabricante =BIOCONTROL ( www.biocontrolsys.com)

Amostra na

diluio desejada

Meio de cultura

liofilizadoSimplate

+ 100ml de gua destilada estril

agitao Meio de cultura rehidratado

1ml

9ml

Homogeneizao

Remoo do excesso do lquido

incubao

35oC/24h( CT ; colif.)

25oC/72h( B e L )

(Placa de plstico com 84 cavidades)

LEITURA

Colnias vermelhas: presena de

coliformes totais

Luz UVColnias

fluorescentes: presena de E.coli

Tabela de NMP

Simplate CEC

Simplate TPC = Contagem total de bactrias por fluorescncia

Simplate TPC-Cl = Contagem total de bactrias por indicador de cor

Simplate SYM = Contagem de Bolores e Leveduras

Contagem Indireta

1. Bioluminescncia

2. Impedncia/Condutncia

Contagem Indireta

1.Tcnica de Bioluminescncia

Princpio: Quantidade de ATP detectada a partir de clulas

metabolicamente ativas (residuos orgnicos, inclusive microrganismos).

Mecanismo: reao de enzima luciferina-luciferase (cauda do vagalume)

ATP- reage com a enzima produzindo luz, medida em um luminometro

1.Bioluminescncia:

Aplicao comum: Monitoramento de Higienizao em plantas processadoras de alimentos.

Equipamentos comercializados base de bioluminescncia:Lightning e Hi-Lyte.

Consistem em um swab aplicado a superfcie a ser checada: introduz num tubo com os reagentes necessrios e o coloca no luminometro que mede a intensidade da luz:

Quanto mais sujo, + luz!

SISTEMA LIGHTNING Fabricante =BIOCONTROL ( www.biocontrolsys.com)

Sistema Lightning monitora o processo de limpezqa e sanificao de superfcies .

Princpio do mtodo: emisso de bioluminiscncia por ATP.

1 . Luciferina + luciferase + ATP + Mg +2 Luciferil adenilato - luciferase + pirofosfato

2. Luciferil adenilato - luciferase + O2 Luciferase + Oxiluciferina + AMP+ CO2 + LUZ

O substrato Luciferina sofre fosforilao atravs da enzima luciferase , na presena de ATP.

A molcula de ATP pode ser encontrada em : clulas microbianas viveis; clulas no microbianas ( sangue, carne,...)

Sistema Lightning detecta

ATP residual em superfcies

Componentes - sistema Lightning

Swab ; luminmetro ; alicate ; software

Buffer

swab

1

c

2

a

b

Luciferina +

Luciferase

Buffer

swab

1

c

2

a

b

Luciferina +

Luciferase

Procedimento de uso

1 ) Esfregao numa determinada superfcie.

2 ) Pea 1 em 2

3) Entortar a regio a com a mo : escorrimento do buffer ao longo da haste

4) Alicate amassar a regio c para romper a barreira b: permitindo o

contato entre buffer + esfera + estremidade da haste

5 ) Agitar o conjunto 3

6) Introduzir a pea 1 no luminmetro e fazer a leitura 3

tu43

0 2,5 3 7,