Micro Biologic A

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  • Aplicao de mtodos rpidos para controle microbiolgico

    Neliane F.A.SilveiraITAL

    SEMINRIO FOOD DESIGN: TENDENCIAS EM HACCP

    28 DE SETEMBRO DE 2006

  • Mtodos rpidos ou alternativos

    Para que servem? Usados em que situaes?

    O que seriam?

  • Grandes tendncias

    Hoje: Todos preocupados com :

    Inocuidade e Qualidade dos alimentos: Monitoramento e Anlise Microbiologicas

  • QUALIDADE DOS ALIMENTOS

    Verificado por : Indicadores Bactrias totais Mesfilos Psicrotroficas Termofilas S. aureus - homem- portador Fungos- limpeza do local Contaminao fecal_ Totais- Termotolerantes e E. coli Enterobacteriaceae

  • Inocuidade Verificada pelos patogenos: Gram-positivos-( Intoxicao)-Listeria

    monocytogenes, S. aureus, C. perfringens, Bacillus cereus

    Gram negativos: (Infeco) Salmonella, Vibrio, E coli patogenicas, Campylobactyer, E,sakazakii,Shigella Aeromonas, etc,.

  • Verificao:

    Mtodos tradicionais, culturais, clssicos

    Mtodos alternativos ou rpidos : Porque a procura??????

    Culturais: Problemas: pouco elaborados, trabalhosos, demorados, muito material de laboratrio, requer pessoal treinado, sujeito a falhas humanas.

  • Problemas com os mtodos tradicionais:

    Sensibilidade insuficiente- capacidade de detectar o que o mtodo prope,

    Especificidade:Detecta so microrganismo procurado- nem sempre ocorre!- da falso negativos

    Repetitividade: Se o operador fizer 50 vezes-ele obtem o mesmo resultado- no ocorre

    Reprodutibilidade: Gerar resultados estatisticamente iguais - nem sempre ocorre!!

  • Mtodos novos no mercado

    No perodo de 1993 ate 2000- houve uma exploso no mercado de testes alternativos comeando em pases desenvolvidos : ate o ano 2000- muita confuso na rea!!!

    Atualmente: O mercado filtrou os que no funcionavam e hoje os que esto ai, so mtodos confiveis!

  • Objetivos dos mtodos rpidos em anlises microbiologicas

    1.Melhorar a eficincia dos laboratrios, simplificando trabalhos, reduzindo o custo no geral, aumentando a capacidade analtica

    2. Aumentar confiabilidade dos resultados_ no preparado pelo analista- kit vem pronto

    3. Aumentar a preciso dos resultados Mesmo assim: deve ter um microbiologista

    treinado

  • Mtodos Rpidos- 3 grupos

    1. Automao laboratorial

    2. Mtodos rpidos para avaliar a qualidade

    3.Mtodos rpidos para avaliar inocuidade

  • 1. Automao laboratorial

    Utilizado nas etapas da analise: a . Pesagem- Por ex, atravs de um

    aparelho chamado DILUTER - ajustado que ao colocar a amostra, pesa a aliquota desejada, e j dilui acrescentando a gua necessaria para a diluio!

    b . Homogeneizao- Uso do stomacher-homogeneizador de pisto

  • Continuao: automao laboratorial

    c .Semeadura - Utilizao de um aparelho chamado- spiral plater- a amostra semeada na placa, atraves de uma canula, que verte o inoculo, e a placa fica numa superficie que gira.

    d .Plaqueamento-Contagens no geral - Com novos meios como os cromogenicos - uteis para identificar certos microrganismos - j seleciona melhor, evitando testes bioquimicos inteis

  • 2. Mtodos para avaliao da qualidade

    Mtodos de contagem- direta e indireta

  • Contagem Direta 1. Membrana filtrante_ Utilizada para lquidos onde grande

    quantidade necessitada para amostra : utilizada em gua, refrigerantes,

    2. Mtodos de contagem fluorogenicos_ como LST MUG-no caso-baseada na propriedade da E coli- o indicador procurado- adiciona-se MUG (u-metil umbeliferil beta-d-glico

    rondeo) ao caldo da cultura (presuntivo)- O nmero de tubos com gs e fluorescentes apos 24 h, ou 48- sob luz ultra-violeta visvel,da o numero mais provvel de E.coli por grama

    E coli- tem a enzima glucoronidase que degrada o MUG e da fluorescncia

  • Um exemplo:Colilert

    Vantagens: SimplesNo requer trabalho de preparoExecuo rpidaNao exige confirmaoNo requer equipamento de leitura

    Desvantagem: ser aprovado s p/ gua

    Existem testes de outras marcas comerciais semelhantes(mesmo principio) a este aqui exposto,

    esse foi citado como exemplo por ter sido o primeiroconhecido no mercado.

  • 1 . Galactopiranosdeo ortonitrofenilONPG

    ortonitrofenil ortonitrofenol

    (Cor amarela)

    oxidao

    ( P = reagente Colilert )

    Onde , ONPG = enzima presente nos coliformes totais orto nitro fenil galacturonidase

    2. 4-metil umbeliferil glucorondeoglucoronidase

    ( P = reagente Colilert )

    4 metil umbeliferil

    oxidao

    4-metil umbeliferona

    Produo de brilho fluorescente

    Onde, glucoronidase = enzimas presentes nas E. coli

  • COLILERT

    VANTAGENS DESVANTAGENS

    Resultado em 24h

    Praticidade na inoculao: placa de Petri, pipeta,...

    Economia de tempo

    Leitura aps 28h fornece resultado no confivel devido

    ao efeito limitado do antibitico Solanium: leitura deve ser efetuada entre 24 -

    28h aps a incubao.

    Apenas para amostras de gua.

  • QUANTI-TRAY/2000 Fabricante = IDEXX Laboratories Inc.

    uma adaptao do sistema dos tubos mltiplos (NMP) , envolvendo , portanto, uma tabela de leitura com base estatstica.

    100ml de amostra de gua

    + Colilert Distribuio na cartela contendo os tubos

    Leitura sob luz UV Selagem da cartelaincubao

    Tabela Resultado em NMP

  • Contagem direta- continuao-

    3. Sistemas prontos para uso- Ex: Placas de simplate_ 1 placa so- com

    sulcos- amostra diluida-Ex:Contagem total Placas de Petrifilm-3M - cartes-Coliformes,

    S. aureus, Fungos, Contagem total, etc. Placas de compact dry- Verus-Madasa- idem Ilustrao:

  • PETRIFILM COLIFORMES (AOAC 991.14)

    Coliformes totais e E. coli em amostras de alimentos em geral

    Fabricante= 3M Prods para Microbiologia

    Princpio de funcionamento Modificao do mtodo tradicional de contagem de clulas viveis em placas

    Placas de Petrifilm

    Vista Superiorou planta

    Filme de polipropileno

    Adesivo c/ corante indicador

    Gis hidrossolveis a frio

    Nutriente e gis hidros. A friadesivo

    Papel quadriculado c/ polietileno

    Vista lateral

  • Amostra diluda 1ml

    Espalhar o inculo com um difusor

    1 minuto

    Gelificao do meio de cultura

    Incubao

    Contagem de Aerbios colnias vermelhasContagem de coliformes colnias vermelhas com gs

    Contagem de Bolores e Leveduras

    Contagem de E. coli colnias azuis com gs

    Placas para:

    Leveduras = Colnias pequenas , rosa escuro a azul esverdeada;

    Bolores = colnias grandes , colorao variada

  • SIMPLATE Fabricante =BIOCONTROL ( www.biocontrolsys.com)

    Amostra na

    diluio desejada

    Meio de cultura

    liofilizadoSimplate

    + 100ml de gua destilada estril

    agitao Meio de cultura rehidratado

    1ml

    9ml

    Homogeneizao

    Remoo do excesso do lquido

    incubao

    35oC/24h( CT ; colif.)

    25oC/72h( B e L )

    (Placa de plstico com 84 cavidades)

  • LEITURA

    Colnias vermelhas: presena de

    coliformes totais

    Luz UVColnias

    fluorescentes: presena de E.coli

    Tabela de NMP

    Simplate CEC

    Simplate TPC = Contagem total de bactrias por fluorescncia

    Simplate TPC-Cl = Contagem total de bactrias por indicador de cor

    Simplate SYM = Contagem de Bolores e Leveduras

  • Contagem Indireta

    1. Bioluminescncia

    2. Impedncia/Condutncia

  • Contagem Indireta

    1.Tcnica de Bioluminescncia

    Princpio: Quantidade de ATP detectada a partir de clulas

    metabolicamente ativas (residuos orgnicos, inclusive microrganismos).

    Mecanismo: reao de enzima luciferina-luciferase (cauda do vagalume)

    ATP- reage com a enzima produzindo luz, medida em um luminometro

  • 1.Bioluminescncia:

    Aplicao comum: Monitoramento de Higienizao em plantas processadoras de alimentos.

    Equipamentos comercializados base de bioluminescncia:Lightning e Hi-Lyte.

    Consistem em um swab aplicado a superfcie a ser checada: introduz num tubo com os reagentes necessrios e o coloca no luminometro que mede a intensidade da luz:

    Quanto mais sujo, + luz!

  • SISTEMA LIGHTNING Fabricante =BIOCONTROL ( www.biocontrolsys.com)

    Sistema Lightning monitora o processo de limpezqa e sanificao de superfcies .

    Princpio do mtodo: emisso de bioluminiscncia por ATP.

    1 . Luciferina + luciferase + ATP + Mg +2 Luciferil adenilato - luciferase + pirofosfato

    2. Luciferil adenilato - luciferase + O2 Luciferase + Oxiluciferina + AMP+ CO2 + LUZ

    O substrato Luciferina sofre fosforilao atravs da enzima luciferase , na presena de ATP.

    A molcula de ATP pode ser encontrada em : clulas microbianas viveis; clulas no microbianas ( sangue, carne,...)

    Sistema Lightning detecta

    ATP residual em superfcies

  • Componentes - sistema Lightning

    Swab ; luminmetro ; alicate ; software

    Buffer

    swab

    1

    c

    2

    a

    b

    Luciferina +

    Luciferase

  • Buffer

    swab

    1

    c

    2

    a

    b

    Luciferina +

    Luciferase

    Procedimento de uso

    1 ) Esfregao numa determinada superfcie.

    2 ) Pea 1 em 2

    3) Entortar a regio a com a mo : escorrimento do buffer ao longo da haste

    4) Alicate amassar a regio c para romper a barreira b: permitindo o

    contato entre buffer + esfera + estremidade da haste

    5 ) Agitar o conjunto 3

    6) Introduzir a pea 1 no luminmetro e fazer a leitura 3

  • tu43

    0 2,5 3 7,