Tema 2 TCNICAS DE SEPARACIN CROMATOGRFICA

1. Introduccin La etimologa de la palabra cromatografa es curiosa. Por las palabras griegas que la forman significara: escritura en colores. El botnico ruso Mikhail S. Tsvet formaliz el uso de la cromatografa en los estudios cientficos -por el ao 1910-, dio ese nombre a la tcnica y la aplic a la separacin de los pigmentos naturales que se encuentran en las plantas (conocidos como carotenoides y clorofilas). Tsvet empac material adsorbente en una columna de vidrio vertical (de unos cuantos centmetros de dimetro). Posteriormente, por dicha columna vertical verti una disolucin que contena la mezcla de pigmentos provenientes de las hojas molidas de una planta. Pasados unos minutos, el material empacado en la columna haba adquirido una coloracin diferente por segmentos. Es decir, se haba logrado la separacin de los pigmentos naturales de la planta. En cada segmento de color definido haba un pigmento diferente. Como su nombre indica las tcnicas de separacin sirven para separar componentes de una muestra. Desde el punto de vista de la caracterizacin de los materiales, conocer la composicin de los mismos es imprescindible puesto que las propiedades de los materiales dependen fundamentalmente, por un lado, de los componentes que lo forman y, por otro, de la proporcin existente entre ellos. Otra de las aplicaciones importantes en cromatografa es realizar el seguimiento de una sntesis que podra ir asociada a la preparacin de un material (una polimerizacin por ejemplo). A medida que se produce la reaccin en el matraz de reaccin tendremos productos y reactivos, cuya proporcin ir variando en funcin de la conversin. Es importante notar que, en general, las tcnicas de separacin slo sirven para eso, separar, y que no nos dan ninguna otra informacin acerca de la naturaleza de los componentes separados, de ah que en la mayora de los casos estas tcnicas o mtodos de separacin vayan acompaados de otros mtodos de anlisis (composicional y/o de grupos) con el fin de identificar y en algunos casos cuantificar los componentes de la muestra separados. En los primeros aos de la Qumica, la mayor parte de los anlisis se realizaban separando los componentes de inters de una muestra mediante precipitacin, extraccin o destilacin. Estos mtodos clsicos para la separacin todava se utilizan en muchos laboratorios. Sin embargo, su grado de aplicacin general est disminuyendo con el paso del tiempo y estn empezando a ser reemplazados por mtodos de separacin cromatogrficos.

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Existen al menos tres puntos importantes de incidencia de la cromatografa en la Ciencia y Tecnologa de Materiales: i) Por la aplicacin como tcnica de separacin y caracterizacin de compuestos relacionados con la sntesis de materiales. As, muchos slidos se preparan a partir de precursores moleculares organometlicos o de complejos de coordinacin, y stos a su vez a partir de compuestos orgnicos. De aqu la necesidad de controlar el grado de pureza de los compuestos de partida, de efectuar el seguimiento de las reacciones de sntesis en que intervienen los mencionados compuestos y de evaluar rendimientos y detectar procesos secundarios mediante aplicacin cromatogrfica. Adems, el empleo de columnas convencionales (columnas de gravedad) sigue todava teniendo inters preparativo para el aislamiento y purificacin de reactivos, con potencial inters en la obtencin de materiales slidos. ii) Por la necesidad analtica de identificacin y cuantificacin de compuestos transformados por la accin de materiales sobre sustancias orgnicas. Las tcnicas cromatogrficas son imprescindibles para una correcta evaluacin de la actividad de materiales catalizadores y para el estudio de soportes slidos de reacciones qumicas de gran importancia en petroqumica y en la elaboracin de compuestos orgnicos de alto valor aadido (qumica fina). Pero las tcnicas cromatogrficas no slo tienen aplicacin en catlisis convencional donde intervienen transformaciones de compuestos orgnicos; podemos tambin citar la separacin e identificacin de gases simples como el hidrgeno y el oxgeno producidos por la accin de catalizadores que actan en la fotodescomposicin del agua. iii) Por el desarrollo de nuevas fases estacionarias para cromatografa (rellenos de columnas cromatogrficas). La extensin cada vez mayor de las tcnicas de anlisis cromatogrfico llevan a su vez a una demanda de materiales utilizables como fases estacionarias que permitan, ya sea resolver algunas deficiencias de las fases utilizadas tradicionalmente, tales como la existencia de interacciones secundarias no deseadas, o bien realizar de forma especfica anlisis que de otra forma resultaran muy complejos por la gran cantidad de compuestos interferentes en las mezclas a utilizar o por la enormemente compleja preparacin de la muestra que es necesaria en algunos casos.

2. Lugar que ocupa la cromatografa en la caracterizacin de materialesAntes de introducirnos de lleno en lo que es la cromatografa y su clasificacin es necesario situarla en relacin al proceso completo de caracterizacin o anlisis de una muestra. Con objeto de ayudar en esta tarea, a continuacin, en el esquema 1, se presenta un diagrama en el que se muestran los pasos a seguir en cuanto a la manipulacin de una determinada muestra hasta que se la caracteriza mediante el empleo de una tcnica o mtodo instrumental.

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MuestraNOHay que solubilizarla?

SI NO

Es soluble? Es voltil?

Digestin

NO

Descompone trmicamente?

NO Formaplasma?

NO

Otros mtodos

SI

SI

SI

SI GAS SI

SI

SI

DISOLUCIN SI

Hay que separar componentes?

Cromatografa

Hay que separar componentes?

NO

NO

Tcnicas y Mtodos de anlisis

Esquema 1.- Pasos a seguir en cuanto a la manipulacin de una muestra hasta su caracterizacin.

3. La cromatografa. Conceptos y definiciones a) Cromatografa La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales est en reposo (fase estacionaria o lecho estacionario) mientras que la otra (fase mvil) se mueve en una direccin definida. El proceso cromatogrfico se da como resultado de la mayor o menor capacidad para ser retenidos los diferentes componentes de una muestra por la fase estacionaria, es decir, se basa en los repetidos procesos de interaccin durante el movimiento de los componentes de una mezcla arrastrados por la fase mvil a lo largo de la fase estacionaria (elucin), producindose la separacin debido a las diferencias en las constantes de distribucin de los componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y la mvil. b) Fase estacionaria Es una de las dos fases que forman un sistema cromatogrfico. Puede ser un slido, un gel o un lquido. Si es un lquido, puede estar distribuido en un slido, el cual puede o no contribuir al proceso de separacin. El lquido puede tambin estar qumicamente unido al slido (fase ligada) o inmovilizado sobre l (fase inmovilizada). La expresin lecho cromatogrfico o sorbente se puede usar como trmino general para designar cualquiera de las formas diferentes en que se use la fase estacionaria. En particular, en la cromatografa de gases se usa el trmino fase lquida, caso ms comn de fase estacionaria, frente a fase gaseosa para la fase mvil. Sin embargo, en el

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desarrollo inicial de la cromatografa lquida se us el trmino "fase lquida" para referirse a la fase mvil, frente a la "fase slida", es decir, la estacionaria. Debido a esta ambigedad, se desaconseja utilizar el trmino "fase liquida". Si se debe expresar el estado fsico de la fase estacionaria, se propone el uso de adjetivos, tales como fase estacionaria lquida, fase estacionaria slida, fase ligada slida o fase inmovilizada slida. c) Fase ligada Una fase estacionaria que est unida de forma covalente a las partculas de soporte o a la pared interior de la columna (lugar donde se produce la separacin). d) Fase inmovilizada Una fase estacionaria que est inmovilizada sobre las partculas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por polimerizacin in situ (entrecruzamiento qumico) tras un recubrimiento. e) Fase mvil Fluido que se filtra a travs o a lo largo del lecho estacionario, en una direccin definida. Puede ser un lquido (cromatografa cquida, LC), un gas (cromatografa de gases, GC) o un fluido supercrtico (cromatografa con fluido supercrtico). En la cromatografa de gases se puede usar la expresin gas portador para la fase mvil. En la cromatografa de elucin se usa tambin para la fase mvil la expresin eluyente. f) Eluir Proceso en el que la fase mvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria transportando los componentes a separar. El proceso de elucin se puede detener mientras todos los componentes de la muestra estn an en el lecho cromatogrfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado (se prefiere el trmino "Eluir" a "Desarrollar", trmino usado en nomenclaturas anteriores de cromatografa plana). g) Efluente La fase mvil que abandona la columna. h) Muestra Mezcla consistente en cierto nmero de componentes, cuya separacin se pretende en el lecho cromatogrfico al ser arrastrados o eluidos por la fase mvil. i) Componentes de la Muestra Los constituyentes qumicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente. Se aceptan tambin los trminos eluito y analito para un componente de la muestra.

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j) Soluto Trmino que se refiere a los componentes de la muestra en la cromatografa de reparto. k) Disolvente Trmino que en ocasiones se refiere a la fase estacionaria lquida en la cromatografa de reparto. Nota: En la cromatografa lquida, el trmino "disolvente" se ha usado a menudo para la fase mvil. Este uso no se recomienda. l) Zona Regin del lecho cromatogrfico donde se localizan uno o ms componentes de la muestra. Se puede usar para ello tambin el trmino banda. m) Cromatograma Una grfica u otro tipo de presentacin de la respuesta de un detector (la concentracin de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentracin en el efluente) frente al volumen de efluente o al tiempo. En la cromatografa plana, "cromatograma" puede referirse al papel o capa con las zonas separadas. n) Cromatografiar Separar por cromatografa. o) Cromatgrafo El instrumento empleado para realizar una separacin cromatogrfica.

3.1. Mecanismos de separacin3.1.1. Cromatografa de Adsorcin La separacin se basa principalmente en la diferente afinidad en trminos de adsorcin de los componentes de la muestra sobre la superficie de un slido activo. La fuerza con que es adsorbido un componente depende de las interacciones (tipo y magnitud) existentes entre, o bien, el componente y la fase estacionaria, o el componente y la fase mvil, es decir de la polaridad de los componentes, de la actividad del adsorbente (fase estacionaria) y de la polaridad de la fase mvil. La cromatografa de adsorcin, es una tcnica particularmente til para separar compuestos de polaridad baja o media. La separacin de compuestos muy polares mediante cromatografa de adsorcin requiere, debido a la gran retencin que ofrecen, la utilizacin de adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos qumicos previos a fin de reducir su polaridad.

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3.1.2. Cromatografa de Reparto La separacin se basa principalmente en la diferente solubilidad de los componentes de la muestra en la fase estacionaria (caso de la cromatogafa de gases), o en las diferentes solubilidades de los componentes en las fases mvil y estacionaria (caso de la cromatografa lquida). La mayor o menor migracin de un componente en este tipo de cromatografa ser funcin del coeficiente de reparto de ste entre la fase estacionaria y la fase mvil:

Kd =

Concentracin de A en fase mvil Concentracin de A en fase estacionaria

La cromatografa de reparto se utiliza para la separacin de mezclas de compuestos de polaridad media y alta. Algunos ejemplos de este tipo de cromatografa son las cromatografas sobre papel, slice hidratada y fase inversa en la cromatografa lquida de alta eficacia. 3.1.3. Cromatografa de Exclusin La separacin se basa principalmente en efectos de exclusin, tales como las diferencias de tamao molecular o de forma, o las diferencias de carga (Figura 2.1). Se puede usar tambin el trmino cromatografa de exclusin por tamaos, SEC, cuando la separacin se basa en el tamao molecular. Anteriormente se usaban para esto los trminos filtracin en gel y cromatografa de permeacin en gel (GPC), cuando la fase estacionaria es un gel hinchado. El trmino cromatografa de exclusin de iones se usa especficamente para la separacin de iones en una fase acuosa. La cromatografa de filtracin en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su dimetro se conoce. Cuando penetran en el lecho de la columna dos macromolculas de tamaos tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros, reducindose la concentracin en la fase libre entre las bolas. La segunda macromolcula, por tamao, slo puede encontrarse entre las bolas. El flujo de disolvente es ms elevado entre las bolas que en el interior de los poros de stas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las macromolculas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. En esta cromatografa se eluyen primero las macromolculas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. Empleando patrones de macromolculas de masa molecular conocida se pueden construir curvas de calibrado que posteriormente permitan la determinacin de la masa molecular de macromolculas de tamao desconocido. El rango de trabajo de las fases estacionarias se define como el intervalo de masas moleculares que pueden ser separadas. Otro parmetro que caracteriza a este tipo de

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fases es su lmite de exclusin que se define como la masa molecular a partir de la cual los compuestos pasarn a travs del lecho estacionario sin experimentar retencin.Molculas pequeas Molculas grandes

Figura 2.1.- Esquema del proceso de separacin por cromatografa de exclusin por tamaos. 3.1.4. Cromatografa de Intercambio Inico La separacin se basa principalmente en la diferente afinidad para el intercambio de iones de los componentes de la muestra (Figura 2.2). Actualmente, cuando se lleva a cabo sobre columnas de partculas pequeas y elevada eficiencia, y empleando habitualmente detectores conductimtricos o espectroscpicos, se denomina cromatografa de iones (IC). La cromatografa de intercambio inico se realiza sobre matrices que tienen una carga neta (positiva en el esquema de la Figura2.2). La carga de la matriz de la columna as como la carga de las molculas depender del pH del disolvente y de su fuerza inica (proporcional a la concentracin de iones). En unas condiciones determinadas sern retenidas en la columna las molculas o especies que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las molculas cargadas negativamente sern retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo eluidas las restantes. Para eluir las molculas retenidas se puede variar la carga inica del disolvente o su pH de forma que se alcance el punto isoelctrico de la molculas o especies de inters o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las molculas en la columna.

Flujo del disolvente

Partcula polimrica (gel) con poros Pared de columna cromatogrfica

Disolvente

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+ - + + + + + + + + - + + + - + + + + + +

+

Especies positivas Especies negativas Partculas slidas (matriz) cargada positivamente Pared de columna cromatogrfica

Figura 2.2. Esquema del proceso de separacin por cromatografa de intercambio inico. 3.1.5. Cromatografa de Afinidad Esta expresin caracteriza una variedad particular de cromatografa en la que se utiliza para la separacin la especificidad biolgica singular respecto a la interaccin entre analito y ligando.

3.2. Mtodos principales de anlisis cromatogrfico3.2.1. Anlisis por desarrollo Es el mtodo utilizado en los experimentos iniciales de cromatografa. El cromatograma se desarrolla hasta que el frente del disolvente alcanza el final del lecho estacionario, de forma que los constituyentes de la mezcla una vez separados permanecen sobre el lecho al finalizar la separacin. La tcnica de anlisis por desarrollo presenta la ventaja de que es analizable la totalidad de la muestra, incluyendo los compuestos de muy baja o muy alta retencin. Se utiliza fundamentalmente en cromatografa de papel y capa fina (Figura 2.3). Cromatografa

Figura 2.3.- Anlisis por desarrollo. Esquema de sistema para hacer cromatografa en capa fina. 8

Flujo del disolvente

Disolvente

Fase Mvil

3.2.2. Anlisis por elucin (Cromatografa de elucin) Procedimiento en el que la fase mvil pasa de forma continua a travs o a lo largo del lecho cromatogrfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequea cantidad en un tiempo breve. Esta tcnica presenta la desventaja de que los componentes con retenciones muy altas pueden no ser observados.Muestra Fase Mvil

Sorbente

Cromatograma

Placa Porosa EfluenteVolumen de fase mvil

Figura 2.4.- Esquema de dispositivo para realizar cromatografa con anlisis por elucin. Es la tcnica ms utilizada en casi todas las separaciones cromatogrficas analticas y en muchas preparativas. 3.2.3. Anlisis frontal (cromatografa frontal) Procedimiento en el que la muestra (lquida o gasesosa) se alimenta de forma continua al lecho cromatogrfico. No se utiliza ninguna fase mvil adicional. Se utiliza la diferencia de afinidad del adsorbente por cada una de las sustancias a separar. Se utiliza una pequea columna, que se satura sucesivamente por cada una de las sustancias a separar, emergiendo de ella el primer componente puro hasta que la columna se satura del segundo componente, momento en el que empezar a emerger ste mezclado con el primero. El anlisis frontal tiene su principal aplicacin como tcnica preparativa en la purificacin de sustancias.

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Fase Mvil Con la muestra A+B+C

A+B+ C A+B A

Placa Porosa Efluente Figura 2.5.-

3.2.4.

Anlisis por Desplazamiento (Cromatografa por desplazamiento)

Procedimiento en el cual la fase mvil contiene un compuesto (el desplazante) que es retenido ms fuertemente que el resto de los componentes de la muestra analizada. La muestra se alimenta al sistema en forma discreta, como una pequea cantidad en un intervalo breve. Este mtodo se utiliza tanto para separaciones analticas como preparativas, siendo muy utilizada en cromatografa de cambio inico.

3.3. Clasificacin de acuerdo a la forma del lecho cromatogrfico3.3.1. Cromatografa en columna Tcnica de separacin en la que el lecho estacionario est contenido dentro de un tubo. Las partculas de fase estacionaria slida, o de soporte recubierto con una fase estacionaria lquida, pueden llenar por completo el tubo (columna empaquetada) o estar concentradas sobre o a lo largo de su pared interna, dejando una ruta abierta, no restringida, para el paso de la fase mvil por el centro del tubo (columna tubular abierta).3.3.2.

Cromatografa Plana

Tcnica de separacin en la que la fase estacionaria est en forma de plano o sobre un plano. ste puede ser un papel, que sirva como tal o que est impregnado con una sustancia que acte de fase estacionaria (cromatografa en papel), o una capa de partculas slidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio (cromatografa en capa fina, TLC). A veces a la cromatografa plana se la llama tambin cromatografa de lecho abierto.

3.4. Clasificacin de acuerdo al estado fsico de la fase mvil10

3.4.1.

Tcnicas cromatogrficas

Las tcnicas cromatogrficas se clasifican a menudo especificando el estado fsico de las dos fases empleadas. En consecuencia, se utilizan los siguientes trminos:

Cromatografa gas-lquido (GLC) Cromatografa gas-slido (GSC) Cromatografa lquido-lquido (LLC) Cromatografa lquido-slido (LSC)

Se puede encontrar tambin en la bibliografa el trmino cromatografa de reparto gas-lquido (GLPC). Sin embargo, a menudo la distincin entre estos modos no es sencilla. Por ejemplo, en cromatografa de gases se puede usar un lquido para modificar una fase estacionaria slida de tipo adsorbente.3.4.2. Cromatografa de Gases (GC)

Tcnica de separacin en la que la fase mvil es un gas. Se lleva siempre a cabo en columna.3.4.3. Cromatografa Lquida (LC)

Tcnica de separacin en la que la fase mvil es un lquido. Puede desarrollarse en una columna o sobre un plano. La cromatografa lquida en la actualidad emplea generalmente partculas muy pequeas y una presin de entrada relativamente alta, denominndose entonces cromatografa lquida de alta eficacia o de alta presin, cuyas siglas provenientes del ingls son HPLC.3.4.4. Cromatografa con fluido supercrtico (SFC)

Tcnica de separacin en la que la fase mvil es un fluido por encima y relativamente cerca de sus temperatura y presin crticas. En general, los trminos y definiciones usados en la cromatografa de gases y lquida son aplicables igualmente a la de fluido supercrtico.

3.5. Tcnicas especiales3.5.1. Cromatografa con fase invertida

Procedimiento de elucin empleado en cromatografa lquida en el cual la fase mvil es significativamente ms polar que la estacionaria; por ejemplo, un material microporoso de base silcea con cadenas alquilo unidas qumicamente. Nota: el trmino "fase reversa" es una expresin incorrecta que debe evitarse (en ingls, debe decirse Reversed Phase y no Reverse Phase).3.5.2.

Cromatografa con Fase Normal

Procedimiento de elucin en el que la fase estacionaria es ms polar que la fase mvil. Este trmino se usa en cromatografa lquida para resaltar el contraste con la cromatografa con fase invertida.3.5.3.

Anlisis Isocrtico

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Procedimiento en el que la composicin de la fase mvil permanece constante a lo largo del proceso de elucin.3.5.4.

Elucin con Gradiente

Procedimiento en el que la composicin de la fase mvil cambia, de forma continua o en etapas, a lo largo del proceso de elucin.3.5.5.

Elucin en Etapas o Escalonada

Proceso de elucin en el que se cambia la composicin de la fase mvil en etapas o escalones durante un slo desarrollo de la cromatografa.3.5.6.

Cromatografa Bidimensional

Procedimiento en el que parte o todos los componentes de la muestra se someten, una vez separados, a etapas adicionales de separacin. Esto se puede hacer, por ejemplo, conduciendo a una fraccin en particular que eluye de la columna hacia otra columna (o sistema) que tenga diferentes caractersticas de separacin. Cuando se combina con etapas de separacin adicionales, se puede hablar de cromatografa multidimensional. En la cromatografa plana, cromatografa bidimensional se refiere al proceso cromatogrfico que hace que los componentes migren primero en una direccin y luego en otra perpendicular a ella; las dos eluciones se llevan a cabo con eluyentes diferentes.

3.6. Parmetros bsicos de cromatografa3.6.1. Retencin y factor de capacidad Cuando se introduce un compuesto en la corriente de la fase mvil de un sistema cromatogrfico, de no existir interaccin entre ste y la fase estacionaria, la banda que forma se desplazara a la misma velocidad que la fase mvil y emergera de la fase estacionaria cuando el volumen total de la fase mvil utilizado fuese igual al volumen vaco o intersticial del lecho estacionario (volumen muerto). Sin embargo, como las molculas de la muestra interaccionan con la fase estacionaria, necesitarn para su elucin un volumen de fase mvil mayor que se denomina volumen de retencin de la muestra. Dado que en un sitema cromatogrfico que opere a caudal constante el volumen eluido y el tiempo de elucin son proporcionales, los conceptos de volumen muerto y volumen de retencin son directamente intercambiables por los de tiempo muerto (tM) y tiempo de retencin (tR). Segn lo anterior se puede decir que la retencin es la estacionaria para retardar la salida de un componente. El tiempo que tarda en salir un componente que no se retiene tiempo de retencin, tR, es el tiempo medio que tarda componente. capacidad real de la fase tiempo muerto, tM, es el (o el propio eluyente). El en salir un determinado

En la Figura 2.6 se muestran los parmetros de retencin para el caso de una nica banda cromatogrfica. Se observa que el tiempo de retencin de la banda puede dividirse en dos partes: i) el tiempo muerto, tM; ii) y el tiempo transcurrido a partir de este momento hasta la aparicin del mximo de la banda, tR.

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Figura 2.6. Cromatograma de un componente y parmetros ms caractersticos (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introduccin a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993). . A partir de la definicin de tiempo muerto se induce que el segundo, tR, es el tiempo real que la fase estacionaria ha retrasado el avance del compuesto y se conoce con el nombre de tiempo de retencin corregido. Se define el factor de capacidad, K, como:

K'=

t'R t R t M = tM tM

(2.1)

Este factor adimensional expresa la retencin de un compuesto por la fase estacionaria independientemente del caudal de la fase mvil. En la prctica, los compuestos de inters deben presentar valores de K comprendidos entre 1 y 15 con el fin de no alargar excesivamente los tiempos de separacin. 3.6.2. Dispersin de bandas Cuando se introduce una mezcla de componentes en una columna cromatogrfica (cabeza de columna), al fluir la mezcla desde un extremo a otro de la columna se observa que las bandas de los componentes se van ensanchando (se denomina bandas a la distribucin de concentracin de un determinado componente) al mismo tiempo que se separan. Este proceso se debe fundamentalmente a la difusin termodinmica de las molculas de la banda, que tienden a distribuirse uniformemente en todo el volumen disponible. El proceso de difusin es dependiente del tiempo de forma que la dispersin de la banda aumentar en funcin del tiempo de elucin. Dado que los procesos de difusin de las molculas tienen su fundamento en movimientos de las mismas al azar, la concentracin final de las molculas dentro de una banda cromatogrfica adoptar en un caso ideal, un perfil de distribucin normal (gaussiano) y el registro de las concentraciones de la banda en funcin del volumen eluido o del tiempo, dar lugar a un perfil gaussiano de anchura definida por la desviacin estndar de la dispersin. Los parmetros caractersticos de un pico gaussiano se ilustran en la Figura 2.7.

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Figura 2.7. Parmetros caractersticos de un pico cromatogrfico (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introduccin a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993). 3.6.3. Eficacia Para hacer mxima la operatividad de una separacin cromatogrfica debe evitarse en lo posible el ensanchamiento de las bandas (debido a la dispersin trmica). En efecto, cuanto ms anchas sean las bandas, menor nmero de ellas se podrn resolver en un espacio de tiempo dado, en otras palabras, cuanto ms agudos sean los picos que emergen de una columna mejor estar actuando dicha columna. Las anchuras de las bandas cromatogrficas dependen de las caractersticas de la columna (tamao de las partculas de la fase estacionaria, homogeneidad de sta, etc.), as como de otros factores como por ejemplo, la velocidad de la fase mvil. En consecuencia, para expresar la calidad de un pico, se utiliza un parmetro comparativo relativo como es el cociente entre el tiempo de retencin y la desviacin estndar, , de la banda cromatogrfica. En la prctica, se define la eficacia de una columna como el cuadrado del cociente entre el tiempo de retencin y , y se expresa como el nmero de platos tericos:

t n= R

2

(2.2)

As, el nmero de platos tericos de una columna puede calcularse utilizando la anchura de uno de sus picos, normalmente el ltimo que pueda medirse directamente sobre el cromatograma (Figuras 2.7 y 2.8) utilizando las expresiones:t n = 16 R Wb 2

(2.3)

14

t n = 5.545 R Wh

2

(2.4)

El nmero de platos de una columna cromatogrfica depende lgicamente de su longitud, por lo que para comparar la eficacia de columnas con diferente longitud se introduce otro trmino, denominado altura equivalente de un plato terico, que relaciona la eficacia de una columna con su longitud y que se define como el cociente entre la longitud de la columna, L, y su nmero de platos tericos, n.h= L n

(2.5)

Es de destacar que al considerar la eficacia, solamente se han tenido en cuenta los efectos propios de la columna, aunque existen otros parmetros del sistema (anchura de banda inicial, velocidad de la fase mvil, etc.) que contribuyen al ensanchamiento de las bandas cromatogrficas. De esta manera, no siempre la baja eficacia de un sistema cromatogrfico es atribuible a la columna, sino a otros factores que ser preciso optimizar 3.6.4. Separacin y resolucin Hasta el momento, nicamente se ha considerado el caso en que existe una sola banda cromatogrfica; sin embargo, el objeto de la cromatografa es separar mezclas de varios componentes y es de suma importancia considerar la separacin entre ellos. Debe recordarse siempre que, independientemente del nmero de componentes que pueda tener la mezcla, el problema de separacin de todos ellos queda siempre reducido al de las dos bandas adyacentes ms difciles de separar. La separacin entre dos bandas cromatogrficas (Figura 2.8) puede estudiarse en funcin de dos parmetros: La retencin relativa, , definida como el cociente entre los tiempos de retencin corregidos de las dos bandas

t 'R 2 = t ' R1-

(2.6)

La resolucin, Rs, definida como el cociente de la distancia entre los centros de las dos bandas y el valor medio de la anchura de las mismas.

Rs =

2t Wb1 + Wb 2

(2.7)

15

Figura 2.8.- Cromatograma de dos bandas y parmetros para su resolucin. (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introduccin a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993). En consecuencia, una separacin total de dos bandas requerir valores de y Rs lo ms elevados posible. Es de tener en cuenta que mientras que un valor elevado de Rs puede conseguirse aumentando la eficacia de la columna (mayor longitud de columna, menores dispersiones de banda, etc.), el valor de la retencin relativa, , es constante para cada sistema cromatogrfico y solamente podr variar alterando la fase estacionaria o la fase mvil; en otras palabras, cambiando el sistema cromatogrfico. La solucin de un problema real de separacin entre dos bandas deber darse en funcin de los valores de y Rs que presente. As, para valores altos de retencin relativa y bajos de resolucin, la separacin podr conseguirse mediante un aumento de eficacia, mientras que para valores bajos de no es prctico intentar la separacin aumentando la eficacia y debe procederse a un cambio del sistema.

4. Tcnicas cromatogrficas no instrumentalesDe las tcnicas clsicas de cromatografa no instrumentales, solamente continan teniendo utilizacin amplia las de columna y capa fina, dado que la cromatografa sobre papel ha sido prcticamente relegada por esta ltima. Estos dos mtodos son particularmente tiles a escala preparativa, aunque en el caso de la cromatografa de capa fina sigue utilizndose ampliamente como mtodo analtico.

4.1. Cromatografa en columnaLa caracterstica fundamental de la cromatografa clsica en columna es que el gradiente de presin necesario para el desplazamiento de la fase mvil a travs de la fase estacionaria, est originado por gravedad. La cromatografa en columna se puede basar en cualquier mecanismo de separacin y, en consecuencia, se puede utilizar con cualquier fase estacionaria y fase mvil a condicin de que esta ltima sea lquida. Los lechos cromatogrficos utilizados para columnas, son generalmente de un solo uso y se preparan en el propio laboratorio. La Figura 2.9 muestra un esquema de una columna de gravedad. El recipiente es normalmente un tubo de vidrio provisto de algn tipo de llave para regular el flujo de la fase mvil. Es muy importante que la fase 16

estacionaria est distribuida de forma homognea, sin fracturas ni burbujas de aire, siendo tambin fundamental que los extremos de la columna sean planos para evitar eluciones simultneas de ms de una fraccin, especialmente si la capacidad de separacin de la columna no es muy grande. El mtodo ms recomendable de llenado consiste en aadir al tubo, una vez colocado en posicin vertical, una pasta formada con la fase estacionaria y un disolvente de menor actividad que la fase mvil a utilizar, dejando salir el disolvente sobrante a medida que la fase estacionaria va sedimentando.

Figura 2.9.- Esquema de una columna de gravedad (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introduccin a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993). La capacidad de separacin de las columnas de gravedad no es muy grande ya que su eficacia se encuentra limitada por el tamao de las partculas de la fase estacionaria que debe ser bastante alto (70-230 mallas ASTM) para permitir un caudal razonable de la fase mvil. La cantidad de fase estacionaria y el tamao de la columna tambin limitan su capacidad de separacin. Como norma general, se utilizan de 20 a 30g de fase estacionaria por gramo de mezcla a separar, pudindose llegar hasta relaciones de 100:1 para separaciones especialmente difciles. La relacin entre el dimetro y la longitud de la columna es tambin importante, ya que columnas demasiado cortas no proporcionarn espacio suficiente para lograr la separacin. En general, las relaciones longitud/dimetro para este tipo de columnas deben oscilar entre 8:1 y 10:1. Las columnas de gravedad operan normalmente por elucin, y el control del contenido de la fase eluida se realiza en la prctica recogiendo un gran nmero de pequeas fracciones que se analizan por medio de alguna otra tcnica, normalmente cromatografa de capa fina.

4.2. Cromatografa en capa finaAqu se utiliza un lecho abierto formado por una capa fina de fase estacionaria soportada sobre una superficie plana. La elucin se consigue por el movimiento capilar ascendente de la fase mvil.

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Las fases estacionarias utilizadas normalmente para cromatografa en capa fina son, almina o gel de slice para cromatografa de adsorcin y, celulosa para cromatografa de adsorcin o de reparto. En la cromatografa en capa fina, se utiliza normalmente el anlisis por desarrollo. El proceso se lleva a cabo en recipientes cerrados, por ascensin del disolvente, debiendo colocarse en el interior del recipiente cubriendo una de sus paredes una capa de papel de filtro impregnado en la fase mvil (disolvente) para conseguir una atmsfera saturada en ella. Una vez desarrollada la placa, la visualizacin de los cromatogramas se realiza, caso de no tratarse de compuestos coloreados, mediante iluminacin con luz ultravioleta, si la fase estacionaria lleva un indicador de fluorescencia, o bien mediante pulverizado de la placa con reveladores de carcter general (yodo, cido sulfrico, etc.) si se quieren visualizar nicamente compuestos de un tipo determinado. La cromatografa en capa fina puede utilizarse para separaciones analticas o preparativas: i) Aplicaciones analticas. Las muestras se aplican en forma de manchas circulares sobre uno de los extremos de la placa. Tras el desarrollo, la identificacin de cada componente de la mezcla se realiza midiendo el desplazamiento relativo de cada mancha en la placa respecto a un compuesto patrn o al frente del disolvente, definindose para cada banda sus valores Rx o Rf respectivamente (Figura 2.10) como:Rx = desplazamiento del compuesto desplazamiento del patrn desplazamiento del compuesto desplazamiento del frente del disolvente

(2.8)

Rf =

(2.9)

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Figura 2.10.- Determinacin de Rf y Rx en cromatografa en capa fina (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introduccin a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993). ii) Aplicaciones preparativas. La muestra se sita en la placa en forma de banda a lo largo de uno de los extremos de la placa, realizndose el revelado mediante luz ultravioleta (mtodo no destructivo) o por pulverizacin con un revelador de uno de los laterales del cromatograma que servir como gua para conocer la posicin de las bandas (mtodo destructivo). La recuperacin de las muestras se realiza por raspado de la fase estacionaria y extraccin con algn disolvente adecuado.

5. Mtodos instrumentales en cromatografa

5.1. Cromatografa de gasesEn la cromatografa de gases (GC), la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de un gas inerte y, a diferencia de la mayora de los equipos de cromatografa, la fase mvil no interacciona con las molculas del analito, su nica funcin es la de transportar al componente a travs de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases: Cromatografa gas-slido (GSC) Cromatografa gas-lquido (GLC). Tiene gran aplicacin en todos los campos de la ciencia y su denominacin se abrevia normalmente como cromatografa de gases (GC).

5.1.1. Cromatografa Gas-Lquido La cromatografa gas-lquido se basa en la distribucin del componente a separar entre una fase mvil gaseosa y una fase lquida inmovilizada sobre la superficie de un slido inerte. Los principios generales en esta cromatografa coinciden con lo ya explicado en secciones anteriores y las relaciones matemticas son aplicables con slo ligeras modificaciones que resultan de la compresibilidad de las fases mviles gaseosas. 5.1.1.1. Instrumentos para la cromatografa Gas-Lquido Los componentes bsicos de un instrumento para realizar cromatografa de gases se muestran en la Figura 2.11. A continuacin, se da una descripcin de cada uno de los componentes.

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Figura 2.11.- Esquema de un sistema cromatogrfico Gas-Lquido. Componentes bsicos (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introduccin a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993). i) Gas portador He, Ar, N2, CO2, H2. La eleccin del gas est con frecuencia determinada por el tipo de detector que se utilice. Los caudales se controlan mediante un regulador de presin de dos niveles colocado en el cilindro de gas y algn tipo de regulador de presin o regulador de flujo instalado en el cromatgrafo. Los caudales pueden determinarse mediante un rotmetro en la cabeza de la columna y un medidor de pompas de jabn al final de la columna. ii) Sistema de inyeccin de muestra El mtodo ms comn de inyeccin de muestra implica el uso de una microjeringa para inyectar una muestra lquida o gaseosa a travs de un diafragma o septum de goma de silicona, en una cmara de vaporizacin instantnea situada en la cabeza de la columna. Las muestras slidas se introducen como disoluciones o, alternativamente, en viales cerrados hermticamente de paredes delgadas que pueden colocarse junto a la cabeza de la columna y ser perforados o aplastados desde el exterior. iii) Configuraciones de columna y hornos En cromatografa de gases se usan dos tipos generales de columnas, las empaquetadas o de relleno y las tubulares abiertas o capilares. Las columnas cromatogrficas se construyen de acero inoxidable, vidrio, slice fundida o Tefln. A fin de poder colocarse en el interior de un termostato, normalmente se configuran como helicoides. La temperatura de la columna es una variable importante y para un trabajo preciso ha de regularse a las dcimas de grado. Por ello, normalmente se introduce dentro de un horno termostatizado. La temperatura ptima de la columna depende del punto de ebullicin promedio de la muestra y del grado de separacin requerido. Para muestras con un amplio intervalo de ebullicin a menudo es conveniente emplear una programacin de temperatura, con lo que se aumenta la temperatura bien de manera continua, bien por etapas, al mismo tiempo que tiene lugar la separacin. En la Figura 2.12 se muestra la mejora de un cromatograma ocasionada por la programacin de temperatura.

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Figura 2.12.- Mejora de un cromatograma por programacin de temperatura en columna (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introduccin a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).En general, la resolucin ptima se asocia con una menor temperatura; sin embargo, la consecuencia de una reduccin de temperatura es un aumento en el tiempo de elucin y por tanto, del tiempo que se necesita para completar el anlisis. Las Figuras 2.12a y 2.12b ilustran este principio. iv) Detectores CARACTERSTICAS DEL DETECTOR IDEAL Adecuada sensibilidad Buena estabilidad y reproducibilidad Una respuesta lineal para los componentes que se extienda a varios rdenes de magnitud Intervalo trmico de trabajo (25 400)C Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal Alta fiabilidad y manejo sencillo Respuesta semejante para todos los componentes No destructivo

a) DETECTOR DE IONIZACIN DE LLAMA

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En un quemador, el efluente de la columna se mezcla con hidrgeno y con aire para luego encenderse elctricamente. La mayora de los compuestos orgnicos cuando se pirolizan a la temperatura de una llama de hidrgeno/aire, producen iones y electrones que pueden conducir la electricidad a travs de la llama. Entre el extremo del quemador y un electrodo colector situado por encima de la llama, se aplica una diferencia de potencial de unos pocos cientos de voltios y para la medicin de la corriente que resulta se utiliza un amplificador operacional de alta impedancia. La ionizacin en la llama de los compuestos que contienen carbono no es un proceso bien establecido, aunque se observa que el nmero de iones que se produce es aproximadamente igual al de tomos de carbono transformados en la llama. Por tanto, este detector es sensible a la masa. Grupos funcionales como C-OH, -C=O, -X, -NH2, originan pocos iones o prcticamente ninguno. Adems, el detector es insensible al H2O, CO2, SO2 y NOx. Estas propiedades hacen del detector de ionizacin de llama uno de los detectores generales ms utilizados para el anlisis de la mayora de los compuestos orgnicos. b) DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD TRMICA Se basa en los cambios de la conductividad trmica del gas portador ocasionados por la presencia de las molculas del componente a analizar. El sensor consiste en un elemento calentado elctricamente cuya temperatura, a una potencia elctrica constante, depende de la conductividad trmica del gas circundante. El elemento calentado puede ser un hilo fino de platino, oro o wolframio, o tambin, un termistor semiconductor. La resistencia del hilo o del termistor da una medida de la conductividad trmica del gas. Este detector posee las siguientes caractersticas: Simple Amplio rango dinmico lineal (~ 105) Respuesta universal (especies orgnicas e inorgnicas) Carcter no destructivo Sensibilidad relativamente baja (~ 10-8 g de soluto/ml de gas portador)

c) DETECTOR TERMOINICO El detector termoinico (TID) es un detector selectivo de los compuestos orgnicos que contienen fsforo y nitrgeno. En este caso el efluente de la columna se mezcla con hidrgeno, pasa a travs de una llama y se quema. El gas caliente fluye alrededor de una bola de silicato de rubidio calentada elctricamente, la cual se mantiene a unos 180 V con respecto al colector. La bola caliente forma un plasma que alcanza una temperatura de 600 a 800 C. Lo que ocurre exactamente en el plasma, que hace que se produzcan inslitamente una gran cantidad de iones a partir de las molculas que contienen fsforo o nitrgeno, realmente no est bien establecido, pero el resultado es una gran corriente de iones, la cual se utiliza para la determinacin de compuestos que contienen P y N. d) DETECTOR DE CAPTURA DE ELECTRONES El detector de captura de electrones (ECD) opera casi de la misma forma que un contador proporcional para la medida de radiacin X. En este caso el efluente de la columna pasa sobre un emisor , como niquel-63 o tritio (adsorbido sobre lmina de

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platino o titanio). Un e- del emisor provoca la ionizacin del gas portador (con frecuencia N2) y la produccin de una rfaga de e-. De este proceso de ionizacin, en ausencia de especies orgnicas, resulta una corriente constante entre un par de electrodos. Sin embargo, la corriente disminuye en presencia de molculas orgnicas que tiendan a capturar electrones. Este detector es de respuesta selectiva, siendo sensible a grupos funcionales electronegativos: halgenos, perxidos, quinonas y grupos nitro. En cambio, no es sensible a aminas, alcoholes e hidrocarburos. e) DETECTOR DE EMISIN ATMICA En este dispositivo el eluyente se introduce en un plasma de helio obtenido con microondas que se acopla a un espectrmetro de emisin con series de diodos. El plasma es suficientemente energtico como para atomizar todos los elementos de una muestra, excitarlos y as obtener sus espectros de emisin caractersticos. 5.1.2. Acoplamiento de la cromatografa de gases con mtodos espectroscpicos La cromatografa de gases a menudo se combina con otras tcnicas selectivas de anlisis como la espectroscopia y la electroqumica. Los mtodos de anlisis que resultan se denominan mtodos acoplados y proporcionan unas potentes herramientas para la identificacin de los componentes de una mezcla compleja. Cromatografa de gases/espectrometra de masas Cromatografa de gases/espectroscopia infrarroja

5.1.3. Cromatografa Gas-Slido Esta cromatografa se basa en una fase estacionaria slida en la cual se produce la retencin de los analitos como consecuencia de la adsorcin fsica. Los coeficientes de distribucin son generalmente mucho mayores que en el caso de la cromatografa gaslquido. En consecuencia, la cromatografa gas-slido es til para la separacin de especies que no se retienen en columnas de gas-lquido, tales como los componentes del aire, H2S, CS2, xidos de nitrgeno, CO, CO2 y los gases nobles. Se suelen utilizar dos tipos de adsorbentes: tamices moleculares y polmeros porosos.

5.2. Cromatografa de lquidos de alta resolucinLa cromatografa de lquidos, hoy en da, es la tcnica de separacin ms ampliamente utilizada. Las razones de su popularidad las encontramos en su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estas sustancias incluyen los aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies organometlicas y cierta variedad de especies inorgnicas.

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La Figura 2.13 pone de manifiesto que los distintos procedimientos que utilizan la cromatografa de lquidos tienden a ser complementarios por lo que a sus campos de aplicacin se refiere. As, para solutos con masas moleculares superiores a 10000, a menudo se utiliza la cromatografa de exclusin, aunque ahora tambin es posible tratar estos compuestos con cromatografa de reparto de fase inversa. Para especies inicas de baja masa molecular, se utiliza con frecuencia la cromatografa de intercambio inico. Los mtodos de reparto se aplican a las especies polares pero no inicas. Adems, este procedimiento se utiliza muchas veces para la separacin de los integrantes de una serie homloga. La cromatografa de adsorcin se elige con frecuencia para separar especies no polares, ismeros estructurales y grupos de compuestos como, por ejemplo, los hidrocarburos alifticos de los alcoholes alifticos.

Figura 2.13. Distintos procedimientos que se utilizan en la cromatografa de lquidos as como su mbito de utilizacin en funcin del tipo de especies a separar (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introduccin a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993). 5.2.1. Instrumentacin para cromatografa de lquidos La figura 2.14 muestra un esquema de los componentes fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin tpico. i) Recipientes para la fase mvil y sistemas para el tratamiento de los disolventes (eliminacin de O2 y N2) Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos mediante vaco a travs de un filtro de poro muy pequeo. Este tratamiento elimina los gases adems de la materia en suspensin.

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Figura 2.14.- Esquema de los componentes fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introduccin a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).

ii) Sistemas de bombeo Se utilizan tres tipos de bombas: bombas recprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumticas o de presin constante. iii) Sistemas de inyeccin de muestra iv) Columnas para cromatografa de lquidos v) Precolumnas vi) Termostatos En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces, si se controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado, se obtienen mejores cromatogramas. vii) Detectores Los detectores en cromatografa de lquidos son de dos tipos: a) los basados en una propiedad de la disolucin responden a una propiedad de la fase mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica o la densidad que se modifica por la presencia de los analitos y b) los detectores basados en una propiedad del soluto

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responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia en el UV-VIS, la fluorescencia, o la intensidad de dispersin que no son propias de la fase mvil. Detectores de absorbancia UV-Vis con filtros Detectores de absorbancia UV-Vis con monocromadores Detectores de absorbancia en el IR Detectores de fluorescencia Detectores de ndice de refraccin Detector de dispersin de luz Detectores electroqumicos

8.- Bibliografa 1. D.A. Skoog, J.J. Leary, Anlisis Instrumental, McGraw-Hill, Madrid (1996)2.

H.H. Willard, L.L. Merritt Jr.,J.A. Dean, F.A. Settle Jr., Mtodos Instrumentales de anlisis, Grupo Editorial Iberoamericana S.A. de C.V., Mxico (1991).(1984).

3. TECHNIQUES in liquid chromatography Simpson, Colin F. John Wiley & Sons 4. Liquid chromatography column theorySons (1992).

Scott, Raymond P.W. John Wiley &

5. Chromatography of polymers : characterization by SEC and FFF American Chemical Society (1993). 6. Handbook of size exclusion chromatography Marcel Dekker (1995). 7. Cromatografa de exclusin por tamaos [Vdeo] Prez Dorado, Angel,CEMAV, Universidad Nacional de Educacin a Distancia [1997].

8. Manual de cromatografa Loro Ferrer, Juan Francisco Gobierno de Canarias,Direccin General de Universidades e Investigacin (2001).

9.- Direcciones URL tiles Nomenclatura IUPAC para cromatografa

Cromatografa de gaseshttp://www.uib.es/depart/dqu/dquo/pau/Cromatograf%92a/chrom10/chrom/GC/concept/ main.htm http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm http://ciencias.ucv.cl/micro/croma/cro1.htm

Cromatografa en capa finahttp://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Thin.htm#historia

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