métodos de separacion y tecnicas de efc

Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos

METODOS DE SEPARACIÓN Y TECNICAS DE ELECTROFORESIS CAPILAR

GUILLERMO SALAMANCA GROSSO

Universidad del Tolima Colombia


QUIMICA ANALITICA E INSTRUMENTAL: Conjunto de procesos funcionales y aproximaciones operacionales que se integran funcionales y aproximaciones operacionales que se integran para resolver problemas con la ayuda de la información cualitativa y cuantitativa y haciendo uso de equipos e instrumentos.



Mé d d ióMé d d ióMétodos de separaciónMétodos de separaciónSimpleSimple

CristalizaciónCristalizaciónCentrifugaciónCentrifugación

12

PrecipitaciónPrecipitaciónZonasZonasCentrifugaciónCentrifugación 2

3

4FiltraciónFiltraciónExtracciónExtracción

Líquido Líquido -- LíquidoLíquido

En fase sólidaEn fase sólida

45

FiltraciónFiltración

ClasificaciónClasificaciónLixiviaciones

SimpleSimple6

CromatografícosCromatografícosDestilaciónDestilación

FraccionadaFraccionada6

7ME Fase SólidaME Fase Sólida

Técnica analítica. Principio científico adaptado a uno o varios

ElectroforesisElectroforesis

ME.Fase SólidaME.Fase Sólida89


Técnica analítica. Principio científico adaptado a uno o variosinstrumentos para obtener información sobre diversos materiales.


ELECTROFORESIS CAPILAR

Cortesia: Toni Pomar. Universidad de Virginia

Evolución y desarrollo de la electrónica



1 Ciencias Biomédicas Proteínas. Péptidos. ADNMarcadores genéticos. Drogas

Drogas de abuso. Forense

2 C. Farmacéuticas Estudio farmacodinamia y cinéticaBiotecnología. Estudio de quiralidad

3 Alimentos Colorantes. Aditivos. AminoácidosProteínas. Aminas biogénicas. Tóxicos

Vitaminas

P l t t P ti id Hid bElectroforesisModos de operación.

Bases de la separación

Ambiente4 Polutantes. Pesticidas. HidrocarburosMetales pesados

Técnica que ha venido creciendo con el desarrolo de la instrumentación

electrónica y métodos de detecciónpermite aplicaciones diversas



•En (CZE): La composición del Buffer es constante en lazona de separación.•El potencial aplicado genera separación diferencial en lamovilidad iónica

Termostatización

Detector movilidad iónica•Zonas resueltas bien definidas.•o parcialmente solapadas.

DA

ElectrodoElectrodo FP

Carrusel de Porta muestrasElectroforegramaElectroforegrama

ELECTROFORESIS: Técnica de separación basada en la MOVILIDADBuffer

Ánodo CátodoÁnodo Cátodo

ELECTROFORESIS: Técnica de separación basada en la MOVILIDADDIFERENCIAL de una mezcla de analitos (partículas cargadas o no) bajo elefecto de un CAMPO ELÉCTRICO. Proceso de separación debida a ladiferencias en la velocidad de migración de las especies.

Universidad del Tolima ColombiaTubo capilar < 0.5 m; 0.1 mm diTubo capilar < 0.5 m; 0.1 mm di


TermostatizaciónTermostatización

DetectorDA

ElectrodoElectrodo FP

Carrusel de Porta muestrasCarrusel de Porta muestras

Buffer



Ánodo (+) Cátodo (-)

DetectorFuente de luz

280 nm

Detectores: UV:Conductividad

Ánodo (+) Cátodo (-)

DetectorFuente de luz

280 nm

Detectores: UV:Conductividad

Ánodo (+) Cátodo (-)Ánodo (+) Cátodo (-)

Buffer Buffer

Fotorreceptorηπµ

rqv

6==

E1 2

Buffer Buffer

Fotorreceptorηπµ

rqv

6==

E1 2

ComputadorSistema de

registro

ComputadorSistema de

registro

ELECTROFORESIS: Técnica de separación basada en la MOVILIDAD

g

10- 60 kV

g

10- 60 kV

DIFERENCIAL de una mezcla de analitos (partículas cargadas o no) bajo elefecto de un CAMPO ELÉCTRICO. Proceso de separación debida a ladiferencias en la velocidad de migración de las especies.

Universidad del Tolima ColombiaTubo capilar < 0.5 m; 0.1 mm di


Columna capilar en síliceColumna capilar en sílice

••DiámetroDiámetro internointerno:: 22 aa 100100 µµmm••DiámetroDiámetro externoexterno:: 363363 µµmm••LongitudLongitud:: 100100 cmcmC b tC b t lii idlii id••CoberturaCobertura poliimidapoliimida

••PermeabilidadPermeabilidad luzluz UVUV••DetecciónDetección enen columnacolumna••AcondicionamientoAcondicionamiento previoprevio dede lala columnacolumnaAcondicionamientoAcondicionamiento previoprevio dede lala columnacolumna

2 a 100 2 a 100 µµmm 363 363 µµmm



+ -+ + + CátodoÁnodo

Aniones -

+ - - -CátodoÁnodo

Medio de conducciónCationes +

Naturaleza de los iones

CargaTamaño

Carga

TamañoMigración alta

µ qv==

µ = movilidad electroforéticav = velocidad del ionE = campo eléctricoηπ

µr6

==E E = campo eléctrico

q = carga del iónr = radio η = viscosidad del medioMovilidad electroforética η = viscosidad del medio

depende:Carga eléctrica moléculapH medioFuerza ionica

µ: Se relaciona con la selectividad


Fuerza ionica


A i

+ -+ + + CátodoÁnodo

Aniones -

- - -

Medio de conducciónCationes +

•Movilidad electroforética: CapacidadPara el desplazamiento de una especie en unmedio conductor. Respuesta al campo

Movilidad electroforéticaµef

aplicado.

•Flujo electroosmótico: Movilidad del medio conductor. FEO

La velocidad de migración es unarelación directa entre el tamaño y lacarga de cada especie


carga de cada especie.


1 E. Capilar de Zona Buffer constante en a la zona de separación. El potencial aplicado genera migración diferencial de

2 C. Electrocinética micelar

g gespecies

3 E. Capilar en gel

Electroforesis capilar

Modos de operación

Isoelectroenfoque4

Modos de operación.Bases de la separación Isotacoforesis5

Electrocromatografía

Electroforesis quiral

6

7Universidad del Tolima Colombia

Electroforesis quiral7


1 E. Capilar de Zona

Sistema de surfactantes

2 C. Electrocinética micelarDSS. Formacion de micelasAdición de ciclodextrinas

3 E. Capilar en gel


Modos de operación

Isoelectroenfoque4+ -

Modos de operación.Bases de la separación Isotacoforesis5

Piridoxinas. Riboflavina. A ascorbicoTiamina Complejo B


Electroforesis quiral

6

7

Tiamina. Complejo B.






2 Buffers: Acido y BaseAnfolitos en la columna: Mezcla agregados

3 E. Capilar en gel

Moleculares: Acido Polietilen pentamina.Separación selectiva a pH´s


Modos de operación.Bases de la separación

Isoelectroenfoque

I t f i

4

5Bases de la separación Isotacoforesis


5

6






3 E. Capilar en gel

Combinación de Buffers:Iones rápidos y lentos.

Mismo contra-Ion en cada casoPara el sistema de buffers.


Modos de operación.Bases de la separación

Isoelectroenfoque

I f i

4

5 Capilares con poliacrilamidas para citratos, oxalatos, piruvatos

Bases de la separación Isotacoforesis


5

6




Métodos de inyección:

•Usa un sistema de generación de presión (Pistón).Mueve uno de los viales del electrolito.

1. Hidrodinámica.

No discriminativa

•Vacío.•Presión•Sifonación: Capilaridad

Efecto capilaridadkV

Inyección presión

Presión

Inyección presión

VacíoInyección presión

Vacío



Métodos de inyección: 2. Electrocinética.

Discriminativa



M ilid d l t óti Fl j l t óti FEOMovilidad electroosmótica. Flujo electroosmótico. FEO

- -+µFEO

a

+ ++

+-

- ++

+-

--

-Seno disolución

+ + ++

+-

- ++

+-

oble

Cap

aCapa móvil

+- - - - - - - - -+ + + +Capa fija

Pared capilar

Do

+ - CátodoÁnodoDirección flujo electoósmotico

Pared capilar

La velocidad de migración es unarelación directa entre el tamaño y


yla carga de cada especie.


FEO

Grupos SiOH ~ 5x1014 cm-2

FEO

10Campo eléctrico

FEO

FEO

Calentamiento

SiO-

FEO

FEOFEO

FEO ModificacionespH+ -

FEOpH Buffer

FEO

Modificaciones de la carga soluto

Método para ajustar FEO

FEO

FEO

µ=1/2ΣCiZi2Potencial Zeta

2.0 FEOSiOH2+

Universidad del Tolima ColombiaModificaciones especiales según sea el pH Uso de surfactantes


Colorantes: Amplio uso en los alimentos y bebidas. Aditivo mejora de aspecto. Xantofilas(E-161). Origen Natural o artificiales. Internacionalmente aparecen codificados E-100 a E-180. Naturales origen mineral, vegetal o animal (como la Cochinilla o E-120).

E102 T t i E124Tartracina

(colorante azoico)E124

Rojo cochinilla A

E131Azul Patentado V

E110 Amarillo anaranjado S

E123 E129Rojo Allura AC

E123 Amaranto

Cancerigeno Embriotoxico

Universidad del Tolima ColombiaInocuidad y toxicidad. Aspectos legales. En los países nórdicos están prohibidos casi todos los colorantes sintéticos y en cambio otros paises los autorizan.


E102 Tartracina

(colorante azoico)E124

Rojo cochinilla A

E131

En ECZ: La composición del tampón es constante en a la

E110 A ill j d S


pzona de separación.

Amarillo anaranjado S

selección de BufferCampo aplicado

Separaciónes diferenciablesE129

Rojo Allura AC E123

AmarantoCancerigeno Embriotoxico

Separaciónes diferenciables



Separación



tm = tiempo de migraciónml V L µef

p g= recorrido del soluto= Potencial aplicado= Longitud del capilar= Movilidad del soluto

µFEO = Velocidad flujo electroosmótica

E102 Tartracina

(colorante azoico)


Incrementos del flujo electroosmotico provoca reducción en el tiempo de análisis, pero se pierde resolución



Protocolo para Acidos Orgánicos en Vinos

Muestra de vino Bebidas y aperitivos

Minicolumna C18 Centrifuga a 10K rpm

Volumen de exclusión Diluye 1/50 idem vinos

Centrifuga a 10K rpm 7 – 10 min. Ac. cadena corta

Diluye 1/1000 en bufferPftalato 50 mM *Para Ac. de cadena larga se usa

Buffer Benzoato 50 mM

7 – 10 minutosAnalisis

Buffer Benzoato 50 mM



Acido acetico Acido Láctico



Electroferogramas de Acidos Orgánicos2

11

13

3

3

1 23



CarotenoNo se puede mostrar la imagen. Puede que su equipo no tenga suficiente memoria para abrir la imagen o que ésta esté dañada. Reinicie el equipo y, a continuación, abra el archivo de nuevo. Si sigue apareciendo la x roja, puede que tenga que borrar la imagen e insertarla de nuevo.

CarotenoCarotenoProcesos de la visión. Metabolismo del calcioProtector de las vitaminas A y C (Antioxidante)Factor de coagulación

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Procesos de la visión. Metabolismo del calcioProcesos de la visión. Metabolismo del calcioProtector de las vitaminas A y C (Antioxidante)Protector de las vitaminas A y C (Antioxidante)Factor de coagulaciónFactor de coagulación

LiposolublesNo se puede mostrar la imagen. Puede que su equipo no tenga suficiente memoria para abrir la imagen o que ésta esté dañada. Reinicie el equipo y, a continuación, abra el archivo de nuevo. Si sigue apareciendo la x roja, puede que tenga que borrar la imagen e insertarla de nuevo.

LiposolublesLiposolublesCalciferolTocoferolFiloquinionaK (Farnoquinona Menaiona)

CarotenoCarotenoCalciferolCalciferolTocoferolTocoferolFiloquinionaFiloquiniona

gFactor de coagulaciónFactor de coagulación

VitaminasNo se puede mostrar la imagen. Puede que su equipo no tenga suficiente memoria para abrir la imagen o que ésta esté dañada. Reinicie el equipo y, a continuación, abra el archivo de nuevo. Si sigue apareciendo la x roja, puede que tenga que borrar la imagen e insertarla de nuevo.

VitaminasVitaminas

K (Farnoquinona, Menaiona)K K (Farnoquinona, Menaiona)(Farnoquinona, Menaiona)

B1TiaminaB2 RiboflavinaB3 Niacina


BB11 TiaminaTiaminaBB22 RiboflavinaRiboflavinaBB NiacinaNiacina

HidrosolublesNo se puede mostrar la imagen. Puede que su equipo no tenga suficiente memoria para abrir la imagen o que ésta esté dañada. Reinicie el equipo y, a continuación, abra el archivo de nuevo. Si sigue apareciendo la x roja, puede que tenga que borrar la imagen e insertarla de nuevo.

HidrosolublesHidrosolubles

B3 NiacinaB6 PiridoxinaB7 Ácido fólicoB12 Cianocobalamina

BB33 NiacinaNiacinaBB66 PiridoxinaPiridoxinaBB77 Ácido fólicoÁcido fólicoBB1212 CianocobalaminaCianocobalamina

Vitamina CB1212 CianocobalaminaCianocobalaminaVitamina CVitamina CComplejo B: Metabolismo carbohidratos,

grasas y proteínas. Piel visión, Glóbulos rojos, Crecimiento


Complejo B: Metabolismo carbohidratos, Complejo B: Metabolismo carbohidratos, grasas y proteínas. Piel visión, Glóbulos grasas y proteínas. Piel visión, Glóbulos rojos, Crecimientorojos, Crecimiento



16

14

12

10n) 10

8

6

t m(m

i

7 7.5 8.5 9.58 9 pH



Control de calidad en los edulcorantes adicionados enalimentos. Autenticidad de las mieles y mieles de mielada.Regulaciones y normativas. Japón controla la presencia de

l jsacarosa en los jugos.

Condiciones analíticasColumna:Capilar sílice fundida80.5 cm72 cm efectivoD.I. 50µmPotencial25 kV

Patró n carbohidratos

Jugo de naranja

Temperatura15 ºCDetectorArreglo deDiodosMuestra: Dilución. Filtración.

Yogurt

280 nmInyección50 mbar x 6 sBuffer

SeparaciónBuffer Aniónico

Respuesta lineal: 50 a 1000µg/mlCV: < 0.16%. HPLC Vs EC



Hesperidina 1

Naringina

2

Hesperedina 3

4Naringenina

Detección electroquímica vs ESC +0.95 V.Amperometria. Columna capilar 75 cm

25 id. X360 od. µm Sílice fundidaó ff ó f ó

Rutina

Patrón. Buffer borato. Jugo extracción y filtraciónPiel extracción etOH Ultrasonido

Filtración membrana 0.2 µ m56

Universidad del Tolima ColombiaAc. Ascorbico


Hesperidina 13

4

Naringina 25

Hesperedina

23

4

12 6

Naringenina

Detección electroquímica vs ESC +0.95 V.Amperometria. Columna capilar 75 cm

25 id X360 od m Sílice fundida25 id. X360 od. µm Sílice fundidaPatrón. Buffer borato. Jugo extracción y filtración

Piel extracción etOH UltrasonidoFiltración membrana 0.2 µ m56

Universidad del Tolima ColombiaRutina

Ac. Ascorbico


Hesperidina 12Jugo

Piel

Naringina 2

1

Hesperedina

1

Naringenina

3

466

RutinaAc. Ascorbico

5



AFLATOXINAS B (B1,B2 Y B2a), que emitenfluorescencia Compuestos altamente ionizablesy por ello muy reactivos, pudiendo modificarDNA RNA y proteínas celularesDNA, RNA y proteínas celulares.

Complejo proceso de extracción. Características de la matriz. Test Elisa. HPLC.

Fluidos supercriticos.



•Ocratoxina A (OTA): Micotoxina generada porhongos género Aspergillus y Penicillium. Estable yresistente a los tratamientos térmicos.C l li t A M í M í C fé•Cereales y alimentos: Arroz. Maíz. Maní. Café.

Polen.•Efectos: Nefrotoxicidad. Efectos: Teratogénico, Carcinogénico, Genotóxico e imunotóxico.

EC: Capacidad de resolución y menor uso de disolventes orgánicos.Límites de detección comparables con HPLC



Factores que influencian la eficiencia de CEFactores que influencian la eficiencia de CE

Difusión : De mayor concentración a menor concentración.Diferencias causadas por fluctuaciones térmicas.

Adsorción : Mayormente ocurre con macromoléculas en las paredes delcapilar.

Calentamiento Joule : Parte del potencial E. se transforma en calor.

Dispersión electroforética : Asimetrias de picos por distorciones de dosamortiguadores al mezclarse (cambios de conductividad yamortiguadores al mezclarse (cambios de conductividad y

campo eléctrico).

Inyección : Largo de la inyección.

Detección : Ancho de la zona de detección (menor resolución).



CONCLUSIONES

•Separaciones según mecanismos definidos en un ámbito capilar.Ofrece facilidades y velocidad respecto de (HPLC).

Eli i l bl d l l t d l HPLC l t i id d d l•Elimina el problema de los solventes de la HPLC, la toxicidad de losmismos y su costo.

•Emplea soluciones acuosas en su gran mayoría con muy bajap g y y jconcentración iónica.

•Incorpora los principios de la automatización a través de un hardwarecreado especialmente con un software altamente optimizadocreado especialmente con un software altamente optimizado.

•Las separaciones se obtienen en pocos minutos, on line con lacorrida, obteniéndose simultáneamente resultados cuantitativos.,


métodos de separacion y tecnicas de efc

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