micro biologic a
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Aplicao de mtodos rpidos para controle microbiolgico
Neliane F.A.SilveiraITAL
SEMINRIO FOOD DESIGN: TENDENCIAS EM HACCP
28 DE SETEMBRO DE 2006
Mtodos rpidos ou alternativos
Para que servem? Usados em que situaes?
O que seriam?
Grandes tendncias
Hoje: Todos preocupados com :
Inocuidade e Qualidade dos alimentos: Monitoramento e Anlise Microbiologicas
QUALIDADE DOS ALIMENTOS
Verificado por : Indicadores Bactrias totais Mesfilos Psicrotroficas Termofilas S. aureus - homem- portador Fungos- limpeza do local Contaminao fecal_ Totais- Termotolerantes e E. coli Enterobacteriaceae
Inocuidade Verificada pelos patogenos: Gram-positivos-( Intoxicao)-Listeria
monocytogenes, S. aureus, C. perfringens, Bacillus cereus
Gram negativos: (Infeco) Salmonella, Vibrio, E coli patogenicas, Campylobactyer, E,sakazakii,Shigella Aeromonas, etc,.
Verificao:
Mtodos tradicionais, culturais, clssicos
Mtodos alternativos ou rpidos : Porque a procura??????
Culturais: Problemas: pouco elaborados, trabalhosos, demorados, muito material de laboratrio, requer pessoal treinado, sujeito a falhas humanas.
Problemas com os mtodos tradicionais:
Sensibilidade insuficiente- capacidade de detectar o que o mtodo prope,
Especificidade:Detecta so microrganismo procurado- nem sempre ocorre!- da falso negativos
Repetitividade: Se o operador fizer 50 vezes-ele obtem o mesmo resultado- no ocorre
Reprodutibilidade: Gerar resultados estatisticamente iguais - nem sempre ocorre!!
Mtodos novos no mercado
No perodo de 1993 ate 2000- houve uma exploso no mercado de testes alternativos comeando em pases desenvolvidos : ate o ano 2000- muita confuso na rea!!!
Atualmente: O mercado filtrou os que no funcionavam e hoje os que esto ai, so mtodos confiveis!
Objetivos dos mtodos rpidos em anlises microbiologicas
1.Melhorar a eficincia dos laboratrios, simplificando trabalhos, reduzindo o custo no geral, aumentando a capacidade analtica
2. Aumentar confiabilidade dos resultados_ no preparado pelo analista- kit vem pronto
3. Aumentar a preciso dos resultados Mesmo assim: deve ter um microbiologista
treinado
Mtodos Rpidos- 3 grupos
1. Automao laboratorial
2. Mtodos rpidos para avaliar a qualidade
3.Mtodos rpidos para avaliar inocuidade
1. Automao laboratorial
Utilizado nas etapas da analise: a . Pesagem- Por ex, atravs de um
aparelho chamado DILUTER - ajustado que ao colocar a amostra, pesa a aliquota desejada, e j dilui acrescentando a gua necessaria para a diluio!
b . Homogeneizao- Uso do stomacher-homogeneizador de pisto
Continuao: automao laboratorial
c .Semeadura - Utilizao de um aparelho chamado- spiral plater- a amostra semeada na placa, atraves de uma canula, que verte o inoculo, e a placa fica numa superficie que gira.
d .Plaqueamento-Contagens no geral - Com novos meios como os cromogenicos - uteis para identificar certos microrganismos - j seleciona melhor, evitando testes bioquimicos inteis
2. Mtodos para avaliao da qualidade
Mtodos de contagem- direta e indireta
Contagem Direta 1. Membrana filtrante_ Utilizada para lquidos onde grande
quantidade necessitada para amostra : utilizada em gua, refrigerantes,
2. Mtodos de contagem fluorogenicos_ como LST MUG-no caso-baseada na propriedade da E coli- o indicador procurado- adiciona-se MUG (u-metil umbeliferil beta-d-glico
rondeo) ao caldo da cultura (presuntivo)- O nmero de tubos com gs e fluorescentes apos 24 h, ou 48- sob luz ultra-violeta visvel,da o numero mais provvel de E.coli por grama
E coli- tem a enzima glucoronidase que degrada o MUG e da fluorescncia
Um exemplo:Colilert
Vantagens: SimplesNo requer trabalho de preparoExecuo rpidaNao exige confirmaoNo requer equipamento de leitura
Desvantagem: ser aprovado s p/ gua
Existem testes de outras marcas comerciais semelhantes(mesmo principio) a este aqui exposto,
esse foi citado como exemplo por ter sido o primeiroconhecido no mercado.
1 . Galactopiranosdeo ortonitrofenilONPG
ortonitrofenil ortonitrofenol
(Cor amarela)
oxidao
( P = reagente Colilert )
Onde , ONPG = enzima presente nos coliformes totais orto nitro fenil galacturonidase
2. 4-metil umbeliferil glucorondeoglucoronidase
( P = reagente Colilert )
4 metil umbeliferil
oxidao
4-metil umbeliferona
Produo de brilho fluorescente
Onde, glucoronidase = enzimas presentes nas E. coli
COLILERT
VANTAGENS DESVANTAGENS
Resultado em 24h
Praticidade na inoculao: placa de Petri, pipeta,...
Economia de tempo
Leitura aps 28h fornece resultado no confivel devido
ao efeito limitado do antibitico Solanium: leitura deve ser efetuada entre 24 -
28h aps a incubao.
Apenas para amostras de gua.
QUANTI-TRAY/2000 Fabricante = IDEXX Laboratories Inc.
uma adaptao do sistema dos tubos mltiplos (NMP) , envolvendo , portanto, uma tabela de leitura com base estatstica.
100ml de amostra de gua
+ Colilert Distribuio na cartela contendo os tubos
Leitura sob luz UV Selagem da cartelaincubao
Tabela Resultado em NMP
Contagem direta- continuao-
3. Sistemas prontos para uso- Ex: Placas de simplate_ 1 placa so- com
sulcos- amostra diluida-Ex:Contagem total Placas de Petrifilm-3M - cartes-Coliformes,
S. aureus, Fungos, Contagem total, etc. Placas de compact dry- Verus-Madasa- idem Ilustrao:
PETRIFILM COLIFORMES (AOAC 991.14)
Coliformes totais e E. coli em amostras de alimentos em geral
Fabricante= 3M Prods para Microbiologia
Princpio de funcionamento Modificao do mtodo tradicional de contagem de clulas viveis em placas
Placas de Petrifilm
Vista Superiorou planta
Filme de polipropileno
Adesivo c/ corante indicador
Gis hidrossolveis a frio
Nutriente e gis hidros. A friadesivo
Papel quadriculado c/ polietileno
Vista lateral
Amostra diluda 1ml
Espalhar o inculo com um difusor
1 minuto
Gelificao do meio de cultura
Incubao
Contagem de Aerbios colnias vermelhasContagem de coliformes colnias vermelhas com gs
Contagem de Bolores e Leveduras
Contagem de E. coli colnias azuis com gs
Placas para:
Leveduras = Colnias pequenas , rosa escuro a azul esverdeada;
Bolores = colnias grandes , colorao variada
SIMPLATE Fabricante =BIOCONTROL ( www.biocontrolsys.com)
Amostra na
diluio desejada
Meio de cultura
liofilizadoSimplate
+ 100ml de gua destilada estril
agitao Meio de cultura rehidratado
1ml
9ml
Homogeneizao
Remoo do excesso do lquido
incubao
35oC/24h( CT ; colif.)
25oC/72h( B e L )
(Placa de plstico com 84 cavidades)
LEITURA
Colnias vermelhas: presena de
coliformes totais
Luz UVColnias
fluorescentes: presena de E.coli
Tabela de NMP
Simplate CEC
Simplate TPC = Contagem total de bactrias por fluorescncia
Simplate TPC-Cl = Contagem total de bactrias por indicador de cor
Simplate SYM = Contagem de Bolores e Leveduras
Contagem Indireta
1. Bioluminescncia
2. Impedncia/Condutncia
Contagem Indireta
1.Tcnica de Bioluminescncia
Princpio: Quantidade de ATP detectada a partir de clulas
metabolicamente ativas (residuos orgnicos, inclusive microrganismos).
Mecanismo: reao de enzima luciferina-luciferase (cauda do vagalume)
ATP- reage com a enzima produzindo luz, medida em um luminometro
1.Bioluminescncia:
Aplicao comum: Monitoramento de Higienizao em plantas processadoras de alimentos.
Equipamentos comercializados base de bioluminescncia:Lightning e Hi-Lyte.
Consistem em um swab aplicado a superfcie a ser checada: introduz num tubo com os reagentes necessrios e o coloca no luminometro que mede a intensidade da luz:
Quanto mais sujo, + luz!
SISTEMA LIGHTNING Fabricante =BIOCONTROL ( www.biocontrolsys.com)
Sistema Lightning monitora o processo de limpezqa e sanificao de superfcies .
Princpio do mtodo: emisso de bioluminiscncia por ATP.
1 . Luciferina + luciferase + ATP + Mg +2 Luciferil adenilato - luciferase + pirofosfato
2. Luciferil adenilato - luciferase + O2 Luciferase + Oxiluciferina + AMP+ CO2 + LUZ
O substrato Luciferina sofre fosforilao atravs da enzima luciferase , na presena de ATP.
A molcula de ATP pode ser encontrada em : clulas microbianas viveis; clulas no microbianas ( sangue, carne,...)
Sistema Lightning detecta
ATP residual em superfcies
Componentes - sistema Lightning
Swab ; luminmetro ; alicate ; software
Buffer
swab
1
c
2
a
b
Luciferina +
Luciferase
Buffer
swab
1
c
2
a
b
Luciferina +
Luciferase
Procedimento de uso
1 ) Esfregao numa determinada superfcie.
2 ) Pea 1 em 2
3) Entortar a regio a com a mo : escorrimento do buffer ao longo da haste
4) Alicate amassar a regio c para romper a barreira b: permitindo o
contato entre buffer + esfera + estremidade da haste
5 ) Agitar o conjunto 3
6) Introduzir a pea 1 no luminmetro e fazer a leitura 3
tu43
0 2,5 3 7,